Summary
Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) anvendes til at billedet og analysere dendritiske pigge i murine hippocampus.
Abstract
Tredimensionel elektronmikroskopi (3D EM) giver mulighed for at analysere morfologiske parametre for dendritiske rygsøjler med nanoskalaopløsning. Derudover kan nogle funktioner i dendritiske rygsøjler, såsom volumen af rygsøjlen og postsynaptisk tæthed (PSD) (der repræsenterer postsynaptisk del af synapsen), tilstedeværelse af præsynaptisk terminal og glat endoplasmisk reticulum eller atypisk form af PSD (f.eks. multiin innerverede rygsøjler), kun observeres med 3D EM. Ved at anvende seriel blok-ansigt scanning elektronmikroskopi (SBEM) er det muligt at opnå 3D EM data lettere og på en mere reproducerbar måde end ved udførelse af traditionel seriel sektionsopdele. Her viser vi, hvordan man forbereder muse hippocampalprøver til SBEM-analyse, og hvordan denne protokol kan kombineres med immunfluorescensundersøgelse af dendritiske rygsøjler. Mild fiksering perfusion giver os mulighed for at udføre immunfluorescens undersøgelser med lys mikroskopi på den ene halvdel af hjernen, mens den anden halvdel blev forberedt til SBEM. Denne fremgangsmåde reducerer antallet af dyr, der skal anvendes til undersøgelsen.
Introduction
De fleste af de excitatoriske synapser i centralnervesystemet er placeret på dendritiske rygsøjler - små fremspring af en neuronal membran. Disse fremspring danner begrænsede biokemiske rum, der styrer intracellulær signaltransduktion. Strukturel plasticitet af dendritiske rygsøjler og synapser er tæt forbundet med de funktionelle ændringer i synaptisk effekt, der ligger til grund for så vigtige processer som læring og hukommelse1,2. Det er vigtigt at bemærke, at elektronmikroskopi (EM) er den eneste teknik, der gør det muligt at afgøre, om en dendritisk rygsøjle har et præsynaptisk input. EM-opløsning er også nødvendig for at studere ultrastrukturelle detaljer såsom form af en postsynaptisk tæthed (PSD), der repræsenterer en postsynaptisk del af en synapse, eller dimensioner af en dendritisk rygsøjle, samt størrelsen og formen af en axonal bouton. Derudover er det med EM muligt at visualisere synapser og deres omgivelser.
Takket være fremskridt inden for billed- og computerteknologier er det muligt at rekonstruere hele neurale kredsløb. Volumenelektronmikroskopiteknikker, såsom seriel sektionstransmissionselektronmikroskopi (ssTEM), seriel blok-ansigtsscanning elektronmikroskopi (SBEM) og fokuseret ionstrålescanning elektronmikroskopi (FIB-SEM) er almindeligt anvendt til neuronale kredsløbsrekonstruktioner3.
I vores undersøgelser anvendes SBEM-metoden med succes til at undersøge den strukturelle plasticitet af dendritiske rygsøjler og PSD'er i prøver af musen hippocampus og organotypiske hjerneskiver 4,5. SBEM er baseret på installation af en miniature ultramikromitomi inde i scanningselektronmikroskopkammeret6,7,8,9. Toppen af prøveblokken afbildes, og derefter skæres prøven i en bestemt dybde af ultramikrotomen og afslører en ny blokflade, som igen afbildes, og derefter gentages processen8. Som følge heraf er det kun billedet af en blok-ansigt er tilbage, mens skiven, der er blevet skåret er tabt som snavs. Derfor kaldes SBEM en destruktiv teknik, hvilket betyder, at det ikke er muligt at afbilde det samme sted igen. Fordelen ved de destruktive on-block-metoder er imidlertid, at de ikke lider af vridningsproblemer og sektionstab, der kan påvirke datakvaliteten og dataanalysen3betydeligt . Desuden giver SBEM mulighed for at afbilde et relativt stort synsfelt ( > 0,5 mm × 0,5 mm) ved høj opløsning3.
For at anvende SBEM skal prøverne forberedes i henhold til en dedikeret, meget kontrasterende protokol på grund af den backscattered elektrondetektor, der bruges til at erhverve billeder. Vi viser her, hvordan man udfører prøveforberedelse i henhold til protokollen baseret på en procedure udviklet af Deerinck10 (National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR) metode), ved hjælp af reducerede osmium-thiocarbohydrazide-osmium (rOTO) pletter udviklet i 1980'erne8,11. Derudover introducerer vi en to-trins fikseringsmetode med mild fikseringsperfusion, der gør det muligt at bruge den samme hjerne både til immunfluorescensundersøgelser med lysmikroskopi og SBEM.
I protokollen er en musehjerne primært fastgjort med et mildt fikseringsmiddel og skæres derefter i halve, og den ene halvkugle anbringes og forberedes til immunfluorescens (IF), mens den anden til EM-undersøgelser (Figur 1).
Figur 1. Skematisk repræsentation af arbejdsprocessen for forberedelsen af dendritiske rygsøjler til analysen med SBEM. Mus blev ofret og perfunderet med en mild primær fikseringsmiddel. Hjernen blev skåret i halve, og en halvkugle blev anbragt med immunfluorescens (IF)-dedikeret fiksativ, kryobeskyttet, skåret ved hjælp af en kryostat og behandlet for IF-undersøgelser, mens den anden halvkugle blev anbragt med EM fiksativ, skåret med vibratomet og forberedt til EM-undersøgelser. Hjerneskiver til SBEM-undersøgelser blev kontrasteret, fladt indlejret i harpiks, så blev en CA1-region af hippocampus monteret på stiften og afbildet med SBEM (Figur 1). Den del af protokollen, der er fremhævet i en gul boks, blev vist i videoen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forskningen blev udført i overensstemmelse med Nencki Institute retningslinjer og tilladelse fra det lokale etiske udvalg. Undersøgelserne blev gennemført i overensstemmelse med De Europæiske Fællesskabers rådsdirektiv af 24. Der blev gjort alt for at minimere antallet af anvendte dyr og deres lidelser.
ADVARSEL: Alle nedenfor beskrevne procedurer skal udføres i en laboratoriefumhætte. På grund af reagensernes farlige karakter. Personlige sikkerhedsforanstaltninger såsom handsker, laboratoriekittel, sikkerhedsbriller og en ansigtsmaske er påkrævet.
1. Forberedelse af fikseringspræparatet til perfusion (2% wt/vol paraformaldehyd (PFA) og 0,5% vol/vol glutaraldehyd (GA) i 0,1 M fosfatbuffer (PB), pH 7,4)
BEMÆRK: Forbered fikseringsopløsningen samme dag, som den vil blive brugt, og opbevar den ikke længere end i 3 timer. I tilfælde af tidsmangel skal der forberedes 2 % PFA i 0,1 M PB dagen før, opbevares ved 4 °C og tilsættes frisk GA kort før perfusionen.
- Der tilsm. tages 400 mL sterilt dobbeltdestilleret vand (ddH2O) og opvarmes til 60 °C ved hjælp af en omrørende kogeplade. Derefter tilsættes 20 g PFA. Tilsæt dråber på 1 M NaOH, indtil PFA er helt opløst, og lad blandingen køle af.
- Der tilsættes 500 mL 0,2 M PB (pH 7,4).
- Opløsningen filtreres for at fjerne aflejringen og afkøles til 4 °C.
- Lige før perfusion tilsættes 20 ml 25% GA til opløsningen og fyldes derefter lydstyrken op med ddH2O til 1 L.
2. Forberedelse af postperfusionsfikseringsmiddel til SBEM (2% wt/vol. PFA og 2,5% vol./vol. GA i 0,1 M PB, pH 7,4)
- Tag 50 mL af fikseringsmærket for perfusion (2% PFA og 0,5% GA i 0,1 M PB).
- Tilføj 5 mL på 25% GA.
3. Forberedelse af postperfusionsfikseringsmiddel til IF-farvning (4% PFA i fosfatbufferet saltvand (PBS))
- En tablet med 1x PBS (pH 7.4) opløses i et renset og deioniseret vand (H2O) i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Brug en omrøringsvarmeplade til at opvarme opløsningen til 60 °C og tilsæt 40 g PFA.
- Tilsæt dråber på 1 M NaOH, indtil PFA er helt opløst og lad blandingen køle af.
- Opløsningens pH-enhed justeres til 7,5 med 1 M HCl, og op ad volumenet med H2O til 1 L.
- Filtrer opløsningen for at fjerne eventuelle aflejringer.
4. Transcardial perfusion af dyr
BEMÆRK: Alt PFA- og GA-affald skal indsamles og opbevares til bortskaffelse i henhold til de lokale regler. Anæstesi og perfusion bør følge de lokale regler. I den beskrevne protokol blev voksne 3 måneder gamle og 20±1 måneder gamle kvindelige Thy1-GFP(M) mus (Thy1-GFP +/-)12, der udtrykte grønt fluorescensprotein (GFP) i en sparsomt fordelt population af glutamatergiske neuroner, brugt, men alle andre kan også bruges. Dyr blev opdrættet som heterozygoter med C57BL/6J baggrund i Animal House af Nencki Institute of Experimental Biology.
- Før perfusion bedøve en mus ved administration af en ketamin / xylazin blanding (op til 90 mg / kg kropsvægt ketamin og 10 mg / kg kropsvægt xylazin) via intraperitoneal injektion (27-gauge nål).
- Vurdere, om dybden af anæstesi er tilstrækkelig ved at kontrollere refleks til smerte stimuli (klemme) og hornhinde refleks (knibe).
- Efter 20 minutter udføres en intraperitoneal injektion (27-gauge nål) af natrium pentobarbital (50 mg/kg kropsvægt).
- Gennemgå en mus i henhold til en perfusionskirurgiprotokol beskrevet af Gage et al.13 (se punkt 4; Figur 5-6). Ved hjælp af en perfusionspumpe startes med en 0,1 M fosfatbuffer, pH 7,4 (30 mL) i 3 minutter og fortsættes med 2% PFA og 0,5% GA i 0,1 M PB, pH 7,4 i 6 minutter (80 mL).
- Disseker forsigtigt hjernen fra kraniet og del den i halve (se figur 9-10 i Gage et al., 201213). Et stykke i et hætteglas, der indeholder fikseringsmiddel til SBEM, og det andet anbringes i hætteglasset med 4 % PFA/PBS til IF-farvning.
- Hold halvkuglerne i fikseringsmærket ved 4 °C natten over.
5. Hjerneskiver forberedelse til elektronmikroskopi
- Vælg indstillingerne for vibratome (bladeens kørehastighed: 0,075 mm/s, skærefrekvens: 80 Hz).
- Sæt skivekammeret i holderen, fastgør det til vibratomet og omgiv det med is. Placer derefter et barberblad i vibratomebladets holder.
- Brug en ske eller lignende genstande, og placer den kølede hjerne (dorsal overflade op) på en hård skæreflade (f.eks. et låg til en petriskål i glas). For at forberede en koronar skive hippocampus laves et vinkelret snit mellem hjernehalvdelen og lillehjernen med et barberblad eller skalpel, og fjern dermed lillehjernen. Den olfaktoriske pære kan også fjernes.
- Påfør cyanoacrylatlim på vibratomets tørre platform.
- Saml hjernen op med pincet og tør den forsigtigt på filterpapir.
- Lim halvkuglen til platformen tæt på skærebladet med rostralspidsen opad. Fastgør platformen til holderen og fyld den straks op med iskold 0,1 M PB, pH 7,4. Hvis vinkelret snit er korrekt lavet, vil halvkuglen stå lige op og give 90 ° vinkel, der kræves for at lave et symmetrisk koronasnit, der indeholder hippocampus. Sørg for, at hjernen er dækket af PB.
- Placer vibratomebladet foran halvkuglen, og sænk det til kransesiden af halvkuglen. Sænk klingen til 400 μm længere i kaudale retning og begynde udskæring. Fortsæt udskæring, indtil de første to skiver er helt adskilt fra vævsblokken.
- Træk klingen tilbage, og sænk yderligere 100 μm, og skær derefter igen.
- Når hippocampus bliver synlig (brug musen hjerne atlas Paxinos og Franklin, 200414) indsamle skiver med den lille pensel eller udvidet plast Pasteur pipette.
- Overfør skiverne til en 12-brønds plade fyldt med kold 0,1 M PB, pH 7,4.
- Disseker hippocampus i en glas petriskål fyldt med 0,1 M PB, pH 7,4 ved hjælp af et barberblad eller skalpel, og læg det i glasglas med samme fosfatbuffer.
BEMÆRK: Ved langtidsopbevaring af skiverne suppleres 0,1 M PB med 0,05% natriumanzid (NaN3).
6. Forberedelse af hjerneprøve til immunostaining
- Efter fastgørelse natten over i 4% PFA/PBS-opløsning i en røghætte anbringes hjernevævet i kryopræserveringsopløsningen (30% saccharose i PBS med 0,05% NaN3)og det opbevares ved 4 °C i 2 dage (indtil det sænkes).
- Der fremstilles en frostvæskeopløsning (15% saccharose/30% ethylenglycol/0,05% NaN3/PBS).
- Sæt kryostatens skabstemperatur til -19 °C, og sørg for, at temperaturen er nået, før du går videre. Under sektionsopdeningen skal det sikres, at skabstemperaturen forbliver mellem -18 °C og -20 °C.
- Brug en ske eller lignende genstande, og placer den kølede hjerne (dorsal overflade op) på en hård skæreflade (f.eks. et låg til en petriskål i glas). For at forberede en koronar skive hippocampus laves et vinkelret snit mellem hjernehalvdelen og lillehjernen med et barberblad eller skalpel, og fjern dermed lillehjernen.
- Vælg en forkølet prøveskive, dæk den med et medium til frysning på en frigørende hylde og brug pincet fastgøre halvkuglen til disken med en rostral spids opad og vent, indtil prøven er helt frosset. Sæt prøveskiven i et prøvehoved.
- Der monteres et blad i en klingeholder inde i kryokammeret, og der skæres 40 μm tykke skiver.
- Overfør skiver med en lille pensel til 96-brøndspladen fyldt med kold frostvæskeopløsning, og rul forsigtigt sektionerne ud (saml en skive efter hver runde udskæring for at forhindre dem i at gå tabt i skivekammeret).
BEMÆRK: Hjerner eller sektioner kan opbevares i en frostvæskeopløsning ved -20 °C i lang tid.
7. Immunostaining af hjerneskiver
BEMÆRK: Alle farvning trin blev udført i en 24-godt plade på en platform shaker.
- Vask skiverne med PBS tre gange, hver gang i 6 minutter.
- Inkuber skiver i 300 μL blokeringsopløsning (5% normalt æselserum (NDS)/0,3% Triton X-100) i 1 time med blid rysten på en rotator.
- Skiverne inkuberes med det primære antistof mod PSD-95 fortyndet 1:500 i 5% NDS/0,3% Triton X-100/PBS (300 μL pr. brønd) natten over ved 4 °C. Den endelige koncentration af det primære antistof er 2 μg/mL.
- Skiverne vaskes med 0,3% Triton X-100/PBS ved stuetemperatur (RT) tre gange, hver gang i 6 minutter.
- Inkuber skiver med det sekundære antistof fortyndet 1:500 i 300 μL på 0,3% Triton X-100/PBS i 90 minutter. Den endelige koncentration af det sekundære antistof er 4 μg/mL.
- Vask skiverne med PBS tre gange, hver gang i 6 minutter.
- Monter udsnittene på dias ved hjælp af et monteringsmedie, og luk dem derefter med et coverdias.
- Prøverne undersøges ved hjælp af et konfokalt mikroskop (63 × oliemål, NA 1,4, pixelstørrelse 0,13 μm × 0,13 μm).
BEMÆRK: Til langtidsopbevaring: Prøverne opbevares ved 4 °C, og de beskyttes mod lys.
8. SBEM-prøveforberedelse
ADVARSEL: På grund af reagensernes farlige karakter skal alle nedenstående procedurer udføres i en laboratoriefumehætte. Før du bruger disse kemikalier, skal du læse de materialesikkerhedsdatablade, som producenterne har leveret, omhyggeligt og spørge sikkerhedsmedarbejderen om de lokale regler for at sikre sikker håndtering og bortskaffelse af affald.
- Eksempel på kontrast
BEMÆRK: Skiver vask og stuetemperatur inkubation skal udføres med mild rystelse (f.eks på en platform shaker). Autoklave afgasset vand blev brugt.- Vask skiverne med koldt 0,1 M PB, pH 7,4 fem gange, hver gang i 3 minutter.
- Forbered en 1:1 blanding af 4% vandig osmium tetroxid og 3% kalium ferrocyanid (1:1 af vol). Det endelige produkt bliver brunt. Fordyb prøverne i denne blanding, læg dem på is, og fra dette stadium og fremefter er det vigtigt at beskytte dem mod lys. Inkuber dem med blid rysten i 1 time.
- I mellemtiden forberede en thiocarbohydrazide (TCH) løsning. Der blandes 10 mL dobbeltdestilleret H2O (ddH2O) og 0,1 g TCH, og den anbringes i en ovn, der er indstillet til 60 °C i 1 time. Det er vigtigt at hvirvle opløsningen fra tid til anden (f.eks. hvert 10. minut). Når du er klar, afkøles den til stuetemperatur.
- Vask skiverne med ddH2O fem gange, hver gang i 3 minutter.
- TCH-opløsning filtreres med et 0,22 μm sprøjtefilter, og prøven nedsænkes i filtreret opløsning. Skiverne bliver sorte. Inkuber dem i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Prøverne vaskes med ddH2O fem gange, hver gang i 3 minutter.
- Inkuber prøverne med en 2% vandig opløsning af OsO4 i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Prøverne vaskes med ddH2O fem gange, hver gang i 3 minutter.
- Prøverne anbringes i filtreret 1% vandigt uranylacetat, og de inkuberes ved 4 °C natten over. Brug 0,22 μm sprøjtefilter til filtrering.
- L-aspartic syreopløsning fremstilles ved at blande 0,4 g L-asparticsyre og 80 ml ddH2O, justere pH-toppen til 3,8 for lettere opløsning og derefter fyldes op med vand til 100 ml.
- Næste dag, begynde med Walton's bly aspartate15 forberedelse. 0,066 g blynitrat blandes med 10 ml L-aspartiksyreopløsning (punkt 8.1.10) forvarmes til 60 °C, og pH justeres til 5,5 (målt ved 60 °C) med 1 M NaOH. Hætteglasset lukkes med bly aspartat og efterlades ved 60 °C i 30 minutter i et vandbad. Løsningen skal være klar. Hvis det bliver overskyet, skal det kasseres, og der skal forberedes et nyt.
- I mellemtiden vaskes prøverne med afgasset ddH2O fem gange, hver gang i 3 minutter. Derefter opbevares de i ovnen indstillet til 60 °C i 30 minutter.
- Prøverne nedsænkes i den frisklavede aspartatopløsning og inkuberes i ovnen, der er indstillet til 60 °C i 20 minutter.
- Prøverne vaskes med afgasset ddH2O fem gange, hver gang i 3 minutter.
- Dehydrering og harpiksintegrering
- Gør epoxyharpiks klar. Ingredienserne (33,3 g komponent A/M, 33,3 g komponent B og 1 g komponent D) afvejes og blandes harpiksen godt (f.eks. rystes den på en roterende shaker i et 15 mL rør) i mindst 30 minutter, før der tilsættes 16 dråber accelerator DMP 30. Rør igen i yderligere 10 minutter.
BEMÆRK: Afveje ingredienserne under røghætten. Denne mængde komponenter giver ca. 60 mL harpiks, hvad der er nok til 15 hætteglas med prøver. Du kan forberede mindre eller opbevare resten af harpiksen i en sprøjte ved 4 °C og bruge den næste dag. Husk at forsegle spidsen af sprøjten. - Forbered hætteglas med gradueret fortynding af ethanol (30%, 50%, 70%, 90%, 100%, 100% ethanol i vand og 100% tørret på en molekylær sigte).
- Bland harpiksen med 100% ethanol i 1:1-proportion for at opnå 50% harpiks. Bland det godt.
- Dehydrer prøverne i 5 minutter i hver fortynding af ethanol fra 30% og slutter med 100% vandfri ethanol tørret på molekylær sigte. Husk, at prøverne aldrig må tørre helt.
- Infiltrere prøverne først i 50% harpiks i 30 minutter, næste i 100% harpiks i en time, og derefter igen i 100% harpiks natten over. Udfør alle infiltrationstrin med konstant langsom rysten.
- Den næste dag, placere prøverne i frisk 100% harpiks i en time og derefter integrere dem mellem fluoropolymer indlejring ark. Degrease stykker af indlejring ark med ethanol, og flad indlejre prøverne mellem to lag af det, ved hjælp af to glas dias som støtte. Prøv at undgå luftbobler i harpiks på eller tæt på prøven.
- Prøverne i ovnen skal hærdes ved 70 °C i mindst 48 timer.
- Gør epoxyharpiks klar. Ingredienserne (33,3 g komponent A/M, 33,3 g komponent B og 1 g komponent D) afvejes og blandes harpiksen godt (f.eks. rystes den på en roterende shaker i et 15 mL rør) i mindst 30 minutter, før der tilsættes 16 dråber accelerator DMP 30. Rør igen i yderligere 10 minutter.
- Trimning og montering
- Adskil indlejringspladerne, og skær et stykke af den indlejrede prøve (ca. 1 mm x 1 mm) med et barberblad. Overfør det til en parafilm. Dette vil minimere risikoen for at miste prøven på grund af elektrostatika.
- Tag en aluminiumsnål, der er blevet affedtet med ethanol. Bland en ledende epoxy godt og bruge en lille mængde af det til at montere prøven til stiften. Ledningsevne epoxy ved 70 °C hærdes i 10 minutter.
- Trim hver side af prøveblokken med diamantkniven, og puds derefter blokkens ansigt, indtil vævet udsættes.
BEMÆRK: På dette trin skal du bekræfte tilstedeværelsen af en region af interesse ved at samle nogle sektioner og udføre toluidinblå farvning16 eller kontrollere under elektronmikroskopet. - Reducer prøvens størrelse så meget som muligt. Derefter jordes prøven til stiften med ledende maling og hærdes (i 24 timer ved stuetemperatur eller i ovnen ved 65 °C i 40 minutter).
- For at minimere opladning artefakter, sputter pels prøverne med et tyndt lag af guld eller guld / palladium.
9. SBEM-billedbehandling
- Placer stiften med en prøve i kammeret af den serielle blok-ansigt scanning elektron mikroskop. Prøven justeres til kniven. Luk kammeret, og angiv parametrene.
- Saml en stak billeder ved den ønskede forstørrelse, pixelstørrelse, skivetykkelse, accelereret spænding (EHT), blænde, tryk osv.
BEMÆRK: Parametrene afhænger af prøven og eksperimentets mål. Eksemplariske indledende billedbehandlingsindstillinger er inkluderet i materialetabellen.
10.3D rekonstruktioner
BEMÆRK: For de trin, der er nævnt nedenfor, bruger vi open-access software, f.eks. FijiJ17 (ImageJ version 1.49b), Mikroskopibilledbrowser (MIB)18 og Rekonstruer19, men forskellige andre software kan anvendes.
- Konverter digitale mikrograffiler (dm) til TIFF-format. Importer først billedsekvensen (i FijiJ: File > Import > Image sequence > Choose 8 Bit Format) og gem derefter som TIFF (i FijiJ: File > Save As > Image Sequence > Choose Tiff).
- Juster lysstyrken og kontrasten i stakken af billeder (i FijiJ: Image > Adjust > Brightness/Contrast) og om nødvendigt denoise det (brug DenoisEM plugin til FijJ20 : Plugins > DenoiseEM > Denoise).
- Juster stakken (i FijiJ: Plugins > StagReg eller MIB: Datasæt > Justeringsværktøjer).
- Segment dendritiske rygsøjler og synapser (I MIB eller Rekonstruer software, omfattende tutorials er tilgængelige (Se Tabel over materialer for detaljer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af den metode, der er beskrevet ovenfor høj kontrast, god opløsning billeder af musens hjernevæv kan opnås. Et stort synsfelt, der leveres af SBEM-teknikken, letter en præcis udvælgelse af den region, der er af interesse. Det store billede af CA1-regionen i hippocampus blev taget for at måle længden af stratum radiatum (SR) (Figur 2A) og for at indstille billeddannelsen præcist i midten (Figur 2B). Dernæst blev stakken af billeder erhvervet, og objekter af interesse, såsom dendritter, dendritiske rygsøjler, postsynaptiske tætheder af synapser blev segmenteret (Figur 2C, D).
Brugen af SBEM-teknikken giver mulighed for at analysere en relativt stor mængde væv og genkende sjældne hændelser som en multiind innerveret dendritisk rygsøjle (Figur 2E) - en bestemt type synapser, der er karakteriseret ved flere præsynaptiske terminaler, der kontakter den samme postsynaptiske rygsøjle21.
Figur 2. Dendritiske pigge i mus hippocampus CA1 region. Repræsentativt billede af mus hippocampal CA1 region. Stratum radiatum (SR) vises med en hvid pil (A). Regionen midt i SR blev valgt til billeddannelse (B). Rekonstruktion af et stykke dendrit med dendritiske rygsøjler (C). Rekonstruktion af dendritiske rygsøjler i et vævsvolumen (D). Rekonstruktion af en multi-innerveret dendritisk rygsøjle (E). To forsynaptiske terminaler, der kontakter den samme postsynaptiske rygsøjle, vises (i magenta og grøn). Klik her for at se en større version af dette tal.
Den præsenterede protokol for SBEM-prøveforberedelse gjorde det muligt for os at opnå billeder af hjernevævet i høj kvalitet med stærkt kontrasterede membraner, hvilket muliggør lettere segmentering og rekonstruktion af membranomringede strukturer. Standardfikseringen med den højere koncentration af PFA (figur 3B) og totrinsfikseringsmetoden resulterede i lignende vævsmorfologi (figur 3A).
Figur 3. Morfologiske detaljer. Med brugen af protokollen præsenteret her god kvalitet billeder, der viser morfologi synaptiske vesikler, PSD og mitokondrier blev opnået. Hjernevæv fastgjort med totrins tilgang (A) eller med en standard fikseringsmiddel (B). Skalalinje 2 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Resultaterne er reproducerbare, hvilket betyder, at hver prøve, der blev fremstillet ved hjælp af denne protokol, ikke kun hjernevæv, men også monolayer af dyrkede celler, var godt kontrasteret.
Brugen af mild primær fiksering giver mulighed for at bruge vævet også til immunfluorescens undersøgelser, der involverer et lysmikroskop. I tilfælde af PSD-95 antistof observerede vi ikke forskellen i immunfarvningsresultater mellem prøverne fastgjort med totrins fiksering (mild primær og derefter sekundær med et traditionelt fiksativ) og den, der opnås ved hjælp af traditionel fiksering kun med 4% PFA(henholdsvis figur 4A og 4B).
Figur 4. Sammenligning af PSD-95 immunfluorescens i prøver fastgjort med forskellige protokoller. Repræsentative mikrofotografer af PSD-95 immunostaining i stratum radiatum lag af CA1 område i dorsale hippocampus. (A) Konfokalt billede efter mild primær fiksering efterfulgt af anbringelse med en standardfikseringsmiddel. (B) Confocal billede efter standard, stærkere fiksering. Skalalinjer: 5 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er mange variationer af den primære NCMIR-metode beskrevet af Deerinck i 201010. De grundlæggende principper forbliver de samme, men afhængigt af den undersøgte type materiale gennemføres små ændringer. Det blev tidligere beskrevet, at forskellige harpikser kan bruges til at integrere prøver til SBEM, og for eksempel i tilfælde af planter er Spurr's den valgte harpiks på grund af dens lave viskositet, der giver bedre infiltration gennem cellevæggene22,23. Desuden kan forskellige buffere anvendes til fiksering (f.eks. cacodylatbuffer, HEPES eller fosfatbuffer samt en anden koncentration af glutaraldehyd (2-3%) og paraformaldehyd (2-4%)23,24,25,26,27,28). Brugen af garvesyre til at forbedre farvning af prøver rig på ekstracellulær matrix29 eller rutheniumrød for at forbedre farvning af plantemateriale23,30 er en anden ændring, der kan bruges. For så vidt angår dehydrering anbefales normalt ethanol og/eller acetone til epoxyharpiks24,28.
Den samme protokol som beskrevet her, eller meget lignende, er blevet brugt før af vores team og andre grupper4,5,24. Prøver, der behandles efter denne metode, er kompatible med TEM imaging31. I sammenligning med den oprindelige NCMIR-protokol, der blev offentliggjort i 201010, introducerer vi nogle mindre ændringer såsom udskiftning af giftig cacodylatbuffer under fiksering og osmium efter fikseringstrin med en fosfatbuffer. Som nævnt ovenfor kan forskellige buffere bruges under EM-forberedelse, og ifølge vores erfaring giver ikke-giftig PB tilfredsstillende resultater.
En anden ændring er en udskiftning af acetone med mindre brugerskadelig ethanol under det sidste trin af dehydrering. Ethanol blev også brugt som harpiksopløsningsmiddel under indlejringsprocessen. Desuden DMP-30 blev brugt i stedet for epoxy harpiks komponent C, som offentliggjort før32,33.
På grund af behovet for at bruge de samme hjerner til immunfluorescensundersøgelser blev totrins fikseringsmetoden introduceret. Først dyrene blev perfunderet med en buffer, der indeholdt en lavere koncentration af glutaraldehyd (mild primær fiksering ved perfusion med en buffer, der indeholder 2% PFA og 0,5% GA), og derefter var kun halvdelen af hjernen dedikeret til EM yderligere postfixed med en højere koncentration af glutaraldehyd (2% PFA og 2,5% GA), mens den anden halvdel af hjernen blev anbragt med en standard fikseringsmiddel til immunostaining (4% PFA). Brugen af EM-fikseringsmiddel med en lavere koncentration af PFA blev tidligere offentliggjort af andre og vores gruppe4,5,31,34. Den totrinsfiksering, der præsenteres her, er lige så tilstrækkelig som en traditionel ettrinstilgang(figur 3 og figur 4). Men da vi foreslår, at hver halvdel af hjernen kan behandles separat, giver vores protokol mulighed for at reducere antallet af anvendte dyr. Mild primær fiksering opretholder med succes vævsantigenicitet, hvilket muliggør yderligere immunfluorescens som påvist for antistoffet mod PSD-95 protein. Det skal dog understreges, at nytten af vores tilgang skal valideres for andre antistoffer.
Den præsenterede metode resulterer i billeder med høj kontrast af hjernevævet med tydeligt synlige membraner. Det er dog værd at nævne, at der er de samme trin, der er tilbøjelige til at mislykkes, som i tilfælde af enhver anden metode til SBEM-prøveforberedelse, og der skal lægges særlig vægt på dem. Kvaliteten af selve vævsmorfologien afhænger for det meste af perfusionen. Det er et kritisk skridt, da kun vellykkede faste prøver giver tilfredsstillende resultater. Desværre er fikseringstransfusion påvirket af individuel variation blandt dyr, således at kvaliteten af billeder kan variere fra et dyr til et andet. Desuden skal man passe på ikke at tørre prøven under dehydrering; Ellers vil prøven ikke blive infiltreret korrekt med harpiksen. Et andet vigtigt aspekt er prøve montering på stiften. Epoxyharpikserne er ikke-forførende, og derfor akkumulerer de elektroner under billeddannelse, hvad der forårsager opladning af artefakter. For at reducere opladningseffekten i SBEM er det nødvendigt forsigtigt at fjerne overskydende harpiks på hver side af prøven og nøjagtigt jorde prøven med sølvmaling og sputter belægning.
Den nuværende protokol fokuserer på hjernevæv; Det kan dog tilpasses til cellemonolayer, organotypiske skiver eller andet væv. Ligesom den oprindelige NCMIR-protokol resulterer den, der præsenteres her, i meget kontrasterede prøver, der ikke kun er egnede til SBEM, men også til FIB-SEM- og ATUM-SEM-eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
SBEM billeddannelse, lys mikroskopi billeddannelse og elektron mikroskopi prøve forberedelse blev udført med brug af udstyr fra Laboratory of Imaging Tissue and Function, der fungerer som en billeddannelse kerne facilitet på Nencki Institute of Experimental Biology.
Til forberedelse af figur 1 blev billedet af en mus (Souris_02) og et hætteglas fra https://smart.servier.com/ brugt.
Dette arbejde blev støttet af National Science Centre (Polen) Grant Opus (UMO-2018/31/B/NZ4/01603) tildelt KR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: | |||
| Ketamine/xylazine mixture (Ketamina/Sedazin) | Biowet Pulawy, Pulawy, Poland | ||
| Sodium pentobarbital (Morbital) | Biowet Pulawy, Pulawy, Poland | ||
| Fixatives: | |||
| Glutaraldehyde (GA) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | G5882 | Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative |
| Hydrochloric acid (HCl) | POCH, Gliwice, Poland | 575283115 | pure p.a. |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 441244 | prilled, 95% |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | P4417-50TAB | tablets |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S5881 | reagent grade,  98%, pellets (anhydrous) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S3264 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S3139 | |
| Perfusion: | |||
| Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14519-14 | |
| Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8") | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 10091-12 | |
| Needle tip, 15 GA, blunt (perfusion needle) | KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, Germany | KD-FINE 900413 | 1.80 x 40 mm |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 11050-10 | |
| Perfusion pump | Lead Fluid | BQ80S | |
| Plastic vials | Profilab, Warsaw, Poland | 534.02 | plastic vials with blue cap for tissue storage, 20 ml, 31 x 48 mm |
| Straight iris scissors (~9 cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14058-11 | |
| Brain slices preparation for EM: | |||
| 12-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 712001 | |
| Cyanoacrylic glue | Fenedur, Montevideo, Uruguay | ||
| Glass vials | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 72632 | 20 ml Scintillation Vial, a pack of 100 |
| Pasteur pipette | VWR, Radnor, PA, USA | 612-4545 | LDPE, disposable, 7.5 ml |
| Razor blade | Wilkinson Sword, London, UK | Classic double edge safety razor blades | |
| Scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | No. 20 | |
| Vibratome | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica VT1000 S | |
| Brain slices preparation for IF: | |||
| 96-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 701101 | |
| Criostat | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica CM 1950 | |
| Ethylene glycol | Bioshop, Burlington, Canada | ETH001 | |
| Low-profile disposable blade 819 | Leica Biosystems Inc., USA | 14035838925 | |
| Scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | No. 20 | |
| Sodium azide (NaN3) | POCH, Gliwice, Poland | 792770426 | |
| Sucrose | POCH, Gliwice, Poland | 772090110 | |
| Tissue freezing medium for cryosectioning, OCT-Compound | Leica Biosystems, Switzerland | 14020108926 | |
| Immunostaining: | |||
| 24-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 702001 | |
| Anti-Post Synaptic Density Protein 95 Antibody | Merck-Millipore, Burlington, MA, USA | MAB1598 | |
| Confocal microscope | Zeiss, Göttingen, Germany | Zeiss Spinning Disc microscope (63 × oil objective, NA 1.4, pixel size 0.13 µm × 0.13 µm) | |
| Cover slide | Menzel Glaser, Braunschweig, Germany | B-1231 | 24 x 60 mm |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | A31570 | |
| Fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | 00-4959-52 | |
| Microscope slide | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | AGAA00008 | SuperFrost |
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| Shaker | JWElectronic, Warsaw, Poland | KL-942 | |
| TritonT X-100 Reagent Grade | Bioshop, Burlington, Canada | TRX506 | |
| Electron microsocpy sample preparation | |||
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | POCH, Gliwice, Poland | 746980113 | |
| Aclar 33C Film | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 50425 | Fluoropolymer Film embedding sheet |
| DMP-30, 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | T58203 | Epoxy embedding medium accelerator |
| Durcupan ACM single component A, M | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44611 | Durcupan ACM single component A, M epoxy resin |
| Durcupan ACM single component B | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44612 | Durcupan ACM single component B, hardener 964 |
| Durcupan ACM single component D | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44614 | Durcupan ACM single component D , plasticizer |
| Ethyl alcohol absolute | POCH, Gliwice, Poland | 64-17-5 | Ethyl alcohol absolute 99.8 % pure P.A.-BASIC |
| Genlab laboratory oven | Wolflabs, York, UK | Mino/18/SS | Oven Genlab MINO/18/SS 18l volume, no fan circulation, no digital display, standard temperature gradient, standard recovery rate, no timer, 250°C maximum temperature, 240V electrical supply |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | A-9256 | reagent grade, 98% (HPLC) |
| Lead (II) nitrate | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 467790 | 99.95% trace metals basis |
| Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 75632 | for electron microscopy, 4% in H2O |
| pH meter | Elmetron, Zabrze, Poland | CP-5-5 | |
| Rotator | BioSan, Józefów, Poland | Multi Bio RS-24 | rotator Multi Bio RS-24 |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S5881 | reagent grade, 98%, pellets (anhydrous) |
| Sunflower mini shaker | Grant bio, Shepreth,UK | PD-3D | |
| Syringe filter | Millipore, Burlington, MA, USA | SLGP033NB | 0,22 µm pore size |
| Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 88535 | purum p.a., for electron microscopy, 99.0% (N) |
| Uranyl acetate | Serva, Heidelberg, Germany | 77870 | Uranyl acetate·2H2O, research grade |
| Water bath | WSL, Swietochlowice, Poland | LWT | |
| Specimen mounting for SBEM | |||
| 96-well culture plate | VWR, Radnor, PA, USA | 734-2782 | 96-well plates, round bottom, non treated |
| AM Gatan 3View stub handling tweezers | Micro to Nano, Haarlem, Netherlands Netherlands |
50-001521 | |
| Binocular | OPTA-TECH, Warsaw, Poland | X2000 | |
| Conductive glue | Chemtronics, Georgia, USA | CW2400 | conductive eopxy |
| Gatan 3View sample pin stubs | Micro to Nano, Haarlem, Netherlands Netherlands |
10-006003 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | P7793 | roll size 20 in. × 50 ft |
| Pelco conductive silver paint | Ted Pella, Redding, CA, USA | 16062-15 | PELCO® Conductive Silver Paint, 15g |
| Razor blades double edge | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 72000 | Stainless Steel "PTFE" coated. PERSONNA brand .004" thick, wrapped individually, 250 blades in a box. |
| Scanning Electron Microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | Sigma VP with Gatan 3View2 chamber, acceleration voltage 2.5 kV, variable pressure 5 Pa, aperture 20 µm, dwell time 6 µs, slice thickness 60 nm, magnification 15 000 x, image resolution 2048 x 2048 pixels, pixel size 7.3 nm | |
| trim 90° diamond knife | Diatome Ltd., Nidau, Switzerland | DTB90 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica ultracutR | |
| Software | webpage | tutorials | |
| FijiJ | https://fiji.sc/ | ||
| Microscopy Image Browser | http://mib.helsinki.fi/ | http://mib.helsinki.fi/tutorials.html | |
| Reconstruct | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0 | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0) | |
| Animals | |||
| Mice | Adult 3-month old and 20±1 month old female Thy1-GFP(M) mice (Thy1-GFP +/-) (Feng et al.,2000) which express GFP in a sparsely distributed population of glutamatergic neurons. Animals were bred as heterozygotes with the C57BL/6J background in the Animal House of the Nencki Institute of Experimental Biology. |
References
- Bosch, M., Hayashi, Y.
- Borczyk, M., Radwanska, K., Giese, K. P. The importance of ultrastructural analysis of memory. Brain Research Bulletin. 173, 28-36 (2021).
- Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience: challenges of SBEM in neuroscience. Journal of Microscopy. 259 (2), 137-142 (2015).
- Śliwińska, M. A., et al. Long-term Memory Upscales Volume of Postsynaptic Densities in the Process that Requires Autophosphorylation of αCaMKII. Cerebral Cortex. 30 (4), 2573-2585 (2020).
- Borczyk, M., Śliwińska, M. A., Caly, A., Bernas, T., Radwanska, K. Neuronal plasticity affects correlation between the size of dendritic spine and its postsynaptic density. Scientific Reports. 9 (1), 1693 (2019).
- Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , Pt 2 73-76 (1981).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
- Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue and Cell. 57, 111-122 (2019).
- Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure: Volume scanning electron microscopy. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
- Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , 6-8 (2010).
- Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).
- Feng, G., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Acad. Press. San Diego, Calif. (2004).
- Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
- Mercer, E. H. a scheme for section staining in electron microscopy. Journal of the Royal Microscopical Society. 81 (3-4), 179-186 (1963).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
- Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218 (1), 52-61 (2005).
- Roels, J., et al. An interactive ImageJ plugin for semi-automated image denoising in electron microscopy. Nature Communications. 11 (1), 771 (2020).
- Radwanska, K., et al. Mechanism for long-term memory formation when synaptic strengthening is impaired. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18471-18475 (2011).
- Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems: SBFSEM Methods for Plant Cells. Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).
- Fendrych, M., et al. Programmed Cell Death Controlled by ANAC033/SOMBRERO Determines Root Cap Organ Size in Arabidopsis. Current Biology. 24 (9), 931-940 (2014).
- Russell, M. R. G., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
- Płachno, B. J., Świątek, P., Jobson, R. W., Małota, K., Brutkowski, W. Serial block face SEM visualization of unusual plant nuclear tubular extensions in a carnivorous plant (Utricularia, Lentibulariaceae). Annals of Botany. 120 (5), 673-680 (2017).
- Genoud, C., Titze, B., Graff-Meyer, A., Friedrich, R. W. Fast Homogeneous En Bloc Staining of Large Tissue Samples for Volume Electron Microscopy. Frontiers in Neuroanatomy. 12, (2018).
- Puhka, M., Joensuu, M., Vihinen, H., Belevich, I., Jokitalo, E. Progressive sheet-to-tubule transformation is a general mechanism for endoplasmic reticulum partitioning in dividing mammalian cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2424-2432 (2012).
- Gluenz, E., Wheeler, R. J., Hughes, L., Vaughan, S. Scanning and three-dimensional electron microscopy methods for the study of Trypanosoma brucei and Leishmania mexicana flagella. Methods in Cell Biology. 127, 509-542 (2015).
- Starborg, T., et al. Using transmission electron microscopy and 3View to determine collagen fibril size and three-dimensional organization. Nature Protocols. 8 (7), 1433-1448 (2013).
- Hughes, L., Borrett, S., Towers, K., Starborg, T., Vaughan, S. Patterns of organelle ontogeny through a cell cycle revealed by whole-cell reconstructions using 3D electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (3), 637-647 (2017).
- Bojko, A., et al. Improved Autophagic Flux in Escapers from Doxorubicin-Induced Senescence/Polyploidy of Breast Cancer Cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6084 (2020).
- Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis. Nature Protocols. 4 (8), 1145-1156 (2009).
- Glauert, A. M., Lewis, P. R. Biological specimen preparation for transmission electron microscopy. , Princeton University Press. Princeton. (2014).
- Genoud, C. Altered Synapse Formation in the Adult Somatosensory Cortex of Brain-Derived Neurotrophic Factor Heterozygote Mice. Journal of Neuroscience. 24 (10), 2394-2400 (2004).
