Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Etablering av en elektrofysiologisk plattform for modellering av ALS med regionalt spesifikke humane pluripotente stamcelleavledede astrocytter og nevroner

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62726
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Neurology, Johns Hopkins University
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver en metode for å differensiere ryggmargsmenneskeskapte pluripotente astrocytter og nevroner og deres samkultur for elektrofysiologisk registrering.

Abstract

Humane pluripotente stamcelleavledede astrocytter (hiPSC-A) og nevroner (hiPSC-N) gir et kraftig verktøy for modellering av patofysiologi for amyotrofisk lateral sklerose (ALS) in vitro. Multi-electrode array (MEA) opptak er et middel til å registrere elektriske feltpotensialer fra store populasjoner av nevroner og analysere nettverksaktivitet over tid. Det ble tidligere demonstrert at tilstedeværelsen av hiPSC-A som er differensiert ved hjelp av teknikker for å fremme en ryggmargsastrocytfenotype, forbedret modning og elektrofysiologisk aktivitet av regionalt spesifikke ryggmargshiPSC-motorneuroner (MN) sammenlignet med de som ble dyrket uten hiPSC-A eller i nærvær av gnagerastrocytter. Beskrevet her er en metode for å samdyrke ryggmargs hiPSC-A med hiPSC-MN og registrere elektrofysiologisk aktivitet ved hjelp av MEA-opptak. Mens differensieringsprotokollene beskrevet her er spesielle for astrocytter og nevroner som er regionalt spesifikke for ryggmargen, kan samkultureringsplattformen brukes på astrocytter og nevroner differensiert med teknikker som er spesifikke for andre skjebner, inkludert kortikal hiPSC-A og hiPSC-N. Disse protokollene tar sikte på å gi en elektrofysiologisk analyse for å informere om glia-neuron interaksjoner og gi en plattform for testing av legemidler med terapeutisk potensial i ALS.

Introduction

Humane pluripotente stamcelleavledede astrocytter (hiPSC-A) og nevroner (hiPSC-N) er kraftige verktøy for modellering av patofysiologi for amyotrofisk lateral sklerose (ALS) in vitro og gir et translasjonsparadigme for narkotikaoppdagelsesstrategier1. Forskere har vist at samkulturen til hiPSC-A med hiPSC-N forbedrer morfologisk, molekylær, elektrofysiologisk og farmakologisk modning av begge celletyper, og genererer komplekse nevronnettverk og astrocyt-neuron-interaksjoner som ligner deres in vivo kolleger 2,3. Lignende kokultureksperimenter kan rekapitulere kjennetegn ved ALS-patobiologi som astrocytmediert nevrotoksisitet 4,5 og nevronal hypereksitabilitet6. I tillegg, med fremskritt i differensieringsprotokoller, kan humane induserte pluripotente stamceller (hiPSC) differensieres i regionalt spesifikke nevrale subtyper, inkludert kortikale og ryggmargs hiPSC-A og hiPSC-N 7,8. Disse strategiene gir potensial for modellering av kortikal og spinal motor neuron patologi i ALS samt astrocytisk innflytelse på begge. Dette krever imidlertid at det finnes en reproduserbar funksjonsanalyse for å bestemme disse effektene.

Nylig ble det vist at multi-elektrode array (MEA) opptak er spesielt egnet for elektrofysiologisk karakterisering av nevron-astrocytt kokulturer2. I motsetning til encellede elektrofysiologiske analyser, registrerer disse elektroderadene med høy tetthet passivt ekstracellulære feltpotensialer fra store populasjoner av nevroner uten å forstyrre kulturforhold og bevare cellemembranens integritet. Disse plattformene er spesielt nyttige for registrering av cellulær og nettverksaktivitet av kulturer over tid og som svar på farmakologisk manipulasjon. Til slutt, når tilstedeværelsen av astrocytter er en kulturvariabel, kan MEA-opptak gi funksjonell innsikt i astrocytt-neuron toveis interaksjoner 2,9.

Presentert her er en optimalisert protokoll for differensiering av hiPSC i ryggmargen hiPSC-A og hiPSC-motor neurons (MN) som tidligere har blitt validert2. Ryggmargens hiPSC-A differensieringsprotokoll resulterer konsekvent i astrocyttkulturer, som er positive for S100 kalsiumbindende protein B (S100β), glialfibrillært surt protein (GFAP) og Homeobox B4 (HOXB4) i henholdsvis opptil 80%, 50% og 90% av cellene, noe som indikerer en moden glial- og ryggmargsspesifikasjon 2,10 . HiPSC-MN-differensieringsprotokollen genererer nevroner som er >90% positive for kolinacetyltransferase (ChAT), noe som tyder på en moden alfa-motorneuronidentitet2. I tillegg beskriver protokollen teknikker for generering av hiPSC-A/MN-kokulturer som tidligere er vist å resultere i nevroner med økt morfologisk kompleksitet ved Scholl-analyse og immunfluorescerende mikroskopi sammenlignet med nevronkulturer uten astrocytter eller med gnagerastrocytter2. Selv om disse beskrivelsene er spesifikke for ryggmargs hiPSC-A og hiPSC-N, er en unik fordel at den første uavhengige kulturen av astrocytter og nevroner etterfulgt av trinn til samkultur på senere tidspunkter kan oversettes for å studere effekten av nevron-astrocyttinteraksjoner fra andre spesifikke regioner så vel som sykdomsspesifikke celler 7,8 . Til slutt beskriver protokollen hvordan man kan dyrke disse kulturene på MEA-plater slik at funksjonell aktivitet som en faktor for samkultursammensetning kan studeres over tid med evnen til å manipulere cellulær sammensetning samt kulturforhold.

Målet med disse protokollene er å gi en funksjonell analyse for å undersøke astrocytt-neuron interaksjoner, undersøke sykdomsspesifikke endringer, og teste legemidler med terapeutisk potensial innen ALS. Videoinstruksjoner er gitt for de mest utfordrende trinnene i denne protokollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse av cellekulturmedier

  1. Forbered de enkelte cellekulturmediene ved hjelp av sammensetningene nevnt i tabell 1.
  2. Bland og steril filtrer mediet i 500 ml filtrerte flasker, og oppbevar beskyttet mot lys ved 4 °C i opptil 2 uker.

2. Opprettholde og passere ikke-konfluerende humane induserte pluripotente stamceller (hiPSC)

  1. Tine membranmatrisen i kjelleren (oppbevares i alikoter ved -80 °C) i et kjøleskap på 2-8 °C over natten.
  2. Fortynn kjellermembranmatrisen ved 1:100 (v / v) i kaldfosfatbufret saltvann (PBS) eller Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM).
  3. Tilsett nok matrise av kjellermembran til å belegge bunnen av vevskulturplaten (5 ml for en 10 cm plate, 2 ml for enkeltbrønner med 6-brønnsplate) og inkuber ved 37 °C i minimum 30 minutter over natten eller ved romtemperatur i minimum 1 time.
  4. Aspirer den fortynnede kjellermembranmatrisen og vask platen en gang med PBS før du tilsetter kulturmedier og såceller.
  5. Undersøk platene daglig for å finne og forutse når de er klare til å bli passert. Passasjeplater av hiPSC når flertallet av koloniene har blitt tilstrekkelig tette til at sentrum av koloniene viser spredte hvite områder. Ikke la platene modnes forbi dette punktet. Det vil føre til overflødig differensiering som fører til utseendet til et gult område i sentrum av koloniene på grunn av celle flerlag, overflod av langstrakte celler ved kantene, løs kompaktitet i kolonier eller økt celledød.
  6. På passasjedagen tegner du rutenettlinjer på den nederste ytre overflaten av platene med en markør for å lette nøyaktig dekning av hele platen.
  7. Løsne differensierte kolonier i en kulturhette ved hjelp av et fasekontrastmikroskop (10x forstørrelse) som skrapes manuelt med en 200 μL pipettespiss.
  8. Skyll platene to ganger med PBS (5 ml per vask for 10 cm plater).
  9. Tilsett 5 ml forvarmet vevsdissosiasjonsprotease (materialfortegnelse) og inkuber cellene ved 37 °C til kantene på koloniene begynner å runde opp (4-7 min), men før koloniene løfter seg fra platen.
  10. Aspirer forsiktig dissosiasjonsproteasen. Skyll platen forsiktig to ganger med PBS, og vær forsiktig så du ikke løsner koloniene.
  11. Tilsett 5 ml forvarmet hiPSC-medium (tabell 1) til kulturplaten.
  12. Løft koloniene mens du bryter dem opp i mindre celleaggregater ved å skrape hele platen med spissen av en 5 ml pipette ved hjelp av en frem og tilbake bevegelse fra topp til bunn.
  13. Snu platen 90° og gjenta trinnet ovenfor.
  14. Triturer celleaggregatene forsiktig ved å pipettere opp og ned med en 5 ml pipette og kontroller størrelsen på aggregatene med jevne mellomrom under et mikroskop til flertallet av celleaggregatene er ca. 50-100 celler.
  15. Frø cellen aggregerer i de forhåndsbelagte kjellermembranmatriseplatene, ved hjelp av et ekstra hiPSC-medium for å vaske den originale platen. Samle opp og overfør mesteparten av celleaggregatene til de nye platene ved hjelp av en 5 ml pipette.
    MERK: Hvis protokollen brukes konsekvent, skal originalplaten inneholde iPSC-kolonier som dekker omtrent 50% av kulturoverflaten før passasje. I dette tilfellet bør delingsforholdet være fra en plate til fem nye plater. Dette kan imidlertid måtte justeres avhengig av vekstforholdene og cellelinjespesifikke vekstrater.
  16. Rist de nysådde platene frem og tilbake for å fordele aggregatene jevnt.
  17. Overfør platene til en inkubator (37 °C og 5 % CO2), og la dem stå uforstyrret over natten for å muliggjøre riktig celleadhesjon.
  18. Utfør en komplett middels forandring hver dag med 10 ml hiPSC-medium. Hvis det er overflødig cellulært avfall dagen etter passasje, vask en gang med 5 ml av mediet før medieendring.
  19. Planlegg å passere neste gang hvite områder vises i sentrum av flertallet av iPSC-koloniene (trinn 2.5). Dette vil skje 4-6 dager etter hver passasje.

3. Frysing av hiPSC

  1. Utfør de første trinnene som i trinn 2.5-2.14 for hiPSC-passasje.
  2. Samle celleaggregatene i et 15 ml rør og spinn ved 200 x g i 2 minutter.
  3. Aspirer supernatanten, resuspender pelleten i et frysemedium og overfør til kryorør ved hjelp av en 5 ml pipette.
    MERK: I likhet med passasjetrinnene er det vanlige delingsforholdet en iPSC-plate til fem kryorør, avhengig av tettheten av kolonier. Bruk et totalt volum på 1 ml frysemedium for hvert kryorør.
  4. Plasser kryorørene i en avkjølt kryopreserveringsbeholder og overfør den til -80 °C over natten.
  5. Overfør cellene til flytende nitrogen etter 24 timer.

4. Tining av hisc

  1. Belegg en 10 cm plate med kjellermembranmatrisen (se 2.1-2.3).
  2. Fjern et iPSC-kryorør fra flytende nitrogen og legg det umiddelbart i et vannbad på 37 °C i opptil 2 minutter for å tine raskt. Rist hetteglasset i badekaret til det er delvis tint og inneholder et lite stykke is omgitt av væske.
  3. Overfør celleaggregatene fra kryorøret til et 15 ml konisk rør ved hjelp av en 1000 μL pipette. Tilsett opptil 15 ml forvarmet hiPSC-medium for å fortynne dimetylsulfoksidet (DMSO) i frysemediet.
  4. Sentrifuger det 15 ml koniske røret ved 200 x g i 2 minutter.
  5. Aspirer supernatanten og bruk en 5 ml pipette til å resuspendere cellepelleten i hiPSC-medium inneholdende 20 μM Rho-assosiert kveiledannende protein serin/treoninkinasehemmer (ROCK-I, forbindelse Y-27632) for å unngå ytterligere triturering av celleaggregater.
  6. Overfør celleaggregatene til en kjellermembranmatrisebelagt 10 cm plate ved hjelp av en 5 ml pipette.
    MERK: Hvis protokollen brukes konsekvent, kan celler i ett kryorør overføres til en enkelt 10 cm plate.
  7. Rist platen for å fordele aggregatene jevnt.
  8. Overfør platen til en inkubator og la den være uforstyrret over natten for å muliggjøre riktig celleadhesjon.
  9. Utfør en fullstendig middels forandring dagen etter tining med 10 ml hiPSC-medium uten ROCK-I.

5. Differensiering av hiPSC i ryggmargen nevrale stamceller (NPC)

  1. Sørg for at kjellermembranmatrisebelagte 6-brønnsplater er klare til bruk før differensiering starter.
  2. Start med iPSC som har passert minst én gang og helst to ganger etter tining og med minst fire 10 cm plater (se forklaring i trinn 5.11).
  3. Utfør de første trinnene som i trinn 2.5-2.14 for hiPSC-passasjen.
  4. Overfør celleaggregatene fra minst to 10 cm plater til et 15 ml rør ved hjelp av en 5 ml pipette.
  5. Sentrifuge ved 200 x g i 2 min.
  6. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten med 10 ml hiPSC-medium ved hjelp av en 10 ml pipette, og sentrifuger deretter igjen ved 200 x g i 2 minutter for å løsne celle-til-celle-adhesjonene i hvert aggregat.
  7. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i 1 ml hiPSC-medium inneholdende 20 μM ROCK-I ved hjelp av en 1000 μL pipette.
  8. Pipett opp og ned med en 1000 μL pipette for å triturere celleaggregatene. Kontroller størrelsen på aggregatene under et mikroskop med jevne mellomrom til flertallet av cellesuspensjonen består av enkeltceller eller små aggregater av <10 celler.
  9. Telle cellene med et hemocytometer (foretrukket) eller en automatisert celleteller og beregne celletettheten i cellesuspensjonen.
  10. Plate 3,0 x 10 6 celler i hver brønn av en 6-brønns plate forhåndsbelagt med kjellermembranmatrise. Bruk en 1000 μL pipette for å overføre cellesuspensjonen.
    MERK: Hvis protokollen brukes konsekvent, tilsvarer dette et forhold på to 10 cm plater i en enkelt brønn på en 6-brønn / plate.
  11. Gjenta trinn 5.3-5.10 med en andre batch med to 10 cm plater og plate sluttproduktet i en kjellermembranmatrise belagt brønn av en andre 6-brønns plate. Bruk en 1000 μL pipette for å overføre cellesuspensjonen.
    MERK: Ideell ferdigstillelse av ryggmargens NPC-protokoll krever to brønner lik fire 10 cm plater. For enkel arbeidsflyt, fullfør trinn 5.3- 5.10 med to partier med to plater, hver med sluttproduktet som to separate 6-brønnsplater og hver med en brønn som inneholder 3,0 x 106 celler i den.
  12. Oppretthold det resulterende humane iPSC-monolaget i hiPSC-medium inneholdende 20 μM ROCK-I til sammenløpet når >90 %, vanligvis dagen etter, men ikke lenger enn 3 dager etter første plettering for å unngå spontan (ukontrollert) differensiering.
  13. Hvis differensiering ikke kan startes dagen etter cellebelegg, vask cellene én gang med PBS og bytt medium daglig til et nytt hiPSC-medium inneholdende 20 μM ROCK-I. Hvis det ikke flyter sammen >90% innen 3 dager etter plating, kast cellene og start protokollen på nytt.
  14. Når >90% sammenløp er nådd, start differensieringen. Dette er dag in vitro 1 (DIV1) i differensieringsprotokollen.
  15. På DIV 1, kast hiPSC-mediet inneholdende 20 μM ROCK-I og skyll to ganger med PBS for å fjerne fosterets vekstfaktor (FGF) og transformerende vekstfaktor-beta (TGFβ) som er tilstede i stamcellemediet.
  16. Endre mediet til WiCell-medium (tabell 1) supplert med 0,2 μM LDN193189 (LDN) og 10 μM SB431542 (SB) i 48 timer.
  17. På DIV 3, vask en gang med PBS og bytt medium til WiCell-medium supplert med LDN (0,5 μM) + SB (10 μM) + retinsyre (RA; 1μM) i 48 timer.
  18. På DIV 5, vask én gang med PBS og bytt media til WiCell: Neural induksjonsmedium (NIM) base (tabell 1) (50%:50%, v/v) supplert med LDN (0,5 μM) + SB (10 μM) + RA (1 μM) i 48 timer.
  19. På DIV 7 utfører du middels utveksling med samme medium som i trinn 5.18.
  20. På DIV 8, vask en gang med PBS og bytt medium til WiCell: NIM base (50%: 50%) supplert med RA (1 μM) + puromorfamin (PMN) (1 μM) + Rekombinant human-hjerne-avledet nevrotrofisk faktor (BDNF) (10 ng / ml) + askorbinsyre (ASAC) (0,4 μg / ml) i 48 timer.
  21. På DIV 10 vasker du én gang med PBS og bytter medium til NIM-base (100 %) supplert som nevnt i trinn 5.20 i 48 timer.
  22. På DIV 11 eller 12, belegg en 25 cm2 steril kulturkolbe med kjellermembranmatrise som forberedelse til passasje.
  23. Aspirer mediet fra hver brønn på 6-brønnsplaten l og skyll cellene en gang med PBS.
  24. Tilsett 2 ml 0,05% trypsin i hver brønn og inkuber ved 37 °C i 5-15 minutter; Intermitterende risting av platene kan hjelpe til med celleløsrivelse.
  25. Hvis cellene fortsatt ikke er i oppheng, løsner du mekanisk ved å kaste ut NIM-medier fra en 1000 μL pipettespiss på cellene med en sirkulær bevegelse (sørg for å dekke hele overflaten), eller ved å skrape med en celleskraper (anbefales ikke).
  26. Overfør cellene fra 2 brønner til et 15 ml rør og tilsett trypsininhibitor i passende forhold til mengden trypsin som brukes ved bruk av en 5 ml pipette.
  27. Sentrifuge ved 200 x g i 2 minutter, aspirer supernatanten og resuspender deretter med 10 ml NIM-base ved hjelp av en 10 ml pipette.
  28. Sentrifuger igjen ved 200 x g i 2 minutter for å løsne celle-til-celle-adhesjonene.
  29. Etter det andre sentrifugeringstrinnet, fjern supernatanten og suspender pelleten på nytt med 1 ml NIM-medium (100 %) supplert med RA (1 μM) + PMN (1 μM) + BDNF (10 ng/ml) + ASAC (0,4 μg/ml) og ROCK-I (20 μM). Bruk en 1000 μL pipettespiss til å triturere cellene opp og ned ca. fem ganger til en uklar suspensjon oppnås.
  30. Re-frø aggregatene i dette mediet til kjellermembranmatrisen belagt 25 cm 2 steril kulturkolbe slik at det endelige resultatet er kombinasjonen av cellene fra to brønner på en 6 brønnplate til en enkelt kjellermembranmatrisebelagt 25 cm 2 steril kulturkolbe (2: 1 passasje). Bruk en 1000 μL pipette for å overføre cellesuspensjonen.
    MERK: Cellene skal være >90% sammenflytende på DIV 13, og ingen ytterligere trinn er nødvendig før dag 14. Hvis cellene ikke er sammenflytende, hold ROCK-I i mediet i ytterligere 1 eller 2 dager.
  31. På DIV 14 bytter du medium til ferske NIM-medier + RA (1 μM) + PMN (1 μM) + BDNF (10 ng/ml) + ASAC (0,4 μg/ml).
  32. På DIV 15, endre medium til NIM: Neural differentiation medium (NDM) base (tabell 1) (50%:50%) med RA (1 μM) + PMN (1 μM) + ASAC (0,4 μg/ml) + Supplement B (50x) + BDNF (10 ng/ml) + Gliacellelinjederivert nevrotrofisk (GDNF) (10 ng/ml) + insulinlignende vekstfaktor 1 (IGF-1) (10 ng/ml) + Ciliær nevrotrofisk faktor (CNTF) (10 ng/ml). Bytt med ferske medier annenhver dag.
  33. På DIV 21, bytt medium til NDM base (100%) supplert som i trinn 5.32, og bytt med ferskt medium annenhver dag.
  34. På DIV 25-30, samle NPC og enten fryse dem eller pass dem til en 10 cm plate for terminal differensiering.
  35. Skyll T-25-kolben med PBS og tilsett 0,05% trypsin.
  36. Inkuber i 5 minutter ved 37 °C.
  37. Skyll trypsinet og cellene med NDM-basen og overfør til et 15 ml konisk rør. Tilsett trypsinhemmeren i passende forhold til trypsin og sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter.
  38. Resuspender cellepelleten med motornevron eller astrocyttdifferensieringsmedium (tabell 1) og bruk en 1000 μL pipette til å triturere opp og ned for å oppnå en enkeltcellesuspensjon (vanligvis opptil 5 ganger).
  39. Tell cellene og overfør til en 10 cm platebelagt som beskrevet i avsnitt 6, ved bruk av enten differensieringsmedier +Rock-I, for å skille mellom hiPSC-MN og hiPSC-A.
  40. Alternativt kan du fryse kulturene ved å resuspendere i et frysemedium sammensatt av 90 % NDM-medium med vekstfaktorer (som i trinn 5,32-5,33) og 10 % DMSO, triturere på samme måte og deretter overføre til et kryorør. Aliquot 6 x 106 NPC per kryorør.

6. Tining av NPC-kulturer

  1. Belegg 10 cm plater med polyornitin (PLO) og laminin dagen før tining av cellene.
    1. Tilsett 5 ml PLO fortynnet til 100 μg/ml i PBS eller destillert vann (dH2O) til plater. Inkuber ved 37 °C i minst 1 time opp til over natten.
    2. Aspirer PLO-oppløsningen og skyll platene tre ganger med PBS. (PLO er giftig hvis den ikke vaskes ordentlig.)
    3. Tilsett laminin fortynnet i PBS til en konsentrasjon på 10 μg/ml til PLO-belagte plater. Inkuber ved 37 °C i minimum 1 time, helst over natten. Etter inkubering, aspirer lamininoppløsningen uten å skylle for å øke celleadhesjonen.
      MERK: Platene kan belegges med PLO på forhånd, vaskes tre ganger med vann, tørkes i steril hette og oppbevares ved 4 °C.
  2. Tine ett NPC-hetteglass (dvs. DIV 25 eller 30) som inneholder 6 x 106 celler/hetteglass for hver cellekulturplate på 10 cm.
  3. Fjern NPC-kryorøret fra flytende nitrogen og legg umiddelbart i et vannbad på 37 °C i opptil 2 minutter. Tine raskt ved å riste hetteglasset til det er et lite isstykke omgitt av væske.
  4. Overfør celleaggregater til en 15 ml konisk ved hjelp av en 1000 μL pipette og tilsett opptil 15 ml forvarmet NDM eller Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) / Hams F21 F12-supplement for å fortynne DMSO.
  5. Sentrifuge ved 300 x g i 5 min.
  6. Aspirer supernatanten, resuspender cellepelleten med enten astrocytt- eller MN-differensieringsmedium (tabell 1) + ROCK-I (20 μM) og bruk en 1000 μL pipette til å triturere opp og ned til en enkeltcellesuspensjon oppnås (opptil 5 ganger).
  7. Overfør encellesuspensjonen til en PLO-lamininbelagt 10 cm plate.
  8. Overfør platen til en inkubator og la den være uforstyrret over natten for å muliggjøre riktig celleadhesjon.

7. Differensiering av ryggmargen NPC i motorneuroner

  1. Utfør innledende trinn som nevnt i trinn 6.1-6.8, der det siste mediet er MN-differensieringsmedium + ROCK-I (20 μM).
  2. Dagen etter plating, utfør en fullstendig utveksling av mediet med MN-differensieringsmedium uten ROCK-I, og bytt deretter media annenhver dag. I løpet av helgen, mate celler på fredag og deretter igjen på mandag. Skyll cellene med PBS når det er nødvendig for å fjerne celleavfall.
  3. Endre medium med MN-differensieringsmedium + cytosin arabinosid (ARA-C) (0,02 μM) og inkuber i 48 timer når gliaengasjerte forfedre fremstår som enkeltprolifererende flate celler under postmitotiske MN-forfedre aggregert i celleklynger.
    MERK: Vanligvis skjer dette innen de første 7 dagene etter første plettering, selv om det kan være variabilitet avhengig av cellelinjen.
  4. Etter 48 timer, aspirer mediet som inneholder ARA-C, skyll kulturer forsiktig med PBS tre ganger, og bytt medium til ferskt MN-medium uten ARA-C.
  5. Etter behandling med ARA-C, utfør middels utskifting annenhver dag (eller mandag, onsdag og fredag) ved å fjerne det gamle mediet med en manuell pipette i stedet for en vakuumaspirator for å forhindre for tidlig løsrivelse av nevronklynger. I tillegg berik MN-mediet med Laminin 1 μg / ml en gang i uken for ytterligere å forbedre nevronfestet til kulturplatene.

8. Differensiering av NPC i ryggmargsastrocytter

  1. Tine NPC-kulturer som i avsnitt 6, ved bruk av astrocyttdifferensieringsmedium (tabell 1) med tillegg av føtalt bovint serum (FBS) med volumvolumvolumkonsentrasjon på 1 % (NS + 1 % FBS) samt ROCK-I (20 μM) for plettering.
    MERK: Kommersielt tilgjengelig serumerstatning (tabell 1) kan erstattes med FBS ved bruk av de samme fortynningsfaktorene.
  2. På dagen etter plating, bytt kulturmedium med NS + 1% FBS-medium uten ROCK-inhibitor, og bytt deretter medium annenhver dag. I helgene mater du celler på fredag og deretter igjen på mandag. Skyll cellene med PBS når det er nødvendig for å fjerne celleavfall. Hvis cellene fortsetter å dø, supplere media med ROCK-I (10 μM) for å fremme celleoverlevelse. Vær forsiktig med å bruke ROCK-I for ofte eller for lenge, gitt potensialet til å velge udødelige celler.
  3. La astrocyttene bli sammenflytende før de passerer.
    MERK: Cellestørrelsen vil øke over tid, så det er ikke noe angitt nummer å passere. Det typiske passasjeforholdet er 1:2 eller 1:3. Ved dårlig overlevelse eller passering til for mange plater, kombiner to (eller flere, etter behov) 10 cm plater til en 10 cm plate for å opprettholde samløp.
  4. For å passere astrocytprogenitorkulturer, vask platene en gang med PBS (for å fjerne FBS), inkuber med 0,05% trypsin i 5 minutter, samle cellene i NS-medium + 1% FBS (FBS vil inaktivere trypsin), og sentrifuge deretter ved 300 x g i 5 minutter. Aspirer supernatanten, resuspender cellene i NS-medium + 1% FBS, og triturer deretter til en enkeltcellesuspensjon. Fordel celler i NS + 1% FBS til nye 10 cm plater.
    MERK: I tillegg til å utvide astrocyttkulturer, tjener gjentatt passering av plater formålet med å drepe eventuelle gjenværende stamceller som har valgt en nevronskjebne. Derfor, selv om det ikke er en veldig høy mitotisk hastighet, kan plater passeres i forholdet 1: 1 hvis det ser ut til å være nevronforurensning.
  5. Bytt belegget i løpet av differensieringen for å øke utbyttet som følger.
    1. Plate de opprinnelig tinte NPC-kulturene og de første passasjene etter første plating på PLO / Laminin.
    2. Plate de umodne astrocyttene på kjellermembranmatrisebelagte plater.
    3. Plate mer modne astrocytter (dvs. etter dag 90) på enten kjellermembranmatrise, PLO / Lamininbelagte plater (typisk for samkultur med nevroner), eller på ubelagte plater.
  6. Frys astrocyttprogenitorene når som helst i løpet av 60-dagers modningsperioden for å synkronisere kulturer eller lagre for senere eksperimenter. Når du tiner utover NPC-trinnet, tiner astrocyttprogenitorene på kjellermembranmatrisebelagte plater i stedet for PLO / Laminin.
  7. Ved DIV 90 og deretter bytter du mediet fra NS + 1% FBS til NS + 5% FBS for å fremme astrocytoverlevelse og redusere spredning.

9. Co-culturing MN og ryggmargen astrocytter i multi-elektrode array plater

  1. Differensiere og plate motorneuronene og astrocyttene når de er klare til bruk samme dag og alderen til DIV 60 for motorneuronene og DIV 90 for astrocyttene.
  2. Belegg MEA-platene dagen før eller på dagen for plating som følger hvis du arbeider med 24-brønns plastplater (materialfortegnelse).
  3. Fortynn PLO i vann eller PBS til 100 μg/ml.
    1. Tilsett 15-20 μL til hver brønn (avhengig av pipettekomfortnivå), og danner en dråpe på midten av brønnen som dekker området av elektrodene og omgivelsene, men ikke hele brønnen.
    2. Pass på at du ikke skader elektrodene med pipettespissen. Være konsistent med volum fra brønn til brønn for å sikre dekning av samme overflateareal i hver brønn.
    3. Inkuber PLO ved 37 °C i minimum 1 time (helst 2 timer).
      MERK: De små volumene vil tørke opp hvis det ikke er tilstrekkelig fuktighet i platene. Tilsett vann i rommene rundt brønner for å sikre tilstrekkelig fuktighet i løpet av belegg og opptak.
  4. Aspirer så mye PLO som mulig ved hjelp av en mikropipettespiss av plast. Pass på at du ikke berører elektrodene. Vask med 250 μL vann tre ganger. Hvis du bruker en vakuumsuger til vask, må du ikke la spissen være nær elektrodematrisen. Etter den tredje vasken, fjern så mye vann som mulig ved hjelp av en pipettespiss etter behov. La overflaten tørke under cellekulturhetten med lokket fjernet.
  5. Når plateoverflatene er tørre, tilsett laminin fortynnet til 10 μg/ml i PBS. Bruk 15-20 μL for å dekke hver elektroderade. Tilsett vann i fuktighetsrommene, sett på lokket igjen og sett platen tilbake til 37 °C inkubasjon i minimum 2 timer frem til over natten.
  6. På dagen for plating, skyll MN og astrocyttkulturer en gang med PBS og tilsett trypsin 0,05% ved 37 ° C for å løfte celler (5 min). Samle inn i et 15 ml konisk rør som inneholder trypsininhibitor og vaskeplater med medium eller base for å sikre at alle cellene samles opp. Sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter og resuspenderes med en 1000 μL pipette for å generere 1 ml av en enkeltcellesuspensjon. Ved resuspendering av MN og astrocytter, bytt til kokulturmediet (tabell 1), med tillegg av 20 μM ROCK-I.
  7. Telle MN og astrocytter parallelt ved hjelp av et hemocytometer. Mens du teller og foretar beregninger, setter du tak på celleopphengene og plasserer dem i et isoporstativ ved 4 °C.
  8. Beregn volumet som kreves for å resuspendere kulturene til en konsentrasjon på 5 x 10 4 celler per 5 μL for motorneuroner og 2, 5 x 104 celler per 5 μL for astrocytter. Sentrifuger 1 ml cellesuspensjonene ved 300 x g i 5 minutter og resuspender i beregnet volum.
  9. Beregn antall ønskede brønner som skal sås og multipliser det med 5 μL av hver cellesuspensjon. Kombiner det nødvendige volumet av nevron- og astrocyttsuspensjoner i forholdet 1:1 og bland ved å pipettere til de er grundig kombinert (vanligvis to ganger), men unngå å være for aggressiv.
  10. Fjern lamininet fra hver brønn på MEA-platen ved hjelp av en pipettespiss. Overfør 10 μL av den endelige kombinerte cellesuspensjonen til hver brønn, og danner en liten dråpe som dekker elektrodeoppstillingen for å gi en celletetthet på 5 x 10 4 MN og 2,5 x 104 astrocytter per brønn.
    MERK: Høy celletetthet i den kombinerte suspensjonen krever hyppig resuspendering mellom brønner under såingstrinnet for å sikre nøyaktig og konsistent celletelling.
  11. Sett platene tilbake til inkubatoren i 20-30 minutter. Pass på at du ikke forstyrrer celledråpen og la cellene danne innledende fester på platene.
  12. Etter 20-30 min, tilsett varme samkulturmedier + ROCK-I til hver brønn ved å pipetere 250 μL ned på veggen av hver brønn, etterfulgt av ytterligere 250 μL nedover veggen av samme brønn på motsatt side. Sett platen tilbake til inkubatoren.
  13. Undersøk tallerkener dagen etter såing (Samkulturdag 1). Hvis det er betydelig celleavfall eller døde celler, bytt ut mediet med et friskt samkulturmedium som inneholder ROCK-I. Ellers bytter du medium den andre dagen etter såing (Samkulturdag 2) til samkulturmediet uten ROCK-I. Utfør halvmiddels utveksling (aspirer 50% og tilsett 60% av det endelige volumet for å ta hensyn til fordampning) to ganger i uken.
  14. Hvis du bruker MEA-systemer med enkeltbrønns 30 mm glassplater (materialfortegnelse), kan plateprepareringen ta 2 eller flere dager. Følg trinnene nedenfor for å utføre dette.
  15. Løft cellene og cellerestene fra tidligere MEA-kulturer med 0,05% Trypsin i 5-15 minutter.
  16. Aspirer trypsin og skyll tre ganger med vann.
  17. Steriliser ved å tilsette 70% etanol og rug i hetten i 10 minutter. Aspirer etanolen, og skyll deretter med vann tre ganger.
  18. Påfør 1% anionisk vaskemiddel med proteaseenzym i vann. Dekk platene med et lokk og pakk dem inn med termoplastfilm og aluminiumsfolie, og la dem stå på en vippe ved romtemperatur over natten.
  19. Aspirer vaskemiddelet, og skyll deretter tre ganger med vann.
  20. Hvis du planlegger å lagre platene, tilsett et tilstrekkelig volum vann. Dekk platene med et lokk og pakk dem inn med termoplastfilm og aluminiumsfolie, og la dem stå i kjøleskapet til neste bruk.
  21. Hvis du planlegger å belegge, la overflaten tørke under cellekulturhetten.
  22. Hvis ekstra sterilisering er nødvendig (f.eks. tidligere infeksjon eller ikke-nylig bruk), utsett MEA-platene for ultrafiolett (UV) lys under panseret i 30-60 minutter.
    MERK: Å unngå hyppig UV-lys vil forhindre skade på elektrodene. Bruk av UV-lys når plater har serum på dem vil resultere i ikke-funksjonelle elektroder, og det er derfor det bare skal brukes på rengjorte plater.
  23. Når platene er helt tørre, fortsett med plasmarengjøring i 1 min for å lade glassoverflaten på MEA-plater og forbedre beleggets effektivitet. Plasma rengjør minst en gang hver 4-5 sykluser av MEA plate rengjøring-plating sykluser.
    1. Som et alternativ, når plasmarengjøring ikke er mulig eller ikke berettiget, tilsett et tilstrekkelig volum FBS-holdig medium for å dekke MEA-platenes overflate og returner dem til inkubatoren over natten.
  24. Bruk PLO/laminbelegg som beskrevet ovenfor i avsnitt 6. Tilsett PLO-oppløsning (100 μg i PBS) umiddelbart etter plasmarengjøring eller aspirasjon og skylling av det FBS-holdige mediet.
  25. Plate cellene som ovenfor ved følgende tettheter: 1 x 10 5 hiPSC-A / plate og 5 x 105 hiPSC-MN / plate.

10. Opptak av flere elektroder

  1. Trekk ut råspenningsdataene ved en samplingsfrekvens på 12,5 kHz ved hjelp av et Butterworth-filter med et 200 Hz høypass og 3 kHz lavpassfilter. Sett pigggjenkjenning som øyeblikkelige spenningspunkter ≥6 standardavvik fra grunnlinjen. Identifiser utbrudd som en aktivitet med >5 pigger på 100 ms. Definer nettverksaktivitet når over 35 % av de totale aktive elektrodene fyres av innen 100 ms med minst 50 pigger per nettverksbrudd.
  2. Start innspillingen så snart som mulig etter Co-Culture (CC) dag 1.
    MERK: Elektrisk aktivitet vil sjelden bli notert før CC Day 3.
  3. Plate parallelle kulturer ved lignende tettheter og replikerer i passende kulturplater eller dekkslipp for biokjemiske analyser, immunocytokjemi (ICC) eller qPCR.
  4. Utfør opptak med temperaturen satt til 37 °C ad CO2 ved 5%. Overfør plater til maskinen og la dem balansere i minst 5 minutter før opptak.
  5. Registrer baseline aktivitet enten annenhver dag eller ukentlig, over 1-15 min, avhengig av eksperimentell design. Ikke ta opp i minst 1 time etter en middels utveksling, og vent helst i 24 timer etter hver medieutveksling.
  6. For å unngå kontaminering, bytt medium (dvs. halv middels utveksling som i trinn 9.14) etter opptak der lokket på den sterile platen må åpnes utenfor den sterile hetten (dvs. påføring av legemiddelforbindelser). Utfør komplette middelutvekslinger og vasker for å vaske ut stoffer hvis plater skal fortsette å bli brukt utover narkotikabehandling.
  7. For analyseformål, bruk minst tre tekniske og biologiske replikater for hver tilstand. Ekspress elektrofysiologiske data som middel til n ≥ 3 replikerer.

11. Farmakologiske analyser på multi-elektrode array

  1. Bruk en annen kombinasjon av kokulturer avhengig av det eksperimentelle spørsmålet: ALS-nevroner med kontrollastrocytter, kontrollneuroner med ALS-astrocytter, ALS-nevroner og astrocytter, kontrollnevroner og astrocytter.
  2. Ved undersøkelse av forbigående elektrofysiologiske effekter av forbindelser rettet mot enten nevroner eller astrocytter, registrer baselineaktivitet i minst 1 min med platelokket fjernet, men maskinlokket lukket.
  3. Åpne lokket manuelt på maskinen uten å stoppe det elektrofysiologiske opptaket, og bytt ut 25 mikrol medium med egnet legemiddelkjøretøy (vanligvis ferskt medium) ved hjelp av en flerkanalspipette hvis du behandler flere brønner. Lukk lokket manuelt.
  4. Ta opp i ytterligere 1 min (eller mer hvis det er betydelige kjøretøyinduserte endringer som kulturen trenger å komme seg fra).
  5. Åpne lokket manuelt igjen og bytt 25 μL medium med stoffet av interesse i samme kjøretøy. Lukk lokket på maskinen og fortsett opptaket.
    MERK: Varigheten av registreringen og volumet av legemiddel/kjøretøy som administreres kan variere eller må optimaliseres avhengig av det eksperimentelle spørsmålet.
  6. For analyseformål, sørg for at tilsetningen av kjøretøyet ikke provoserer betydelige endringer i elektrofysiologiske parametere. Beregn prosentvise endringer i aktiviteten etter legemiddel sammenlignet med etter tilsetning av kjøretøy og sammenlign mellom tilstander.
  7. For å undersøke langsgående elektrofysiologiske effekter, for eksempel kandidat sykdomsmodifiserende legemidler, registrere baseline aktivitet skissert i trinn 11.2. Til dette må du enten bruke et kokulturmedium som inneholder stoffet/stoffene som er av interesse for det aktuelle kjøretøyet, eller mediet som bare inneholder kjøretøyet.
  8. For analyseformål, sammenlign tidspunktregistreringene fra ALS eller kontrollkokulturer langsgående behandlet med legemidler med hverandre og kontrollbetingelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ryggmargsmønsterprotokollen for generering av hiPSC-MN og ryggmargshiPSC-A er skissert i figur 1. I denne protokollen opprettholdes og passeres hiPSCer som ikke-sammenflytende kolonier (figur 2A). Neurogenese initieres (nevral induksjon) gjennom dobbel SMAD-hemming ved tillegg av LDN193189 og SB431542, som inaktiverer henholdsvis benmorfogenetisk protein (BMP) og transformerende vekstfaktor-beta (TGF-β) veier. En monolagsbasert metode brukes til dette trinnet hvor hiPSC er belagt på en adherent matrise, dvs. kjellermembranmatrise, for å generere en nevroepitellignende 2D-kultur. Morfologisk er nevral induksjon preget av overgangen fra iPSC med store kjerner og rund form til nevroepiteliale (stam) celler som er tett komprimert, med stor cytoplasma og sylindrisk form. Disse cellene vil dele seg horisontalt så vel som vertikalt, og generere et flerlags epitel (figur 2B,i).

Preferansen for en 2D, i motsetning til en 3D-strategi (dvs. embryoid kroppsbasert), er avhengig av litteraturbevis 11,12 som tyder på at førstnevnte kan fremme ryggmargsmønster ved å introdusere celle-ekstrinsiske miljøsignaler13. Nevroepitelceller blir deretter temporalt og romlig mønstret for å generere regionspesifikke, det vil si ryggmarg, nevrale stamceller (NPC) (figur 1). To viktige morfogener brukes til dette formålet: retinsyre, som bestemmer caudalization, og purmorphamine, en pinnsvin signalagonist, som forårsaker ventral spesifikasjon. I deres fravær ville den celle-iboende regionale identiteten til NPC være rostral og dorsal14,15,16.

Fra DIV 15 til DIV 25-DIV 30 forsterkes den regionale identiteten til disse NPC-ene ved å supplere media med morfogener. Samtidig genererer tidlig eksponering for nevronale vekstfaktorer og et gliogent cytokin som ciliær nevrotrofisk faktor (CNTF) en blandet populasjon av NPC (figur 2B,ii). Morfologisk er disse cellene mindre komprimerte enn nevroepitelceller, og viser få korte prosesser, arrangert i et monolag etter forstyrrelse av søyleepitelet etter passering ved DIV 12. Ved nærmere øyesyn er noen av disse cellene langstrakte, mens andre viser flere prosesser, noe som indikerer tidlig forpliktelse mot henholdsvis en glial vs. nevronskjebne.

Nevroner vil oppstå spontant fra denne blandede populasjonen med mindre den gliogene bryteren aktiveres (figur 1 og figur 2B,iii). Tilsetningen av Notch-banehemmeren, Compound E, vil forbedre lavere MN-differensiering17. Ryggmargsidentiteten til disse cellene støttes av høye nivåer av ChAT-uttrykk (figur 2C,i). I tillegg har det tidligere blitt vist2 at en underpopulasjon av disse motorneuronene også er ISL1+.

Astrocytdifferensiering induseres av den gliogene bryteren gjennom aktivering av JAK/STAT-banen (figur 1 og figur 2B,iv). CNTF og sannsynligvis andre cytokiner inneholdt i føtal bovint serum tjener dette formålet i den foreslåtte protokollen. Tid er også en viktig faktor, siden gliogenese spontant vil følge etter nevronogenese på grunn av celle-iboende ledetråder. Etter DIV 90 viser hiPSC-A en moden fenotype indikert ved S100β og GFAP-uttrykk 2,11, mens ryggmargens regionale identitet støttes av >90 % uttrykk for HOXB4 (figur 2C, ii)2,11,14.

Metoden for samdyrking av hiPSC-MN og hiPSC-A er kjent for samtidig plating av disse cellesubtypene i motsetning til teknikker der nevroner er serielt belagt på toppen av astrocyttkulturer. I disse samtidige kokulturene vil cellene omorganisere seg spontant, med astrocytter som skaper et fôringslag nederst og nevroner som kobles sammen i nettverk øverst (figur 2C, iii). Denne strategien har tidligere vist2 å tillate en mer ensartet fordeling av nevroner enn andre samkulturstrategier, hvor disse celletypene har en tendens til å klynge.

Human iPSC-MN er belagt alene eller i samkultur med hiPSC-A på en 24-brønns MEA-plate (n = 12 per tilstand), hvor hver brønn inneholder 16 elektroder (figur 3A). Fasekontrastbilder av enten mono- eller kokulturer og rasterplott av piggaktivitet fra to representative brønner er vist (figur 3B,C). Human iPSC-A forsterker den elektrofysiologiske modningen av hiPSC-MN, som vist ved signifikant høyere grader av pigging og sprengningsaktivitet i kokulturene (figur 3D). Dette er parallelt med effekten av hiPSC-A på den morfologiske og molekylære modningen av hiPSC-MN som tidligere er demonstrert2.

Noen av de tekniske utfordringene i denne protokollen er beskrevet i videoinstruksjonene, der teknikkene for plating og opptak ved hjelp av MEA-plattformer samt representative opptak fra disse kulturene vises.

Figure 1
Figur 1: Protokoll for generering av ryggmargs hiPSC-MN og hiPSC-A og deres samkultur . (A) Tidslinje for differensieringsprotokollen som beskriver kritiske stadier. I innlegget fokuserer du på 30-dagers protokollen for generering av ryggmargs NPC, med daglige handlinger (E-utvekslingsmedium, P-passasje eller ingen handling), cellekulturbase og kosttilskudd (for ytterligere informasjon om sammensetningen, se tabell 1 og materialfortegnelse). (B) Avstamninger og celleskjebneforpliktelser er skjematisk representert. Kokulturer genereres når modne hiPSC-MN (dvs. DIV 60) og hiPSC-A (dvs. DIV 90) blandes og belegges samtidig. (Illustrasjon laget med BioRender). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Morfologiske forandringer under ryggmargsdifferensieringsprotokollen. (A) Fasekontrastmikroskopbilder av hiPSC. Panelene (i) (lavere effekt, 10x) og (ii) (høyere effekt, 20x) viser normal hiPSC, panelene (iii) (10x) og (iv) (20x) viser en differensiert hiPSC-koloni. Skalastenger = 200 μm og 50 μm. (B) Representative fasekontrastmikroskopbilder av nevroepitelceller ved DIV 5 (i), NPC ved DIV 21 (ii), og modne DIV 60 motorneuroner (iii) og DIV 90 astrocytter (iv). Skalastenger = 100 μm og 50 μm (C) Representative immunocytokjemiske bilder på 40x olje av hiPSC-MN (i), hiPSC-A (ii) og deres samkultur (iii). Modning og regionspesifikke markører var målrettet. Skala bar = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Multi-elektrode array opptak av hiPSC-MN. (A) Varmekart over gjennomsnittlig piggaktivitet fra en enkelt MEA-plate (n = 24 brønner) ved DIV 18 etter plating. Brønner i rad A og B (n = 12 brønner / tekniske replikater) representerer kulturer av hiPSC-MN alene, mens brønner i rad C og D (n = 12 brønner) er kokulturer av hiPSC-MN/hiPSC-A. (B) Representative fasekontrastbilder av hiPSC-MN alene (MN) og i samkultur med hiPSC-A (MN + SCA) på MEA-plater. Nevroner aggregerer i store celleklynger når de dyrkes alene, mens samkulturen av hiPSC-MN med hiPSC-A resulterer i jevnt fordelte monolag. Skalastang = 50 μm. (C) Representativt rasterplott av piggaktivitet over 120 s opptakstid fra en enkelt brønn med hiPSC-MN alene og hiPSC-MN i samkultur med hiPSC-A. Nettverksburstaktivitet på tvers av alle elektroder er uthevet med en lilla boks. (D) Kvantifisering og sammenligning av spiking og sprengningsaktivitet mellom nevroner alene og nevroner i samkultur med astrocytter fra MEA-platen vist i panel A. (*** p < 0,001, **** p < 0,0001). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hittil har hiPSC- og MEA-baserte metoder for elektrofysiologiske registreringer av astrocytt-nevron-kokulturer funnet begrenset anvendelse innen ALS6 og fortsatt ikke i fullt menneskelige plattformer, i motsetning til deres mer utbredte bruk for in vitro-modellering av epilepsi9. Denne plattformen har imidlertid potensial til å ta opp patofysiologisk relevante spørsmål i ALS-forskning, for eksempel mekanismene for nevronal hyperexcitability, astrocyttbidrag til nevrotoksisitet eller rollen som nettverksaktivitet i sykdomsprogresjonen. I tillegg tillater denne plattformen innsamling av prospektive elektrofysiologiske data i over 9 måneder in vitro og gir derfor en tilnærming for testing av forbindelser med terapeutisk potensial2.

Protokoller for generering av hiPSC-N og hiPSC-A funnet i litteraturen varierer mye i forhold til medieforhold, tidspunktet for kulturer, utbytte og modningsprofiler, blant andre faktorer. En stor fordel med den foreslåtte plattformen er at astrocytter og nevroner differensieres separat og dyrkes sammen på senere tidspunkter ved samtidig plating av de to celletypene. Etter optimalisering for celletetthet og timing, kan denne metoden oversettes til å brukes med celletyper avledet fra andre protokoller også, inkludert andre regionspesifikke celler.

Avgjørende for den foreslåtte plattformen er den regionale spesifikasjonen av motorneuroner og astrocytter. Mens den foreslåtte protokollen er ryggmargsspesifikk i sin evne til å generere ChAT + MN og HOXB4 + astrocytter, kan veletablerte differensieringsteknikker brukes til å generere hiPSC-avledede nevroner og astrocytter som viser kortikale identiteter, for eksempel CTIP2 + lag V kortikale motorneuroner18 og OTX2 + forhjerne astrocytter14 . Dermed har den foreslåtte plattformen potensial til å modellere nevrale kretser i cortex og ryggmargen, samt deres forbindelser.

Flere systemer er tilgjengelige for MEA-opptak. Plast 24-brønns MEA-plater med 16 elektroder per brønn med CO2 og temperaturkontroll ble foretrukket for studien. Denne plattformen er spesielt egnet for høy gjennomstrømningsscreening i motsetning til systemer basert på enkeltbrønnopptak. Hovedbegrensningen til plastplater er at overflaten kan være mer utsatt for nedbrytning ved gjentatt bruk. Systemer basert på MEA-plater i glass har fordelen av å kunne gjenbrukes flere ganger etter passende behandlinger som beskrevet ovenfor (opptil 20 ganger), uten betydelig tap av dataregistreringskvalitet. Imidlertid er disse behandlingene og belegningsmetodene mer tidkrevende og teknisk utfordrende, gitt den hydrofobe overflaten til disse platene.

En av de største hindringene for iPSC- og MEA-baserte metoder for elektrofysiologisk registrering er variabiliteten og reproduserbarheten av eksperimentelle funn. Tidligere studier viser at MEA-aktiviteten til nevroner er avhengig av modning som påvirkes av flere faktorer, inkludert, men ikke begrenset til, passende differensieringsteknikker som brukes i genereringen av både astrocytter og nevroner, celletetthet av nevroner, forholdet mellom astrocytter og nevroner gjennom differensiering og modning, sekvens av astrocytt- og nevron-kokulturer2 . Standardisering av disse variablene som foreslått i denne protokollen er en måte å sikre reproduserbarhet på. Valget av multiwell MEA-systemer som genererer data med høy gjennomstrømning vil ta hensyn til eksperimentell variabilitet. Hvis den elektrofysiologiske aktiviteten til en kultur er mindre enn det som forventes på et gitt tidspunkt, er det viktig å fastslå at vellykket differensiering har skjedd og søsterkulturer som kan analyseres immunocytokjemisk eller biokjemisk er nyttige. Gitt at et svært lite volum av celler blir sådd i utgangspunktet, kan små pipetteringsfeil resultere i relativt store endringer i cellenummer og dermed tetthet. Bruk av MEA-plater som muliggjør direkte visualisering og vurdering av celletetthet er også viktig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette manuskriptet ble støttet av følgende: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH/NINDS (CWH), 2020 Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Career Development Award (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). Vi takker Dr. Raha Dastgheyb og Dr. Norman Haughey for å gi MEA-plattformen og dataanalyseprogramvaren vi har brukt for å validere den beskrevne elektrofysiologiske plattformen. Vi vil takke Khalil Rust for deres hjelp med protokolldemonstrasjon og filming.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm sterile culture plates Falcon 353003
25 cm2 sterile culture flasks Falcon 353136
2-Mercaptoethanol (β-ME) Thermofisher 21985023 Working concentration 110 µM
500 mL 0.2 µm CA Filter System Corning 430769
5 mL pipette Falcon 357543
6 well sterile culture plates Falcon 3046
Amphotericine B Gibco 15290018 Working concentration 2.0 μg/mL
Anionic detergent with protease enzyme - Terg-A-Zyme Sigma-Aldrich Z273287 Working concentration 1% m/v
Ascorbic acid (ASAC) Sigma A4403 Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL).
Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W) Axion OPT-24
Axion Edge MEA platform Axion Maestro Edge
Basement Membrane matrix - Matrigel Corning 354277 Details in the protocol
Benchtop microscope (sterile under cell culture hood) Zeiss 415510-1100-000 Primo Vert
Bicuculline Sigma Aldrich 14340 Working concentration10 μM
Ciliary neurotrophic factor (CNTF) Peprotech 450-13 Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
CO2 tanks and regulator for Axion Edge AirGas/Harris 9296NC
Compound E Abcam ab142164 Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM).
Cyanquixaline  (CNQX) Sigma Aldrich C239 Working concentration 50 μM
Dihydrokainic acid (DHK) Tocris 111 Working concentration 50 μM and 300 μM
DMEM/F12 Thermofisher 113300 Working concentration 1x
Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement Thermofisher A1517001 Combine 10 mL of Essential 8 (10x)  supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x)
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermofisher 16140071 Working concentration 1x
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) Peprotech 450-10 Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Hemocytometer Election Microscopy Sciences 63510-20
Heparin Millipore-sigma H3149-100KU Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL).
Humidity controlled Cell culture incubator ThermoFisher 370 set to 37 ºC, 5 % CO2
Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) R&D systems 291-G1-200 Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Kainc acid Abcam ab144490 Working concentration 5 μM
Knockout Serum Replacement (KSR) Thermofisher 10828 Working concentration 1x
Laminin Thermofisher 23017-015 Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media)
LDN193189 Stemgent 04-0074 Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution
L-Glutamine Thermofisher 25030 Working concentration 100x
MEA glass plates MultiChannel Systems 60MEA200/30iR-Ti-gr
Multichannel Pipet P200 Gilson PJ22224
Neurobasal Thermofisher 21103049 Working concentration 1x
Non-Essential Amino Acids (NEAA) Thermofisher 11140050 Working concentration 100x
Pencillin/Streptomycin Thermofisher 15140122 Working concentration 100x
Polyornithine (PLO) Sigma-Aldrich P3655 Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL)
Potassium chloride (KCl) NA NA Working concentration100 mM
Purmorphamine (PMN) Millipore-Sigma 540223 Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM).
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) Peprotech 450-02 Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Retinoic acid (RA) Sigma R2625 Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM).
ROCK-I nhibitor Peprotech 1293823 Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM).
SB431542 Sigma S4317 Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM)
Sterile cell culture hoods Baker Company SG-600
Supplement B - B27 Supplement Thermofisher 21985023 Working concentration 50x
Supplement N - N2 Supplement Thermofisher 17502048 Working concentration 100x
Table top cell culture centrifuge ThermoFisher 75004261 Sorvall Legend X1R
Thermoplastic film - Parafilm PARAFILM P7793
Tissue dissociation protease - Dispase StemCell Technologies 7923 Working concentration 1x
Trypsin Inhibitor Sigma T6522-1G Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL).
Trypsin-EDTA (0.05%) Thermofisher 2530054 Working concentration 1x
Waterbath ThermoFisher 2332 Isotemp

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets. Neuroscience Letters. 755, 135911 (2021).
  2. Taga, A., et al. Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system. Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).
  3. Klapper, S. D., et al. Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks. Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).
  4. Zhao, C., et al. Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology. Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).
  5. Almad, A. A., et al. Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).
  6. Wainger, B. J., et al. Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons. Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).
  7. Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders. Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).
  8. Imaizumi, K., et al. Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).
  9. Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system. Scientific Reports. 8 (1), 10416 (2018).
  10. Haidet-Phillips, A. M., et al. Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment. Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).
  11. Roybon, L., et al. Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes. Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).
  12. Shimojo, D., et al. simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
  13. Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).
  14. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  15. Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
  16. Liu, H., Zhang, S. C. Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).
  17. Borghese, L., et al. Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo. Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).
  18. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).

Tags

Nevrovitenskap utgave 174 multielektrodematrise ekstracellulært opptak screening analyse ryggmarg glia motornevron amyotrofisk lateralsklerose hiPSC motornevronsykdom sykdomsmodellering
Etablering av en elektrofysiologisk plattform for modellering av ALS med regionalt spesifikke humane pluripotente stamcelleavledede astrocytter og nevroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taga, A., Habela, C. W., Johns, A.,… More

Taga, A., Habela, C. W., Johns, A., Liu, S., O'Brien, M., Maragakis, N. J. Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons. J. Vis. Exp. (174), e62726, doi:10.3791/62726 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter