Summary
يقدم هنا بروتوكول لتحديد وإنتاج صور ديناميكية للخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) لتنظيم البلعمة الضامة (MΦ) من جزيئات الخميرة غير opsonized (zymosan) التي يتم اقترانها بجزيء فلوري حساس ل درجة الحموضة.
Abstract
تمت دراسة الخلايا الجذعية الميزنشيمالية (MSC) تقليديا لخصائصها التجديدية ، ولكن في الآونة الأخيرة ، كانت خصائصها المناعية في المقدمة. وهي تتفاعل مع نشاط الخلايا المناعية وتنظمه. ينصب تركيز هذه الدراسة على تنظيم MSC للنشاط البلعوي الضام. الضامة (MΦ) البلعومي هو جزء مهم من استجابة الجهاز المناعي الفطرية للعدوى ، والآليات التي من خلالها تعدل MSC هذه الاستجابة قيد التحقيق النشط. هنا هو وسيلة لدراسة MΦ phagocytosis من الجسيمات غير opsonized zymosan المقترنة جزيء الفلورسنت الحساسة ل درجة الحموضة بينما في الثقافة المشتركة مع MSC. مع زيادة النشاط البلعوسي وانسداد جزيئات الزيموسان المسماة داخل البيئة الحمضية للفسوسوم ، تزداد كثافة الفلورية للجزيء الحساس ل درجة الحموضة. مع الإثارة المناسبة والأطوال الموجية للانبعاثات ، يتم قياس النشاط البلعوسي باستخدام مطياف فلوري ويتم تقديم البيانات الحركية كتغيرات في وحدات الفلورسنت النسبية على مدى فترة 70 دقيقة. ولدعم هذه البيانات الكمية، يتم تصور التغير في النشاط البلعوي باستخدام التصوير الديناميكي. تظهر النتائج باستخدام هذه الطريقة أنه عندما تكون في الثقافة المشتركة ، تعزز MSC الفوسفات MΦ من zymosan غير opsonized من كل من السذاجة وIFN-γ تعامل MΦ. هذه البيانات إضافة إلى المعرفة الحالية لتنظيم MSC من الجهاز المناعي الفطري. ويمكن تطبيق هذه الطريقة في التحقيقات المستقبلية لتحديد الآليات الخلوية والجزيئية الأساسية بشكل كامل.
Introduction
الخلايا الجذعية الميكنشيمالية (MSC) هي خلايا سلفية تؤدي إلى خلايا النسيج الضام. MSC موجودة في أنسجة الثدييات الكبار ويمكن عزلها عن نخاع العظام1. بسبب خصائصها المناعية ، تتم دراسة هذه الخلايا على نطاق واسع2. الدراسات المبكرة التي ركزت على تنظيم MSC من الخلايا التائية3،4،5،6 ولكن في الآونة الأخيرة ، وتنظيمها للخلايا الضامة (MΦ) ، وهو عنصر خلوي رئيسي من الحصانة الفطرية ، وقد تلقت اهتماما متزايدا7،8،9،10،11،12،13،14 . أهمية التفاعل MSC-MΦ في علاج مرض التهابي يؤكده حقيقة أن استنفاد monocytes / الضامة يلغي الآثار العلاجية للMSC في النماذج الحيوانية8. هنا، التركيز هو تفاعل اتصال الخلية من MSC مع MΦ. MSC لديها القدرة على تنظيم النمط الظاهري من MΦ من خلال تعزيز التحول من الاستجابات الالتهابية إلى المضادة للالتهابات، مما يؤدي إلى أنشطة إصلاح الأنسجة8،9،10،11، وقد تم القيام بالكثير لإثبات هذه الآليات التنظيمية. في ظل ظروف أخرى، يمكن أن تدعم MSC أو تفاقم استجابة التهابية مدفوعة MΦ12،13 وتعزيز النشاط البلعوي MΦ14،15. ومع ذلك، هناك نقص خطير في البيانات الموجودة التي تحدد الآليات التي بموجبها والظروف التي تنظم MSC النشاط البلعوي MΦ.
MΦ لديها عائلات المستقبلات التي تعترف إما opsonized (الأجسام المضادة أو تكمل المغلفة) أو مسببات الأمراض غير opsonized مما يؤدي إلى البلعوم16. تفعيل ونشاط هذا الأخير هو أقل دراسة جيدة17. في بيئة غير التهابية في المختبر ، تعزز MSC الفوسفات MΦ من مسببات الأمراض غير opsonized13. ومع ذلك ، يمكن تقليل التعرف على مسببات الأمراض غير opsonized بواسطة MΦ بعد التعرض لبيئة التهابية تنتجها الخلايا الليمفاوية أثناء الاستجابة المناعية التكيفية. IFN-γ، التي أطلقتها الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا الليمفاوية التأثير، له تأثير مثبط على MΦ البلعوم من الجسيمات غير opsonized18. تم تطوير نموذج الثقافة المشتركة لدراسة آليات تنظيم الاتصال المباشر MSC من البلعوس MΦ. الهدف من التجربة المعروضة هنا هو تحديد ما إذا كان MSC ينظم MΦ phagocytosis من مسببات الأمراض غير opsonized بعد MΦ قد تعرضت لIFN-γ (الشكل 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع تقنيات الإعداد المتوسط وزراعة الخلايا في ظل ظروف مطهرة باستخدام خزانة السلامة البيولوجية مع تدفق الصفيحة. يتم تنفيذ جميع خطوات حضانة الثقافة الموصوفة باستخدام حاضنة مصممة للحفاظ على جو من 37 درجة مئوية و 5٪ CO2و 95٪ رطوبة.
1. ثقافة الخلية
- إعداد متوسط النمو
- بالنسبة إلى MSC و LADMAC، أضف 50 مل من FBS و5 مل من مزيج المضادات الحيوية/مضادات الميكويك 100x إلى 500 مل من DMEM عالي الجلوكوز.
- بالنسبة إلى MΦ، أضف 50 مل من FBS، و100 مل من وسيط حالة LADMAC (تم إعداده باتباع خطوات القسم 1.2)، و5 مل من مزيج المضادات الحيوية 100x إلى 500 مل من DMEM عالي الجلوكوز.
ملاحظة: تنتج خلايا LADMAC عامل تحفيز المستعمرة (CSF-1) الضروري لدعم نمو خلايا MΦ.
- إعداد LADMAC المتوسطة مشروطة
- لزرع خلايا LADMAC من المخزون المجمد، أضف 19 مل من متوسط النمو من القسم 1.1 في كل من قوارير معالجة زراعة الخلايا T75 cm2 الخمسة ووضعها في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 15 دقيقة للتوازن إلى 37 درجة مئوية.
- وفي الوقت نفسه، ذوبان سريع واحد aliquot من 106 الخلايا المجمدة عن طريق احتضان في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 2-3 دقائق أو حتى يحصل على إذابة. أضف الخلايا إلى 9 مل من متوسط نمو MSC الطازج في أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مل أو 50 مل وطارد مركزي عند 125 × ز في دوار دلو متأرجح لمدة 5 دقائق.
- أسبيرات أو decant العملاقة، إضافة 5 مل من متوسط النمو الطازج، وماصة بلطف صعودا وهبوطا لإعادة إنفاق بيليه الخلية.
- إضافة 1 مل من تعليق الخلية إلى كل من قوارير T75 cm2 الخمسة باستخدام ماصة مصلية معقمة ووضعها في حاضنة ثقافة الخلية.
- كل يومين إلى ثلاثة أيام، أضف 10 مل إضافية من المتوسط على مدى فترة 7-10 أيام. ثم، جمع الخلايا وsupernatant في أنابيب مخروطية معقمة 50 مل باستخدام ماصة المصلية معقمة والطرد المركزي في 125 × ز لمدة 5 دقائق.
- فصل supernatant من بيليه الخلية ومرشح معقمة supernatant باستخدام وحدة تصفية فراغ 0.2 ميكرومتر عقيمة ذات استخدام واحد.
- إزالة التجميع الطامح من الحزمة والاتصال باستخدام أنابيب فراغ إلى مضخة الطامح. صب supernatant في المقصورة العليا واستبدال الغطاء. قم بتشغيل مضخة الطامح لتصفية في المقصورة السفلية.
- إعداد aliquots عن طريق الأنابيب في أنابيب مخروطية معقمة 50 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية.
- لتجميد بيليه الخلية، وإعادة الإنفاق في المتوسط تجميد في 106 خلية / مل، ووضعها في حاوية تجميد، ومن ثم وضعها في الثلاجة -80 درجة مئوية. بعد 24 ساعة، نقل إلى LN2 التخزين.
- نشر الخلايا استعدادا للثقافة المشتركة
- لزرع خلايا MSC و MΦ من المخزون المجمد ، قم بموافقة 9 مل من متوسط النمو المناسب المعد في القسم 1.1 في كل من الأطباق الأربعة 100 مم من الخلايا المعالجة لكل نوع من الخلايا ومكانها في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 15 دقيقة.
- وفي الوقت نفسه، إذابة سريعة aliquots من 106 الخلايا المجمدة عن طريق احتضان لهم في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 2-3 دقائق أو حتى إذابة فقط. ثم، إضافة خلايا MSC المذابة إلى 9 مل من المتوسط نمو MSC الطازجة وإضافة الخلايا MΦ المذابة إلى 9 مل MΦ الطازجة متوسطة النمو في 15 أو 50 مل أنابيب مخروطية معقمة والطرد المركزي في 125 × ز في الدوار دلو يتأرجح لمدة 5 دقائق.
- أسبيرات أو decant العملاقة وإعادة إنفاق كل بيليه في 4 مل من المتوسط النمو الطازج المناسب عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا. أضف 1 مل من تعليق الخلية إلى كل طبق من الأطباق الأربعة مقاس 100 مم لكل نوع من أنواع الخلايا التي تم تهاونها في الخطوة 1.3.1.
- أعد الأطباق مع الخلايا إلى الحاضنة. تغيير المتوسط كل 2-3 أيام حتى التقاء 70٪-80٪.
2. بذور MSC في الأطباق التجريبية، اليوم 1
ملاحظة: قبل بذر MSC، قم بتصميم تخطيط اللوحة التجريبي 96 جيدا لقياس الطيف الفلوري وشريحة الحجرة للتصوير الديناميكي. بالنسبة للوح 96 بئرا ، يحيط بالآبار التجريبية مع آبار تحتوي على خلايا ولكن لا تستخدمها في المقايسة. وضع علامة على أربعة آبار على الأقل لاستخدامها في الكواشف الفارغة (RBL). راجع الجدول 1 للحصول على مثال قالب 96-well والجدول 2 للحصول على مثال على قالب شرائح غرفة 4-well. يوصى بألواح 96 جيدا بالأبيض والأسود ذات قيعان صافية. شريحة غرفة زجاجية 1.5 ملم borosilicate هو الأمثل، ولكن يمكن تعديل عدد الغرف اعتمادا على تصميم الدراسة. يتم تضمين مخطط تدفق ملخص للأساليب التالية في الشكل 2.
- في التقاء 70٪ -80٪، يستنشق متوسط النمو من الثقافات في أطباق 100 ملم وإضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني لعزل MSC.
- أسبيرات برنامج تلفزيوني، إضافة 2 مل من 0.05٪ تريبسين / EDTA، ووضعه في حاضنة الثقافة لمدة 3-5 دقائق.
- بعد 3 دقائق، تحقق من مفرزة الخلية باستخدام مجهر مقلوب. إذا كانت الخلايا منفصلة، تابع إلى الخطوة التالية؛ إذا لم يكن كذلك، استمر في الحضانة لمدة 1-2 دقيقة أخرى. لا تحتضن أطول من 5-6 دقائق.
- إضافة 5 مل من متوسط النمو الطازج إلى الطبق مع الخلايا المنفصلة. شطف الطبق باستخدام خليط تريبسين / متوسطة وجمع الخلايا في نظيفة, عقيمة 50 مل أنبوب مخروطي باستخدام ماصة المصلية العقيمة.
- جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 125 × ز. أسبيرات العملاقة وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 10 مل من متوسط النمو الطازج عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا.
- لحساب الخلايا، أضف 10 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى 30 ميكرولتر من محلول أزرق ثلاثي الثقب بنسبة 0.4٪ في أنبوب ميكروسينترريفي سعة 1.5 مل. ثم، ماصة 10 ميكرولتر من الخليط تحت غطاء من غرفة عد مقياس الدم.
- باستخدام مجهر حقل مقلوب أو مشرق ، مع هدف 10x ، عد الخلايا غير الملطخة (قابلة للحياة) في أربعة من المربعات 1 مم2. حساب رقم الخلية باستخدام الصيغة: الخلايا / مل = عدد الخلايا / # 1 مم2 المربعات × عامل التخفيف × 104.
ملاحظة: لهذا المثال، عدد المربعات2 مم 1 يتم عد أربعة وعامل التخفيف هو 4. - استخدم المعادلة C1V1 = C2V2 لحساب وإعداد تعليق خلية/مل 1 ×10 5. إعداد 1 مل من تعليق الخلية / مل لكل عمود من لوحة 96 جيدا ليتم شغلها و 0.75 مل لكل غرفة من الشريحة غرفة 4-جيدا ليتم شغلها وفقا لتصميم لوحة.
ملاحظة: C1 = عدد الخلايا، V1 = ما يتم حسابه، C2 = 1 × 105، V2 = 5.50 مل. - تحديد V1، طرح من 5.50 مل المطلوب من إجمالي حجم لتحديد حجم المتوسطة الطازجة اللازمة لإعداد التعليق. أضف حجم الخلايا (V1)من التعليق الأصلي إلى حجم الوسط الطازج بإجمالي 5.50 مل مع 1 × 105 خلايا / مل.
- إضافة 100 ميكرولتر من 1 × 105 تعليق الخلية / مل إلى كل بئر من لوحة 96 جيدا وفقا لتصميم لوحة باستخدام micropipettor متعددة القنوات و 530 ميكرولتر إلى كل بئر من آبار الشريحة الغرفة باستخدام micropipette وفقا لتصميم لوحة. احتضان بين عشية وضحاها.
ملاحظة: لهذه التجربة، يتم طلاء MSC في الأعمدة 1 و 2 و 3 و 6 من لوحة 96 بئرا(الجدول 1)والآبار 1 و 2 من الشريحة غرفة 4-جيدا (الجدول 2). لذلك، يتم إعداد ما لا يقل عن 5.50 مل من تعليق خلية/مل 1 ×10 5. يتم التعامل مع MΦ في التقاء 80٪ مع الوسطاء الالتهابيين في نفس اليوم الذي يتم فيه بذر MSC في الصفائح التجريبية.
3. تفعيل MΦ مع IFN-γ، اليوم 1
- قم بإعداد وسيط التنشيط والأوراق المالية Γ IFN.
- ل200 مل من المتوسط التنشيط, إضافة 40 ملغ من BSA إلى 200 مل من الدم خالية من الجلوكوز عالية DMEM ومرشح معقم باستخدام 0.2 ميكرومتر عقيمة وحدة تصفية فراغ أحادية الاستخدام.
- لإعداد 0.1٪ BSA/ PBS، إضافة 20 ملغ من BSA إلى 20 مل من برنامج تلفزيوني. دوامة لتذوب. استخدمي فلتر حقنة معقمة 0.2 ميكرومتر لتصفيته إلى أنبوب مخروطي نظيف معقم سعة 50 مل.
- إضافة 1 مل من المعقم 0.1٪ BSA/ PBS الحل إلى 100 ميكروغرام من lyophilized IFN-γ لتحقيق 100 ميكروغرام / مل من محلول المخزون. يخزن في 50 ميكرولتر من الأسعار عند -20 درجة مئوية.
- تنشيط MΦ مع IFN-γ
- أضف 2.5 ميكرولتر من 100 ميكروغرام/مل من مخزون Γ IFN لكل مل واحد من الوسط المطلوب. لكل طبق 100 مم ليتم تنشيطه، قم بإعداد 10 مل من وسيط التنشيط الذي يحتوي على IFN-γ بتركيز 250 نانوغرام/مل.
- يستنشق متوسط النمو من الثقافات MΦ واستبداله مع 5 مل من وسيط التنشيط دون IFN- γ لشطف.
- أسبيرات المتوسطة المستخدمة في الشطف واستبدالها مع 10 مل من IFN- γ تكملة وسيطة التنشيط للطبق التجريبي ومع 10 مل من وسيط التنشيط غير المكمل للتحكم. احتضان الثقافات لمدة 16-24 ساعة.
4. عزل MΦ وإعداد الثقافات المشتركة، اليوم 2
- إزالة وسيطة التنشيط من الخلايا MΦ واستبدالها مع 5 مل من متوسط النمو الطازج. كشط بلطف مع رافع الخلية وجمع الخلايا في أنبوب مخروطي 50 مل.
- عد الخلايا باستخدام استبعاد أزرق ثلاثي الريبان والهيموسيكلوميتري كما هو موضح ل MSC في الخطوات 2.6-2.7.
- باستخدام المعادلة في الخطوات 2.8-2.9، قم بإعداد تعليقين منفصلين من 2 × 105 خلايا / مل، واحدة مع خلايا من عنصر التحكم وواحدة مع خلايا من ثقافات MΦ المعالجة.
ملاحظة: إعداد 1 مل من تعليق الخلية/مل لكل عمود من لوحة 96-well ليتم شغلها و0.75 مل لكل غرفة من الشريحة غرفة 4-جيدا ليتم شغلها وفقا لتصميم لوحة. - يستنشق بلطف المتوسطة من الآبار التجريبية من لوحة 96 جيدا التي تحتوي على MSC. باستخدام micropipette متعدد القنوات، إضافة 100 ميكرولتر من المعالجة وتعليق الخلية MΦ التحكم في الآبار التجريبية المناسبة مع وبدون MSC وفقا لتصميم لوحة. احتضان بين عشية وضحاها.
- يستنشق بلطف المتوسطة من الشريحة غرفة 4-جيدا التي تحتوي على MSC، وباستخدام micropipette، إضافة 530 ميكرولتر من تعليق الخلية MΦ إلى الآبار المناسبة وفقا للتصميم. احتضان بين عشية وضحاها.
5. فحص البلعوس ، الفلورسنت الحركي 96-جيدا لوحة قراءة ، اليوم 3
- تعيين معلمات الفحص
- في يوم الفحص، قم بتشغيل قارئ اللوحة الفلورية وحدد الكمبيوتر درجة الحرارة على النظام إلى 37 درجة مئوية.
- افتح برنامج Pro system وتحقق من رمز الأداة في الزاوية العلوية اليسرى لتحديد ما إذا كان الجهاز متصلا بالكمبيوتر. إذا كانت الدائرة الحمراء مع خط مرئية، انقر على أيقونة الصك واختيار الصك في النافذة المنبثقة لإجراء الاتصال.
- حدد تجربة جديدة للوصول إلى الإطار المنبثق "مساعد إعداد لوحة". من القائمة مساعد إعداد لوحة، حدد تكوين إعدادات الاستحواذ الخاصة بك.
- حدد Monochromator من قائمة الإعدادات للتكوين البصري. حدد FL (مضان) لوضع القراءة والحركية لنوع القراءة.
- في نفس نافذة التكوينات، تحت Category، انقر على الأطوال الموجية، ثم قم بتعيين النطاق الترددي إلى 9 نانومتر للإثارة و 15 نانومتر للانبعاثات.
- تعيين عدد أزواج الطول الموجي إلى 1. تعيين الأطوال الموجية LM1 إلى 510 نانومتر للإثارة و 540 نانومتر للانبعاثات.
- تابع الفئات وحدد نوع اللوحة التالي. حدد الخيار الذي يطابق نوع اللوحة المستخدمة.
ملاحظة: من المهم أن الاختيار يطابق نوع لوحة. يتم تعيين ارتفاعات القراءة من قبل النظام وفقا للاختيار. - بعد ذلك، حدد منطقة القراءة وأبرز مساحة اللوحة ذات ال 96 بئرا المضمنة في التصميم التجريبي.
- حدد PMT والبصريات، تعيين PMT كسب إلى عالية ومضات لكل قراءة إلى 6. حدد المربع بجوار القراءة من الأسفل إذا كنت تستخدم لوحة واضحة أسفل.
- حدد التوقيت وحدد فترات زمنية مدتها 10 دقائق على مدى فترة 70 دقيقة.
- حدد اهتزاز، حدد المربع قبل القراءة الأولى، ثم قم بتعيين لمدة 5 s. حدد المربع بين القراءات وتعيين لمدة 3 s. تعيين كثافة اهتزاز لكل من منخفض وخطي.
- أغلق النافذة. عندما تظهر نافذة مساعد إعداد اللوحة، حدد تكوين تخطيط اللوحة. تسليط الضوء على آبار BL من تصميم لوحة وانقر على لوحة فارغة.
- قم بتمييز كل صف من الصفوف التجريبية، وانقر على إضافة، واسم المجموعة، ثم حدد لونا.
- ضمن خيارات التعيين أسفل تصميم اللوحة، حدد سلسلة،ثم حدد السلسلة في النافذة وانقر فوق موافق. كرر لكل مجموعة.
- إعداد تعليق الزيموسان
- أثناء انتظار أن تصل درجة حرارة النظام إلى 37 درجة مئوية ، أعيد إنفاق 1 ملغ من جزيئات الزيموسان في 5 مل من وسيط التصوير بالخلايا الحية.
- أضف 1 مل من وسيط التصوير بالخلايا الحية إلى القارورة التي تحتوي على الجسيمات وجمعها في أنبوب زجاجي. شطف القارورة مع 1 مل إضافية من محلول التصوير ونقلها إلى نفس الأنبوب الزجاجي لضمان نقل جميع الجسيمات. أضف 3 مل من محلول التصوير الإضافي لتحقيق تعليق 0.2 ملغم/مل من الجسيمات.
- دوامة مع نبضات سريعة لمدة 30-60 s. ثم، استخدم سونيكاتور التحقيق ل sonicate مع 60 نبضة سريعة.
ملاحظة: من المهم جدا إنشاء تعليق متجانس للجسيمات وعدم السماح للتعليق بالجلوس لفترة طويلة جدا قبل إضافة إلى الآبار التجريبية. تتجمع تتكرر بسرعة. قد تحتاج كثافة الجسيمات لكل خلية إلى تحسينها حسب مصدر MΦ المستخدمة ومعالجتها وكثافتها. في الدراسات المقدمة، تم استخدام جزيئات الزيموسان المترافقة. ومع ذلك، تتوفر أيضا الإشريكية القولونية المترافقة وS. aureus.
- أثناء انتظار أن تصل درجة حرارة النظام إلى 37 درجة مئوية ، أعيد إنفاق 1 ملغ من جزيئات الزيموسان في 5 مل من وسيط التصوير بالخلايا الحية.
- إضافة zymosan وقراءة لوحة
- يستنشق الوسط من الآبار التجريبية ويشطف 1x ب 100 ميكرولتر من محلول التصوير بالخلايا الحية. شطف آبار RBL مع حل التصوير بالخلايا الحية كذلك.
- يستنشق محلول التصوير بالخلايا الحية من الآبار التجريبية وRBL ويستبدله ب 100 ميكرولتر من تعليق الجسيمات الزيموسان المعد في القسم 5.2.
- افتح درج لوحة قارئ الفلورسنت باستخدام واجهة لوحة اللمس. تعيين لوحة، دون غطاء، في علبة مع بئر A1 في الزاوية اليسرى العليا. أغلق الدرج باستخدام لوحة اللمس وانقر على الزر "قراءة" الأخضر في القائمة العلوية.
- عند اكتمال القراءة، احفظ الملف إلى المجلد المناسب ثم قم بتصدير البيانات بتنسيق جدول بيانات بالنقر فوق ملف وتحديد تصدير.
- حساب متوسط ± SEM الفلورسينس النسبي لكل مجموعة تكرار في كل نقطة زمنية (10 دقيقة، 20 دقيقة، 30 دقيقة، الخ) في جدول البيانات(ملف تكميلي 1)ونقل البيانات إلى برامج الرسم البياني.
- استخدم تنسيق الرسم البياني الخطي لعرض البيانات وتطبيق ANOVA ثنائي الاتجاه (الوقت x العلاج / MSC كعوامل) متبوعا باختبار المقارنات المتعددة ل Tukey لتحديد الاختلافات بين المجموعات الفردية.
ملاحظة: أثناء قراءة لوحة 96 جيدا قيد التقدم، قم بإعداد لوحة التصوير الديناميكية للحصول على صورة الفاصل الزمني. تأكد من أن التصوير الديناميكي يمضي قدما في تحليل بئر تجريبي واحد في كل مرة.
6. فحص داء البلعوس، التصوير الديناميكي، اليوم الثالث
- قم بتشغيل نظام التصوير والكمبيوتر. انقر نقرا مزدوجا لفتح البرنامج. حدد وضع البرنامج Pro.
- تحقق من منطقة المرحلة للتأكد من عدم وجود عينات ولا شيء يعيق حركة المرحلة. ثم انقر على معايرة الآن.
- تحت قائمة الحضانة على الشريط الجانبي على اليمين، حدد المربع بجوار H Unit XL وحدده إلى 37 درجة مئوية.
ملاحظة: انتظر حتى تصبح المرحلة المحتضنة تقريبا إلى درجة الحرارة قبل إعداد العينات للتصوير. - شطف البئر التجريبية الأولى مع 750 ميكرولتر من وسائط التصوير واستبداله مع 400 ميكرولتر من تعليق الجسيمات zymosan أعدت في القسم 5.2. اترك الآبار المتبقية في وسط النمو.
ملاحظة: قد يكون من الضروري دوامة و sonicate تعليق الجسيمات مرة أخرى لفترة وجيزة إذا كان قد استقر لأكثر من 15 دقيقة. - ضع الشريحة على المرحلة المحتضنة من نظام التصوير. تعيين جهاز توقيت لمدة 10 دقيقة.
- استخدم برنامج التصوير، وحدد Brightfield ضمن علامة التبويب تحديد موقع، ثم انقر فوق رمز العدسة في إطار تكوين النظام أدناه. مع الهدف 10x في مكان، واستخدام العدسة ومقبض التركيز للتركيز على الخلايا.
- حدد علامة التبويب Acquisition ، واستخدم القائمة المنسدلة Experiment ، ثم حدد مجموعة من الأطوال الموجية التي تتضمن مجموعة مرشح EGFP لاستيعاب أطوال موجية انبعاث 533 نانومتر من الصبغة الحساسة لHP لاستيعاب 509 نانومتر.
- عندما يكون هناك ~ 2 دقيقة اليسار على جهاز ضبط الوقت ، واستخدام البرنامج لتغيير الهدف إلى 20x عن طريق النقر على رمز 20x في القائمة الهدف.
- انقر على قائمة Channels ، وحدد مرشحات EGFP واستخدم قائمة التعرض لتعيين وقت التعرض إلى 400 مللي ثانية للكشف عن الفلوروفور الأخضر الحساس ل درجة الحموضة بمجرد أن يتم تضمينه في phagolysosome.
- انقر على لايف وضبط التركيز باستخدام مقبض التركيز.
- انقر على إيقاف لإيقاف تشغيل الضوء وحدد المربع بجوار الإعداد التجريبي الفاصل الزمني في الأعلى.
- في القائمة استراتيجية التركيز حدد التركيز التلقائي للبرامج. من القائمة المنسدلة في قائمة التركيز البؤري التلقائي، حدد الإعدادات الذكية والخشنة لتقليل وقت التعرض للضوء أثناء تشغيل التركيز البؤري التلقائي.
- في القائمة الفاصل الزمني، حدد العدد المطلوب من عمليات الاستحواذ إلى 30-60 ووقت الفاصل الزمني إلى دقيقة واحدة.
- بعد تعيين معلمات الفاصل الزمني وبعد 10 دقائق من إضافة الجسيمات إلى البئر الأول ، انقر على زر بدء التجربة لبدء الاستحواذ.
- عند اكتمال عملية الاستحواذ باستخدام البئر التجريبي الأول، كرر الخطوات 6.4-6.12 لكل بئر من الآبار التجريبية المتبقية.
- حفظ كافة ملفات التجربة مع التاريخ والمعلمات في العنوان إلى المجلد المناسب.
- أغلق البرنامج. أعد فتح البرنامج في وضع المعالجة واصدر الملفات بتنسيق MP4 باستخدام قائمة التصدير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد حساب متوسط ± SEM لكل مجموعة في كافة النقاط الزمنية، يتم تقديم البيانات بتنسيق الرسم البياني الخطي مع محور Y ككثافة الفلورسنت النسبية ومحور X كزين. يقدم الملف التكميلي 1 مثالا على البيانات الخام من قراءة حركية للوحة 96 جيدا في شكل جدول بيانات.
في هذه الدراسة، تظهر النتائج المثلى المقدمة في الشكل 3A، والجدول 3 أن 1) الثقافة المشتركة مع MSC يعزز النشاط البلعوي للكافر ، 2) العلاج IFN-y يقلل من نشاط الضامة ، و 3) الثقافة المشتركة مع MSC ينقذ جزئيا النشاط البلعوي MΦ. كثافة الخلايا المثلى حاسمة في هذه الدراسات، وعندما تكون مطلية MΦ في منخفضة جدا من كثافة، لا يمكن الكشف عن التغيرات في كثافة الفلورية(الشكل 3B). يمثل الشكل 3C بيانات من دراسة حيث تم طلاء MΦ عند كثافة عالية جدا ويتم رفع كثافة الفلورسينس بسرعة في جميع المجموعات ، ولا يمكن تمييز الاختلافات. تؤكد مقاطع الفيديو الديناميكية للتصوير أن تغيرات كثافة الفلورسنت ناتجة عن الداء البلعمي وليس تحمض الوسط. كما أنها توفر بيانات نوعية وتمثيلا بصريا لمعدل ومدى النشاط البلعوي(الشكل 4).
الشكل 1:رسم توضيحي يصور السؤال المركزي للبيانات المقدمة، وهو "هل يمكن لهذه المؤسسة استعادة النشاط البلعوي ل IFN-γ تعامل MΦ؟". الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نظرة عامة على الثقافة المشتركة وسير عمل الفحص البلعمي. مخطط لسير العمل للتحليل الكمي والنوعي لنشاط الفوستيتات MΦ في الثقافة المشتركة مع MSC. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:بيانات كمية تمثيلية من إعادة تقديم النتائج المثلى ودون المستوى الأمثل. في (A), البيانات هي ممثلة لتجربة مع كثافة الخلية MΦ الأمثل, في (ب) البيانات هي ممثلة لتجربة مع suboptimal منخفضة جدا كثافة الخلية MΦ, وفي (C), البيانات هي ممثلة لتجربة مع suboptimal عالية جدا كثافة الخلية MΦ. يتم رسم كثافة الفلورسنت النسبية التي تقاس بوحدات الفلورسنت النسبية (RFU) على محور Y، في حين يتم رسم الوقت على المحور X. لاحظ الاختلافات في نطاق RFU بين التجارب المثلى ودون الأمثل. في A, MSC جزئيا إنقاذ MΦ النشاط البلعوي في وضع قمع IFN-γ على مدى فترة 70 دقيقة. يتم تقديم RFU على أنه متوسط ± SEM، n = 6. تم إجراء التحليل باستخدام اختبار المقارنات المتعددة ل Tukey بعد ANOVA ثنائي الاتجاه ، وتأثير التفاعل P = 0.0001 ، وتأثير الوقت P = 0.0001 ، وتأثير العلاج / MSC P = 0.0001. تشير الرموز إلى نتائج اختبارات المقارنة المتعددة. * = الفرق الكبير بين MSC/ MΦ + IFN - γ مقابل MΦ + IFN-γ، Ŧ = الفرق الكبير بين MΦ مقابل MΦ + IFN-γ، † = الفرق الكبير بين MSC/MΦ مقابل MΦ. راجع الجدول 3 للحصول على نتائج مفصلة لاختبارات المقارنة المتعددة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: أشرطة الفيديو التصوير الديناميكي توفير تأكيد مرئي للزيادة في الخلايا المحددة في الفلورسينس من التنشيط الحمضية للجسيمات zymosan المسمى بعد دمجها في phagolysosome MΦ. وكانت إعدادات الفاصل الزمني الحصول على كل 1 دقيقة على مدى فترة 30 دقيقة باستخدام وقت التعرض من 400 مللي ثانية ومجموعة مرشح EGFP. (أ) MΦ في الزراعة الأحادية،(ب)MΦ في الثقافة المشتركة مع MSC،(C)MΦ تعامل مع IFN-γ (250 نانوغرام / مل) و (D) MΦ تعامل مع IFN-γ (250 نانوغرام / مل) في الثقافة المشتركة مع MSC. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| B | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| C | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| D | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| E | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| F | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| G | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| H | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL |
الجدول 1: مثال على تصميم لوحة من 96 بئرا. CBL - خلية فارغة; MSC - المصنف اليوم 1؛ MΦ+ المعالجة و MΦ غير المعالجة البذور اليوم 2; RBL الكاشف فارغة وأضاف في اليوم المقايسة 3.
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ |
الجدول 2: مثال لتصميم الشرائح ذات 4 آبار. MSC - مطلي اليوم 1؛ MΦ+ المعالجة و MΦ غير المعالجة مطلي اليوم 2.
| اختبار المقارنات المتعددة لتوكي | يعني ديف. | 95.00٪ CI من فرق. | تحت العتبة؟ | ملخص | القيمة P المعدلة |
| 0 دقيقة | |||||
| MSC/MΦ مقابل MΦ | -3871 | -9495 إلى 1754 | لا | ns | 0.2836 |
| MSC/MΦ + IFN-γ مقابل MΦ + IFN-γ | 720.3 | -4904 إلى 6345 | لا | ns | 0.9873 |
| MΦ مقابل MΦ + IFN-γ | -77.17 | -5702 إلى 5548 | لا | ns | >0.9999 |
| 10 دقائق | |||||
| MSC/MΦ مقابل MΦ | -3466 | -9091 إلى 2159 | لا | ns | 0.3817 |
| MSC/MΦ + IFN-γ مقابل MΦ + IFN-γ | 2326 | -3299 إلى 7950 | لا | ns | 0.7062 |
| MΦ مقابل MΦ + IFN-γ | 992 | -4633 إلى 6617 | لا | ns | 0.968 |
| 20 دقيقة | |||||
| MSC/MΦ مقابل MΦ | -1311 | -6936 إلى 4314 | لا | ns | 0.9303 |
| MSC/MΦ + IFN-γ مقابل MΦ + IFN-γ | 3315 | -2310 إلى 8940 | لا | ns | 0.422 |
| MΦ مقابل MΦ + IFN-γ | 3146 | -2478 إلى 8771 | لا | ns | 0.4689 |
| 30 دقيقة | |||||
| MSC/MΦ مقابل MΦ | 384.8 | -5240 إلى 6010 | لا | ns | 0.998 |
| MSC/MΦ + IFN-γ مقابل MΦ + IFN-γ | 2313 | -3312 إلى 7937 | لا | ns | 0.7098 |
| MΦ مقابل MΦ + IFN-γ | 8726 | 3101 إلى 14350 | نعم | *** | 0.0005 |
| 40 دقيقة | |||||
| MSC/MΦ مقابل MΦ | 2247 | -3377 إلى 7872 | لا | ns | 0.7278 |
| MSC/MΦ + IFN-γ مقابل MΦ + IFN-γ | 4913 | -712.2 إلى 10537 | لا | ns | 0.1101 |
| MΦ مقابل MΦ + IFN-γ | 16521 | 10896 إلى 22145 | نعم | **** | <0.0001 |
| 50 دقيقة | |||||
| MSC/MΦ مقابل MΦ | 5657 | 32.12 إلى 11282 | نعم | * | 0.0481 |
| MSC/MΦ + IFN-γ مقابل MΦ + IFN-γ | 4932 | -692.9 إلى 10557 | لا | ns | 0.1079 |
| MΦ مقابل MΦ + IFN-γ | 19083 | 13458 إلى 24708 | نعم | **** | <0.0001 |
| 60 دقيقة | |||||
| MSC/MΦ مقابل MΦ | 12376 | 6752 إلى 18001 | نعم | **** | <0.0001 |
| MSC/MΦ + IFN-γ مقابل MΦ + IFN-γ | 9361 | 3736 إلى 14986 | نعم | *** | 0.0002 |
| MΦ مقابل MΦ + IFN-γ | 24748 | 19123 إلى 30373 | نعم | **** | <0.0001 |
| 70 دقيقة | |||||
| MSC/MΦ مقابل MΦ | 13770 | 8145 إلى 19395 | نعم | **** | <0.0001 |
| MSC/MΦ + IFN-γ مقابل MΦ + IFN-γ | 11987 | 6362 إلى 17612 | نعم | **** | <0.0001 |
| MΦ مقابل MΦ + IFN-γ | 27264 | 21639 إلى 32888 | نعم | **** | <0.0001 |
الجدول 3: تحليل إحصائي مفصل للبيانات المعروضة في الشكل 3 أ. نتائج اختبارات المقارنة المتعددة التي أجرتها توكي بعد ANOVA ثنائية الاتجاه كبيرة من البيانات المقدمة في الشكل 3A.
الملف التكميلي 1: ملف جدول بيانات تمثيلي للبيانات الحركية الخام من تجربة مثالية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تحليل البلعوس باستخدام الجسيمات الحيوية المترافقة مع صبغة حساسة ل درجة الحموضة هو أداة جديدة نسبيا التي أثبتت جدواها على الجسيمات التقليدية المسمى الفلورسنت12،19،20. مع الجسيمات التقليدية ذات العلامات الفلورية ، لا يمكن إجراء سوى تحليل نقطة النهاية. يتم الكشف عن طريق المجهر الفلوري و / أو قياس الطيف بعد غسل أو إخماد الجسيمات التي لم يتم تناولها من قبل الخلايا الفرجية. البيانات الكمية المستمدة من قياس الطيف لديها القدرة على الكشف عن الجسيمات غير الغارقة، وتحليل الصور لتحديد الجزيئات داخل الخلايا فقط مملة وتستغرق وقتا طويلا باستخدام أنظمة المجهر الفلورية التقليدية14. الجسيمات الحيوية المترافقة مع الأصباغ الحساسة ل درجة الحموضة الفلورس فقط في بيئة حمضية مثل phagolysosome، وبالتالي، فإن الغسيل مملة وخطوات إخماد غيرضرورية 14. وبالإضافة إلى ذلك، توفر الجسيمات الحيوية ذات التصنيف الحساس لHH ميزة توفير بيانات حركية لا يمكن الحصول عليها بسهولة باستخدام FITC أو غيرها من الجسيمات الحيوية المقترنة بالفلوروفوري.
وقد استخدمت الدراسات باستخدام هذه الأداة الجديدة تدفق قياس الخلايا و / أو منصات التصوير لتوليد قياس كمي وحركي للنشاط phagocyte19،20،21. تدفق قياس الخلايا مفيد إذا كان هناك عدد محدود من الخلايا الكغائية أو إذا كان أحد المهتمين في الفرز لتحليلات المصب مثل الشاشات الوراثية19. ومن المعروف MSC لتنظيم النمط الظاهري MΦ من خلال كل من الاتصال المباشر ومن خلال عوامل قابلة للذوبان. وقد أظهرت الدراسات الأولية أن المتوسطة مشروطة من MSC قمعت MΦ البلعوم، وبالتالي، تم تصميم هذا البروتوكول لتحديد التغيرات في النشاط البلعوم MΦ بينما في الثقافة المشتركة المباشرة مع MSC. في ظل هذه الظروف، قياس الطيف لتحديد كميا والتصوير الديناميكي لتصور وتأكيد النشاط البلعومي هي الأنسب.
حاسم لنجاح هذه الأساليب هو الأمثل لكثافة الخلايا. يجب أن تكون لوحة MSC في كثافة تسمح بالاتصال الأمثل للخلية مع الخلايا MΦ. MΦ تحتاج إلى أن تكون المصنف في الثقافات الأحادية والمشاركة في كثافة التي لا تسمح فقط للاتصال الأمثل ولكن أيضا يسمح للكشف عن الفلورية الأمثل. سوف يؤدي انخفاض الكثافة إلى انخفاض الدمج في التغييرات الفسفورية الصغيرة أو الصغيرة أو المسطحة في وحدات الفلورسنت النسبية(الشكل 3B). إذا كانت البذور MΦ في عالية جدا من الكثافة، يزيد داء البلعم بسرعة، والكشف عن الاختلافات بين المجموعات ملثمين(الشكل 3C). كما أن تحسين تركيز الصبغة الحساسة لحاء الحموضة المسمى جزيئات الزيموسان لكل عدد من الخلايا أمر بالغ الأهمية. وينبغي إجراء التجارب الأولية لتحسين كثافة الخلايا من MSC و MΦ، وعدد الجسيمات لكل خلية MΦ. بالإضافة إلى ذلك، يجب اتخاذ خطوات التحسين هذه إذا تم استخدام الجسيمات الحيوية الأخرى المسماة، مثل الإشريكية القولونية أو S. aureus.
كما أن وسيلة التصوير المناسبة مهمة أيضا. يجب أن تكون الوسيطة لكلا الأسلوبين وسيطة مخزنة مؤقتا ولا يجب أن تحتوي على فينول أحمر. سوف فينول الأحمر كتم الكشف عن انبعاث الفلورسنت. أيضا، أي المضافة أو الشرط الذي يمكن أن تحمض المتوسطة سوف تنشيط قبل الأوان الجسيمات المسمى وإدخال خلفية مرتفعة. الكاشف فارغة أمر بالغ الأهمية لتحديد التحمض المحتمل للوسط.
ليس فقط يمكن استخدام هذه البروتوكولات للتحقيق في تنظيم MSC من البلعوم MΦ من مجموعة متنوعة من الجسيمات الحيوية الحساسة ل درجة الحموضة، ولكن يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على مجموعة متنوعة من نماذج الثقافة المشتركة التي تشمل العدلات وغيرها من الخلايا الخلايا الجرثوسية. بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام هذا النموذج ، يمكن بحث الجزيئات والمسارات المشتبه في تورطها في تنظيم الاتصال الخلوي للنشاط البلعوي الضام عن طريق siRNA أو CRISPR بوساطة أسفل التنظيم للتحقق من صحة أو دحض الأهداف الجزيئية المشتبه بها. وتشمل الأهداف المحتملة جزيئات التصاق، والمستقبلات البلعوسية، وجزيئات إنتيغرين.
العمل باستخدام هذه الأساليب سوف تكشف معلومات جديدة بشأن آليات الإشارات الكامنة وراء زيادة الاستجابات البلعوية من MΦ بعد تفاعلات الاتصال الخلية مع MSC، وبالتالي تعزيز فهمنا للدور الذي تلعبه MSC في تنظيم الحصانة الفطرية. وتتناول دراسات من هذا القبيل مجالا غير مدروس وستسفر عن صورة كاملة عن تأثير لجنة الخدمات البحرية على نشاط الضامة، وهو أمر ضروري لفهم كامل لدورها في الحصانة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يعلنانه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل آلية أداة البحوث الرئيسية التابعة ل NSF في إطار أعداد المنح 1626093 1919583.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Black Polystyrene Microplate | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% trypan blue solution | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 339653 | |
| 4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Imaging System | Zeiss | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Cell lifter | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemocytometer | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Mouse MΦ Cell Line |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1). |
| Live-Cell Imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate | ThermoFisher | P35365 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 micrometer | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher | 25300054 |
References
- Phinney, D. G., Prockop, D. J. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views. Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).
- Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation. Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
- Giuliani, M., et al. Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation. PLoS One. 6 (5), 19988 (2011).
- Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells. Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).
- Luz-Crawford, P., et al. Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65 (2013).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), 10088 (2010).
- Nemeth, K., et al. marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).
- Maggini, J., et al. Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile. PLoS One. 5 (2), 9252 (2010).
- Takizawa, N., et al. marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture. Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).
- Kim, J., Hematti, P. Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages. Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).
- Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56 (2015).
- Cho, D. I., et al. Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages. Experimental Molecular Medicine. 46, 70 (2014).
- Fernandez, N., et al. Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response. Stem Cells International. 2017, 5846257 (2017).
- Jackson, M. V., et al. Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS. Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).
- Chaplin, D. D.
- Lim, J., et al. Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages. Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).
- Wang, Z., et al. Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway. Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).
- Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts. Biotechniques. 68, 245-250 (2020).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Takahashi, D., et al. Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE. Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).
