Summary
Eine Methode zur Extraktion des Cofaktors F420 aus Reinkulturen wurde für die flüssigkeitschromatographische Trennung und Analyse der F420-Schwanzlänge in Reinkultur- und Umweltproben optimiert.
Abstract
Der Cofaktor F420 spielt als Hydridträger eine zentrale Rolle im Primär- und Sekundärstoffwechsel vieler bakterieller und archaealer Taxa. Der Cofaktor ist vor allem für seine Rolle in der Methanogenese bekannt, wo er thermodynamisch schwierige Reaktionen ermöglicht. Da der Polyglutamat-Schwanz zwischen verschiedenen Organismen in der Länge variiert, könnten Längenprofilanalysen ein leistungsfähiges Werkzeug zur Unterscheidung und Charakterisierung verschiedener Gruppen und Wege in verschiedenen Lebensräumen sein. Hier beschreibt das Protokoll die Extraktion und Optimierung der Cofaktor-F420-Detektion durch Anwendung der Festphasenextraktion in Kombination mit einer leistungsstarken Flüssigkeitschromatographie-Analyse unabhängig von kultur- oder molekularbiologischen Ansätzen. Die Methode wurde angewendet, um zusätzliche Informationen über die Expression des Cofaktors F420 aus mikrobiellen Gemeinschaften in Böden, anaeroben Schlämmen und Reinkulturen zu gewinnen und wurde durch Spiking-Experimente bewertet. Dabei gelang es der Studie, unterschiedliche F420-Schwanzlängenprofile für hydrogenotrophe und acetoklastische Methanogene in kontrollierten methanogenen Reinkulturen sowie aus Umweltproben wie anaeroben Fermenterschlamm und Böden zu generieren.
Introduction
F420 ist ein weit verbreiteter, aber oft vernachlässigter Cofaktor, der als obligater Zwei-Elektronenhydrid-Träger in primären und sekundären Stoffwechselprozessen von Archaeen und Bakterien fungiert1,2. F420 ist ein 5-Deazaflavin und strukturell flavin ähnlich, wobei seine chemischen und biologischen Eigenschaften eher mit denen von NAD+ oder NADP+ vergleichbar sind. Aufgrund der Substitution von Stickstoff durch Kohlenstoff an Position 5 des Isoalloxazinrings ist es ein starkes Reduktionsmittel und weist somit ein geringes Standard-Redoxpotential von -340 mV1,3 auf. F420 besteht aus einem 5-Deazaflavin-Ring und einem 2-Phospho-L-Lactat-Linker (F420-0). Ein Oligoglutamatschwanz, der n+1 Glutamatmonomere enthält, kann an das Molekül (F420-n+1)4 gebunden sein.
Lange Zeit wurde der Cofaktor F420 ausschließlich mit Archaeen und Actinobakterien in Verbindung gebracht. Dies wurde weitgehend rückgängig gemacht. Jüngste Analysen ergaben, dass F420 auf verschiedene anaerobe und aerobe Organismen der Phyla Proteobakterien, Chloroflexi und möglicherweise Firmicutes verteilt ist, die eine Vielzahl von Lebensräumen wie Böden, Seen und den menschlichen Darm bewohnen1,5. Im Jahr 2019 zeigten Braga et al.6, dass das Proteobakterium Paraburkholderia rhizoxinica ein einzigartiges F420-Derivat produziert, das ein 3-Phosphoglycerat anstelle eines 2-Phospholactat-Schwanzes enthält, das in verschiedenen Lebensräumen weit verbreitet sein könnte. Innerhalb der Domäne Archaea wurde F420 in mehreren Linien gefunden, darunter methanogenic7, methanotrophic8,9 und sulfatreduzierende Ordnungen10, und soll in Thaumarchaeota11 hergestellt werden. F420 ist am besten als essentielles Redox-Coenzym in der hydrogenotrophen und methylotrophen Methanogenese bekannt. Die reduzierte Form von F420 (F420H2) fungiert als Elektronendonor zur Reduktion von Methylentetrahydromethanopterin (Methylen-H4MPT, Mer) und Methenyl-H4MPT12,13. Es kann auch als Elektronenträger in H2-unabhängigen Elektronentransportwegen von Methanogenen verwendet werden, die Cytochrome enthalten12,14. Darüber hinaus weist die oxidierte Form von F420 eine charakteristische blau-grüne Fluoreszenz bei Anregung bei 420 nm auf, die den mikroskopischen Nachweis von Methanogenen erleichtert (Abbildung 1). Aufgrund seines geringen Redoxpotentials erleichtert F420 (i) die exogene Reduktion eines breiten Spektrums von ansonsten widerspenstigen oder toxischen organischen Verbindungen, (ii) die Synthese von Tetracyclin- und Lincosamid-Antibiotika oder Phytotoxinen in Streptomyceten (Stamm-Actinobakterien) und (iii) die Resistenz gegen oxidativen oder nitrosativen Stress oder andere ungünstige Bedingungen in Mykobakterien (Stamm-Actinobakterien)1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Folglich sind F420-abhängige Oxidoreduktasen vielversprechende Biokatalysatoren für industrielle und pharmazeutische Zwecke sowie für die Bioremediation kontaminierter Umgebungen1,23. Trotz dieser jüngsten Erkenntnisse sind die genauen Rollen des Cofaktors F420 bei Actinobakterien oder anderen Bakterienstämmen noch marginal bekannt.
Es gibt mindestens drei Wege für die F420-Biosynthese2,6,24. Zu Beginn wird der Biosyntheseweg in eine 5-Deazaflavin-Biosynthese und einen 2-Phospholactat-Stoffwechselzweig aufgeteilt. Der reaktive Teil des F420-Moleküls wird über FO-Synthase unter Verwendung der Substrate Tyrosin und 5-Amino-6-Ribitylamino-2,4(1H,3H)-pyrimidindion synthetisiert. Das Ergebnis ist das Riboflavin-Level-Chromophor FO. Innerhalb des derzeit akzeptierten Laktatstoffwechselzweigs wird L-Laktat durch eine L-Laktatkinase (CofB) zu 2-Phospho-L-Lactat phosphoryliert; 2-Phospho-L-lactat wiederum wird durch 2-Phospho-L-Lactat-Guanylyltransferase (CofC) zu L-Lactyl-2-diphospho-5'-guanosin guanyliert. Im nächsten Schritt wird L-Lactyl-2-diphospho-5'-guanosin durch eine 2-Phospho-L-Lactat-Transferase (CofD) mit FO zu F420-02 verknüpft. Schließlich ligat das Enzym F420-0:ɣ-Glutamylligase (CofE) Glutamatmonomere zu F420-0 und bildet den endgültigen Cofaktor6 in unterschiedlicher Anzahl23,25. Verschiedene Organismen zeigen unterschiedliche Muster in der Anzahl der angehängten Glutamatrückstände, wobei kürzere Schwänze für Methanogene gefunden wurden als in Mykobakterien2,25,26. Im Allgemeinen zeigen Methanogene Schwanzlängen von zwei bis drei, mit bis zu fünf im acetoklastischen Methanogen Methanosarcina sp., während die Schwanzlängen in Mycobacterium sp. zwischen fünf und sieben Glutamatresten lagen2,25,26,27. Neuere Erkenntnisse zeigten jedoch, dass langkettiges F420 an F420-abhängige Oxidoreduktasen mit einer höheren Affinität bindet als kurzkettiges F420; Darüber hinaus erhöht gebundenes langkettiges F420 die Substrataffinität, verringert aber die Fluktuationsrate der jeweiligen Enzyme23.
Der Nachweis des Cofaktors F420 basiert oft auf seiner Fluoreszenz. Dabei wurden seine Oligoglutamatderivate mittels Reversed-Phase (RP)-HPLC27,28 getrennt. Kürzlich verwendeten Ney et al. Tetrabutylammoniumhydroxid als Ionenpaarungsreagenz für den negativ geladenen Glutamatschwanz, um die Trennung auf RP-HLPC erfolgreich zu verbessern5. Hier stellen wir eine Methode zur Probenvorbereitung, anschließenden Lyse, Extraktion, Reinigung, Trennung und Quantifizierung des Cofaktors F420 nicht nur aus Reinkulturen, sondern auch aus verschiedenen Umweltproben (d.h. Böden und Faulschlamm) vor.
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Protocol
HINWEIS: Die Extraktion und Analyse von Cofaktor F420 ist ein dreistufiger Prozess, der Probenlyse, Cofaktor-Vorreinigung durch Festphasenextraktion (SPE) und Cofaktordetektion über Ionen-gepaarte RP-HPLC (IP-RP-HPLC) mit Fluoreszenzdetektion umfasst. Bereiten Sie vor Beginn die materialien und Reagenzien gemäß Tabelle 1 vor.
1. Probenlyse
- Geben Sie bis zu 5 g Probe in geeignete Röhrchen (z. B. 50 ml konische Röhrchen).
- 5 ml des Lysepuffers (2x Stammlösung, Tabelle 1) zu den Proben geben.
- Mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 10 mL bringen, um eine Endkonzentration von 0,5 g·ml-1 zu erreichen.
- Wirbeln Sie die verdünnten Proben für 20 s.
- Autoklav für 30 min bei 121 °C.
- Für trockene Proben wie Waldboden nach dem Autoklavieren mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 20 ml bringen und die verdünnte Probe verwirbeln.
VORSICHT: Temperaturanstieg während des Autoklavierens kann dazu führen, dass Schläuche platzen.
2. Vorreinigung des Cofaktors F 420 mittels Festphasenextraktion (SPE)
HINWEIS: Alle Schritte von SPE werden bei Raumtemperatur durchgeführt
- Kühlen Sie die Proben auf Raumtemperatur ab.
- Zentrifugieren Sie die autoklavierten Proben für 5 min bei 11.000 x g.
- Bereiten Sie 5 ml SPE-Säulen vor, die mit 100 mg schwachem Anion-Mixed-Mode-Polymersorbens gefüllt sind.
- Konditionierung des Anionenaustauschers mit 3 ml Methanol (Konditionslösung, Tabelle 1).
- Den Anionenaustauscher mit 3 ml destilliertem Wasser ausgleichen (Gleichgewichtslösung, Tabelle 1).
- Laden Sie bis zu 9,0 ml des Überstandes aus dem zentrifugierten Lysat auf die SPE-Säule.
- Verunreinigungen mit 5 mL 25 mM Ammoniumacetat abwaschen (SPE-Waschlösung 1, Tabelle 1).
- Verunreinigungen mit 5 ml Methanol abwaschen (SPE-Waschlösung 2, Tabelle 1).
- Eluieren Sie den Cofaktor F420 in 1,0 ml Elutionspuffer (Tabelle 1).
HINWEIS: Bereiten Sie frischen Elutionspuffer vor. Aufgrund des aufgebrachten Vakuums und des hohen Dampfdrucks des Elutionspuffers können sich die Elutionsvolumina von Probe zu Probe unterscheiden. Um das gleiche Endvolumen in allen Proben zu sichern, empfiehlt es sich, die Auffanggefäße vor und nach der Elution zu wiegen und das effektive Elutionsvolumen zu berechnen. Gleichen Sie die Differenzen durch Hinzufügen von Elutionspuffer aus.
3. Nachweis des Cofaktors F420
- Stellen Sie den Ofen auf 40 °C und den Fluoreszenzdetektor auf 420 nm Extinktionswellenlänge und 470 nm Emissionswellenlänge. Erreichen Sie die Trennung über den Gradientenmodus mit den mobilen Phasen A und B (Tabelle 1): 0-3 min: 26% B; 3-24 min: 26%-50% B; 24-25 min: 50% B; 25-27 min: 50%-26% B; 27-35 min: 26% B bei einem Durchfluss von 0,75 ml·min-1.
ANMERKUNG: Gewährleisten Sie das Gleichgewicht der Spaltenbedingungen vor dem Einspritzen von Proben, indem Sie die Säule mindestens mit 3 Spaltenvolumina von 74 % mobiler Phase A und 26 % mobiler Phase B spülen (Tabelle 1).- Filtern Sie die eluierten Proben aus der SPE mit einem PTFE-Filter mit einer Porengröße von 0,22 μm in HPLC-Fläschchen.
HINWEIS: PTFE-Filter mit einer Porengröße von 0,22 μm werden empfohlen. - 50 μL der eluierten Probe in das HPLC-System injizieren, um die Zusammensetzung und Konzentration des Cofaktors F420 zu analysieren.
HINWEIS: Da in diesem Protokoll kein quantitativer Standard verwendet wird, müssen Proben und Varianten nach Peakfläche verglichen werden.
- Filtern Sie die eluierten Proben aus der SPE mit einem PTFE-Filter mit einer Porengröße von 0,22 μm in HPLC-Fläschchen.
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Representative Results
Reinkulturen von Methanosarcina thermophila und Methanoculleus thermophilus, beide thermophile methanogene Archaeen, wurden wie zuvor beschrieben in geeigneten Medien gezüchtet29,30. Für Methanosarcina thermophila wurde Methanol als Energiequelle verwendet, während Methanoculleus thermophilus auf H2/CO2 gezüchtet wurde. Das Wachstum wurde durch mikroskopische Auswertung überprüft, während die Aktivität durch Messung von Methan (CH4) mittels Gaschromatographie wie zuvor beschrieben untersucht wurde31. Für die Extraktion des Cofaktors F420 wurden Reinkulturen gemäß dem vorgestellten Protokoll verwendet. Darüber hinaus wurden im Herbst 2020 Umweltproben mit Proben aus einem mesophilen Biogasreaktorschlamm (Kläranlage, Zirl, Österreich; Details zu Den Schlammparametern siehe 32), einer landwirtschaftlich genutzten Wiese (Innsbruck, Österreich) und Waldböden (Lans, Österreich) für die Extraktion und Analyse des Cofaktors F420 entnommen.
Das Wachstum von Reinkulturen wurde durch Mikroskopie nachgewiesen (Abbildung 1), wobei das produzierte CH4 während 14 Tagen Inkubation mittels Gaschromatographie analysiert wurde (Daten nicht gezeigt). Die Effizienz der Cofaktor-F420-Extraktion aus Reinkulturen wurde unter Anwendung verschiedener Zerfallsstrategien getestet: Schlagen mit 0,5-1,0 mm Keramikschlägen, Ultraschallbehandlung und Druck-Temperatur-Zerfall mit 121 ° C und 1,2 bar Druck (Autoklavieren). Die maximale Extraktionseffizienz zeigte sich bei einer Druck-Temperatur-Behandlung unter Anwendung eines Puffers, wie im Protokollabschnitt beschrieben, und wurde somit für alle nachfolgenden Experimente weiter angewendet (Abbildung 2). Extraktionseffizienztests wurden durch Standardzugabe verschiedener Volumina einer gut wachsenden Methanoculleus-Thermophiluskultur durchgeführt. Darüber hinaus basierte der Vergleich verschiedener Proben und Varianten auf der Peakfläche aus Chromatogrammen.
Anschließend wurden Zellextrakte einem Festphasenextraktionsverfahren (SPE) unterzogen. Dazu wurden verschiedene Ionenaustauscher getestet. Es stellte sich heraus, dass ein schwaches Polymersorbens mit gemischtem Modus die höchste Menge an Cofaktor F420 nach Elution ergab. Darüber hinaus wurden verschiedene Elutionspuffer und Waschlösungen getestet und zeigten die besten Ergebnisse für 25 mM Ammoniumacetat als Waschpuffer und eine Mischung aus NH3 in Methanol als Elutionspuffer. Methanol aus dem Elutionsschritt könnte nach der Elution über eine Vakuum-Temperatur-Behandlung mit Wasser ausgetauscht werden.
Die HPLC-Analyse des Cofaktors F420 wurde mit verschiedenen C18-Säulen getestet, wobei die besten Ergebnisse für die Systemkonfiguration während der vorgestellten Studie mit einer NX C18-Säule erzielt wurden. Ein Standard, der eine bekannte Verteilung von F420-Derivaten mit unterschiedlicher Glutamatschwanzlänge enthielt, wurde zu Referenzzwecken verwendet. Dieser Standard wurde freundlicherweise von Prof. Colin Jackson von der Australian National University zur Verfügung gestellt. Die Analyse der Glutamatschwanzlänge ergab Unterschiede in der Gesamtkonzentration des Cofaktors F420 und der Verteilung der F420-Schwanzlänge von methanogenen Reinkulturen und Umweltproben (Abbildung 3).
| Puffer | Zusammensetzung |
| Lysepuffer (2x Stammlösung) | 200 mM Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) 50 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) 1% (w/v) Polysorbat 80 (Tween 80) eingestellt auf pH 7,0 mit 5 M Natronlauge |
| SPE-Konditionierungslösung | Methanol (HPLC-Qualität) |
| SPE-Äquilibrierungslösung | Destilliertes Wasser 0,2 μm filtriert |
| SPE Waschlösung 1 | 25 mM Ammoniumacetat |
| SPE Waschlösung 2 | Methanol (HPLC-Qualität) |
| SPE Elution Puffer | 2% (v/v) Ammoniak in Methanol durch Verdünnen von 20%–25% wässriger Ammoniaklösung in Methanol |
| HPLC mobile phase A | 10 mM Tetrabutylammoniumhydroxid (TBAH) 20 mM Di-Ammoniumhydrogenphosphat ((NH4)2HPO4) eingestellt auf pH 7,0 mit 85% Phosphorsäure |
| HPLC mobile phase B | Acetonitril (HPLC-Qualität) |
Tabelle 1: Puffer- und mobile Phasenzusammensetzung für die Festphasenextraktion (SPE) und HPLC-Analyse.
Abbildung 1: Fluoreszierende methanogene Reinkultur. Visualisierung von Methanosarcina thermophila mittels (A) Phasenkontrastmikroskopie und mittels (B) Fluoreszenzmikroskopie, wenn der Cofaktor F420 mit UV-Licht angeregt wird (Anregung bei 395-440 nm und Emission bei 475-495 nm). Maßstabsbalken: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Standardaddition. Spitzenfläche des gewonnenen Cofaktors F420 nach SPE aus 1,0 g Matrix, die mit unterschiedlichen Volumina von M. thermophilus-Kulturen versetzt war. Die Matrix wurde mit 0 μL, 250 μL, 500 μL, 750 μL und 1000 μL Kultur modifiziert und verschiedenen Zerfallsstrategien unterzogen: Schlagschlag, Ultraschallbehandlung und Druck-Temperatur-Zerfall (Autoklavieren). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Glutamat-Schwanzlängenverteilung. Cofaktor F420 Schwanzlängenverteilung von Reinkulturen und Umweltproben. Von oben nach unten: landwirtschaftlich genutzte Wiese (Erde), Wald (Boden), mesophiler Biogasreaktor, Reinkultur von M. thermophilus und Reinkultur von M. thermophila. Die relative Absorption wurde durch Normalisierung auf den höchsten Peak innerhalb des gezeigten Chromatogramms berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Zur Beurteilung des Cofaktors F420 aus methanogenen Reinkulturen kann eine mikroskopische Auswertung durchgeführt werden, um das Wachstum und die Aktivität (Fluoreszenzmikroskopie) der beteiligten Mikroorganismen sichtbar zu machen (Abbildung 1). Für Proben aus natürlichen Umgebungen ist die Verwendung der Mikroskopie zum Nachweis oder zur Quantifizierung von F420 aufgrund von Interferenzen mit anderen fluoreszierenden Mikroorganismen, organischen und anorganischen Partikeln begrenzt. In diesem Zusammenhang kann die Extraktion von F420 und die anschließende fluorometrische Analyse mittels HPLC, wie zuvor beschrieben5, nicht nur Informationen über die Gesamtkonzentration des Cofaktors F420 , sondern auch über die Polygutamat-Schwanzlängenverteilung liefern.
Für die Extraktion des Cofaktors F420 erwies sich eine Druck-Temperatur-Behandlung als hochwirksam (Abbildung 2) und entspricht den bisherigen Befunden5,27,33. Über diese Methode und unter Anwendung eines Phosphatpuffer-Lysesystems einschließlich EDTA und Polysorbat wurden die höchsten Konzentrationen des Cofaktors F420 aus methanogenen Reinkulturen erhalten, die hohe Konzentrationen des Faktors enthielten. Darüber hinaus (und im Vergleich zu den anderen getesteten Zellaufschlussmethoden) ist die Druck-Temperatur-Behandlung leicht anwendbar und materialsparend.
SPE wurde durchgeführt, um eine nachgeschaltete HPLC-Analyse zu ermöglichen, die auf die Bestimmung der Cofaktor-F420-Polyglutamat-Schwanzlängenverteilung innerhalb einer Probe abzielt. Unter den verschiedenen Ionenaustauschern zeigte ein schwaches Polymersorbens mit gemischtem Modus die beste Leistung und ermöglicht eine effektive Bindung des Cofaktors F420 an die Matrix zu Waschzwecken sowie dessen anschließende Entfernung aus der Extraktionsmatrix nach dem Abwaschen unerwünschter Nebenprodukte. Zu diesem Zweck erwies sich Basismethanol als am besten.
Mit der vorgestellten Methode konnten verschiedene Reinkulturen und Umweltproben reproduzierbar hinsichtlich des Cofaktors F420 analysiert werden (Abbildung 3). Auch Proben wie Böden oder Schlämme, die hohe Anteile unerwünschter Nebenprodukte enthielten, konnten mit dem vorgestellten Verfahren analysiert werden. Daher wurde die nachgeschaltete Analyse mittels HPLC erfolgreich zur Analyse der Gesamtkonzentration von F420 und der Längenverteilung der Polyglutamatschwänze von F420-Derivaten durchgeführt. Der Nachweis hoher F420-Spiegel im Boden und anderen Proben unterstützt Ney et el.5, die vorschlugen, dass der Cofaktor in aeroben Bodenbakterien auf der Grundlage genomischer und metagenomikischer Analysen weit verbreitet ist.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dies das erste Protokoll ist, das darauf abzielt, den Cofaktor F420 nicht nur aus Reinkulturen, sondern auch aus Umweltproben wie Boden oder Schlamm zu extrahieren und zu analysieren. Der kritischste Schritt bei der Extraktion von F420 aus Umweltproben ist die SPE, die für die Vorreinigung von Lysaten für die anschließende HPLC-Analyse benötigt wird. Das vorgestellte Protokoll wird für zukünftige Projekte hilfreich sein, um die Rolle von F420 in verschiedenen Umgebungen und Bioprozessen zu enthüllen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Wir danken Prof. Colin Jackson für die Unterstützung mit gereinigtem Cofaktor F420. Diese Forschung wurde vom Tiroler Wissenschaftsfonds (TWF) und der Universität Innsbruck (Publikationsfonds) unterstützt. Wir danken der Unterstützung von GPS, HK, SB, GG und HB sehr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | |||
| Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector | Shimadzu | HPLC system | |
| Centrifuge and rotor for 50 mL “Falcon” tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes | |||
| HPLC Column: Gemini NX C18, 5 μm, 150 x 3 mm | Phenomenex | HPLC column | |
| PTFE filter (pore size 0.22 µm) to remove particulate matter prior HPLC analysis | |||
| Resin for SPE: Strata-X-AW 33 μm as weak anion mixed-mode polymeric sorbent | Phenomenex | weak anion mixed-mode polymeric sorbent | |
| Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes | SPE equipment | ||
| Vortex mixer |
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