Summary
En protokoll er gitt for å sette opp et standard konfokalt laserskanningsmikroskop for in vivo Förster-resonansenergioverføringsmålinger, etterfulgt av dataevaluering.
Abstract
Sensibiliserte utslippsbaserte Förster resonansenergioverføringseksperimenter (FRET) gjøres enkelt, men avhenger av det mikroskopiske oppsettet. Konfokale laserskanningsmikroskoper har blitt en arbeidshest for biologer. Kommersielle systemer gir høy fleksibilitet i lasereffektjustering og detektorfølsomhet og kombinerer ofte forskjellige detektorer for å oppnå det perfekte bildet. Sammenligningen av intensitetsbaserte data fra forskjellige eksperimenter og oppsett er imidlertid ofte umulig på grunn av denne fleksibiliteten. Biologvennlige prosedyrer er til fordel og gir enkel og pålitelig justering av laser- og detektorinnstillinger.
Videre, ettersom FRET-eksperimenter i levende celler påvirkes av variasjonen i proteinuttrykk og donor-akseptorforhold, må proteinuttrykksnivåer vurderes for dataevaluering. Beskrevet her er en enkel protokoll for pålitelige og reproduserbare FRET-målinger, inkludert rutiner for estimering av proteinuttrykk og justering av laserintensitet og detektorinnstillinger. Dataevaluering vil bli utført ved kalibrering med en fluoroforfusjon av kjent FRET-effektivitet. For å forbedre enkelheten har korreksjonsfaktorer blitt sammenlignet som er oppnådd i celler og ved å måle rekombinante fluorescerende proteiner.
Introduction
Förster resonansenergioverføring ((F)RET) observeres vanligvis ved fluorescensspektroskopi, selv om selve prosessen ikke er begrenset til å forekomme mellom fluoroforer. Den underliggende dipol-dipolkoblingen krever ganske enkelt et lysemitterende donormolekyl og en lysabsorberende akseptor. Dette er avledet fra den nødvendige spektral overlapping integrert J av normalisert donor utslipp og akseptor absorbans spektra1. Men fordi RET konkurrerer med fluorescens, blir energioverføringen målbar ved endringer i fluorescensutslipp: RET induserer donorslukking og sensibilisert akseptorutslipp.
Fluoroforbasert RET har blitt kalt fluorescensresonansenergioverføring (FRET) for å skille den fra bioluminescensresonansenergioverføring (BRET). RET avhenger sterkt av avstanden mellom donor og akseptor, som er mye i området 0,5-10 nm2 og dermed i samme område som dimensjonene til proteiner og deres komplekser. For det andre avhenger RET av dipol-dipole orientering kappa kvadrert. Kombinert med det faktum at rotasjonsfrihet av proteinbundne fluoroforer kan overses på grunn av molekylvekten og den langsomme rotasjonsavslapningen, tillater RET analyse av konformasjonsendringer3.
Den såkalte Förster-radiusen er basert på den spektrale overlappingsintegralen og bølgelengdeområdet til overlappingen, slik at røde lysabsorberende kromoforer resulterer i lengre Förster radier enn blå lysabsorberende fargestoffer. Siden det dynamiske spekteret av FRET-målinger er begrenset med 0,5 × R0 og 1,5 × R0, har FRET-paret ECFP-EYFP et dynamisk område på 2,5-7,3 nm på grunn av R0 på 4,9 nm4.
Lysstyrken til en fluorofor er gitt av produktet av sin molar utryddelseskoeffisient og kvanteutbyttet. For FRET-målinger er det fordelaktig å velge fluoroforer med nesten lik lysstyrke. Dette forbedrer påvisning av donorslukking og sensibilisert akseptorutslipp. Det favoriserer også kalibrering av mikroskopisystemet. Ser vi på de ofte brukte FRET-parene cyan og fluorescerende proteiner, blir den nedre lysstyrken til de cyan fluorescerende proteinene åpenbar (figur 1A).
Imidlertid må akseptørens levetid være lavere enn giverens levetid, noe som sikrer tilgjengeligheten av akseptoren for energioverføring. Hvis akseptørens levetid overstiger giverens levetid, kan akseptoren fortsatt være i spent tilstand når giveren er spent igjen. Avanserte cyan fluorescerende proteiner som mTurquoise viser forlenget levetid og bidrar dermed til økt sannsynlighet for FRET (figur 1B). Sannsynligheten for FRET avhenger også av akseptorens molarutryddelseskoeffisient.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: For følgende protokoll ble forbigående transfeksjon av protoplaster utført, som beskrevet tidligere12. En kort beskrivelse er gitt nedenfor.
1. Forbigående transfeksjon av protoplaster
- Klipp ~ 4 g sunne blader av Arabidopsis thaliana ecotype Columbia i 1 mm skiver og overfør dem til 20 ml enzymoppløsning (1,5% cellulase; 0,4% macerozyme; 0,1% bovint serumalbumin Fraction V; 0,4 M mannitol; 20 mM KCl; 20 mM 2-(N-morpholino)etanesulfonsyre (MES), pH 5,7; 10 mM CaCl2).
- Vakuum-infiltrere bladskivene etterfulgt av en inkubasjon med agitasjon i 2 timer ved romtemperatur. Høst cellene ved sentrifugering i 3 min ved 100 × g.
- Vask protoplastene med W5-oppløsning (154 mM NaCl; 125 mM CaCl2; 5 mM KCl; 2 mM MES, pH 5,7) og resuspend dem i MMG-oppløsning (0,4 M mannitol; 15 mM MgCl2; 4 mM MES, pH 5,7).
- Utfør transfeksjonen i et 8-brønns lysbilde med osmotisk støt i nærvær av polyetylenglykol (PEG) 4000. Bland 20 μL av protoplastfjæringen med 5 μL plasmid DNA (5 μg/μL) og 25 μL PEG-oppløsning (0,2 M mannitol, 0,1 M CaCl2, 40 % PEG 4000).
- Snu det osmotiske sjokket ved forsiktig justering av de osmotiske forholdene.
MERK: I tillegg til utvalget av interesse, er uttrykket av donor alene og akseptor alene nødvendig for å bestemme spektralblødning av henholdsvis giveren og akseptøren. Et fusjonsprotein av donoren og akseptoren må også uttrykkes for kalibreringsformål. Det fluorescerende proteinuttrykket var under kontroll av et blomkålmosaikkvirus 35S-promotor (pCaMV35S). For alle målinger ble det brukt to kondokale laserskanningsmikroskoper (LSM1 og LSM2). LSM1 har to typer detektorer: for FRET-målinger ble donorsignalet oppdaget av en GaAsP-detektor, mens FRET og akseptorutslipp ble registrert med en fotomultiplier. LSM2 har to fotomultipliseringer, som ble brukt til påvisning av donor-, FRET- og akseptorutslipp.
2. Laserjustering
MERK: Her er det brukt 458 nm og 514 nm linjer med argon-ion-laser for FRET-analyse mellom forbedret cyan fluorescerende protein (ECFP) - og forbedret gult fluorescerende protein (EYFP)-merkede proteiner. For reproduserbar datainnsamling ble begge linjene justert til tilsvarende intensitet. Dette ble oppnådd av enten en overføring fotomultiplier eller refleksjonsmodus.
- Laserjustering med en transmisjonsfotomultiplier
- Bruk en tom brønn for justering.
- Velg linjeskanningsmodus og histogramvisning.
- Reduser laserintensiteten til et minimum, og juster detektorforsterkningen til påviselig bakgrunnsstøy.
- Øk laserintensiteten i trinn på 0,5% og registrer det tilsvarende signalet.
- Påfør rutinen for begge laserlinjene.
- Laserjustering med refleksjonsmodus
- Bruk en tom brønn for justering.
- Bruk et gjenspeilingsfilter, slå på gjenspeilingsmodus, hvis tilgjengelig.
- Kontroller at detektorbølgelengdeområdet dekker laserens bølgelengde.
- Velg linjeskanningsmodus og histogramvisning.
- Reduser laserintensiteten til et minimum, og juster detektorforsterkningen til påviselig bakgrunnsstøy.
- Flytt målsettingen til laveste posisjon.
- Flytt målet opp til refleksjonen av dekslene er synlig.
- Øk laserintensiteten i trinn på 0,5% og registrer det tilsvarende signalet.
- Påfør rutinen for begge laserlinjene.
- Evaluering av data
- Tabuler dataene og sorter dataene etter signalintensiteter.
- Plott signalintensitetene mot den relative laserkraften.
- Velg laserintensiteter som resulterer i lignende signalintensitet.
3. Justering av fotomultipliers
MERK: Etter laserjustering ble fotomultipliserne justert til individuelle gevinster for å oppnå lignende følsomhet. Denne kalibreringen ble gjort med 514 nm laserlinje, som er i sentrum av bølgelengdeområdet av interesse.
- Bruk en tom brønn for justering.
- Bruk et gjenspeilingsfilter, og bytt til gjenspeilingsmodus hvis tilgjengelig.
- Kontroller at detektorbølgelengdeområdet dekker laserens bølgelengde (514 nm).
- Velg linjeskanningsmodus og histogramvisning.
- Reduser detektorforsterkningen til halvparten av maksimumet, og juster laserintensiteten til påviselig bakgrunnsstøy.
- Flytt målsettingen til laveste posisjon.
- Flytt målet opp til refleksjonen av dekslene er synlig.
- Øk detektorforsterkningen i trinn på 50 til 100 V og registrer det tilsvarende signalet.
- Påfør trinn 3.1 til 3.8 for begge detektorene.
- Evaluering av data
- Tegn intensiteten mot detektorforsterkningen for hver detektor.
- Velg de individuelle detektorgevinstene for å oppnå lignende følsomhet.
4. FRET-bildeoppkjøp
MERK: Begynn med utvalget av interesse for å sette opp bildeanskaffelse.
- Velg passende filtre/dikroiske speil, for eksempel et dobbelt dikroisk speil MBS 458/514 for FRET-paret ECFP/EYFP. Bruk det samme dikroiske speilet for alle kanaler for å aktivere linje-for-linje-skanning. Velg et vann nedsenkingsmål for avbildning av levende celler. Velg 12-biters eller 16-biters skanning og moderat skannehastighet.
- Definer deteksjonsområdet, helst 470-510 nm for donordeteksjon og 530-600 nm for akseptor / FRET-deteksjon når det gjelder ECFP / EYFP. Når du bruker en 445 nm eller 440 nm diodelaser, bruk 450 til 510 nm som deteksjonsområde. Når det gjelder en acousto-optisk strålesplitter (AOBS), definer donordeteksjon i området 450 til 500 nm for å forhindre uønsket akseptordeteksjon.
- Påfør detektorinnstillingen i henhold til 3.10.2.
- Påfør laserinnstillingen i henhold til 2.3.2. Revider laserintensiteten basert på det oppnådde lasereffekttabellen om nødvendig. Forsikre deg om at signal-til-støy-forholdet dekker hele det dynamiske spekteret til detektorene (intensitet fra 0 til 4095 for 12-biters skanning).
- Hold laserintensiteter og detektorgevinster konstante. Bruk pinhole diameteren for finjustering.
MERK: Husk at endringer i pinhole-diameteren påvirker romlig oppløsning. - Utfør målingene (ta bilder av minst 20 celler).
5. Bestemmelse av krysstalekorreksjoner
MERK: Celler som bare uttrykker giveren eller akseptøren, er pålagt å bestemme henholdsvis donorspektral blødning (DSBT) og akseptorspektral blødning (ASBT). Behold de samme innstillingene som er beskrevet i avsnitt 4.
- Utfør FRET-målinger med celler som uttrykker donorfluofor.
- Utfør FRET-målinger med celler som uttrykker akseptorfluorepreofor.
6. Kalibrering av målingene i henhold til Beemiller et al.13
MERK: Celler som uttrykker en donor-akseptorfusjon av kjent FRET-effektivitet er nødvendig. Her har en ECFP-5 aa-EYFP-fusjon med en FRET-effektivitet på 0,46 blitt brukt4. Behold de samme innstillingene som er beskrevet i avsnitt 4.
- Utfør FRET-målinger med celler som uttrykker donor-akseptorfusjonen
7. Evaluering av data
- Hent linjeprofiler for cellene, og kontroller at hver profil ikke inneholder mer enn én celle. Lagre profilene som tekstfiler.
- Importer tekstfilene til et regneark ved hjelp av alternativet for import av tekstfiler i Data - delen.
- Les opp maksimumsverdiene ved å bruke Max-funksjonen .
- Før opp de oppnådde verdiene i en tabell, ha en kolonne hver for donorutslipp ID, FRET-utslipp IF, akseptorutslipp IA og minst fire datasett: bare donor, akseptor, donor-akseptorfusjon og måling.
MERK: Eksitasjon av giveren resulterer også i direkte eksitasjon av akseptøren og forårsaker ASBT som er beskrevet av α verdi. - Beregn ASBT-α verdier med det godtagende datasettet ved hjelp av formel (1).
(1)
MERK: Bruk medianen for alle α-verdier i følgende ligninger. Giveren viser et bredt utslippsspekter som resulterer i utslippskryss med den sensibiliserte utslippet av akseptoren. Denne DSBT-verdien angis av β verdi. - Beregn donorens gjennomblødning β verdier med datasettet kun for donor ved hjelp av ligning (2).
(2)
MERK: Bruk medianen for alle β verdier i følgende ligninger. Kalibreringsfaktoren beskriver ξ det lineære forholdet mellom FRET-avledet donorslukking og sensibilisert utslipp av akseptoren. Bruk medianene 7,5 og 7,6 i følgende ligninger. - Beregn kalibreringsfaktorene ξ med donor-akseptor-fusjonsdatasettet og FRET-effektivitet E (0,46) ved hjelp av ligning (3).
(3)
MERK: Bruk medianen for alle ξ verdier i følgende ligninger. - Beregn FRET-effektiviteten til proteinparets interesse ved hjelp av ligninger (4) og (5).
(4)
(5) - Beregn effekten av uttrykksstyrke og/eller donor-akseptorforhold: Plott summen av ID, IF og IA mot FRET-effektiviteten. Utfør en lineær regresjon; Vær oppmerksom på at jo brattere grafen og den høyere R2 er, jo høyere er virkningen av uttrykksnivået, eller jo større er forskjellen mellom donor og akseptoroverflod.
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Justering av det kondokale laserskanningsmikroskopet
Laserjusteringen avdekket en lineær økning av utslipp med økende laserintensitet (figur 2 og tabell 1). Som forventet for argon-ion lasere, utslipp av 514 NM linjen var mye høyere enn utslipp av 458 NM linjen, som det fremgår av en brattere skråning. For etterfølgende eksperimenter ble laserkraft på henholdsvis 4,5% og 6,5% valgt for henholdsvis 514 nm-linjen og 458 nm-linjen. Dette resulterte i nesten lik utslippsintensitet på 1123 (514 nm) og 1141 (458 nm).
Varierende detektorgevinster ved konstant lasereffekt avslørte en eksponentiell oppførsel for begge analyserte detektorer. Tilsvarende utslippsintensiteter ble oppnådd for en gevinst på 700 V (figur 3). Selv om justeringen av laserlinjer dra nytte av den lineære oppførselen, påvirkes justeringen av detektorene sannsynligvis av eksponentiell oppførsel, noe som resulterer i markerte forskjeller med mindre endringer i gevinsten ved høyere spenninger. Dessverre er dette høyere spekteret av interesse for målinger i levende celler, da økning av laserkraften er cytotoksisk og fremmer fotobleaching.
Bestemme spektralblødning
Først ble spektralblødning av donoren og akseptoren analysert med rekombinant renset ECFP og EYFP; DSBT β = 0,498 og ASBT α = 0,100. Det samme ble gjort med celler som uttrykker enten ECFP eller EYFP. Med LSM 2 ble estimert DSBT β = 1,602 ± 0,207 (gjennomsnittlig ± SD) og ASBT ble α = 0,119 ± 0,018. Medianverdiene ble β = 1,506 og α = 0,120. Denne uoverensstemmelsen mellom dataene som er oppnådd i levende celler og dataene oppnådd med rekombinant protein, viser at det er umulig å utelate bestemmelsen av spektral blødning i levende celler. Dette er sannsynligvis forårsaket av cellulære pigmenter.
Bildene viser den høyere lysstyrken til EYFP sammenlignet med ECFP (figur 4 og tabell 2). Hvis du kompenserer lysstyrkeforskjellene med forskjellige laserinnstillinger, forbedres det dynamiske området til giveren og FRET-kanalen. Å gi den relative utgangen ved å måle laserintensitetene, som gjort for justeringen, øker fortsatt reproduserbarheten til målingene.
For LSM 1 β = 0,171 ± 0,044, α = 0,094 ± 0,031 med medianer på α = 0,084 og β = 0,180. Bestemmelsen av ASBT avhenger av laserjusteringen og en enkelt detektor, og dermed fungerte bestemmelsen av ASBT godt. DBST involverer to detektorer, noe som resulterer i svært forskjellige resultater for begge mikroskopene. Det skal huskes at LSM 2 er utstyrt med to fotomultipliers, mens LSM 1 bruker en GaAsP-detektor og en fotomultiplier, to forskjellige typer detektorer med forskjellige spektralegenskaper og følsomhet. Følgelig fungerer justeringen bedre med to identiske detektorer.
Kalibrering av målingen
For kalibrering ble medianverdiene til α og β påført, og en sammensmelting av ECFP og EYFP ble brukt som standard for kjent FRET-effektivitet (E = 0,46). Kalibreringen av rekombinant og renset ECFP-EYFP resulterte i en ξ verdi på 13,44, mens in vivo-målingene viste en ξ verdi på 1,525 ± 1,844. Medianen var 0,798, og avslørte ekstreme outliers sammen med det høye standardavviket. For LSM 1 ble verdiene ξ = 1,978 ± 0,807 med en median på ξ = 1,883. For LSM 2 og LSM 1 var datasettene som ble innhentet for beregning av ξ (tabell 3) statistisk identiske, som bevist ved Students t-test (p > 0,2).
FRET-måling
Som et konseptbevis ble FRET-målingen gjentatt med donor-akseptorfusjonen. Den målte FRET-effektiviteten var 0,47 ± 0,07 for renset protein og 0,47 ± 0,06 i levende celler med LSM 2 (tabell 4). Medianen for målingene i levende celler var E = 0,45. For LSM 1 var FRET-effektiviteten 0,46 ± 0,09 med en median på E = 0,45 (tabell 4). Disse dataene viser den effektive kalibreringen med en FRET-konstruksjon av kjent FRET-effektivitet.
Virkninger av uttrykksnivå og donor-akseptorforhold
For det analyserte datasettet ble fret-effektiviteten ikke påvirket av uttrykksnivået. På grunn av fusjonen av donoren og akseptoren var forholdet også konstant. Inkluderingen av tidligere datasett viste en avhengighet av uttrykksnivået i ett tilfelle (figur 5). FRET-effektiviteten mellom de merkede vakuolar ATPase (V-ATPase)-underenhetene, VHA-A-ECFP og VHA-a-EYFP, redusert med økende signalintensitet. Interaksjonen mellom VHA-E1-ECFP og VHA-C-EYFP var derimot uavhengig av signalintensiteten. Når det gjelder VHA-A og VHA-a, blir de tre kopiene av VHA-A i økende grad erstattet av VHA-A-ECFP, noe som resulterer i et giveroverskudd i forhold til enkeltkopien av VHA-a i komplekset. Selv om VHA-E1 kan være til stede i form av tre kopier, kan den høye løseligheten til VHA-C avskaffe denne effekten i dette eksemplet. Her har FRET-effektiviteten vært forholdsvis lav. Denne enkle tilnærmingen gjør det mulig å teste uttrykks- og forholdsartefakter.
Figur 1: Oversikt over fluorescerende protein FRET-par med cyan-emitterende donorer. (A) Parets Förster radii og lysstyrken til donor og akseptor er gitt for godt karakteriserte FRET-par. (B) Sammenligning av donor- og akseptorlevetider. Grå stjerner indikerer et multieksponentielt forfall. Forkortelser: FRET = Förster resonans energioverføring; CFP = cyan fluorescerende protein; GFP = grønt fluorescerende protein; YFP = gult fluorescerende protein; mX = monomerisk X; EX = utvidet X; SX = super X. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Laserjustering. Utslippet av laserne ble registrert ved refleksjon av dekslene og plottet mot den relative laserintensiteten som modulert av det acoustooptiske justerbare filteret til LSM. Utslipp av 458 nm linje (A) og 514 nm linje (B) av en argon-ion laser er vist. Forkortelser: LSM = laserskanning mikroskop; r.u. = relative enheter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Detektorforsterkning og utslippsintensitet. De resulterende utslippsintensitetene ble registrert i refleksjonsmodus for detektorgevinster fra henholdsvis 300 til 750 V og 300 til 750 V for detektor 1 (A) og detektor 2 (B). Forkortelse = r.u. = relative enheter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Spektralblødning. Bilder ble innhentet i donor-, FRET- og akseptorkanalene. (A) Bilder oppnådd med rensede fluorescerende proteiner; skalastenger = 100 μm; (B) tilsvarende bilder for celler som uttrykker fluorescerende proteiner; skalastenger = 10 μm. (C) Grafer over de oppnådde SBT-verdiene; gjennomsnittlig ± SD er gitt. Forkortelser: FRET = Förster resonans energioverføring; SBT = spektral blødning; ECFP = forbedret cyan fluorescerende protein; EYFP = forbedret gult fluorescerende protein; LSM = laserskanning mikroskop; ASBT = akseptor SBT; DSBT = donor SBT. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Effekter av uttrykksnivå og/eller donor-akseptorforhold. Summen av utslippene i donor-, FRET- og akseptorkanalene er plottet inn mot FRET-effektiviteten. Dette er gjort for VHA-E1-ECFP og VHA-C-EYFP (A), VHA-A-ECFP og VHA-a-EYFP (B) og ECFP-EYFP-fusjonen (C). Lineær regresjon ble utført; ligningen og R2 er gitt. Forkortelser: FRET = Förster resonans energioverføring; ECFP = forbedret cyan fluorescerende protein; EYFP = forbedret gult fluorescerende protein; VHA = vacuolar ATPase-underenhet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Donor og akseptor gjennomblødning av ECFP og EYFP. Spektra av fluorescerende proteiner ble hentet fra FP-databasen14. (A) Under sensibiliserte utslippsforsøk oppdages de store delene av giveren og akseptoren av individuelle fotomultipliers, henholdsvis PMT1 og PMT2. ECFP-utslipp kan også påvises av akseptordetektoren ved eksitasjon med 458 nm. Beregnet donorspektral blødning til PMT2 er 40,6% av utslippene som er påvist av PMT1. (B) Utslippsspekteret til EYFP viser at EYFP viser direkte eksitasjon ved 458 nm, som ofte brukes til eksitasjon av cyan donorer. Forventet eksitasjonseffektivitet er 9,6% av eksitasjonen ved 514 nm. Forkortelser: FP = fluorescerende protein; ECFP = forbedret cyan fluorescerende protein; EYFP = forbedret gult fluorescerende protein; AVDRAG = fotomultiplier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Lasereffekt og signalintensitet. Signalintensitetene på 458 nm-linjen er gitt i blått, signalintensitetene til 514 nm-linjen i grønt. Intensitetene som brukes for eksperimentet er uthevet i grått. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Signalintensiteter for SBT-bestemmelse. Registrerte maksimer og beregnede α- og β verdier er gitt. Forkortelser: SBT = spektral blødning; LSM = laserskanning mikroskop; FRET = Förster resonans energioverføring; ASBT = akseptor SBT; DSBT = donor SBT. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 3: Signalintensiteter for kalibrering. Registrerte maksimer og beregnede ξ verdier er gitt. Korrigerte verdier tilsvarer FRET-signalintensitetene minus SBT. Forkortelser: SBT = spektral blødning; LSM = laserskanning mikroskop; FRET = Förster resonans energioverføring. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 4: Signalintensiteter for FRET-målinger. Registrerte maksimer og E-verdier angis. Korrigerte verdier tilsvarer FRET-signalintensitetene minus SBT. Kalibrerte E-verdier ble beregnet med kalibrering av ξ. Forkortelser: SBT = spektral blødning; LSM = laserskanning mikroskop; FRET = Förster resonans energioverføring; cal. = kalibrert. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Donorslukking og sensibilisert akseptorutslipp er preget av et lineært forhold som gjør det mulig å enten donor- eller akseptorbasert beregning av FRET. De tilsvarende faktorene for linearitet kalles enten G-faktor (donor til akseptor) eller xi (akseptor til donor), som er gjensidige verdier4. Måling av FRET mellom fluorescerende proteiner ved fluorescensmikroskopi krever ofte korreksjoner for DSBT og ASBT på grunn av den brede absorpsjons- og utslippsspektraen til de fluorescerende proteinene. Mange korrigeringer avhenger imidlertid av en målbar ASBT, som er en faktor i nevneren av ligningene i protokolldel 7, og en α = 0 resulterer i udefinerte ligninger5,6.
En justering av laserintensiteter anbefales for å unngå slike effekter. Dette muliggjør bruk av akseptorbaserte beregninger og enkel deteksjon av upassende donor-akseptorforhold. I denne protokollen har ligningen til Beemiller og medarbeidere blitt brukt, noe som har fordelen av enkel kalibrering av en enkelt referansekonstruksjon av kjent FRET-effektivitet. Justeringen av detektorene er kritisk, spesielt når to forskjellige typer detektorer påføres. Tidligere data innhentet med to identiske fotomultiplikatorer og identiske gevinster resulterte i en konstant β = 0,61 for flere eksperimenter over år7,8,9 og viser at detektorjustering er fordelaktig for reproduserbarhet. Hvis detektorene ikke tillater en pålitelig justering, kan en sekvensiell skanning med en enkelt detektor i ramme-for-ramme-modus være et alternativ for å unngå skjevheter fra detektoregenskaper.
Målinger i planteceller påvirkes av mange pigmenter, noe som resulterer i eksitasjonslysabsorpsjon og autofluorescens i bakgrunnen. De cellulære pigmentene er hovedsakelig begeistret av lys i UV til blå rekkevidde4,10. Dette forklarer uoverensstemmelsen mellom målingene i celler og de med rensede proteiner. De rensede proteinene kan fungere som et tegn på justering fordi de forventede verdiene for ASBT-α- og DSBT-β kan avledes fra henholdsvis akseptorabsorpsjonsspekteret og donorutslippsspekteret (figur 6). Verdiene til ASBT er like i celler (α = 0,094) og med rensede fluoroforer (α = 0,114) og nær forventet verdi på 0,096 på grunn av den lave cellulære absorpsjonen ved 514 nm. DSBT på β = 0,498 med rensede proteiner er også nær forventet verdi på 0,406. Den spektrale blødningen avhenger videre av oppsettet; diodelasere på 445 eller 440 nm reduserer den direkte eksitasjonen av EYFP og reduserer dermed ASBT. AOBSer er preget av et mindre overføringsgap enn dikroiske speil. Dermed er påvisning av EYFP forbedret i området 500 til 510 nm og kan resultere i ekstra ASBT i donorkanalen. Spektralegenskapene til EYFP peker imidlertid på mindre enn 1% utslipp av maksimal topp, med tanke på både mindre effektiv eksitasjon og lav utslippsintensitet. Filtergapet er mye bredere med dikroiske speil, noe som resulterer i en ytterligere undertrykkelse av en slik akseptor krysstale.
Bruk av verdiene fra rensede proteiner gjenspeiler ikke situasjonen i cellen. Det samme gjelder for kalibreringen av faktor ξ. Selv om kalibreringsfaktoren har vært lik for både LSM, var den mye høyere i målinger med det rekombinante proteinet, og avslørte virkningen av cellulære pigmenter. Det skal nevnes at bakgrunnsstøyen i disse målingene var ubetydelig, men påviselig og ikke påvirket de observerte intensitetene. I motsetning til målinger av donorlevetiden er sensibiliserte utslippsforsøk følsomme overfor donor-akseptorforholdet, slik at et overskudd av donor resulterer i redusert FRET-effektivitet.
Proteinuttrykket har imidlertid vært under kontroll av CaMV35S-promotoren i de nåværende eksperimentene. Denne promotoren brukes ofte til overekspressering av proteiner i planter og kan resultere i ufysiologisk høye mengder proteiner13. Under slike forhold øker sannsynligheten for interaksjon, og falske positive resultater kan oppstå med høyere proteinkonsentrasjoner. Plotting av utslippsintensitetene mot FRET-effektiviteten resulterer deretter i en økende FRET-effektivitet med økende utslippsintensitet og muliggjør evaluering av FRET-dataene med hensyn til uttrykksnivået.
Det anbefales å skille høyoppløselige colokaliseringseksperimenter fra FRET-målinger. For colokalering velges optimale innstillinger for hver fluorofor, mens for FRET-opptak forstyrrer utslippsintensiteter og finjustering av pinhole-diameteren optimale bildeforhold. Likevel er separasjonen av organeller og informasjon om subcellulære strukturer fortsatt omfattet i FRET-målinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi sørger for at alle forfattere har avslørt alle interessekonflikter og ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Eksperimentene ble utført ved Light Microscopy Technology Platform (LiMiTec) ved Fakultet for biologi, Bielefeld University. Dette arbeidet er finansiert av Bielefeld University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well slides | Ibidi | 80821 | |
| Immersion oil Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | refraction index of water |
| LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss |
References
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescent Spectroscopy. Third Edition. , Springer. New York, NY. (2006).
- Clegg, R. M. Förster resonance energy transfer- FRET what it is, why do it, and how it's done. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. 33, 1-57 (2009).
- Vogel, S. S., Nguyen, T. A., vander Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS ONE. 7, 49593 (2012).
- Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Science. 4, 413 (2013).
- Gadella, T. W. J., vander Krogt, G. N., Bisseling, T. GFP-based FRET-microscopy in living plant cells. Trends in Plant Science. 4, 287-291 (1999).
- Van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86, 2517-2529 (2004).
- Seidel, T., Golldack, D., Dietz, K. J. Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements. FEBS Letters. 579, 4374-4382 (2005).
- Seidel, T., Schnitzer, D., Golldack, D., Sauer, M., Dietz, K. J. Organelle-specific iso-enzymes of plant V-ATPase as revealed by in vivo-FRET. BMC Cell Biology. 9, 28 (2008).
- Schnitzer, D., Seidel, T., Sander, T., Golldack, D., Dietz, K. J. The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H+-ATPase and impairs vacuolar acidification. Plant Cell Physiology. 52, 946-956 (2011).
- Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 124672 (2012).
- Holtorf, S., Apel, K., Bohlmann, H. Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 29, 637-646 (1995).
- Seidel, T., et al. Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar H+-ATPase in living plant cells. Journal of Biotechnology. 112 (1-2), 165-175 (2004).
- Beemiller, P., Hoppe, A. D., Swanson, J. A. A phosphatidylinositol-3-kinase-dependent signal transition regulates ARF1 and ARF6 during FCγ receptor-mediated phagocytosis. PLoS Biology. 4, 162 (2006).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16, 277-278 (2019).
