Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kjemisk modifikasjon av Tryptophan-rester i en rekombinant Ca2+-ATPase N-domene for å studere Tryptophan-ANS FRET

Published: October 9, 2021 doi: 10.3791/62770
Automatic Translation
1, 1
1Instituto de Física, Universidad Autónoma de San Luis Potosí

Summary

ANS binder seg til Ca2+-ATPase rekombinant N-domene. Fluorescensspektra viser et FRET-lignende mønster ved eksitasjon ved en bølgelengde på 295 nm. NBS-mediert kjemisk modifikasjon av Trp slukker N-domenets fluorescens, noe som fører til fravær av energioverføring (FRET) mellom Trp-rester og ANS.

Abstract

Sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) er en P-type ATPase som har blitt krystallisert i ulike konformasjoner. Detaljert funksjonell informasjon kan likevel fås fra isolerte rekombinante domener. Det konstruerte (Trp552Leu og Tyr587Trp) rekombinante nukleotidbindingsdomenet (N-domene) viser fluorescensslukking ved ligandbinding. En ekstrinsisk fluorofor, nemlig 8-anilino-1-naftalensulfonat (ANS), binder seg til nukleotidbindende stedet via elektrostatiske og hydrofobe interaksjoner med Arg, His, Ala, Leu og Phe rester. ANS binding fremgår av økningen i fluorescensintensitet når den er begeistret ved en bølgelengde (λ) på 370 nm. Men når den er spent på λ av 295 nm, ser økningen i fluorescensintensiteten ut til å være koblet til slukking av N-domenets egen fluorescens. Fluorescensspektra viser et Föster-resonansenergioverføringsmønster (FRET)-lignende mønster, og antyder dermed tilstedeværelsen av et Trp-ANS FRET-par, som ser ut til å støttes av den korte avstanden (~20 Å) mellom Tyr587Trp og ANS. Denne studien beskriver en analyse av Trp-ANS FRET-paret ved Trp kjemisk modifikasjon (og fluorescensslukking) som formidles av N-bromosuccinimide (NBS). I det kjemisk modifiserte N-domenet økte ANS fluorescensen når den var spent på en λ på 295 nm, tilsvarende når den var spent på en λ på 370 nm. Derfor kan den NBS-medierte kjemiske modifikasjonen av Trp-rester brukes til å sondere fraværet av FRET mellom Trp og ANS. I fravær av Trp fluorescens, bør man ikke observere en økning i ANS fluorescens. Den kjemiske modifikasjonen av Trp-rester i proteiner ved NBS kan være nyttig for å undersøke FRET mellom Trp-rester som er nær den bundne ANS. Denne analysen vil sannsynligvis også være nyttig når du bruker andre fluoroforer.

Introduction

Föster resonans energioverføring (FRET) har blitt en standard teknikk for å bestemme avstanden mellom molekylære strukturer etter binding eller interaksjon i proteinstruktur og funksjonsstudier1,2,3,4. I P-type ATPases har FRET blitt brukt til å undersøke strukturen og funksjonen til sarco-endoplasmic retikulum Ca2+-ATPase (SERCA)2,5,6,7,8, f.eks. strukturelle svingninger i katalytisk syklus har blitt analysert i hele proteinet av FRET7.

FRET donorer er varierte, og spenner fra små fluorescerende (ekstrinsiske) molekyler til fluorescerende proteiner9,10. Tryptofan (Trp) rester (på grunn av deres fluorescens) er nyttige for å identifisere strukturelle endringer i proteinaminosyresekvenser11,12. Fluorescensintensiteten til Trp avhenger vesentlig av polariteten i omgivelsene13,14. Ligandbinding genererer vanligvis strukturelle omorganiseringer i proteiner/enzymer15,16. Hvis Trp er til stede på eller ligger i nærheten av proteinbindingsstedet, påvirker strukturelle svingninger ofte graden av Trp-eksponering for vandige medier13,14; Dermed resulterer endringen i polaritet i slukking av Trp fluorescensintensitet13,14. Derfor er den fluorescerende egenskapen til Trp nyttig for å utføre ligandbindingsstudier for enzymer. Andre fysiske fenomener kan også føre til Trp fluorescensslukking17,18,19,20, for eksempel FRET og endringer i middels polaritet. Energioverføring fra den begeistrede tilstanden til Trp til en fluorofor har også potensielle bruksområder, for eksempel affinitetsbestemmelse av små ligander i proteiner21. Faktisk har Trp primært blitt brukt som fluorescensdonor i FRET-studier i proteiner22,23,24, f.eks. i terbium (Tb3+) FRET-studier, brukes en Trp-rest ofte som en antenne for energioverføring til Tb3 +25,26,27. Trp viser ulike fordeler i forhold til andre FRET-givere på grunn av sin iboende konstituerende karakter i proteinstrukturen, noe som eliminerer behovet for forberedende prosesser som kan påvirke funksjonen / strukturen til det studerteproteinet 24. Dermed er identifisering av strålingsråte (energioverføring og endringer i den middels polariteten som induseres av proteinstrukturelle omorganiseringer) viktig for å trekke nøyaktige konklusjoner om ligandbinding i proteinstrukturelle studier13,14,19,28.

I proteinstrukturstudier har en ekstrinsisk fluorofor, nemlig 8-anilino-1-naftalensulfonat (ANS), primært blitt brukt i eksperimenter relatert til proteinfolding / utfoldelse28,29. ANS binder seg til proteiner / enzymer i innfødt tilstand, vanligvis i bindingsstedene til substrater31,32,33; en økning i ANS fluorescens kvanteutbytte (ΦF) (nemlig en økning i fluorescens intensitet) er indusert av spennende proteinet på λ = 370 nm når egnede interaksjoner av ANS med Arg og Hans rester i hydrofobe lommer forekommer34,35,36,37. I ulike studier er forekomsten av FRET (når den er spennende ved λ innen 280-295 nm) mellom Trp-rester (donorer) og ANS (akseptor) rapportert, som er basert på følgende: 1) overlapping av fluorescensutslippsspekteret til Trp og eksitasjonsspekteret av ANS, 2) identifisering av en passende avstand mellom en eller flere Trp-rester og ANS for overføring av energi, 3) høyt ANS kvanteutbytte når bundet i proteinlommer, og 4) karakteristisk FRET mønster i fluorescens spektra av proteinet i nærvær av ANS3,17,27,37,38.

Nylig har ligandbinding til nukleotidbindingsdomenet (N-domene) i SERCA og andre P-type ATPaser blitt undersøkt ved hjelp av konstruerte rekombinante N-domener40,41,42,43,44,45,46. Molekylær prosjektering av SERCA N-domenet har blitt brukt til å flytte sålen Trp-rester (Trp552Leu) til en mer dynamisk struktur (Tyr587Trp) som er nær nukleotidbindende stedet, hvor fluorescensvariasjoner (slukking) kan brukes til å overvåke strukturelle endringer ved ligandbinding34. Eksperimentelle resultater har vist at ANS binder (som ATP) til nukleotidbindingsstedet i det rensede rekombinante SERCA N-domenet34. Interessant nok øker ANS-fluorescensen ved binding til N-domenet ved eksitasjon ved en λ på 295 nm, mens den iboende fluorescensen til N-domenet reduseres34, og dermed produserer et FRET-mønster som antyder dannelsen av et Trp-ANS FRET-par.

Bruk av NBS er foreslått for å bestemme innholdet av Trp-rester i proteiner47 ved absorbansanalyse av modifiserte proteiner. NBS endrer den svært absorberende indolgruppen av Trp til den mindre absorberende oksindolen47,48. Dette resulterer i tap (slukking) av Trp fluorescerende egenskap40. Derfor kan NBS-mediert kjemisk modifikasjon av Trp-rester brukes som en analyse for å definere rollen til Trp (som donor) når FRET er hypoteset.

Denne protokollen beskriver den kjemiske modifikasjonen av den eneste Trp-rester av NBS i det konstruerte rekombinante N-domenet til SERCA som en proteinmodell. Eksperimentelle resultater viser at ANS fluorescensintensiteten fortsatt øker i kjemisk NBS-modifisert N-domene34, som mangler egen fluorescens. Analysen er derfor nyttig for å demonstrere fraværet av FRET mellom Trp-restene og ANS når den er bundet til N-domenet34,40,49. Derfor er denne analysen (NBS kjemisk modifikasjon av Trp) nyttig for å bevise tilstedeværelsen av Trp-ANS FRET-paret i proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bestemmelse (i silico) av ANS- og SERCA N-domeneinteraksjonen

  1. Generer en tredimensjonal (3D) struktur av proteinet (SERCA N-domene) ved molekylær modellering ved hjelp av den foretrukne proteinmodelleringsprogramvaren50.
  2. Identifiser aminosyrerester som danner nukleotidbindingsstedet ved hjelp av den foretrukne molekylære strukturprogramvaren51, og bestem tilstedeværelsen av Arg- og Lys-rester35; Disse er nødvendige for ANS-binding og for å øke fluorescensintensiteten (kvanteutbytte).
  3. Utføre molekylær dokking (ved hjelp av den foretrukne dokkingprogramvaren)52,53,54 for å bestemme samspillet mellom ATP, fluoresceinisiocyanat (FITC) (som danner et kovalent bånd med Lys515 som merker nukleotidbindingsstedet), og ANS med aminosyrer rester i nukleotidbindingsstedet ( Figur1).
  4. Beregn molekylavstanden (Å) mellom Trp-rester og bundet ANS ved hjelp av måleverktøyet i den foretrukne programvaren.
  5. Utfør molekylær dynamikksimulering av ANS-N-domenekompleks for å bestemme stabiliteten til interaksjonen52,54. Utfør deretter in vitro-eksperimentene når stabiliteten til komplekset er bekreftet.

2. Uttrykk og rensing av det rekombinante N-domenet

  1. Syntetiser genkodingen for N-domene40.
  2. Design og konstruer plasmidet som inneholder det syntetiske genet som koder for N-domenet40.
  3. Uttrykk og rens ved affinitetskromatografi (Ni-NTA), det konstruerte rekombinante N-domenet. Utfør en SDS-SIDE av det rensede proteinet for å bestemme renheten (figur 2)40.
  4. Bestem proteinkonsentrasjonen ved å studere absorbansen ved λ på 280 nm med N-domene utryddelseskoeffisienten (ε = 11,960 M-1·cm-1)40.

3. Overvåk dannelsen av ANS-N-domenekomplekset basert på ANS- og N-domene fluorescensintensitetsendringer.

  1. Forbered en ANS-lagerløsning i N,N-dimetylformamid.
    1. Vei en liten mengde (1-5 mg) ANS, og oppløs den i 1 ml av det endelige volumet av N,N-dimetylformamid, f.eks.
    2. Forbered en 100 μM ANS vandig lagerløsning ved hjelp av ANS-løsningen i N,N-dimethylformamid, f.eks.
    3. Bland løsningene ved å virvelere 3 - 5 ganger i 15 s.
      MERK: I følgende eksperiment bruker du bare ANS vandig lagerløsning. Forbered ans vandig lagerløsning på nytt før du starter forsøkene.
  2. Klargjør NBS-lagerløsningen i N,N-dimetylformamid.
    1. Vei en liten mengde (1-5 mg) NBS, og oppløs den i 1 ml N,N-dimetylformamid, f.eks. 5,3 mg i 1 ml (29,78 mM endelig konsentrasjon).
    2. Forbered en 1 mM NBS vandig lagerløsning ved hjelp av NBS-løsningen i N,N-dimethylformamid, f.eks.
    3. Bland løsningene ved å virvelere 3 - 5 ganger i 15 s.
      MERK: Forbered nbs vandig lagerløsning på nytt før du starter forsøkene.
  3. Titer N-domenet med ANS, og registrer fluorescensspektraet ved eksitasjon ved λ = 295 nm ved 25 °C.
    1. Oppnå fluorescensspektrumets basislinje.
      1. Plasser 1 ml 50 mM fosfatbuffer med pH 8,0 i en 1 ml fluorescenskvarts cuvette.
      2. Plasser cellen i det termo-uttalte cellekammeret (25 °C) på spektrofluorometeret og sett eksitasjonen λ til 295 nm.
      3. Registrer fluorescensspekteret (305 - 550 nm).
        MERK: Fluorescensspekteret til 50 mM fosfatbufferen med pH 8.0, som fungerer som den tomme prøven, trekkes fra alle oppnådde fluorescensspektra.
    2. Oppnå det iboende fluorescensspekteret til N-domenet.
      1. Plasser 900 μL 50 mM fosfatbuffer med pH 8,0 i en fluorescenskvartscuvette.
      2. Tilsett 100 μL N-domene (10 μM) suspensjon for å oppnå en 1 μM N-domene sluttkonsentrasjon i et 1 ml endelig volum.
      3. Homogeniser forsiktig ved hjelp av en mikropipette 20 ganger for å sikre homogeniteten til løsningen.
        MERK: Proteinet skal renses på nytt for å oppnå iboende fluorescensspektra av høy kvalitet, for eksempel, kan det rensede rekombinante N-domenet bare brukes i en uke etter rensing.
      4. Plasser cellen i det termo-uttalte cellekammeret (25 °C) på spektrofluorometeret og sett eksitasjonen λ til 295 nm.
      5. Registrer N-domene intrinsic fluorescens spektrum (305-550 nm).
    3. Tilsett ANS, og oppnå fluorescensspekteret ved eksitasjon ved λ = 295 nm.
      1. Tilsett en 2 μL aliquot på 100 μM ANS vandig lagerløsning til suspendert N-domene (1 μM) for å oppnå en 0,2 μM ANS sluttkonsentrasjon.
      2. Homogeniser forsiktig ved hjelp av en mikropipette 20 ganger for å sikre homogeniteten til løsningen.
      3. Plasser cellen i det termostabile cellekammeret (25 °C) på spektrofluorometeret og sett eksitasjonen λ til 295 nm.
      4. Registrer fluorescensspekteret (305-550 nm).
      5. Gjenta ANS-tilleggene og fluorescensspektraopptaket over 1:1 molarforhold ANS:N-domene.
      6. Trekk det tomme spekteret fra hvert spektrum ved hjelp av egnet programvare.
      7. Plott alle spektra i en enkelt graf.
      8. Finn ut om spektraet danner et FRET-lignende mønster. ANS-N-domenets fluorescensspektra danner et FRET-lignende mønster (figur 3A).

4. N-domene iboende fluorescenstitrering ved Trp kjemisk modifikasjon med NBS.

  1. Gjenta trinn 3.3.1 og 3.3.2.
  2. Tilsett en 1 μL aliquot på 1 mM NBS vandig lagerløsning til suspendert N-domene (1 μM) for å oppnå en endelig konsentrasjon på 1 μM NBS.
  3. Homogeniser forsiktig ved å bruke en mikropipette 20 ganger for å sikre homogeniteten til løsningen.
  4. Plasser cellen i det termostabile cellekammeret (25 °C) på spektrofluorometeret og sett eksitasjonen λ til 295 nm.
  5. Registrer fluorescensspekteret (305-550 nm) (Figur 3B).
  6. Gjenta nbs addisjon og fluorescens spektra opptak til minimal N-domene iboende fluorescens slukking observeres40. I N-domenet skjer dette vanligvis med et molarforhold på 5-6 NBS / N-domene40.
    MERK: NBS slukker raskt (<5 s) den indre fluorescensen til N-domenet; en reduksjon i fluorescensintensiteten observeres. Fortsett umiddelbart til neste trinn, da NBS også kan reagere med andre aminosyrerester47.
  7. Trekk det tomme spekteret fra hvert spektrum ved hjelp av egnet programvare.
  8. Tegn inn alle spektra i ett enkelt diagram (Figur 3B).

5. Titer det NBS-modifiserte N-domenet med ANS ved å registrere fluorescensspektra ved 25 °C.

  1. Utfør trinn 3.3.3 ved hjelp av det NBS-endrede N-domenet som ble generert i trinn 4.
  2. Trekk det tomme spekteret fra hvert spektrum ved hjelp av egnet programvare.
  3. Tegn inn alle spektra i ett enkelt diagram (Figur 3C).
  4. Det genererte fluorescensspektraet (figur 3C) støtter eller avviser forekomsten av FRET, det vil si når FRET oppstår, øker ikke ANS-fluorescensen og omvendt.

6. Bevis på ANS binding til kjemisk modifisert N-domene ved eksitasjon ved λ = 370 nm.

  1. Utfør trinn 3.3.3 ved hjelp av det NBS-modifiserte N-domenet som ble generert i trinn 4, men endre eksitasjonen λ til 370 nm.
  2. Trekk det tomme spekteret fra hvert spektrum ved hjelp av egnet programvare.
  3. Tegn inn alle spektra i ett enkelt diagram (Figur 3D).
  4. Bekreft ANS-binding til N-domenet ved å observere økningen i ANS fluorescensintensitet. ANS-binding til N-domenet viser en fluorescensøkning når den er spent på λ =370 nm (Figur 3D). Som en kontroll ble fluorescensspekteret av ANS (alene) i 50 mM fosfatbuffer med pH 8.0 oppnådd spennende ved λ på 295 og 370 nm (Figur 4, ikke vist i video).
    MERK: Det stoichiometriske forholdet mellom NBS:Trp som kreves for kjemisk modifikasjon, avhenger av graden av begravelse av Trp-rester i proteinet under studie46,47,55,56. Derfor anbefales det å bestemme NBS: protein / (Trp) molarforholdet, på forhånd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Molekylær dokking viser bindingen av ANS til N-domenets nukleotidbindende sted via elektrostatiske så vel som hydrofobe interaksjoner (figur 1). Molekylær avstand (20 Å) mellom Trp-rester og ANS (bundet til nukleotidbindingsstedet) støtter forekomsten av FRET (figur 1). Det designede (konstruerte) rekombinante N-domenet ble oppnådd ved høy renhet ved affinitetskromatografi (figur 2) og var egnet for fluorescenseksperimenter. Fluorescensspektra i ANS-N-domenekomplekset viste et FRET-lignende mønster ved eksitasjon ved λ =295 nm (figur 3A). Kjemisk modifikasjon av Trp-rester ved NBS førte til slukking av N-domenets egen fluorescens (figur 3B). I det kjemisk NBS-modifiserte N-domenet viser de eksperimentelle resultatene at ANS-fluorescens økte ved eksitasjon ved λ =295 nm (figur 3C), tilsvarende det som ble observert i det ikke-modifiserte N-domenet (figur 3A). Derfor gir direkte eksitasjon av ANS ved λ = 295 nm mest energi for ANS fluorescens (figur 3C), som foreslått tidligere28. ANS-binding til det kjemisk modifiserte N-domenet fremgår av en økning i fluorescens når det er begeistret ved λ = 370 nm (Figur 3D). Fret forekommer derfor ikke mellom Trp-rester og ANS som er bundet til nukleotidbindingsstedet.

Figure 1
Figur 1: Molekylær forankring av ANS til nukleotidbindingsstedet til Ca2+-ATPase N-domenet. ANS molekylær forankring ble utført ved hjelp av AutoDock Vina programvare (http://vina.scripps.edu/) og en generert 3D-modell av N-domene40. Det konstruerte N-domenet inneholder mutasjoner Trp552Leu og Tyr587Trp (vist i blått). Aminosyrerester som danner nukleotidbindingsstedet er representert som baller og pinner og fremhevet i oransje. Denne figuren er endret med tillatelse fra Springer Nature: Springer, Journal of Fluorescence. Opphavsrett (2020)34. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: SDS−PAGE for det konstruerte rekombinante Ca2+-ATPase N-domenet. N-domenet ble utsatt for affinitetsrensing ved hjelp av en kromatografisk kolonne. Brøker som tilsvarte absorpsjon (ved λ = 280 nm) topper ble utsatt for SDS-PAGE og visualisert av Coomassie blå farging. ~30 kDa His-tagged N-domain er dannet av 27 kDa av N-domene Ca2+-ATPase og 3 kDa poly-His tag. Ca2+-ATPase N-domenerenhet ble fastslått å være ≥95% av densitometri ved hjelp av ImageJ-programvaren (https://imagej.nih.gov/ij/download.html). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: NBS-mediert kjemisk modifikasjon av Trp-rester i N-domenet motbeviser FRET mellom Trp og ANS som er bundet til nukleotidbindingsstedet. A. FRET mønster av ANS-N-domene komplekset ved eksitasjon ved λ = 295 nm. ANS ble tilsatt (endelig konsentrasjon i μM: Spectra a, 0; b, 0,2; c, 0,4; d, 0,6; e, 0,8; f, 1,0; g, 1,2; og t, 1,4) til suspendert N-domene (1 μM). B. Fluorescensslukking av N-domenet ved NBS (NBS-konsentrasjon i μM: a, 0; b, 1; c, 2; d, 3; e, 4; og f, 6). NBS formidler kjemisk modifikasjon av Trp-rester. N-domene intrinsisk fluorescens ble observert ved eksitasjon ved λ = 295 nm. C. Fluorescensspektra av ANS som er bundet til det kjemisk modifiserte N-domenet ved eksitasjon ved λ = 295 nm. De eksperimentelle forholdene er som i A. Figur A, B og C er endret med tillatelse fra Springer Nature: Springer, Journal of Fluorescence. Opphavsrett (2020)34. D. Fluorescensspektra av ANS som er bundet til det kjemisk modifiserte N-domenet ved eksitasjon ved λ = 370 nm. N-domenet ble suspendert i 1 ml 50 mM fosfatbuffer (pH 8,0) og aliquots av NBS, og ANS ble tilsatt tilsvarende, som beskrevet i A (ANS) og B (NBS). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: ANS fluorescensspektra. ANS (1,4 μM) i 50 mM fosfatbuffer med pH 8,0 var begeistret ved λ på 295 og 370 nm; spektra presenteres i henholdsvis svart og blått. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fluorescensspektra i ANS-N-domenekomplekset viser et FRET-lignende mønster når det er begeistret for en λ på 295 nm, mens den molekylære avstanden (20 Å) mellom Trp-rester og ANS ser ut til å støtte forekomsten av FRET (Figur 1). Trp kjemisk modifikasjon av NBS resulterer i et mindre fluorescerende N-domene (Figur 3B, Spectrum f); Derfor er energioverføring ikke mulig. ANS fluorescensspektra ligner på det ikke-modifiserte N-domenet når det er begeistret for en λ på 295 nm (Figur 3A og C).

Derfor er direkte eksitasjon av ANS på en λ på 295 nm hovedkilden til ANS fluorescens når den er bundet til ATP-bindingsstedet (Figur 3C), som er i samsvar med mekanismen som ble foreslått av andre forfattere28. Fret fra Trp-rester til bundet ANS forekommer derfor ikke i N-domain-ANS-komplekset. Likevel støtter NBS-mediert kjemisk modifikasjon av Trp-rester i andre proteiner FRET mellom Trp og ANS, for eksempel i enzymene xylose reduktase fra Neurospora crassa49, α-underenhet av F1-ATPase fra gjær mitokondrier58, og termolysin59.

Analysen vil fungere godt i proteiner/enzymer med hydrofobe lommer (bindende steder) som inneholder hans og argrester, da disse bidrar til stabilisering av ANS-interaksjonen. I tillegg bør slike proteiner ideelt sett inneholde en såle Trp-rester som ligger på proteinoverflaten, nemlig tilgjengelig for rask reaksjon med NBS40,41,49.

Alternativt, for å analysere Trp-ANS FRET-paret i proteiner, kan kjemisk modifikasjon av hans rester ved acetylering og kortfattethet brukes til å hemme ANS-interaksjonen i protein / enzymbindingsstedet60. Sletting av Trp-rester ved mutasjon er en annen strategi for å analysere FRET. Dette kan imidlertid være tidkrevende, og konstruksjonene kan vise strukturelle forskjeller, og dermed påvirke ligandbinding61. På samme måte kan mutasjon av Arg og hans rester på det ligandbindende stedet generere uforutsette strukturelle endringer, og dermed gjøre det muterte proteinet uegnet for eksperimenter62.

Når det gjelder Trp-rester, vil ytelsen til den NBS-kjemiske modifikasjonsanalysen være begrenset i følgende tilfeller: 1) hvis Trp-rester er begravet dypt i kjernen av et godt brettet og kompakt protein; siden NBS-moietyen ikke ville være i stand til å få tilgang til Trp-rester på grunn av fravær av store hulrom41,48,63, 2) hvis Trp-rester er plassert i en membran-innebygd strukturer (transmembrane α-helix), da den vandige karakteren til NBS vil forhindre at den kommer inn i det hydrofobe mediet32,56,64, 3) hvis proteinstrukturen inneholder flere Trp-rester; da variasjonene i tilgjengelighet og fysisk-kjemisk miljø kan være store, dermed gjør det vanskelig å tildele et fluorescenssignalskifte til en Trp-rest32,41,56, 4) hvis ANS-binding til proteiner hovedsakelig skyldes hydrofob interaksjon, da ANS-fluorescensøkningen hovedsakelig skyldes elektrostatiske interaksjoner32,65,66,67og e) hvis statisk slukking av Trp forekommer for eksempel i nærvær av oksygen68.

NBS mediert kjemisk modifikasjon av Trp-rester ser ut til å være en rask og enkel analyse for å studere FRET mellom Trp og ANS som er bundet til proteiner/enzymer. Andre Trp-modifiserende reagenser kan brukes i stedet for NBS, for eksempel hydroksy-5-nitrobenzylbromid (HNB)69,70. Til slutt kan analysen gjelde for påvisning av foreslåtte FRET-par Trp med andre flurophorer21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble delvis finansiert av FAI-UASLP tilskuddsnummer C19-FAI-05-89.89 og CONACYT tilskudd nummer 316463 (Apoyos a la Ciencia de Frontera: Fortalecimiento y Mantenimiento de Infraestructuras de Investigación de Uso Común y Capacitación Técnica 2021). Forfatterne takker den tekniske hjelpen til Julian E. Mata-Morales i videoutgaven.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylamide Bio-Rad 1610107 SDS-PAGE
Ammonium persulfate Bio-Rad 1610700 SDS-PAGE
8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid Sigma-Aldrich A1028 Fluorophore
Bis-acrylamide Bio-Rad 1610125 SDS-PAGE
N-Bromosuccinimide Sigma-Aldrich B81255 Chemical modification
N,N-dimethylformamide J.T. Baker 9213-12 Stock solution preparation
Fluorescein isothiocyanate Sigma-Aldrich F7250 Chemical fluorescence label
Fluorescence cuvette Hellma Z801291 Fluorescence assay
Fluorescence Spectrofluorometer Shimadzu RF 5301PC Fluorescence assay
HisTrap™ FF GE Healtcare 11-0004-59 Protein purification
IPTG, Dioxane free American Bionalytical AB00841-00010 Protein expression
Imidazole Sigma-Aldrich I5513-25G Protein purification
LB media Fisher Scientific 10000713 Cell culture
Pipetman L P10L Gilson FA10002M Fluorescence assay
Pipetman L P100L Gilson FA10004M Fluorescence assay
Pipetman L P200L Gilson FA10005M Fluorescence assay
Pipetman L P1000L Gilson FA10006M Fluorescence assay
Pipetman L P5000L Gilson FA10007 Fluorescence assay
Precision plus std Bio-Rad 1610374 SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulphate Bio-Rad 1610302 SDS-PAGE
Sodium phosphate dibasic J.T. Baker 3828-19 Buffer preparation
Sodium phosphate monobasic J.T. Baker 3818-01 Buffer preparation
Syringe filter 0.2 um Millipore GVWP04700 Solution filtration
Temed Bio-Rad 1610801 SDS-PAGE
Tris Bio-Rad 1610719 SDS-PAGE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Munishkina, L. A., Fink, A. L. Fluorescence as a method to reveal structures and membrane-interactions of amyloidogenic proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1768 (8), 1862-1885 (2007).
  2. Dong, X., Thomas, D. D. Time-resolved FRET reveals the structural mechanism of SERCA-PLB regulation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 449 (2), 196-201 (2014).
  3. Szilvay, G. R., Blenner, M. A., Shur, O., Cropek, D. M., Banta, S. A FRET-based method for probing the conformational behavior of an intrinsically disordered repeat domain from Bordetella pertussis adenylate cyclase. Biochemistry. 48 (47), 11273-11282 (2009).
  4. Sun, Y., Wallrabe, H., Booker, C. F., Day, R. N., Periasamy, A. Three-color spectral FRET microscopy localizes three interacting proteins in living cells. Biophysical Journal. 99 (4), 1274-1283 (2010).
  5. Cornea, R. L., et al. High-throughput FRET assay yields allosteric SERCA activators. Journal of Biomolecular Screening. 18 (1), 97-107 (2013).
  6. Gruber, S. J., et al. Discovery of enzyme modulators via high-throughput time-resolved FRET in living cells. Journal of Biomolecular Screening. 19 (2), 215-222 (2014).
  7. Dyla, M., et al. Dynamics of P-type ATPase transport revealed by single-molecule FRET. Nature. 551 (7680), 346-351 (2017).
  8. Corradi, G. R., Adamo, H. P. Intramolecular fluorescence resonance energy transfer between fused autofluorescent proteins reveals rearrangements of the N- and C-terminal segments of the plasma membrane Ca2+ pump involved in the activation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (49), 35440-35448 (2007).
  9. Piston, D. W., Kremers, G. -J. Fluorescent protein FRET: The good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).
  10. Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
  11. Chen, Y., Barkley, M. D. Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins. Biochemistry. 37 (28), 9976-9982 (1998).
  12. Zelent, B., et al. Tryptophan fluorescence yields and lifetimes as a probe of conformational changes in human glucokinase. Journal of Fluorescence. 27 (5), 1621-1631 (2017).
  13. Callis, P. R. Binding phenomena and fluorescence quenching. I: Descriptive quantum principles of fluorescence quenching using a supermolecule approach. Journal of Molecular Structure. 1077, 14-21 (2014).
  14. Callis, P. R. Binding phenomena and fluorescence quenching. II: Photophysics of aromatic residues and dependence of fluorescence spectra on protein conformation. Journal of Molecular Structure. 1077, 22-29 (2014).
  15. Agarwal, P. K., Geist, A., Gorin, A. Protein dynamics and enzymatic catalysis: Investigating the peptidyl-prolyl cis-trans isomerization activity of cyclophilin A. Biochemistry. 43 (33), 10605-10618 (2004).
  16. Deng, H., Zhadin, N., Callender, R. Dynamics of protein ligand binding on multiple time scales: NADH binding to lactate dehydrogenase. Biochemistry. 40 (13), 3767-3773 (2001).
  17. van de Weert, M. Fluorescence quenching to study protein-ligand binding: common errors. Journal of fluorescence. 20 (2), 625-629 (2010).
  18. van de Weert, M., Stella, L. Fluorescence quenching and ligand binding: A critical discussion of a popular methodology. Journal of Molecular Structure. 998 (1-3), 144-150 (2011).
  19. Stella, L., van de Weert, M., Burrows, H. D., Fausto, R. Fluorescence spectroscopy and binding: Getting it right. Journal of Molecular Structure. 1077, 1-3 (2014).
  20. Credi, A., Prodi, L. Inner filter effects and other traps in quantitative spectrofluorimetric measurements: Origins and methods of correction. Journal of Molecular Structure. 1077, 30-39 (2014).
  21. Lee, M. M., Peterson, B. R. Quantification of small molecule-protein interactions using FRET between tryptophan and the pacific blue fluorophore. ACS Omega. 1 (6), 1266-1276 (2016).
  22. Zhang, Y., et al. Comparison of FÖrster-resonance-energy-transfer acceptors for tryptophan and tyrosine residues in native proteins as donors. Journal of Fluorescence. 23 (1), 147-157 (2013).
  23. Xie, Y., Maxson, T., Tor, Y. Fluorescent ribonucleoside as a FRET acceptor for tryptophan in native proteins. Journal of the American Chemical Society. 132 (34), 11896-11897 (2010).
  24. Ghisaidoobe, A. B. T. T., Chung, S. J. Intrinsic tryptophan fluorescence in the detection and analysis of proteins: A focus on Förster resonance energy transfer techniques. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 22518-22538 (2014).
  25. Goryashchenko, A. S., et al. Genetically encoded FRET-sensor based on terbium chelate and red fluorescent protein for detection of caspase-3 activity. International Journal of Molecular Sciences. 16 (7), 16642-16654 (2015).
  26. Arslanbaeva, L. R., et al. Induction-resonance energy transfer between the terbium-binding peptide and the red fluorescent proteins DsRed2 and TagRFP. Biophysics. 56 (3), 381-386 (2011).
  27. Di Gennaro, A. K., Gurevich, L., Skovsen, E., Overgaard, M. T., Fojan, P. Study of the tryptophan-terbium FRET pair coupled to silver nanoprisms for biosensing applications. Physical Chemistry Chemical Physics. 15 (22), 8838-8844 (2013).
  28. Hawe, A., Poole, R., Jiskoot, W. Misconceptions over Förster resonance energy transfer between proteins and ANS/bis-ANS: Direct excitation dominates dye fluorescence. Analytical Biochemistry. 401 (1), 99-106 (2010).
  29. Ghosh, U., Das, M., Dasgupta, D. Association of fluorescent probes 1-anilinonaphthalene-8-sulfonate and 4,4´-dianilino-1,1´-binaphthyl-5,5´-disulfonic acid with T7 RNA polymerase. Biopolymers. 72 (4), 249-255 (2003).
  30. Vreuls, C., et al. Guanidinium chloride denaturation of the dimeric Bacillus licheniformis BlaI repressor highlights an independent domain unfolding pathway. The Biochemical Journal. 384, 179-190 (2004).
  31. Möller, M., Denicola, A. Study of protein-ligand binding by fluorescence. Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (5), 309-312 (2002).
  32. Chang, L., Wen, E., Hung, J., Chang, C. Energy transfer from tryptophan residues of proteins to 8-anilinonaphthalene-1-sulfonate. Journal of Protein Chemistry. 13 (7), 635-640 (1994).
  33. Togashi, D. M., Ryder, A. G. A fluorescence analysis of ANS bound to bovine serum albumin: Binding properties revisited by using energy transfer. Journal of Fluorescence. 18 (2), 519-526 (2008).
  34. Dela Cruz-Torres, V., Cataño, Y., Olivo-Rodríguez, M., Sampedro, J. G. ANS interacts with the Ca2+-ATPase nucleotide binding site. Journal of Fluorescence. 30 (3), 483-496 (2020).
  35. Gasymov, O. K., Glasgow, B. J. ANS fluorescence: Potential to augment the identification of the external binding sites of proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1774 (3), 403-411 (2007).
  36. Matulis, D., Lovrien, R. 1-anilino-8-naphthalene sulfonate anion-protein binding depends primarily on ion pair formation. Biophysical Journal. 74 (1), 422-429 (1998).
  37. Samukange, V., Yasukawa, K., Inouye, K. Interaction of 8-anilinonaphthalene 1-sulphonate (ANS) and human matrix metalloproteinase 7 (MMP-7) as examined by MMP-7 activity and ANS fluorescence. Journal of Biochemistry. 151 (5), 533-540 (2012).
  38. Qin, J., et al. Selective and sensitive homogenous assay of serum albumin with 1-anilinonaphthalene-8-sulphonate as a biosensor. Analytica Chimica Acta. 829, 60-67 (2014).
  39. Malik, A., Kundu, J., Karmakar, S., Lai, S., Chowdhury, P. K. Interaction of ANS with human serum albumin under confinement: Important insights and relevance. Journal of Luminescence. 167, 316-326 (2015).
  40. Páez-Pérez, E. D., De La Cruz-Torres, V., Sampedro, J. G. Nucleotide binding in an engineered recombinant Ca2+-ATPase N-domain. Biochemistry. 55 (49), 6751-6765 (2016).
  41. Sampedro, J. G., Nájera, H., Uribe-Carvajal, S., Ruiz-Granados, Y. G. Mapping the ATP binding site in the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis. Journal of fluorescence. 24 (6), 1849-1859 (2014).
  42. Abu-Abed, M., Millet, O., MacLennan, D. H., Ikura, M. Probing nucleotide-binding effects on backbone dynamics and folding of the nucleotide-binding domain of the sarcoplasmic/endoplasmic-reticulum Ca2+-ATPase. The Biochemical Journal. 379, Pt 2 235-242 (2004).
  43. Abu-Abed, M., Mal, T. K., Kainosho, M., MacLennan, D. H., Ikura, M. Characterization of the ATP-binding domain of the sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPase: probing nucleotide binding by multidimensional NMR. Biochemistry. 41 (4), 1156-1164 (2002).
  44. Sazinsky, M. H., Mandal, A. K., Argüello, J. M., Rosenzweig, A. C. Structure of the ATP binding domain from the Archaeoglobus fulgidus Cu+-ATPase. Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11161-11166 (2006).
  45. Liu, L., et al. Crystallization and preliminary X-ray studies of the N-domain of the Wilson disease associated protein. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 65 (6), 621-624 (2009).
  46. Banci, L., et al. The binding mode of ATP revealed by the solution structure of the N-domain of human ATP7A. Journal of Biological Chemistry. 285 (4), 2537-2544 (2010).
  47. Spande, T. F., Witkop, B. Determination of the tryptophan content of proteins with N-bromosuccinimide. Methods in Enzymology. 11, 498-506 (1967).
  48. Spande, T. F., Green, N. M., Witkop, B. The Reactivity toward N-bromosuccinimide of tryptophan in enzymes, zymogens, and inhibited enzymes. Biochemistry. 5 (6), 1926-1933 (1966).
  49. Rawat, U. B., Rao, M. B. Purification, kinetic characterization and involvement of tryptophan residue at the NADPH binding site of xylose reductase from Neurospora crassa. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1293 (2), 222-230 (1996).
  50. Zaki, M. J., Bystroff, C. Protein Structure Prediction. , Humana Press. Totowa, NJ. (2008).
  51. Wang, Z., et al. Comprehensive evaluation of ten docking programs on a diverse set of protein-ligand complexes: The prediction accuracy of sampling power and scoring power. Physical Chemistry Chemical Physics. 18 (18), 12964-12975 (2016).
  52. Pagadala, N. S., Syed, K., Tuszynski, J. Software for molecular docking: A review. Biophysical Reviews. , 91-102 (2017).
  53. Dolatkhah, Z., Javanshir, S., Sadr, A. S., Hosseini, J., Sardari, S. Synthesis, Molecular Docking, Molecular Dynamics Studies, and Biological Evaluation of 4 H -Chromone-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5-carboxylate Derivatives as Potential Antileukemic Agents. Journal of Chemical Information and Modeling. 57 (6), 1246-1257 (2017).
  54. Forli, S., et al. Computational protein-ligand docking and virtual drug screening with the AutoDock suite. Nature Protocols. 11 (5), 905-919 (2016).
  55. Lindahl, E. R. Molecular dynamics simulations. Molecular Modeling of Proteins. Methods in Molecular Biology. 443, 3-23 (2008).
  56. Turk, T., Maček, P., Gubenšek, F. The role of tryptophan in structural and functional properties of equinatoxin II. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Protein Structure and Molecular. 1119 (1), 1-4 (1992).
  57. Peterman, B. F., Laidler, K. J. Study of reactivity of tryptophan residues in serum albumins and lysozyme by N-bromosuccinamide fluorescence quenching. Archives of Biochemistry and Biophysics. 199 (1), 158-164 (1980).
  58. Divita, G., Goody, R. S., Gautheron, D. C., Di Pietro, A. Structural mapping of catalytic site with respect to α-subunit and noncatalytic site in yeast mitochondrial F1-ATPase using fluorescence resonance energy transfer. Journal of Biological Chemistry. 268 (18), 13178-13186 (1993).
  59. Horrocks, W. D., Holmquist, B., Vallee, B. L. Energy transfer between terbium (III) and cobalt (II) in thermolysin: a new class of metal-metal distance probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 4764-4768 (1975).
  60. Chakraborty, J., Das, N., Halder, U. C. Unfolding diminishes fluorescence resonance energy transfer (FRET) of lysine modified β-lactoglobulin: Relevance towards anti-HIV binding. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 102 (1), 1-10 (2011).
  61. Sirangelo, I., Malmo, C., Casillo, M., Irace, G. Resolution of Tryptophan-ANS Fluorescence Energy Transfer in Apomyoglobin by Site-directed Mutagenesis. Photochemistry and Photobiology. 76 (4), 381-384 (2007).
  62. Ribeiro, A. J. M., Tyzack, J. D., Borkakoti, N., Holliday, G. L., Thornton, J. M. A global analysis of function and conservation of catalytic residues in enzymes. Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 314-324 (2020).
  63. Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Exposure of tryptophanyl residues in proteins. Quantitative determination by fluorescence quenching studies. Biochemistry. 15 (3), 672-680 (1976).
  64. Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Fluorescence quenching of indole and model micelle systems. The Journal of Physical Chemistry. 80 (5), 486-493 (1976).
  65. Kinsley, N., Sayed, Y., Mosebi, S., Armstrong, R. N., Dirr, H. W. Characterization of the binding of 8-anilinonaphthalene sulfonate to rat class Mu GST M1-1. Biophysical Chemistry. 137 (2-3), 100-104 (2008).
  66. Mohsenifar, A., et al. A study of the oxidation-induced conformational and functional changes in neuroserpin. Iranian Biomedical Journal. 11 (1), 41-46 (2007).
  67. Gonzalez, W. G., Miksovska, J. Application of ANS fluorescent probes to identify hydrophobic sites on the surface of DREAM. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (9), 1472-1480 (2014).
  68. Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Fluorescence quenching studies with proteins. Analytical Biochemistry. 114 (2), 199-227 (1981).
  69. Poulos, T. L., Price, P. A. The identification of a tryptophan residue essential to the catalytic activity of bovine pancreatic deoxyribonuclease. The Journal of biological chemistry. 246 (12), 4041-4045 (1971).
  70. Hu, J. -J., He, P. -Y., Li, Y. -M. Chemical modifications of tryptophan residues in peptides and proteins. Journal of Peptide Science An Official Publication of the European Peptide Society. 27 (1), 3286 (2021).

Tags

Biokjemi utgave 176
Kjemisk modifikasjon av Tryptophan-rester i en rekombinant Ca<sup>2+</sup>-ATPase N-domene for å studere Tryptophan-ANS FRET
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sampedro, J. G., Cataño, Y.… More

Sampedro, J. G., Cataño, Y. Chemical Modification of the Tryptophan Residue in a Recombinant Ca2+-ATPase N-domain for Studying Tryptophan-ANS FRET. J. Vis. Exp. (176), e62770, doi:10.3791/62770 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter