Summary
Detta dokument ger ett detaljerat protokoll för att förbereda provgaller vid temperaturer så höga som 70 ° C, före doppfrysning för kryo-EM-experiment.
Abstract
Provgallren för kryoelektronmikroskopiexperiment (kryo-EM) framställs vanligtvis vid en temperatur som är optimal för lagring av biologiska prover, mestadels vid 4 °C och ibland vid rumstemperatur. Nyligen upptäckte vi att proteinstrukturen som löses vid låg temperatur kanske inte är funktionellt relevant, särskilt för proteiner från termofila arkéer. Ett förfarande utvecklades för att framställa proteinprover vid högre temperaturer (upp till 70 °C) för kryo-EM-analys. Vi visade att strukturerna från prover framställda vid högre temperaturer är funktionellt relevanta och temperaturberoende. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för beredning av provgaller vid hög temperatur, med 55 °C som exempel. I experimentet användes en förglasningsapparat som modifierats med hjälp av ytterligare ett centrifugrör, och proverna inkuberades vid 55 °C. De detaljerade procedurerna finjusterades för att minimera ångkondens och få ett tunt lager is på gallret. Exempel på framgångsrika och misslyckade experiment ges.
Introduction
Kryo-EM-tekniken för att lösa strukturerna i proteinkomplex har fortsatt att förbättras, särskilt i riktning mot att erhålla högupplösta strukturer 1,2. Under tiden har landskapet för dess tillämpning också utvidgats genom att variera provförhållandena såsom pH eller ligander före förglasningsprocessen3, vilket innebär beredning av provgaller följt av doppfrysning 4,5. Ett annat viktigt villkor är temperaturen. Även om kryo-EM-experiment, som röntgenkristallografi, utförs vid låga temperaturer, återspeglar strukturen som löses av kryo-EM strukturen vid lösningstillståndet före förglasning. Fram till nyligen använder majoriteten av kryo-EM-studier med en partikelanalys (SPA) prover som hålls på is (dvs. vid 4 ° C) före förglasning6, även om ett antal studier använder prover vid cirkarumstemperatur 7,8,9,10 eller så högt som 42 ° C 11. I en ny rapport utförde vi temperaturberoende studier av enzymet ketolsyrareduktoisomeras (KARI) från den termofila arkéen Sulfolobus solfataricus (Sso) vid sex olika temperaturer från 4 °C till 70 °C12. Våra studier tyder på att det är viktigt att förbereda provnät vid funktionellt relevanta temperaturer och att kryo-EM är den enda strukturella metoden som är praktiskt genomförbar för att lösa strukturen hos samma proteinkomplex vid flera temperaturer.
Den stora svårigheten för förglasning vid höga temperaturer är att minimera ångkondens och uppnå tunn is. Här rapporterar vi det detaljerade protokollet som används för att förbereda provnät vid höga temperaturer i vår tidigare studie av Sso-KARI 12. Vi antar att läsarna eller tittarna redan har erfarenhet av de övergripande provberednings- och databehandlingsförfarandena för kryo-EM-experiment och betonar de aspekter som är relevanta för hög temperatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Detta protokoll syftar till att använda en modifierad kommersiell förglasningsapparat för att förbereda kryoelektronmikroskopiproverna (kryo-EM) vid specifika temperaturer, särskilt högre än 37 °C. Den övergripande experimentella inställningen visas i figur 1. Protokollet använder 55 °C som exempel. För de särskilda förhållandena vid andra temperaturer, se tilläggstabell 2 i referens12.
1. Beredning av förglasningsapparaten
- Gör ett 1 cm hål i ett 50 ml centrifugrör i dess slutna ände.
- Placera röret i förglasningsapparatkammaren vid ultraljudsvattenutloppet, som visas i figur 2.
OBS: Syftet är att minimera vattenkondens genom att leda vattenånga till värmeväxlaren genom röret innan den når hela kammaren. - Ställ in förglasningsapparatens temperatur på den angivna temperaturen (t.ex. 55 °C, som visas i figur 3) och låt förglasningsapparatens kammare nå 55 °C och 100 % relativ fuktighet. Låt det stå i minst en halvtimme för att stabilisera förhållandena innan experimentet påbörjas.
2. Uppvärmning av provet och verktygen
- Placera vattenbadet på en kokplatta och ställ in kokplattan på önskad temperatur (här 55 °C). Kontrollera med termometer att vattnet når 55 °C.
- Inkubera provet i vattenbadet och förvärm pipettspetsen på kokplattans kant i 2 minuter eller längre före blottningsexperimentet.
OBS: Den högsta temperaturinställningen för förglasningsapparatkammaren är 60 °C. För att förbereda rutnät med högre temperatur för cyro-EM-experiment (t.ex. 70 °C) inkuberas provet i vattenbadet vid 80 °C, och medelvärdet mellan provets temperatur och förglasningsapparatens temperatur uppskattas vara provets faktiska temperatur på gallret (70 °C i detta fall). Se diskussionsavsnittet för mer information och begränsningar för den här uppskattningen.
3. Förberedelse för blottningsexperimentet
- Glödutsläpp ett håligt kolstödt galler vid 25 mA i 30 s, eller alternativ till värdena beroende på vilken enhet som används.
- Inkubera pincetten med gallret i förglasningsapparaten i 2 minuter eller längre.
- Fyll etanbehållaren med etan enligt standardprocedurer. Låt inte etan rinna över.
OBS: Detta steg tar cirka 10 minuter och bör följas omedelbart med blottningsexperimentet för att undvika frysning. - Placera förglasningsfilterpapperet i förglasningsapparatens kammare tidigast 5 minuter före blottningsexperimentet.
OBS: Om du placerar filterpapperet i kammaren för tidigt blir det för vått.
4. Blotting experiment
OBS: När du håller gallret, se till att gallret är stabilt och att det finns en minimal kontaktyta med pincetten (figur 4). Detta görs för att bibehålla den bästa kyleffektiviteten hos etan och för att undvika icke-glasartad is.
- Använd en pipettspets för att applicera 7-9 μL av provet på gallret. Vänta sedan på 1-2 s, torka i 1-1,5 s och kasta snabbt provet till flytande etan.
- Överför gallret från flytande etan till kryoboxen, som lagras i flytande kväve.
OBS: Detta steg måste utföras mycket noggrant eftersom pincetten fortfarande är varm, så hela kyltanken är full av ånga just nu.
5. Kvalitetskontroll för gallren
- Klipp rutnäten och ladda upp dem till ett kryo-EM-instrument.
- Använd skärmen på kryo-EM-instrumentet och programvarans lågdosfunktion för att screena istillståndet på gallret och fördelningen av provet på gallret.
OBS: Ofta är gallren mycket torra, eller islagret är för tjockt. Framgångsgraden för de galler som beretts vid höga temperaturer är betydligt lägre än vid rumstemperatur eller 4 °C. Representativa resultat av bra rutnät och icke-tillfredsställande rutnät visas i nästa avsnitt. - Om kvaliteten på det resulterande gallret inte är bra, upprepa processen för nätberedning med olika förhållanden (såsom väntetid, blottningstid etc.). Om kvaliteten på det resulterande gallret är bra, upprepa samma steg för att göra galler vid en annan temperatur.
6. Insamling av uppgifter
- Överför gallren av god kvalitet till ett högupplöst kryo-EM-instrument.
- Utföra datainsamling och dataanalyser enligt fastställda rutiner.
OBS: Som visas i vår tidigare publikation påverkas inte strukturens upplösning av den höga temperaturen12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Översikten över låg förstoring visas i figur 5A,B. Panel A är ett exempel på ett framgångsrikt rutnät. Det finns en isgradient från övre vänstra (tjockare) till nedre högra (tunnare eller tom). Ett sådant rutnät gör det lättare att hitta en lämplig tjocklek på isskiktet i mittområdet som är lämpligt för datainsamling, såsom de blå och gröna rutorna. Gallret B är för torrt. Rutorna i rutnätet har ljus kontrast, vilket innebär att islagret är för tunt eller att det inte finns något islager alls. Endast de två rutorna som indikeras av de röda pilarna är lämpliga för datainsamling.
Dessutom visas exempel på lågdosbilder från olika rutnät i figur 5C,D. Bilden i panel C visar att det mesta av isen är i kristallin form, inte lämplig för datainsamling. Å andra sidan visar bilden i panel D att islagret mestadels är i ett amorft tillstånd, lämpligt för datainsamling.
Observera att detta är ett kort papper med fokus på nätberedning vid höga temperaturer. Rutnätet innehåller bara exemplet för datainsamling. Ett bra rutnät har en god chans, men inte en bestämd chans, att generera bra data för att lösa en högupplöst struktur. De verkliga kryo-EM-data och slutliga strukturerna för de exempel som beskrivs i detta dokument beskrivs redan i det publicerade papperet12. Kort sagt, vi har fått rutnät som är tillräckligt bra för datainsamling, löst strukturerna för två Sso-KARI-komplex vid sex olika temperaturer vardera och jämfört strukturerna från olika temperaturer för varje komplex, liksom strukturerna mellan de två komplexen från samma temperatur. Resultaten indikerar att strukturen för varje komplex är temperaturberoende och att de temperaturberoende förändringarna skiljer sig åt mellan de två komplexen. Viktigt är att de successiva strukturella förändringarna korrelerar väl med de successiva temperaturförändringarna, vilket är en stark indikation på framgången för den temperaturberoende provnätberedningen.
Figur 1: Den övergripande experimentella inställningen för kryo-EM-provberedning vid hög temperatur. De visade föremålen inkluderar förglasningsapparat, inkubator, timer, pipettspetsplacering, kyltank och pincett. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Modifiering av förglasningsapparatkammaren. Ett 50 ml rör är installerat vid ultraljudssprututloppet som indikeras av den röda pilen12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Förglasningsapparatens utseende under experimentet. Skärmen visar temperaturen vid 55 °C och luftfuktigheten vid 100%. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Använd pincett för att ta tag i rutnätet. Det rekommenderas att pincetten greppar gallret med så lite kontakt som möjligt, men det måste kunna hålla gallret stabilt under driftsprocessen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Representativa resultat: Rutnätskontroll av Cryo-EM. (A,B) visar nätets övergripande tillstånd. (C,D) visar exempel på lågdosbilder från olika rutnät. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I steg 1 i protokollet, se till att centrifugröret har installerats väl och inte faller när experimentet pågår. På grund av ackumuleringen av ett stort antal vattendroppar i kammaren, vilket kan förändra filterpapperets adsorptionskapacitet, rekommenderas att den totala tiden för experimentet inte får överstiga 30 minuter efter att förglasningsapparatkammaren nådde jämviktstemperaturen. Om driftstiden överstiger 30 minuter måste operatören byta ut filterpapperet och vänta på att kabinen balanserar temperaturen och luftfuktigheten igen. Vid steg 8 i protokollet är den föreslagna provvolymen på 7-9 μL större än vanligt eftersom provet annars avdunstar snabbt vid hög temperatur, vilket leder till tomma rutor på gallret. Å andra sidan rekommenderas det starkt att det applicerade provet inte överstiger 9 μl. Annars är det mycket troligt att provet kommer att droppa ner under processen att flytta pincetten före blottning. Sammantaget är en nyckel till framgången för denna teknik stabilt och snabbt grepp om rutnät och korrekt och stabilt utförande av varje tidsbegränsad åtgärd. Dessutom rekommenderas att varje experimentrunda endast behandlar en specifik hög temperatur. Innan du fortsätter att utföra experimentet vid en annan temperatur måste alla system återställas och återställas helt.
På grund av kammarens höga temperatur och höga luftfuktighet är fönstret ofta täckt av dimma vilket leder till svårigheter att starta experimentet. Användning av lite tvålar rekommenderas för att rensa fönstret. Om rutnäten inte är bra är möjliga orsaker att stegen som beskrivs ovan inte följs exakt och/eller att stegen tar för lång tid. Försök att upprepa beredningen av provnät med precision och snabbhet. Om gallret fortfarande inte är bra efter upprepningar, försök sedan justera villkoren. Det vanligaste problemet som observeras i detta experiment är ingen is på gallret vid hög temperatur. Om så är fallet, försök att minska blottningstiden ytterligare. Å andra sidan, om isen är för tjock, försök att öka blottningstiden.
En begränsning av högtemperaturkryo-EM är att den maximala uppvärmningstemperaturen på förglasningsapparaten är 60 °C. För att nå den högre temperaturen upphettades provet över 60 °C (t.ex. 80 °C), och medelvärdet mellan provets temperatur och förglasningstemperaturen uppskattades vara provets verkliga temperatur på gallret (70 °C, i detta fall). Det kan finnas en viss felaktighet baserat på denna uppskattning. En möjlig framtida lösning är att bygga ett termoelement för att mäta nättemperaturen exakt precis före doppfrysning. En annan potentiell begränsning är proteinets stabilitet vid höga temperaturer. Ett separat experiment med cirkulär dikroism bör utföras för att säkerställa att proteinet är stabilt vid temperaturen för det planerade kryo-EM-experimentet.
En annan begränsning är att endast två typer av kommersiellt tillgängliga förglasningsapparater kan värmas upp till över 37 °C och upp till 60 °C som nämnts ovan (t.ex. Thermo Fischer Vitrobot och Leica EM-GP). Förglasningsapparater från andra leverantörer är antingen begränsade till rumstemperatur eller justerbara endast mellan 4 °C och 37 °C. Det är dock möjligt för forskargrupper att bygga sina egna störtanordningar med utökade temperaturintervall i framtiden.
Vårt protokoll är modifierat från befintliga protokoll 4,5,6, i syfte att förbereda gallren vid temperaturer högre än rumstemperatur. Utan att göra de ändringar som beskrivs här är chansen att lyckas med att göra bra högtemperaturprovnät lämpliga för kryo-EM-bildsamling mycket liten.
Två artiklar under 2019 har visat att proteinstrukturer är temperaturberoende, i samband med proteinfunktioners temperaturberoende, i intervallet 4 °C till 42 °C för TRP-kanalen TRPV311 och 4 °C till 70 °C för Sso-KARI 12. Dessa rapporter kommer sannolikt att uppmuntra en förändring i kryo-EM-forskning genom att fler framtida studier kommer att utföras vid funktionellt relevanta temperaturer, vanligtvis vid 37 ° C. Det renade proteinets stabilitet vid denna temperatur kan vara ett problem. Det är dock nödvändigt att inkubera proteinprovet vid denna temperatur i endast 2 minuter enligt vårt protokoll. Alternativt kan fysiologiska förhållanden uppnås genom avbildning av proteiner i celler med hjälp av tomografi och sub-tomo-medelvärde. Dessutom kan kryo-EM användas för att studera mekanismen och intermediärerna av protein som utvecklas vid höga temperaturer, sannolikt i intervallet 40 ° C till 80 ° C. Dessa studier kommer alla att dra nytta av det protokoll som beskrivs här.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna tackar Dr. Hervé Remigy från Thermo Fisher Scientific för användbara råd. Kryo-EM-experimenten utfördes vid Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). ASCEM stöds av Academia Sinica (bidrag nr. AS-CFII-108-110) och Taiwan Protein Project (bidrag nr. AS-KPQ-109-TPP2). Författarna tackar också Hui-Ju Huang för hjälpen med provberedningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon tube | Falcon | 352070 | size: 50 mL |
| Filter paper | Ted Pella | 47000-100 | Ø55/20mm, Grade 595 |
| HI1210 | Leica | water bath | |
| K100X | Electron Microscopy Sciences | glow discharge | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | low dose imaging |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot Tweezer | Ted Pella | 47000-500 |
References
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587, 157-161 (2020).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
- Chen, C. Y., et al. Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase. Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).
- Cabra, V., Samsó, M. Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).
- Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales. Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).
- Passmore, L. A., Russo, C. Specimen preparation for high resolution cryo-EM. J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -F., Savage, D. F., Davies, K. M. Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis. Nature. 566, 411-414 (2019).
- Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363, (2019).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364, 355-362 (2019).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23, 1097-1105 (2015).
- Singh, A. K., et al. Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3. Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).
- Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions. Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).
