Summary
Nous présentons un protocole d’imagerie en direct sans étiquette utilisant des techniques de microscopie optique transmise pour capturer des images, analyser et quantifier la cinétique de croissance du champignon filamenteux A. nidulans dans les cultures submergées et les milieux solides. Ce protocole peut être utilisé en conjonction avec la microscopie à fluorescence.
Abstract
Il est bien établi que la croissance des colonies de champignons filamenteux, qui dépend principalement des changements dans le taux de croissance apicale des hyphes et des mycéliums, est estimée macroscopiquement sur les milieux solidifiés en comparant la taille des colonies. Cependant, mesurer quantitativement le taux de croissance de souches ou de souches fongiques génétiquement différentes dans différentes conditions environnementales / de croissance (pH, température, sources de carbone et d’azote, antibiotiques, etc.) est difficile. Ainsi, la poursuite d’approches complémentaires pour quantifier la cinétique de croissance devient obligatoire afin de mieux comprendre la croissance des cellules fongiques. En outre, il est bien connu que les champignons filamenteux, y compris Aspergillus spp., ont des modes distincts de croissance et de différenciation dans des conditions subaérivoles sur des milieux solides ou des cultures submergées. Ici, nous détaillons une méthode microscopique quantitative pour analyser la cinétique de croissance du champignon modèle Aspergillus nidulans, en utilisant l’imagerie en direct dans les cultures submergées et les milieux solides. Nous capturons des images, analysons et quantifions les taux de croissance de différentes souches fongiques de manière reproductible et fiable à l’aide d’un logiciel open source et gratuit pour les bio-images (par exemple, Fidji), d’une manière qui ne nécessite aucune expertise préalable en analyse d’images de la part de l’utilisateur.
Introduction
Les champignons filamenteux sont d’une grande importance socio-économique et écologique, étant à la fois cruciaux en tant qu’outils industriels / agricoles pour la productiond’enzymeset d’antibiotiques1,2 et en tant qu’agents pathogènes des plantes cultivées3, insectes nuisibles4 et humains3. De plus, les champignons filamenteux tels que Aspergillus nidulans sont largement utilisés comme organismes modèles pour la recherche fondamentale, comme les études en génétique, biologie cellulaire et évolutive ainsi que pour l’étude de l’extension hyphale5. Les champignons filamenteux sont des organismes hautement polarisés qui s’allongent grâce à l’apport continu de lipides/protéines membranaires et à la synthèse de novo de la paroi cellulaire à l’extrémité extensible6. Un rôle central dans la croissance de la pointe hyphale et le maintien de la polarité est une structure spécialisée appelée « Spitzenkorper » (SPK), une structure hautement ordonnée composée principalement de composants cytosquelettes et de la distribution polarisée du Golgi6,7,8.
Les stimuli/signaux environnementaux, tels que l’interface eau-air, la lumière, la concentration de CO2 et l’état nutritionnel sont responsables des décisions de développement prises par ces moisissures9. Dans les cultures submergées (liquides), la différenciation d’A. nidulans est réprimée et la croissance se produit par allongement de la pointe hyphale6. Au cours de la croissance végétative, les spores asexuées (conidies) germent par extension apicale, formant un réseau indifférencié de cellules hyphales interconnectées, le mycélium, qui peut continuer à croître indéfiniment tant que les nutriments et l’espace sont disponibles. D’autre part, sur les milieux solides, les pointes hyphales s’allongent et après une période définie de croissance végétative (compétence développementale), la reproduction asexuée est initiée et les tiges de conidiophores aériennes s’étendent à partir de cellules spécialisées du pied du mycélium6. Ceux-ci donnent naissance à des structures multicellulaires de développement spécialisées appelées conidiophores, qui produisent de longues chaînes de conidies haploïdes10 qui peuvent relancer la croissance dans des conditions environnementales favorables.
Une méthode largement utilisée pour mesurer la croissance fongique filamenteuse consiste à inoculer des spores sur une gélose nutritive contenue dans une boîte de Pétri et à mesurer macroscopiquement le diamètre de la colonie quelques jours plus tard11. Le diamètre/surface de la colonie, le plus dépendant des changements du taux de croissance mycéliale et moins de la densité des conidiophores12,est alors utilisé comme valeur de croissance. Bien que la mesure de la taille de la population fongique (colonie) qui pousse sur des surfaces solides soit tout à fait adéquate, ce n’est en aucun cas la mesure la plus précise de la croissance. Par rapport aux moyennes au niveau de la population (moyennes de la taille des colonies fongiques), les mesures unicellulaires peuvent saisir l’hétérogénéité d’une population cellulaire et permettre l’identification de nouvelles sous-populations de cellules, états13,dynamique, voies ainsi que les mécanismes biologiques par lesquels les cellules répondent aux changements endogènes et environnementaux14,15. La surveillance de la croissance et du phénotype des cellules fongiques par microscopie time-lapse est sans doute l’approche d’observation quantitative unicellulaire la plus largement utilisée.
Ici, nous détaillons un protocole d’imagerie en direct sans étiquette utilisant des techniques de microscopie à lumière transmise (telles que le contraste de phase, le contraste d’interférence différentielle (DIC) et la microscopie polarisée) pour capturer des images, qui, indépendamment de l’utilisation combinée de la microscopie à fluorescence, peuvent être utilisées pour analyser et quantifier la croissance polaire des souches d’A. nidulans dans les cultures submergées et les milieux solides.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Préparation de l’inoculum
REMARQUE: Toutes les étapes doivent être effectuées sous une armoire à flux laminaire.
- Striez la souche fongique d’intérêt, à partir d’un stock de glycérol (-80 °C) à l’aide d’une boucle d’inoculation stérile, sur des plaques de milieu minimal (MM) complétées par les besoins nutritionnels appropriés en rapport avec la souche examinée [MM: 10,0 g/L de glucose, solution saline de 20 mL/L (solution saline: 26 g/L KCl, 26 g/L MgSO4·7H2O, 76 g/L KH2PO4, 2,0 mL/L de chloroforme) et 1 mL/L oligo-éléments (oligo-éléments : 40 mg/L Na2B4O7· H2 O, 400 mg/L CuSO4, 8 g/L ZnSO4, 800 mg/L MnSO4, 800 mg/L FePO4), ajuster le pH à 6,8 avec 1 M NaOH, ajouter 1 % (p/v) de gélose et les suppléments requis comme décrit dans16 et autoclave] (Figure 1).
REMARQUE: La solution saline, la solution d’oligo-éléments et les suppléments sont autoclavés. - Incuber pendant 2-3 jours à 37 °C.
- Utiliser un cure-dent stérile (ou une boucle d’inoculation), transférer un petit nombre de conidies, en touchant doucement une seule colonie, sur des plaques de milieu complet (CM) [CM : 10,0 g/L de glucose, 2,0 g/L de peptone, 1,0 g/L d’extrait de levure, 1,0 g/L d’acides casaminés, 20 mL/L de solution saline, 1 mL/L d’oligo-éléments, 5 mL/L de solution vitaminique (solution vitaminique : 0,1 g/L de riboflavine, 0,1 g/L de nicotinamide, 0,01 g/L d’acide p-aminobenzoïque, 0,05 g/L de pyridoxine HCl, 1,0 mg/L de biotine), ajuster le pH à 6,8 avec 1 M de NaOH, ajouter 1 % (p/v) de gélose et les suppléments requis comme décrit aupoint 16 et autoclave]. Autoclavez et conservez la solution vitaminique dans une bouteille sombre à 4 °C.
REMARQUE: Dans le cas où la croissance fongique est trop dense pour identifier et isoler les colonies individuelles, re-streak sur une nouvelle plaque de gélose pour obtenir des colonies uniques. - Incuber pendant 3-4 jours à 37 °C.
- Obtenir une suspension conidiale d’environ 2 x 106 cellules/mL en grattant 1 cm de la surface d’une colonie fongique conidiée cultivée sur des plaques de gélose CM, à l’aide d’un cure-dent stérile(Figure S1).
REMARQUE: Si nécessaire, comptez les conidies avec un hémocytomètre. - Récolter les conidies d’A. nidulans dans un tube de centrifugeuse stérile de 1,5 mL avec 1,0 mL d’eau distillée autoclavée contenant 0,05 % (v/v) de Tween 80 pour réduire le nombre d’amas de conidies.
REMARQUE: Conidia peut être stocké jusqu’à 2-3 semaines à 4 ° C sans perte de viabilité pertinente (A. Athanasopoulos et V. Sophianopoulou, données non publiées). Cependant, il est recommandé de filtrer et / ou de laver la suspension conidiale pour éliminer les parties mycéliales et les nutriments, afin de prévenir le gonflement conidial.
2. Préparation pour l’imagerie des champignons filamenteux se développant sur des milieux agar (solides)
REMARQUE: Une version modifiée de la méthode de la 'gélose inversée17,18 est utilisée.
- Initialement, repérer des aliquotes de 10 μL de conidial vigoureusement vortexé (environ 2 x 104 cellules/mL) en plusieurs points sur des boîtes de Petri (Ø9 cm) 15 mL de MM avec 1% (p/v) de gélose(Figure 2).
REMARQUE: En utilisant la version modifiée de la « méthode de la gélose inversée », il est possible d’imager des échantillons fongiques pendant de nombreuses heures sans effets délétères apparents sur les hyphes en croissance. - Incuber la culture expérimentale en fonction du stade de développement destiné à être étudié.
- Découper un bloc de gélose de ≈0,8 mm2 contenant la colonie à l’aide d’un scalpel stérile.
REMARQUE: Les dimensions du bloc de gélose à découper dépendent des dimensions de l’équipement à placer par la suite. Dans le présent ouvrage, 8 diapositives bien μ sont utilisées (voir ci-dessous). - Inverser et placer le bloc de gélose dans un puits d’un verre de couverture à glissière μ ou similaire à 8 chambres avec couvercle adapté à l’imagerie en direct.
REMARQUE: Dans le cas où la microscopie à lumière transmise sera utilisée en combinaison avec la microscopie à fluorescence (marquage), le bloc de gélose peut être inversé sur une gouttelette de milieu liquide contenant le colorant de coloration des cellules vivantes, juste avant l’imagerie.
3. Préparation pour l’imagerie des champignons filamenteux se développant sur un milieu liquide
- Transférer 10 μL d’aliquotes d’une suspension conidiale vigoureusement vortexée (environ 2 x 104 cellules/mL) dans les puits d’une lame de 8 puits μ contenant 200 μL de MM (liquide) avec les suppléments appropriés (voir ci-dessus).
- Incuber pendant le temps souhaité à la température souhaitée (Figure 3).
REMARQUE: Si la microscopie à lumière transmise est utilisée en combinaison avec la microscopie à fluorescence (marquage), les cultures liquides ont le grand avantage que des colorants fluorescents peuvent être ajoutés à n’importe quel moment souhaité au cours de l’expérience19.
4. Capturez des images
REMARQUE: Le choix du microscope dépend de l’équipement disponible. Dans tous les cas, la configuration du microscope doit inclure un étage inversé, une chambre environnementale ou au moins une pièce avec un contrôle précis de la température de l’air.
- Préchauffer la chambre thermostatée du microscope à 37 °C (sauf indication contraire ou comme convenant aux espèces fongiques utilisées) pour stabiliser la température avant de commencer. Cette chambre permet la modulation de température de l’optique du microscope et de l’étage d’échantillonnage lors d’expériences time-lapse. Sachez que des aberrations optiques20 sont introduites lorsque des huiles d’immersion normales (conçues pour être utilisées à 23 °C) sont utilisées à 37 °C ou plus.
REMARQUE: Avec un budget serré, les chambres d’incubation peuvent être fabriquées à partir de carton et de matériau d’emballage isolant21 ou à l’aide d’une imprimante 3D22. - Allumez le microscope, la puissance du scanner, l’alimentation laser et l’ordinateur, puis chargez le logiciel d’imagerie. Placez la lame μ (préparée précédemment) dans la phase de microscope et faites la mise au point.
- Trouvez des champs de vision qui contiennent des cellules isolées/qui ne se chevauchent pas (ou du moins qui ne sont pas surpeuplées), afin de faciliter les mesures de croissance lors de l’analyse d’images. Capturez au moins 50 cellules en croissance par échantillon pour permettre une analyse statistique robuste.
- Sélectionnez l’approche de microscopie à lumière transmise souhaitée. Réduire le temps d’exposition ou la puissance laser et le temps de séjour des pixels et/ou augmenter les diamètres des trous d’épingle, afin de minimiser le photobleachage des cellules fongiques, comme décrit ailleurs 23,24.
- Réglez le microscope pour acquérir des images aux intervalles de temps souhaités et commencer l’acquisition de séries chronologiques.
REMARQUE: Pour corriger la dérive focale au fil du temps (en particulier pour les longues expériences), en raison de la dérive thermique, de la diversité des tailles de cellules et du mouvement des cellules, utilisez une stratégie de mise au point automatique si disponible dans votre logiciel de microscope.
5. Analyse d’images
REMARQUE: Cette section décrit les étapes clés du traitement des images de microscopie time-lapse pour mesurer le taux de croissance d’A. nidulans. L’ouverture, la visualisation et le traitement des images sont réalisés avec le logiciel open source ImageJ/Fiji25.
- Importez les images aux Fidji à l’aide de Plugins | Bio-Formats | Importateur de bio-formats dans le menu Fidji avec les paramètres par défaut (Figure 4A).
REMARQUE: Vérifiez si l’importateur de bio-formats reconnaît correctement l’étalonnage de l’image. La dimension de l’image affichée dans la fenêtre d’image du champ d’information supérieur doit être égale aux dimensions de l’image d’origine(Figure 4B). Appuyez sur Maj + P pour afficher et modifier les propriétés de l’image dans le logiciel ImageJ/Fiji. - Si nécessaire, utilisez l’histogramme correspondantà 26 pour la correction de l’éclairage entre différentes images (Image | Ajuster | | de correction de l’eau de Javel Correspondance de l’histogramme) (Figure 4C).
- Si nécessaire, utilisez l’algorithme SIFT (Plugins | | d’inscription Alignement linéaire de la pile avec SIFT) pour aligner ou faire correspondre des piles d’images (Figure 4D). Sélectionner "Traduction" dans le menu de transformation attendue devrait suffire à corriger toute dérive x-y.
REMARQUE: D’autres plugins peuvent également être utilisés pour aligner une pile de tranches d’image, telles que Stabilisateur d’image (https://imagej.net/Image_Stabilizer) ou StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/). - Sélectionnez les hyphes qui poussent parallèlement au couvercle, en évitant ceux qui sont inclinés. Assurez-vous de sélectionner les hyphes qui se propagent par extension polaire et évitez les hyphes présentant des ramifications latérales et/ ou apicales.
- Utilisez MTrackJ (Plugins | MTrackJ) plugin pour suivre les pointes hyphales en croissance (Figure 4E)27. Pour ajouter une piste, sélectionnez le bouton Ajouter dans la barre d’outils et placez le premier point à une pointe hyphale à l’aide du clic gauche de la souris. La série chronologique passera automatiquement à l’image suivante. Pour terminer le processus de suivi, double-cliquez avec la souris sur le point final (ou appuyez sur la touche Échap) (Figure 4F). Passez à un autre point d’intérêt (c.-à-d. la croissance de la pointe hyphale) dans le laps de temps initial et recommencez la procédure en mesurant le taux de croissance d’un autre hyphe.
REMARQUE: Pour installer MTrackJ, suivez les instructions présentées à https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ - Cliquez sur le bouton Mesure dans la boîte de dialogue MTrackJ (Figure 4G) pour ouvrir la table de sortie. Enregistrer les mesures de piste (Fichier | Enregistrer sous) au format de fichier souhaité (par exemple, csv), analysez-les et tracez-les(Figure 4H).
REMARQUE: En sélectionnant le bouton Film, un film est produit montrant l’image et la progression du suivi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Suite à ce protocole, nous avons capturé et analysé diverses images correspondant à différents stades de croissance/développement du champignon filamenteux A. nidulans. Les données présentées dans cette étude ont été traitées et analysées à l’aide du logiciel Fidji. Les mesures ont été enregistrées sous forme de fichiers csv, analysées statistiquement et préparées sous forme de graphiques à l’aide de logiciels statistiques commerciaux et / ou d’un langage de programmation Python utilisant des bibliothèques logicielles telles que pandas, numpy, statsmodels, matplotlib et seaborn. Plus de détails peuvent être trouvés dans les publications originales citées.
Afin d’interpréter la réponse des populations, il est important de déterminer l’hétérogénéité des paramètres clés au sein des populations et d’identifier efficacement les sous-populations physiologiquement distinctes28. La figure 5 montre la croissance de la souche mutante azhAΔ ngnAΔ, portant des délétions dans deux gènes, dont les produits sont impliqués dans la désintoxication et l’assimilation du phytoproduit toxique acide L-azétidine-2-carboxylique29, par rapport à la souche WT. En mesurant leur taux de croissance dans des cultures liquides submergées, nous détectons un taux de croissance statistiquement significatif inférieur du double mutant par rapport à la souche WT (t(715) = 20,61, p = <0 0001)(Figure 5A-B). Cette différence de croissance n’était pas détectable en mesurant uniquement la zone de colonie de ces souches(Figure 5C-D),soulignant que l’analyse microscopique d’une seule cellule est plus efficace pour déterminer de petites différences dans les taux de croissance qui sont difficiles à détecter avec l’observation macroscopique de la colonie.
L’imagerie vivante à long terme d’une seule cellule est d’une grande valeur dans l’effort visant à obtenir des informations spatiales et temporelles sur la dynamique des protéines cellulaires. L’imagerie cellulaire vivante à long terme (Figure 6, Vidéo 1) de la germination conidiale co-exprimant la protéine eisosomale pila du noyau marqué GFP et l’histone H1 mRFP montre que PilA30 forme des structures statiques à faible mobilité au niveau de la membrane plasmique fongique31,32. De plus, la figure 7 montre que les colorants fluorescents peuvent être utilisés pour l’imagerie en direct de souches cultivées sur un milieu agar, afin d’étudier la dynamique des organites et des structures cellulaires. Ici, FM4-6433 a été utilisé pour visualiser le réseau mitochondrial et le système vacuolaire chez A. nidulans.
Figure 1: Représentation schématique de la procédure de préparation de l’inoculum. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Représentation schématique de la procédure suivie pour l’imagerie des champignons filamenteux se développant sur un milieu agar. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Représentation schématique de la procédure suivie pour l’imagerie des champignons filamenteux se développant en milieu liquide. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Représentation schématique de la procédure d’analyse d’images. Étapes pour le traitement des images de microscopie time-lapse et la mesure du taux de croissance d’A. nidulans. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5: Comparaison des mesures traditionnelles de population avec des mesures unicellulaires. (A) Images représentatives en microscopie confocale de souches azhAΔ ngnAΔ à double délétion et WT, cultivées dans des cultures liquides immergées contenant de l’urée comme seule source d’azote à 25 °C. Toutes les souches ont été incubées pendant un total de 18 h, à 25 °C et les trames ont été capturées à des intervalles de 15 minutes. Des images de 2048 × 2048 pixels ont été collectées avec une taille de pixel de 115,02 x 115,02 nm à l’aide d’un microscope TCS SP8 MP (Leica, Allemagne) équipé d’un objectif d’immersion à l’huile HC Plan APO 63x, N.A. 1,40. (B) Les mesures de (A) sont tracées dans des diagrammes à boîtes et moustaches. La signification statistique a été analysée via t-Test et est représentée par des astérisques (***), indiquant p < 0,001. (C) Croissance à 25 °C de WT et contrainte à double délétion sur le MM solide. Les colonies ont été photographiées à différents intervalles de temps (18 h, 36 h et 72 h), calibrées spatialement et mesurées manuellement avec une règle dans le programme ImageJ. (D) Les mesures de la superficie des colonies présentées en (C) sont tracées sous forme de placettes à boîtes et moustaches. Les différences de superficie des colonies n’étaient pas statistiquement significatives entre les différents points temporels du double mutant par rapport à la souche WT (18h: t(8) = 0,69, p = 0,50, 36h: t(6) = 0,27, p = 0,5068, 72h: t(6) = 0,39, p = 0,70 ). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6: Imagerie à long terme par cellules vivantes de protéines d’intérêt co-exprimant la germination conique fusionnées avec des étiquettes fluorescentes génétiquement codées. (A) Projections d’intensité maximale (MIP) de 4 tranches générées dans le plan z, d’une souche co-exprimant PilA-GFP et H1-mRFP. Des conidies ont été repérées sur un milieu agar et incubées pendant environ 1 h à 30 °C afin de faciliter l’adhésion des cellules à la gélose. Le bloc de gélose contenant des conidies a été découpé, placé dans des puits d’une μ-lame et incubé pendant un total de 18 h, à 30 °C. Les images ont été capturées à des intervalles de 25 minutes, à l’aide d’un microscope TCS SP8 MP (Leica, Allemagne) équipé d’un objectif d’immersion à l’huile HC Plan APO 63x, N.A. 1,40 (avec une taille de pixel de 92,26 x 92,26 nm). Les images ont été obtenues en excitant GFP à une longueur d’onde de 488 nm et en détectant la fluorescence dans la bande spectrale allant de 495 à 558 nm, et en excitant mRFP à 561 nm de longueur d’onde et en détectant la fluorescence dans la bande spectrale allant de 580 à 660 nm. (B) Les mesures (vitesse de germination et extension de la pointe hyphale) de (A) sont tracées sous forme de graphique linéaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7: Étiquetage FM4-64 des hyphes en milieu solide. Les conidies d’une souche WT ont été cultivées sur des boîtes de Petri MM à 1 % d’agar pendant 16 h à 30 °C. Les germes en croissance ont été incubés pendant 20 min avec 10 μL de MM contenant 10 μM FM4-64. Après l’incubation, un bloc de gélose contenant des germes colorés a été découpé, placé dans 8 μ-slide suivi d’une poursuite de 47 minutes à 30 ° C. Les images ont été capturées toutes les 7 minutes à 30 °C à l’aide d’un microscope TCS SP8 MP équipé d’un objectif d’immersion à l’huile HC Plan APO 63x, N.A. 1,40 (avec une taille de pixel de 184,52 x 184,52 nm). Les images ont été obtenues en excitant FM4-64 à une longueur d’onde de 514 nm et en détectant la fluorescence dans la bande spectrale allant de 596 à 682 nm. Le signal de fluorescence FM4-64 est affiché sous forme d’image inversée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8: Premiers stades de formation des conidiophores. (A) Les conidies de souche WT ont été cultivées sur un milieu agar pendant 136 h à 30 °C, tranchées et placées dans des puits d’une lame μ. Les images étaient capturées toutes les 20 minutes. Des images de 2048 × 2048 pixels ont été collectées avec une taille de pixel de 245,2 x 245,2 nm à l’aide d’un microscope TCS SP8 MP (Leica, Allemagne), équipé d’un objectif d’immersion à l’huile HC Plan APO 63x, N.A. 1,40. Les images montrent la formation de vésicules de conidiophore (flèche noire) ainsi que la formation (flèche brune) et la maturation de métaux (flèche bleue). (B) Les mesures (vitesse de germination et extension unipolaire de la pointe hyphale) de (A) sont tracées sous forme de graphique linéaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Vidéo 1 : Imagerie cellulaire vivante à long terme de la germination conidiale co-exprimant PilA-GFP et H1-mRFP. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 2 : Premiers stades de la formation de conidiophores chez A. nidulans. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Figure S1 : Préparation de la suspension conidiale. En grattant avec un cure-dent stérile une surface d’environ 1 cm2 d’une plaque conidiée, on obtient une suspension d’environ 2 x 106 conidies/ml. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La surveillance de la croissance et du phénotype des cellules fongiques par microscopie time-lapse est une approche puissante pour évaluer le comportement cellulaire en temps réel et déterminer quantitativement et avec précision si un traitement médicamenteux particulier et / ou une intervention génétique entraîne une croissance cellulaire détectable ou des différences phénotypiques au fil du temps.
Dans cette étude, une méthodologie fiable d’imagerie des cellules vivantes a été décrite pour mesurer et analyser quantitativement le développement fongique, y compris la dynamique de la croissance des tubes germinaux et de la pointe hyphale chez A. nidulans. La surveillance des changements morphologiques au fil du temps, à l’aide de techniques de microscopie à lumière transmise, peut être très utile pour identifier les cellules stressées, mourantes ou mortes. Une connaissance détaillée de ces processus dynamiques au niveau de la cellule unique permet d’évaluer l’hétérogénéité au sein d’une population mixte de cellules et, dans une perspective à long terme, permet d’identifier des voies et des mécanismes détaillés par lesquels les cellules répondent aux signaux endogènes et environnementaux.
L’un des avantages de cette méthode est qu’elle est basée sur une approche d’imagerie sans étiquette (qui peut néanmoins être facilement combinée avec la microscopie à fluorescence) qui utilise les propriétés de réfraction de la lumière inhérentes aux cellules pour créer un contraste d’image sans introduire de colorants / étiquettes, ce qui peut confondre les résultats. Alors que les marqueurs fluorescents peuvent être utilisés pour marquer les compartiments cellulaires et les protéines et faciliter considérablement la segmentation et le suivi des cellules, la microscopie optique transmise contourne le besoin de cellules génétiquement modifiées, ce qui permet aux chercheurs d’éviter le coût et l’optimisation fastidieuse des colorants / étiquettes et d’éviter les effets probables de phototoxicité provenant de l’imagerie par fluorescence13,34.
Ce protocole convient à l’étude de la cinétique de croissance des champignons qui forment des hyphes ou des pseudohyphes. En outre, cette approche est très appropriée pour l’imagerie de différentes structures cellulaires de différentes souches et à différents stades de développement. Dans la figure 8 et la vidéo 2,nous présentons les premières étapes du développement d’A. nidulans conidiophore (c.-à-d. structures portant des spores asexuées). Il convient toutefois de noter que cette méthode n’est pas la plus adaptée à l’imagerie de la formation de conidiophores, car la famine carbone/azote et l’exposition à l’air, toutes deux nécessaires au développement des conidiophores, ne peuvent pas être normalisées par notre approche35.
En outre, ce protocole est mal adapté au suivi des biofilms fongiques, qui sont sujets à une extension verticale formant une colonie hétérogène dense associée à la surface composée d’hyphes filamenteux, de cellules pseudohyphales, de cellules sous forme de levure et de diverses formes de matrice extracellulaire36. Une autre limite de la technique est que, bien que l’analyse microscopique sans étiquette représente une méthode précise pour l’analyse qualitative et quantitative de la dynamique de germination/différenciation, l’évaluation manuelle de ces données prend beaucoup de temps, en particulier lorsque de nombreuses souches et/ou conditions sont examinées. Ainsi, les données de la microscopie d’imagerie time-lapse à haut débit doivent être analysées par un logiciel de calcul approprié permettant une analyse d’image automatisée ou semi-automatisée du développement hyphale et de la germination conidiale37,38,39.
En résumé, nous présentons ici un protocole pour analyser la cinétique de croissance fongique de manière reproductible et fiable sans avoir besoin d’une expérience préalable d’analyse d’image de la part de l’utilisateur. Ce protocole permet une quantification objective et précise de la croissance et de la différenciation fongiques, et fournit une approche d’imagerie complémentaire pour étudier les cycles de vie fongiques et la pathogénicitéfongique 37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été en partie soutenu par le projet « Une infrastructure de recherche grecque pour la visualisation et la surveillance des processus biologiques fondamentaux (BioImaging-GR) » (MIS 5002755) qui est mis en œuvre dans le cadre de l’action « Renforcement de l’infrastructure de recherche et d’innovation », financé par le programme opérationnel « Compétitivité, entrepreneuriat et innovation » (CRSN 2014-2020) et cofinancé par la Grèce et l’UE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
| 4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Biotin | Merck | B4639 | |
| Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
| Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
| Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
| Peptone | Millipore | 68971 | |
| Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
| Potassium chloride | Merck | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
| Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
| Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
| Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
| Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
| Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
| Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
| Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
| Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Sodium chloride | Merck | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
| WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
References
- Kumar, A. Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications. International Journal of Microbiology. 2020, 8894215 (2020).
- Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I. Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics. PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).
- Paterson, R. R. M., Lima, N. Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor. Microoraganism. 5 (3), (2017).
- Wang, C., Wang, S. Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements. Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).
- Etxebeste, O., Espeso, E. A. Aspergillus nidulans in the post-genomic era: a top-model filamentous fungus for the study of signaling and homeostasis mechanisms. International Microbiology. 23 (1), 5-22 (2020).
- Riquelme, M., et al. Fungal Morphogenesis, from the Polarized Growth of Hyphae to Complex Reproduction and Infection Structures. Microbiology and Molecular Biology Reviews MMBR. 82 (2), (2018).
- Athanasopoulos, A., André, B., Sophianopoulou, V., Gournas, C.
- Pantazopoulou, A., Peñalva, M. A. Organization and Dynamics of the Aspergillus nidulans Golgi during Apical Extension and Mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (20), 4335-4347 (2009).
- Bayram, Ö, Feussner, K., Dumkow, M., Herrfurth, C., Feussner, I., Braus, G. H. Changes of global gene expression and secondary metabolite accumulation during light-dependent Aspergillus nidulans development. Fungal Genetics and Biology. 87, 30-53 (2016).
- Yu, J. -H. Regulation of Development in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus. Mycobiology. 38 (4), 229-237 (2010).
- Tomkins, R. G. Measuring growth: The petri dish method. Transactions of the British Mycological Society. 17 (1-2), 150-153 (1932).
- Gifford, D. R., Schoustra, S. E. Modelling colony population growth in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Journal of Theoretical Biology. 320, 124-130 (2013).
- Kasprowicz, R., Suman, R., O'Toole, P. Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 89-95 (2017).
- Aknoun, S., et al. Quantitative phase microscopy for non-invasive live cell population monitoring. Scientific Reports. 11, (2021).
- Chessel, A., Carazo Salas, R. E. From observing to predicting single-cell structure and function with high-throughput/high-content microscopy. Essays in Biochemistry. 63 (2), 197-208 (2019).
- Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
- Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell Imaging of Filamentous Fungi Using Vital Fluorescent Dyes and Confocal Microscopy. Methods in Microbiology. 34, 63-87 (2004).
- Trinci, A. P. J. A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and Other Fungi. Journal of General Microbiology. 57 (1), 11-24 (1969).
- Lichius, A., Zeilinger, S. Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi. Journal of Visualized Experiments. (153), e60613 (2019).
- Oomen, L. C. J. M., Sacher, R., Brocks, H. H. J., Zwier, J. M., Brakenhoff, G. J., Jalink, K. Immersion oil for high-resolution live-cell imaging at 37°C: optical and physical characteristics. Journal of Microscopy. 232 (2), 353-361 (2008).
- Distel, M., Köster, R. In Vivo Time-Lapse Imaging of Zebrafish Embryonic Development. CSH protocols. 2007, (2007).
- Walzik, M., et al. A portable low-cost long-term live-cell imaging platform for biomedical research and education. Biosensors and Bioelectronics. 64, (2014).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Miura, K. Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences. F1000Research. 1000, 1494 (2020).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for Cell and Particle Tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1. Microbiology. 155, Pt 6 2040-2048 (2009).
- Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans. Scientific Reports. 11 (1), 7391 (2021).
- Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans. Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).
- Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans. Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).
- Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis. Scientific Reports. 5 (1), (2015).
- Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).
- Versari, C., et al. Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform. Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705 (2017).
- Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -H.
- Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F.
- Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns. Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).
- Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf. Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).
