Optogenética é uma ferramenta poderosa com aplicações abrangentes. Este protocolo demonstra como alcançar a expressão genética indutível à luz em embriões de zebrafish usando o sistema TAEL/C120 de resposta à luz azul.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Expressão GFP induzida pela luz em embriões de zebrafish usando o sistema OPtogenético TAEL/C120
Neste artigo
Resumo
Resumo
Sistemas de expressão genética indutíveis são uma ferramenta inestimável para estudar processos biológicos. Sistemas de expressão optogenética podem fornecer controle preciso sobre o tempo, localização e amplitude da expressão genética usando a luz como agente indutor. Neste protocolo, um sistema de expressão optogenética é usado para alcançar a expressão genética indutível à luz em embriões de zebrafish. Este sistema se baseia em um fator de transcrição projetado chamado TAEL baseado em um fator de transcrição ativado pela luz natural da bactéria E. litoralis. Quando iluminado com luz azul, o TAEL escurece, liga-se ao seu elemento regulatório cognato chamado C120 e ativa a transcrição. Este protocolo utiliza embriões transgênicos de zebrafish que expressam o fator de transcrição do TAEL sob o controle do onipresente promotor ubb. Ao mesmo tempo, o elemento regulatório C120 impulsiona a expressão de um gene repórter fluorescente (GFP). Usando um simples painel LED para fornecer luz azul ativante, a indução da expressão GFP pode ser detectada primeiro após 30 minutos de iluminação e atinge um pico de mais de 130 vezes de indução após 3h de tratamento leve. A indução de expressão pode ser avaliada por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) e por microscopia de fluorescência. Este método é uma abordagem versátil e fácil de usar para a expressão genética optogenética.
Introdução
Sistemas de expressão genética indutíveis ajudam a controlar a quantidade, o tempo e a localização da expressão genética. No entanto, alcançar o controle espacial e temporal exato em organismos multicelulares tem sido desafiador. O controle temporal é mais comumente alcançado adicionando compostos de pequenas moléculas1 ou ativação dos promotores de choque térmico2. Ainda assim, ambas as abordagens são vulneráveis a questões de tempo, força de indução e respostas de estresse fora do alvo. O controle espacial é alcançado principalmente pelo uso de promotores específicos do tecido3,mas essa abordage....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Este estudo foi realizado com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Califórnia Merced.
1. Travessia de zebrafish e coleta de embriões
- Mantenha linhas separadas de zebrafish transgênicos contendo o ativador transcricional TAEL ou o gene repórter controlado pelo C120 para minimizar a ativação espúria.
- Cruze 6-8 zebrafish adultos de cada linha usando métodos padrão9 para produzir embriões transgênicos duplos que contêm os componentes TAEL e C120(Figura 1B).
NOTA: Alternativamente, ambos os componentes podem ser exp....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Para esta demonstração, uma linha de repórteres GFP responsiva C120 -responsiva (Tg(C120F:GFP)ucm107)foi cruzada com uma linha transgênica que expressa TAEL-N onipresentemente a partir da ubiquitina b (ubb) promotor(Tg(ubb:TAEL-N)ucm113)) para produzir embriões transgênicos duplos contendo ambos os elementos. 24 h pós-fertilização, os embriões foram expostos à ativação da luz azul, pulsado a uma frequência de 1 h on/1 h off. A indução da expressão GFP foi quantifi.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Este protocolo descreve o uso do sistema optogenético TAEL/C120 para alcançar a expressão genética indutível da luz azul. Este sistema consiste em um ativador transcricional, TAEL, que escurece após a iluminação com luz azul e ativa a transcrição de um gene de interesse a jusante de um elemento regulatório C120. A expressão induzida de um repórter do GFP pode ser detectada após apenas 30 minutos de exposição à luz, sugerindo que essa abordagem possui cinética relativamente rápida e responsiva.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Nenhum conflito de interesses foi declarado.
Agradecimentos
Agradecemos a Stefan Materna e aos membros dos laboratórios Woo e Materna por sugestões úteis e comentários sobre este protocolo. Agradecemos a Anna Reade, Kevin Gardner e Laura Motta-Mena por valiosas discussões e insights enquanto desenvolvem este protocolo. Este trabalho foi apoiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH; R03 DK106358) e o Comitê Coordenador de Pesquisa do Câncer da Universidade da Califórnia (CRN-20-636896) para s.W.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ferramenta de ilustração científica baseada na web BioRender | Câmera | ||
| digital CCD https://biorender.com/ Color | Lumenara | 755-107 | |
| Console compacto de medidor de energia e energia, LCD digital de 4 | Thorlabs | PM100D | |
| , 545 nm | Olympus | ET545 / 25x | |
| illustra RNAspin Mini kit | GE Healthcare | 95017-491 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (azul e branco) | Amazon | B017GWDF7E | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | |
| NEARPOW Interruptor de temporizador digital programável | Amazon | B01G6O28NA | |
| PerfeCTa SYBR verde mistura rápida | Quantabio | 101414-286 | |
| Software de processamento de imagem | Photoshop Adobe | ||
| Prism software de gráficos e estatísticas | GraphPad | ||
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
| QuantStudio 3 Sistema de PCR em Tempo Real | Applied Biosystems | A28137 | |
| Estereomicroscópio | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine (Etil 3-aminobenzoato metanossulfonato) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| X-Cite 120 Fonte de luz LED de fluorescência | Excelitas | 010-00326R | Descontinuado. Ele foi substituído pelo X-Cite mini+ |
Referências
- Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Halloran, M. C., et al.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
