Summary
Detta arbete dokumenterar en enkel metod för att skapa syntetiska antigenkontroller för immunhistokemi. Tekniken är anpassningsbar till en mängd olika antigener i ett brett spektrum av koncentrationer. Proverna ger en referens för att bedöma prestanda och reproducerbarhet inom och mellan analyser.
Abstract
Immunohistokemi (IHC) analyser ger värdefulla insikter i proteinuttrycksmönster, vars tillförlitliga tolkning kräver väl karakteriserade positiva och negativa kontrollprover. Eftersom lämpliga vävnads- eller cellinjekontroller inte alltid är tillgängliga kan en enkel metod för att skapa syntetiska IHC-kontroller vara fördelaktig. En sådan metod beskrivs här. Det är anpassningsbart till olika antigentyper, inklusive proteiner, peptider eller oligonukleotider, i ett brett spektrum av koncentrationer. Detta protokoll förklarar de steg som krävs för att skapa syntetiska antigenkontroller, med hjälp av som exempel en peptid från den humana erytroblastiska onkogenen B2 (ERBB2 / HER2) intracellulära domänen (ICD) som känns igen av en mängd diagnostiskt relevanta antikroppar. Seriella utspädningar av HER2 ICD-peptiden i bovin serumalbuminlösning (BSA) blandas med formaldehyd och upphettas i 10 minuter vid 85 °C för att stelna och tvärbinda peptid/BSA-blandningen. Den resulterande gelén kan bearbetas, sektioneras och färgas som en vävnad, vilket ger en serie prover av kända antigenkoncentrationer som spänner över ett brett spektrum av färgningsintensiteter.
Detta enkla protokoll överensstämmer med rutinmässiga histologilabbprocedurer. Metoden kräver endast att användaren har en tillräcklig mängd av det önskade antigenet. Rekombinanta proteiner, proteindomäner eller linjära peptider som kodar för relevanta epitoper kan syntetiseras lokalt eller kommersiellt. Laboratorier som genererar interna antikroppar kan reservera alikvoter av det immuniserande antigenet som syntetiskt kontrollmål. Möjligheten att skapa väldefinierade positiva kontroller över ett brett spektrum av koncentrationer gör det möjligt för användare att bedöma analysprestanda inom och mellan laboratorier, få insikt i det dynamiska omfånget och linjäriteten hos deras analyser och optimera analysförhållandena för deras specifika experimentella mål.
Introduction
Immunohistokemi (IHC) möjliggör känslig och specifik, rumsligt exakt detektion av målantigener i formalinfixerade, paraffininbäddade (FFPE) vävnadssektioner. IHC-färgningsresultat kan dock påverkas av flera variabler, inklusive varm och kall ischemitid, vävnadsfixering, vävnadsförbehandling, antikroppsreaktivitet och koncentration, analysdetekteringskemi och reaktionstider1. Följaktligen kräver reproducerbar prestanda och tolkning av IHC-reaktioner noggrann kontroll av dessa variabler och användning av väl karakteriserade positiva och negativa kontrollprover. Ofta använda kontroller inkluderar paraffininbäddade vävnader eller odlade cellinjer som är kända från oberoende analyser för att uttrycka antigenet av intresse, men sådana prover är inte alltid tillgängliga1. Dessutom förstås uttrycksnivåerna för målantigenerna i vävnader och cellinjekontroller i allmänhet endast kvalitativt och kan vara varierande. Kontroller som innehåller reproducerbara, exakt kända koncentrationer av målantigen kan hjälpa till att optimera IHC-reaktionsbetingelserna. En allmän metod, anpassningsbar till en mängd olika antigentyper i ett fysiologiskt relevant koncentrationsområde för att skapa syntetiska IHC-kontrollprover, har beskrivits av författarna2. Ett detaljerat protokoll tillhandahålls här för skapande och användning av denna typ av standard.
Lämpliga kontroller är avgörande för en giltig tolkning av IHC-testerna 1,3,4. Vävnader, odlade celler och peptidbelagda substrat har använts som IHC-kontroller enligt utredarnas specifika behov. Fördelarna och begränsningarna med att använda vävnader som IHC-kontroller har diskuterats utförligt 1,4. För många antikroppar kan lämpliga kontroller väljas från utvalda normala vävnader som innehåller cellpopulationer som uttrycker målantigenet över ett brett dynamiskt intervall. Vävnadskontroller är mindre lämpliga när målantigenet inte är väl karakteriserat med avseende på uttrycksställe eller förekomst, eller när potentiellt korsreagerande antigener uttrycks samtidigt i samma celler eller vävnadsställen. I dessa sammanhang kan block av odlade cellinjer som uttrycker antigenet av intresse vara till hjälp. För att ge ytterligare bevis på målspecificitet kan cellinjer konstrueras för att över- eller underuttrycka målantigen. Till exempel användes ett sådant tillvägagångssätt nyligen för att utvärdera en mängd olika anti-PD-L1-analyser med användning av en vävnadsmikroarray av isogena cellinjer som uttrycker ett intervall av PD-L1-antigen5. Praktiska begränsningar för den rutinmässiga användningen av cellinjeblock inkluderar kostnaden och tiden som krävs för att producera tillräckligt med cellnummer och det faktum att uttrycket av vissa antigener kanske inte är tillförlitligt konsekvent, även inom klonala cellinjer6. Syntetiska peptider är ett tredje alternativ för IHC-kontroller för antikroppar som känner igen korta linjära epitoper. Steven Bogen och kollegor har publicerat mycket om användningen av peptider kopplade till ytan av glasskivor 7,8 och glaspärlor9. En studie av denna grupp visade att kvantitativ analys av peptidbaserade IHC-kontroller kunde upptäcka färgningsprocessvariation missad av kvalitativ utvärdering av vävnadskontroller analyserade parallellt10. Även om standarder som använder pärlbaserade antigener kan vara allmänt tillämpliga, är många detaljer proprietära för författarna, vilket begränsar utbredd användning.
Ett annat tillvägagångssätt för IHC-standarder innehåller målantigener i artificiellt skapade proteingeler. Detta koncept demonstrerades först av Per Brandtzaeg 1972 i en studie där normalt kaninserum polymeriserades med användning av glutaraldehyd11. Små block av den resulterande gelén blötläggdes sedan i 1-4 veckor i lösningar innehållande immunoglobulinantigen av intresse vid olika koncentrationer. Efter alkoholfixering och paraffininbäddning visade sig delar av de resulterande kontrollerna fläcka med intensiteter som motsvarade logaritmen för antigenlösningarna i vilka de hade blötläggts. Senare framställde utredare glutaraldehydkonjugat av specifika aminosyror i utspädda BSA- eller hjärnhomogenatlösningar som positiva kontroller i immunelektronmikroskopistudier 12,13. Nyare arbete undersökte användningen av geler tillverkade av formaldehydfixerade proteinlösningar som surrogater för FFPE-vävnad i masspektrometrianalys14. Ett annat nyligen utfört arbete undersökte strukturen och egenskaperna hos geler som bildas genom upphettning av humana eller bovina serumalbuminlösningar vid olika koncentrationer och pH15. Dessa författare fann att serumalbumin bildar tre typer av geler som skiljer sig åt i mekanisk elasticitet, sekundär strukturbevarande och fettsyrabindande förmåga beroende på experimentella förhållanden. Tillsammans visar dessa dokument den allmänna genomförbarheten av det tillvägagångssätt som används här. Proteinlösningar med definierad sammansättning skapar vävnadsliknande geler som kan bearbetas, sektioneras och färgas ytterligare med rutinmässiga histologiska metoder.
Detta protokoll beskriver bildandet av en syntetisk IHC-kontroll gjord av bovint serumalbumin (BSA) polymeriserat med värme och formaldehyd. Gelerna kan innehålla en mängd olika antigener, inklusive proteiner i full längd, proteindomäner och linjära peptider, såväl som icke-proteinantigener inklusive oligonukleotider2. Denna demonstration använder ett exempelantigen en linjär peptid som kodar för C-terminala 16 aminosyror av det humana ERBB2 (HER2 / neu) proteinet TPTAENPEYLGLDVPV-COOH (se materialtabell). Denna sekvens inkluderar de epitoper som känns igen av tre kommersiellt tillgängliga, diagnostiskt relevanta antikroppar inklusive Herceptest polyklonalt reagens (ENPEYLGLDVP) och de monoklonala antikropparna CB11 (AENPEYL) och 4B5 (TAENPEYLGL) (se materialtabell)16.
Metoden som demonstreras här använder lättillgängliga reagenser med hjälp av processer och tekniker som är bekanta för alla praktiserande histologilaboratorier. Den viktigaste begränsningen är behovet av att identifiera och köpa målantigenerna, vilket i många fall kan uppnås till en relativt blygsam kostnad. Eftersom dessa syntetiska kontroller är av helt definierad sammansättning och gjorda med enkla metoder kan de implementeras i många laboratorier med reproducerbara resultat. Deras användning kan underlätta en objektiv, kvantifierbar utvärdering av IHC-färgningsresultat och möjliggöra större reproducerbarhet inom och mellan laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av lagerlösning och verktyg
- Bered 20 ml av en 25 % w/v BSA-lösning genom att blanda 5 g BSA-pulver i 14 ml PBS, pH 7,2 i ett 50 ml koniskt rör tills det är jämnt dispergerat. Virvel vid behov för att sprida BSA-pulvret.
- Förvara lösningen över natten vid 4 °C för att möjliggöra fullständig upplösning. Justera den slutliga volymen till 20 ml med PBS för att skapa en 25% w / v lagerlösning.
- Bered 20 ml av en 31,3 % w/v BSA-lösning genom att blanda 6,26 g BSA-pulver i 13 ml PBS, pH 7,2 i ett 50 ml koniskt rör tills det är jämnt dispergerat. Förvara lösningen över natten vid 4 °C för att möjliggöra fullständig upplösning. Justera den slutliga volymen till 20 ml med PBS för att skapa en 31.3% w / v lagerlösning.
- Förvärm ett värmeblock till 85 °C.
OBS: Protokollet nedan skapar peptid / BSA-geler med volymer på 1,26-1,4 ml bildade i 1,5 ml mikrocentrifugrör. För att använda mindre volymer, till exempel när antigenlagren är begränsande, förbered gelerna i PCR-rör och använd en termocykler inställd på 85 °C som ett värmeblock. - Testa att BSA/formaldehydblandningen bildar en gel som förväntat genom att blanda 700 μL 25% BSA-lösning med 700 μL 37% formaldehyd. Blanda väl genom att pipettera upp och ner 5 gånger inom 5-10 s. Undvik att skapa luftbubblor.
VARNING: Koncentrerad formaldehyd är giftig; Använd med lämpliga säkerhetsåtgärder. - Omedelbart efter blandning av BSA- och formaldehydlösningar, placera det slutna mikrocentrifugröret i ett värmeblock vid 85 °C i 10 min. Ta bort röret från värmeblocket och låt det svalna. Bekräfta att gelén har bildats som förväntat.
2. Beredning och utspädning av peptider
- Erhålla 5-20 mg frystorkad peptid av önskad sekvens.
OBS: De C-terminala 16 aminosyrorna i den humana ERBB2 intracellulära domänen som känns igen av 4B5 är TPTAENPEYLGLDVPV-COOH.- Tillsätt 4 aminosyror till N-terminalen, acetyl-YGSG och C-terminalen, GSGC-amid för att underlätta tvärbindning av peptiden till BSA och ge avstånd mellan BSA-molekylen och peptidepepittopen.
OBS: Den fullständiga sekvensen är: acetyl-YGSGTPTAENPEYLGLDVPVGSGC-amid. - Om så önskas, använd andra N- och C-terminala aminosyrasekvenser för att förlänga kärnpeptidepiteptopen.
OBS: Effekten av olika sekvenser varierar med olika kombinationer av antikroppar och epitoper. Tillsatsen av den C-terminala peptiden minskar bindningen av vissa antikroppar till C-terminala epitoper. I sådana fall utelämnar du denna sekvens. - Bekräfta att peptider från kommersiella källor levereras med >95% renhet, vars sammansättning bekräftas av HPLC och masspektrometrianalys.
- Tillsätt 4 aminosyror till N-terminalen, acetyl-YGSG och C-terminalen, GSGC-amid för att underlätta tvärbindning av peptiden till BSA och ge avstånd mellan BSA-molekylen och peptidepepittopen.
- Beräkna de nödvändiga volymerna för peptidlagerlösningarna 5x (1,25 E-2 M). Med hänvisning till tabell 1, kolumnerna C-E, ange värden för antigenmolekylvikt (g/mol), procent antigenrenhet (0-100) och antigenmassa (mg).
OBS: Volymen lösningsmedel (i μL) för att återsuspendera provet för att uppnå en stamlösning på 1,25 E-2 M är 800 x antigenmolekylvikt x procent antigenrenhet / antigenmassa.- Förbered och märk tydligt åtta 1,5 ml mikrocentrifugrör.
OBS: Rören kommer att innehålla 5x peptidbestånd i ett lösningsmedel, 1x peptidbestånd i ett lösningsmedel, fem 10x seriella utspädningar av 2,5 E-4 M till 2,5 E-8 M peptid / BSA / formaldehydgel och en negativ kontrollgel innehållande BSA / formaldehyd som saknar tillsatt antigen. Alla gelprover ser identiska ut. När du förbereder flera uppsättningar peptidutspädningar samtidigt, var noga med att märka och identifiera alla rör och bearbetningskassetter korrekt. Använd färgkodade mikrocentrifugrör och bearbetningskassetter där det är möjligt för att minimera felidentifiering.
- Förbered och märk tydligt åtta 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Bered en 5x peptidlösning vid 1,25 E-2 M genom att återsuspera hela massan av frystorkad peptid (20 mg för ERBB2-peptiderna) i 60 μL av lämpligt lösningsmedel.
I det här exemplet tillsattes dimetylformamid (DMF) direkt till leverantörens behållare.- Inspektera lösningen för att säkerställa att peptiden är helt upplöst. Tillsätt vid behov ytterligare lösningsmedel och/eller ultraljudsbehandling av provet tills peptiden är helt upplöst, var noga med att inte överskrida den volym som beräknas i tabell 1 för 5x peptidstocken.
VARNING: DMF är giftigt; Använd med lämplig försiktighet.
OBS: Beroende på aminosyrasekvensen och motsvarande hydrofobicitet och laddning kan peptider vara lösliga i DMF, dimetylsulfoxid (DMSO), rent vatten eller utspädda lösningar av ättiksyra, myrsyra eller ammoniumbikarbonat. Peptidegenskaper kan beräknas med hjälp av en mängd olika onlineverktyg17. Vissa peptid leverantörer kan föreslå lösningsmedel som är lämpliga för specifika sekvenser. - Tillsätt lösningsmedel vid behov för att få volymen av 5x peptidlagret till den slutliga volymen beräknad i tabell 1. Virvel i 5 s och centrifugera vid rumstemperatur vid 5000 x g i 5 s. Peptidberedningslösningar kan förvaras vid -80 °C.
- Inspektera lösningen för att säkerställa att peptiden är helt upplöst. Tillsätt vid behov ytterligare lösningsmedel och/eller ultraljudsbehandling av provet tills peptiden är helt upplöst, var noga med att inte överskrida den volym som beräknas i tabell 1 för 5x peptidstocken.
- Med hänvisning till tabell 2, kolumn C, bered 150 μl 1x peptidstamlösning (2,5 E-3 M) genom att späda ut 30 μL av 5x peptidstocken till 120 μL lösningsmedel (DMF detta exempel). Virvel i 5 s och centrifugera vid rumstemperatur vid 5000 x g i 5 s.
- Med hänvisning till tabell 2, kolumn D, bered 700 μl 5 E-4 M peptid/BSA-lösning (utspädning 1) genom att späda ut 140 μl 1x peptidstock till 560 μl 31,3 % BSA/PBS, pH 7,2. Virvel i 5 s och centrifugera vid rumstemperatur vid 5000 x g i 5 s.
OBS: Den slutliga BSA-koncentrationen av denna lösning är 25% (w / v). - Med hänvisning till tabell 2, kolumnerna E-H, bered fyra på varandra följande 10x seriella utspädningar av 5 E-4 M peptid/BSA-beståndet genom att tillsätta 70 μl peptid/BSA-lösning till 630 μl 25 % BSA/PBS, pH 7,2. Virvel i 5 s och centrifugera vid rumstemperatur vid 5000 x g i 5 s.
OBS: Efter detta steg kommer det att finnas fem 10-faldiga seriella utspädningar av peptid (5 E-4 M till 5 E-8 M) i 25% BSA / PBS, pH 7,2. De första fyra proverna kommer att innehålla 630 μl. Det sista provet kommer att innehålla 700 μl. - Med hänvisning till tabell 2, kolumn I, bered ett negativt BSA-kontrollprov som innehåller 700 μl 25 % BSA/PBS, pH 7,2 (figur 1A).
3. Förbereda BSA-peptidgeler
- Kontrollera att värmeblocket eller termocyklern är stabila vid 85 °C.
- Se tabell 3, kolumnerna B-E. Arbeta ett prov i taget, tillsätt till det första 25% BSA / peptidprovet (utspädning 1) 630 μL 37% formaldehyd. Blanda väl genom att pipettera upp och ner 5 gånger inom 5-10 s. Undvik att skapa luftbubblor.
VARNING: Koncentrerad formaldehyd är giftig; Använd med lämpliga säkerhetsåtgärder.- Efter blandning av peptid-/BSA- och formaldehydlösningarna, placera det slutna mikrocentrifugröret i ett värmeblock vid 85 °C i 10 minuter.
OBS: Blanda BSA-peptidlösningen och formaldehyd noggrant, men spendera inte mer än 10 s på att pipettera blandningen innan du placerar provet på värme. Eftersom formaldehydkorsbindning börjar omedelbart kan gelén bildas annorlunda om proceduren varieras för olika prover. Den slutliga BSA-koncentrationen i dessa geler är 12,5% (w / v). Slutliga BSA-koncentrationer mindre än 10% kan ge geler som inte stelnar; slutliga BSA-koncentrationer större än 16% kan ge geler mer spröda och svåra att sektionera efter bearbetning. - Upprepa steg 3.2 och 3.2.1 för var och en av utspädningarna 2–4.
- Upprepa steg 3.2 och 3.2.1 för spädning 5, men tillsätt 700 μL 37 % formaldehyd, en volym som är lika med 700 μl BSA-antigenlösning.
- Se tabell 3 kolumn G; Upprepa steg 3.2 och 3.2.1 för det negativa kontrollprovet och tillsätt 700 μl 37 % formaldehyd, en volym som är lika med 700 μl negativ BSA-lösning.
- Efter blandning av peptid-/BSA- och formaldehydlösningarna, placera det slutna mikrocentrifugröret i ett värmeblock vid 85 °C i 10 minuter.
- Ta bort rören från värmeblocket efter 10-12 min. Uppvärmningstiden bör vara så konsekvent som möjligt för varje prov. Låt gelerna svalna på bänkskivan i 5-10 min (figur 1B).
- Använd en ren, flexibel engångslaboratoriespatel, ta bort gelprovet i ett stycke från mikrocentrifugröret och placera det i en förseglad behållare som innehåller minst 15 ml neutralt buffrat formalin (NBF) med en separat behållare med NBF för varje prov.
- Alternativt kan du skära av botten av mikrocentrifugröret med ett nytt rakblad med en kant och skjuta ut gelén från botten med luft eller en lämplig sond (figur 1C-G).
OBS: De stelnade formaldehyd/ BSA-gelerna kan förbli i mikrocentrifugrören vid rumstemperatur i upp till 24 timmar. Att lämna gelerna i mikrocentrifugröret i mer än 24 timmar kan få dem att bli spröda och svårare att bearbeta och sektionera.
- Alternativt kan du skära av botten av mikrocentrifugröret med ett nytt rakblad med en kant och skjuta ut gelén från botten med luft eller en lämplig sond (figur 1C-G).
4. Trimning, bearbetning och inbäddning av BSA-geler
- Trimma gelkonen till cylindriska skivor som är cirka 5 mm tjocka med en ren rakhyvel med en kant (figur 1H, I). Slå in skivorna i en biopsiomslag, placera en större gelskiva i en kassett (som ska användas i pilotstudien i steg 5) och de återstående gelskivorna tillsammans i en andra kassett (figur 2A,E) för användning i vävnadsmikroarray (TMA) konstruktion i steg 6. Placera de inslagna gelskivorna i tydligt märkta vävnadsbehandlingskassetter.
- Placera de kassetterade gelerna i minst 15 ml 10% NBF per gelprov före bearbetning, med en separat behållare med NBF för varje prov. Geler kan förbli i 10% NBF i 6-48 h.
- Bearbeta gelerna i en automatiserad histologivävnadsprocessor, enligt ett stort vävnadsschema med tryck och vakuum. Varje steg tar 1 h: 10% NBF, 70% etanol, 95% etanol (upprepa två gånger), 100% etanol (upprepa två gånger), xylener (upprepa tre gånger), paraffin vid 60 °C (upprepa tre gånger).
OBS: För utredare som väljer att bearbeta prover manuellt, följ samma sekvens av reagenser och tider. - När provbehandlingen är klar, ta bort kassetterna från vävnadsprocessorn och flytta dem till paraffininbäddningscentret.
- Packa upp geler från biopsiomslaget och bädda in gelerna i paraffin. För varje prov, bädda in en skiva gel i en liten 15 mm x 15 mm form (figur 2B-D) och de återstående gelskivorna tillsammans i en andra större form (figur 2F-H). Det första blocket med ett prov kommer att användas för att testa peptidgelen i en pilotstudie. Det andra blocket kan användas för TMA-konstruktion.
5. Pilotutvärdering av peptidutspädningsserien
- För varje peptidutspädningsserie, planera att skapa två glasskivor som innehåller totalt 6 separata sektioner: en sektion från vart och ett av de fem utspädningsserieproverna, plus en sektion från det negativa kontrollprovet endast BSA.
- Skär på den första glasskivan en 4 μm tjock sektion från vart och ett av de mindre blocken som innehåller en gelskiva med de tre högsta peptidkoncentrationerna (2,5 E-4 M till 2,5 E-6 M).
- Skär på en andra bild en 4 μm tjock sektion från varje block med de två lägsta peptidkoncentrationerna (2,5 E-7 M och 2,5 E-8 M) och en sektion från endast BSA-kontrollblocket. Anteckna ordningen på proverna på bilderna.
OBS: Förvänta dig att de paraffininbäddade gelerna skär smidigt och producerar enhetliga sektioner utan fragmentering, rivning eller pratande artefakt. Om vissa paraffininbäddade gelprover är svåra att sektionera, blötlägg kort blockytan i iskallt destillerat vatten innan du sektionerar. Experimentera vid behov med olika blötläggningstider eller med olika lösningar (t.ex. ammoniakvatten). - Torka utstrykarna vid rumstemperatur (ca 23 °C) i 24 timmar följt av 60 °C i 30 minuter efter sektionering.
- Färga de två objekten som förberetts för varje peptid med önskad antikropp enligt standard IHC-protokoll.
OBS: Den primära antikroppskoncentrationen på objektsglas som användes för kaninmonoklonal 4B5 i denna demonstration var 1,5 ug/ml.- Förvänta dig att se en relativt enhetlig signal inom varje gelsektion, med de olika gelproverna som visar ett intervall av signalintensitet som motsvarar peptidutspädningarna.
- Om resultaten för pilotstudien är tillfredsställande, konstruera en TMA från geldonatorblocken som innehåller olika koncentrationer av peptidantigen, som beskrivs i nästa steg i protokollet.
6. BSA gel TMA konstruktion
- Konstruera en vävnadsmikroarray som innehåller dubbla kärnor med en diameter på 1 mm från donatorblock som innehåller enbart BSA-gel och BSA-geler som innehåller alla fem utspädningar av ERBB2-peptid.
OBS: Om så önskas, inkludera BSA-geler som innehåller samma fem utspädningar av en icke-målpeptid som ytterligare negativa kontroller. Om så önskas, inkludera kärnor av representativa ERBB2-uttryckande cellinjer som positiva kontroller. - Skär 4 μm tjocka delar av TMA och färga med 1,5 ug / ml anti-ERBB2 / HER2 / neu kanin monoklonal 4B5 (se materialtabell) enligt laboratoriestandardprotokoll.
- Bedöm den resulterande fläckintensiteten kvalitativt genom inspektion eller kvantitativt genom digital bildskanning och analys (figur 3A,B).
OBS: Eftersom digital bildanalys inte är i fokus för detta protokoll lämnas dessa steg åt läsaren att utföra enligt deras önskemål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Peptider bör lösas upp helt i ett lämpligt lösningsmedel vid rumstemperatur för att bilda en optiskt klar lösning. Om synligt partikelmaterial fortfarande finns kvar efter 30–60 minuter kan det vara till hjälp att tillsätta ytterligare volymer av det ursprungliga lösningsmedlet eller ett alternativt lösningsmedel som inte överstiger den avsedda volymen av den 5x peptidbeståndslösning som beräknas i tabell 1. På samma sätt bör den kombinerade peptid/BSA-lösningen förbli genomskinlig (figur 1A).
Peptid/ BSA-gelprover bör bilda en ogenomskinlig gummimassa efter uppvärmning med 37% formaldehyd (figur 1B-I). Mindre sprickbildning av gelproverna kan uppstå under avlägsnandet från mikrocentrifugrören (figur 3A). Dessa bör inte störa efterföljande steg. Paraffininbäddade gelprover ska delas smidigt utan att riva eller prata. Geler som visar oregelbundna utrivning (figur 3B) kan dra nytta av mindre aggressiv blockvändning och/eller kort blötläggning i isvatten eller ammoniakvatten. Områden med varierande reducerad signal i ett vattenstämpelmönster kan uppstå när fördelningen av ett eller flera färgningsreagenser är ojämn (figur 3C). Den fokalt ökade makroskopiska signalen kan ses om reagens fastnar under gelsektionerna i något skede av färgningsprocessen (figur 3C). Användningen av positivt laddade glasglas och noggrann torkning av bilder efter sektionering kan minska denna artefakt. Mikroskopiska områden av den reducerade signalen kan uppstå om det finns en ojämn fördelning av antigen i gelmatrisen eller om variation i den lokala gelstrukturen begränsar antikropp-antigeninteraktion (figur 3D). Ofullständig peptidupplösning kan resultera i spridda områden med fokalt intensiv signal i en lågintensiv bakgrund (figur 3E).
Efter att ha reagerat med en lämplig antikropp bör negativa kontrollgelprover endast för BSA visa minimal signal (figur 4A), optimalt mindre än 2% -3% av det dynamiska analysområdet. Mycket sällan kan det finnas signifikant antikroppsinteraktion med BSA-gelmaterial som saknar antigen som inte kan elimineras genom förändrade reaktionsförhållanden. Signalintensiteten i ett enskilt gelprov bör vara relativt enhetlig, med ökande signal i prover med ökande antigenkoncentrationer (figur 4A,B). Den absoluta signalintensiteten varierar beroende på antigen-antikroppskombinationen och förhållandena som används för IHC-fläcken. Beroende på färgningsförhållandena kan det finnas en tröskelantigenkoncentration under vilken signalen kommer att vara i bakgrunden och en antigenkoncentration över vilken signalen kommer att mättas. I vissa analyser kan signalen ovanför bakgrunden vara synlig i prover med så lite som 2,5 E-8 M peptid2. Vid replikatfärgningskörningar bör signalintensiteten för sektioner som skärs från varje gelprov kunna reproduceras från körning till körning. I denna tillämpning av anti-HER2-antikropp färgades de allmänt använda MDA-175- och SK-BR-3-cellinjekontrollerna i samma experiment för att jämföra med peptidkontrollerna. Cellinjerna visar signalens förväntade fördelning och intensitet: >10% av MDA-175-cellerna (HER2 1+) visar svag (figur 4C,D), ofullständigt omkretsmembranös färgning och >10% av SK-BR-3-cellerna (HER2 3+) (figur 4E,F) visar intensiv helt omkretsmembranös färgning.
Möjliga orsaker till frånvaron av signal inkluderar: (1) peptidsekvensen är inte ett funktionellt mål för antikroppen; (2) färgningsprotokollet är inte optimerat för att detektera antigenkoncentrationerna i gelerna; (3) fel peptidprov färgades; (4) reagens- eller instrumentfel. Möjliga orsaker till signal i prover där det inte förväntas inkluderar icke-specifik reaktivitet hos primära antikropps- eller detektionsreagenser med BSA-gelen eller peptidproverna som var felmärkta under beredningen.
(A) 25% (w / v) BSA (utan tillsatt peptid) i PBS, pH 7,2. (B) Gel bildad genom blandning av lika stora volymer av 25% BSA och 37% formaldehydlösning och upphettning till 85 ° C i 10 min (C-G) Efter kylning vid rumstemperatur i 5-10 min kan BSA-gelén avlägsnas från mikrocentrifugröret med hjälp av en flexibel engångsspatel. (H-I) Den intakta gelén skivas i skivor ~ 5 mm tjocka som förberedelse för bearbetning och inbäddning. Skalstrecken är 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Beredning av BSA-gelprover för bearbetning och inbäddning. (A-D) Framställning av ett paraffinblock innehållande en enda skiva BSA-gel. (A) BSA-antigengelen förpackas i biopsivävnad före bearbetning. (B) Efter paraffininfiltration placeras den nu genomskinliga gelskivan på det inbäddande mittuppvärmda steget och packas upp. (C) Den enda gelskivan placeras i en 15 mm x 15 mm inbäddningsform som innehåller flytande paraffin. (D) Det färdiga paraffinblocket är klart för sektionering. (E-H) Framställning av ett paraffinblock innehållande flera skivor BSA-gel. När det gäller figur A-D ovan bearbetas de återstående gelproverna och inbäddas i ett block för att tillhandahålla material för TMA-konstruktion. Skalstrecken är 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Gelberedning och färgningsartefakter. Fokal mörkning kan återspegla reagensfångst under sektionen. (B) Rivning av gelmaterial (ses i färgade sektioner som oregelbundna hålrum) kan bero på över- eller underblötläggning av blocket före sektionering. (C) Oregelbundna färgmönster för vattenstämpel kan orsakas av ojämn reagensfördelning vid ett eller flera färgningssteg. (D) Mikroskopisk mönstring av BSA-peptidstrukturen kan ses, särskilt vid högre peptidkoncentrationer. (E) Ofullständig peptidupplösning kan ge ett stjärnhimmelmönster med en fokalsignal i en lågintensiv bakgrund. Skalstänger är 200 μm (A-C) eller 20 μm (D,E). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Färgad ERBB2/HER2-peptid TMA med ERBB2/HER2 1+ och 3+ cellinjer. (A) Replikerade TMA-kärnor (övre och nedre rader) som inte innehåller någon peptid (vänster kolumn) eller ERBB2-peptid vid koncentrationer från 2,5 E-8 M till 2,5 E-4 M färgades med anti-HER2 / neu-klon 4B5 enligt tillverkarens rekommendationer. Kärnor med ökande peptidkoncentrationer visar en graderad signalökning. (B) TMA-kärnorna som visas i panel A skannades digitalt och den genomsnittliga pixelintensiteten [0,01 x (100 - % transmittans) x 255] plottas jämfört med peptidkoncentrationen. (C-F) Cellinjepositiva kontroller innehållande ERBB2/HER2-uttryckande cellinjer MDA-175 (HER2 1+, C,D) och SK-BR-3 (HER2 3+, E,F) inkluderades i TMA innehållande BSA-peptidgelerna så att signalintensiteten i cellinjerna och BSA-peptidgelerna kunde jämföras på samma bild. Skalstängerna är 500 μm (A), 250 μm (C,E) och 20 μm (D,F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| A | B | C | D | E | F | G | H | |||
| Peptid namn | Peptid sekvens | MW (Da) | Peptid renhet (%) | Peptidmassa tillhandahålls (mg) | Mol peptid i provet (inkluderar korrigering för renhet) | Volym (mikroliter) lösningsmedel för att återsuspendera peptid för att få 1,25 e-2 M lager | Lösningsmedel | |||
| ERBB2 / HER2 | Ac YGSGTPTAENP EYLGLDVPVGSGC amid |
2424.6 | 95.0 | 20.0 | 7.84E-06 | 626.9 | DMF | |||
Tabell 1: Beräkningar för beredning av peptidbestånd.
| A | B | C | D | E | F | G | H | Jag |
| Rör | 5x Peptid lager | 1x Peptid lager | Utspädning 1 | Utspädning 2 | Utspädning 3 | Utspädning 4 | Utspädning 5 | Negativ kontrol |
| [Peptid] lager (M) | 1.25*10-2 | 2.5*10-3 | 5*10-4 | 5*10-5 | 5*10-6 | 5*10-7 | 5*10-8 | Ingen |
| Peptid lösning (i lösningsmedel) |
>30 uL | 30 uL från 5x (1.25E-2 M) peptid lager |
140 uL från 1x (2,5E-3 M) peptid lager |
70 uL från Utspädning 1 |
70 uL från Utspädning 2 |
70 uL från Utspädning 3 |
70 uL från Utspädning 4 |
Ingen |
| Lösningsmedelsvolym | 120 uL | |||||||
| Slutlig peptid lagervolym |
150 uL | |||||||
| 31,3% BSA / PBS volym |
560 uL 31,3% BSA |
|||||||
| 25% BSA / PBS volym |
630 uL 25% BSA |
630 uL 25% BSA |
630 uL 25% BSA |
630 uL 25% BSA |
700 uL 25% BSA |
|||
| Volym utspädd peptid i BSA | 700 uL | 700 uL | 700 uL | 700 uL | 700 uL | 700 uL |
Tabell 2: Beräkningar för beredning av BSA-peptidutspädningar.
| A | B | C | D | E | F | G |
| Rör | Utspädning 1 | Utspädning 2 | Utspädning 3 | Utspädning 4 | Utspädning 5 | Negativ kontroll |
| Återstående volym av peptid i utspädd BSA | 630 uL | 630 uL | 630 uL | 630 uL | 700 uL | 700 uL |
| [Peptid] (M) i utspädd BSA | 5*10-4 | 5*10-5 | 5*10-6 | 5*10-7 | 5*10-8 | Ingen |
| Volym på 37% Formaldehyd att tillsätta | 630 uL | 630 uL | 630 uL | 630 uL | 700 uL | 700 uL |
| Slutlig [Peptid] (M) i gel |
2.5*10-4 | 2.5*10-5 | 2.5*10-6 | 2.5*10-7 | 2.5*10-8 | Ingen |
Tabell 3: Beräkningar för framställning av BSA-formaldehydgeler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod gör det möjligt för användaren att skapa enhetliga prover av känd sammansättning och antigenkoncentration som standarder i IHC-reaktioner, med hjälp av material och tekniker som är bekanta för de flesta histologilaboratorier. Det mest avgörande steget är att identifiera epitopen som antikroppen av intresse binder till. Detta protokoll beskriver användning av ett linjärt peptidantigen från ERBB2 / HER2 ICD. Samma protokoll kan användas för att bilda BSA-geler som innehåller oligonukleotider, fluorescerande etiketter, proteindomäner eller proteiner i full längd. Detta senare tillvägagångssätt kan vara till hjälp för antikroppar som binder till konformationsepitoper som inte återskapas av en enda linjär peptidsekvens. Till exempel kan BSA-gelstandarder som innehåller 0,1 mg / ml naivT IgG från möss, råttor och kaniner användas som processkontroller för att bekräfta att sekundära detektions- och färgningssteg har fungerat som förväntat.
Antigen-BSA-gelmetoden som beskrivs här kompletterar andra tekniker för att kontrollera och standardisera IHC-reaktioner. Cellinjer och vävnadsprover med väl karakteriserade uttrycksnivåer av målantigener har varit avgörande för välkontrollerade IHC-protokoll 1,3,4. Peptider kopplade till ytan av glasskivor och glaspärlor har föreslagits som kvantitativa kontroller 7,8,9. Var och en av de potentiella metoderna har överlappande fördelar och begränsningar. BSA-antigengelerna har flera fördelar. De är enkla att göra och anpassningsbara till olika antigenkompositioner och koncentrationer. De reproducerar en del av den tredimensionella arkitekturen hos vävnadsprover samtidigt som de kontrollerar för den inneboende heterogeniteten som finns i biologiska prover. Eftersom de syntetiska antigengelerna kan tillverkas med användarvalbara antigenkoncentrationer som sträcker sig från under detektionsgränsen till de högsta koncentrationerna som finns i biologiska prover (~ 10-4 M)2, erbjuder de möjligheter att kalibrera och standardisera analyser utförda med moderna tekniker, t.ex. AQUA18 och bildmassaspektrometri19 , vars dynamiska omfång vida överstiger traditionell kromogen IHC. Dessutom tillåter metoden kontroller som innehåller mer än ett antigen, som kan användas vid multiplexanalysutveckling och standardisering.
Medan metoden kräver att användaren känner till epitoperna för antikropparna av intresse, binder många antikroppar till väldokumenterade linjära epitoper. Epitopkartläggningstekniker 20,21,22 kan ofta identifiera odefinierade linjära epitoper, och syntetiska peptider inklusive kända linjära epitoper kan köpas till en blygsam kostnad. Andra antikroppar binder till konformationsepitoper som inte reproduceras av linjära peptider utan bevaras i hela proteiner eller proteindomäner. För några av dessa antikroppar är rekombinanta former av målantigenen kommersiellt tillgängliga.
För att skapa kontrollprover med optimal enhetlighet och reproducerbarhet måste peptiden eller annat målantigen vara helt upplöst och försiktigt utspätt till BSA-lösningar. Det är också viktigt att en effektiv och snabb blandning av BSA/peptidlösningen med 37 % formaldehyd sker innan provet börjar gela och att det blandade provet sedan omedelbart placeras vid 85 °C i 10 minuter. För att undvika överfixering och bearbetning av artefakter bör geler tas genom bearbetning och paraffininbäddning enligt det rekommenderade schemat.
Variationer av metoden som beskrivs här kan vara till hjälp i specifika sammanhang. Till exempel kan alternativa N- och C-terminala peptidsekvenser användas för att optimera detektionen av peptider bundna till BSA2. Det bör förväntas att antikroppar som känner igen epitoper från de extrema C-terminerna av proteiner kan vara varierande känsliga för C-terminala modifieringar av den ursprungliga sekvensen. Peptid-BSA-gelproverna kan också bildas genom upphettning vid 85 °C i 10 minuter utan fixeringsmedel och sedan beredas som frysta block eller efterfixerade med en mängd olika kemier2. Dessutom kan peptidkonjugering åstadkommas med maleimidkemi eller andra metoder än vad som beskrivs här.
Biologiska prover som cellinjer och vävnader har fördelen som kontroller att representera komplexiteten hos de många variabler som bara finns i livet. Å andra sidan, eftersom vävnads- och cellstandarder är både internt heterogena och variabla från prov till prov, är tolkningen av variabel färgning från körning till körning förvirrad. Dessutom är antigenkoncentrationerna i vävnader och celler ofta endast kända kvalitativt, men med den ökande användningen av kvantitativ masspektrometri rapporteras absoluta proteinkoncentrationer oftare23. BSA-antigenkontrollerna som beskrivs här eliminerar avsiktligt det rumsliga och biologiska sammanhanget för proteiner i celler och vävnader. Av denna anledning kan korrelationen mellan IHC-signalintensitet och antigenkoncentration som finns i dessa kontroller ofullständigt reproducera den som ses i vävnader. De syntetiska kontrollerna som beskrivs här kan vara till hjälp för att optimera och standardisera vissa aspekter av IHC-analysprestanda. Ändå hindrar de inte behovet av lämplig användning av andra kontrollprover. Till exempel kan potentiell icke-specifik färgning i en målvävnad endast utvärderas genom parallell användning av ett negativt vävnadskontrollprov. Dessutom reproducerar BSA-antigengelkontroller inte vävnadsspecifika preanalytiska variabler, inklusive varm och kall ischemitid, proteolys eller fixerings- och bearbetningsförhållanden som kan påverka IHC-prestanda. Följaktligen, och som har diskuterats mer detaljerat 1,3,4, bör utredare göra tankeväckande användning av cell- och vävnadsstandarder för att exakt karakterisera IHC-systemets prestanda.
BSA-antigenkontroller kan användas för att utveckla eller optimera färgningsprotokoll och fungera som referensprover inom och mellan laboratorier vid bedömning av reproducerbarheten hos etablerade protokoll. Tillgång till väldefinierade standardprover bör göra det möjligt för användare att mer rigoröst karakterisera IHC-reaktionsbeteende, identifiera variation i färgningsprestanda och optimera reaktionsförhållandena för att uppnå specifika mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Charles A. Havnar, Kathy J. Hötzel, Charles A. Jones, Carmina M. Espiritu, Linda K. Rangell och Franklin V. Peale är anställda och aktieägare i Genentech och Roche. Deras dotterbolag producerar reagenser och instrument som används i denna studie.
Acknowledgments
Författarna erkänner tacksamt sina kollegor Jeffrey Tom och Aimin Song för peptidsyntes, Nianfeng Ge för TMA-konstruktion, Shari Lau för IHC-färgning, Melissa Edick för digital mikroskopisk skanning och Hai Ngu för digital bildkvantifiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-HER2/neu clone 4B5 | Ventana | 5278368001 | |
| Biopsy Wraps | Leica | 3801090 | |
| Bovine Serum Albumin, ultra pure | Cell Signaling Technology | BSA #9998 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| Disposable base mold (15 mm x 15 mm) | Fisher | 22-363-553 | |
| Disposable base mold (24 mm x 24 mm) |
Fisher | 22-363-554 | |
| Disposable spatula | VWR | 80081-188 | |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22331 | |
| 37% Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15686 | |
| ERBB2 / HER2 peptide | UniProt P04626-1; a.a. 1240-55 | ||
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | |
| Magnetic Stir Bar | |||
| NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL | |||
| Paraplast paraffin | Leica | 39601006 | |
| Peptide parameter calculator | Pep-Calc17 | https://www.pep-calc.com/ | |
| Peptide suppliers | ABclonal Science | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | |
| Anaspec Peptide | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| CPC Scientific | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| New England Peptide | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| Phosphate Buffered Saline pH 7.2 | |||
| Reagent Alcohol | Thermo Scientific | 9111 | |
| Single Edge Razor | VWR | 55411-050 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
| TMA Tissue Grand Master | 3DHISTECH | ||
| Xylenes | VWR | 89370-088 |
References
- Torlakovic, E. E., et al. Standardization of positive controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the International Ad Hoc Expert Committee. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 23 (1), 1-18 (2015).
- Hötzel, K. J., et al. Synthetic antigen gels as practical controls for standardized and quantitative immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (5), 309-334 (2019).
- Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: The histochemical society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
- Torlakovic, E. E., et al. Standardization of negative controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the international ad hoc expert panel. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 22 (4), 241-252 (2014).
- Martinez-Morilla, S., et al. Quantitative assessment of PD-L1 as an analyte in immunohistochemistry diagnostic assays using a standardized cell line tissue microarray. Laboratory Investigation. 100, 4-15 (2020).
- Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
- Sompuram, S. R., et al. Synthetic peptides identified from phage-displayed combinatorial libraries as immunodiagnostic assay surrogate quality-control targets. Clinical Chemistry. 48 (3), 410-420 (2002).
- Sompuram, S. R., et al. A novel quality control slide for quantitative immunohistochemistry testing. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (11), 1425-1433 (2002).
- Sompuram, S. R., Vani, K., Tracey, B., Kamstock, D. A., Bogen, S. A. Standardizing immunohistochemistry: A new reference control for detecting staining problems. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (9), 681-690 (2015).
- Vani, K., et al. Levey-Jennings analysis uncovers unsuspected causes of immunohistochemistry stain variability. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 24 (10), 688-694 (2016).
- Brandtzaeg, P. Evaluation of immunofluorescence with artificial sections of selected antigenicity. Immunology. 22, 177-183 (1972).
- Matute, C., Streit, P. Monoclonal antibodies demonstrating GABA-Iike immunoreactivity. Histochemistry. 86, 147-157 (1986).
- Ottersen, O. P. Postembedding light- and electron microscopic immunocytochemistry of amino acids: description of a new model system allowing identical conditions for specificity testing and tissue processing. Experimental Brain Research. 69, 167-174 (1987).
- Fowler, C. B., Cunningham, R. E., O'Leary, T. J., Mason, J. T. 'Tissue surrogates' as a model for archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Laboratory Investigation. 87, 836-846 (2007).
- Arabi, S. H., et al. Serum albumin hydrogels in broad pH and temperature ranges: characterization of their self-assembled structures and nanoscopic and macroscopic properties. Biomaterials Science. 6 (3), 478-492 (2018).
- Schrohl, A. -S., Pedersen, H. C., Jensen, S. S., Nielsen, S. L., Brünner, N. Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) immunoreactivity: specificity of three pharmacodiagnostic antibodies. Histopathology. 59, 975-983 (2011).
- Lear, S., Cobb, S. L. Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 30, 271-277 (2016).
- Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays. Nature Medicine. 8 (11), 1323-1327 (2002).
- Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
- Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
- Forsström, B., et al. Proteome-wide epitope mapping of antibodies using ultra-dense peptide arrays. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (6), 1585-1597 (2014).
- Forsström, B., et al. Dissecting antibodies with regards to linear and conformational epitopes. PLoS One. 10 (3), 0121673 (2015).
- Prasad, B., et al. Toward a consensus on applying quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry proteomics in translational pharmacology research: A white paper. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 106 (3), 525-543 (2019).
