Summary
Les rongeurs ne sont pas en mesure de signaler les symptômes de la migraine. Ici, nous décrivons un paradigme de test gérable (tests clair/ sombre et champ ouvert) pour mesurer l’aversion à la lumière, l’un des symptômes les plus courants et les plus gênants chez les patients souffrant de migraines.
Abstract
La migraine est un trouble neurologique complexe caractérisé par des maux de tête et des anomalies sensorielles, telles que l’hypersensibilité à la lumière, observée sous forme de photophobie. Bien qu’il soit impossible de confirmer qu’une souris souffre de migraine, l’aversion à la lumière peut être utilisée comme substitut comportemental du symptôme migraineux de la photophobie. Pour tester l’aversion à la lumière, nous utilisons le test lumière/obscurité pour mesurer le temps que les souris choisissent librement de passer dans un environnement clair ou sombre. Le test a été affiné en introduisant deux modifications critiques: des pré-expositions à la chambre avant l’exécution de la procédure d’essai et un éclairage de chambre réglable, permettant l’utilisation d’une gamme d’intensités lumineuses allant de 55 lux à 27 000 lux. Parce que le choix de passer plus de temps dans l’obscurité est également révélateur d’anxiété, nous utilisons également un test d’anxiété indépendant de la lumière, le test en champ ouvert, pour distinguer l’anxiété du comportement aversif à la lumière. Ici, nous décrivons un paradigme de test modifié pour les tests en champ clair/sombre et ouvert. L’application de ces tests est décrite pour l’injection intrapéritonéale de peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP) dans deux souches de souris et pour les études de stimulation cérébrale optogénétique.
Introduction
La migraine est une maladie neurologique répandue, touchant environ 17 % des Américains1 et est la deuxième cause d’invalidité dans le monde2,3. Les patients éprouvent des maux de tête qui durent de 4 à 72 heures accompagnés d’au moins un des symptômes suivants: nausées et / ou vomissements, ou photophobie et phonophobie4. Les progrès récents dans le développement d’anticorps peptidiques liés au gène de la calcitonine (CGRP) qui sont maintenant approuvés par la FDA ont commencé une nouvelle ère pour le traitement de la migraine5,6,7. Ces anticorps bloquent le CGRP ou son récepteur et préviennent les symptômes de la migraine chez environ 50 % des patients migraineux7. Au cours de la dernière année, deux antagonistes à petites molécules du récepteur CGRP ont également été approuvés par la FDA pour le traitement abortif de la migraine, et deux autres sont en cours de développement8. Malgré ces progrès thérapeutiques, les mécanismes par lesquels les crises de migraine se produisent restent encore insaisissables. Par exemple, les sites d’action CGRP ne sont pas connus. L’efficacité des anticorps thérapeutiques qui ne traversent pas sensiblement la barrière hémato-encéphalique suggère que le CGRP agit sur les sites périphériques, tels que les méninges et / ou les ganglions du trijumeau. Cependant, nous ne pouvons pas exclure des actions centrales au niveau des organes circumventriculaires, qui n’ont pas de barrière hémato-encéphalique9. Au moins pour la photophobie, nous pensons que cela est moins probable compte tenu de nos résultats avec l’aversion à la lumière en utilisant des souris transgéniques nestin/hRAMP1 chez lesquelles hRAMP1 est surexprimé dans le tissu nerveux10. Comprendre les mécanismes de la physiopathologie de la migraine fournira de nouvelles voies pour le développement de thérapies contre la migraine.
Les modèles animaux précliniques sont essentiels à la compréhension des mécanismes de la maladie et au développement de nouveaux médicaments. Cependant, l’évaluation de la migraine chez les animaux est difficile car les animaux ne peuvent pas signaler verbalement leurs sensations de douleur. Étant donné que 80 à 90% des patients migraineux présentent une photophobie11, l’aversion à la lumière est considérée comme un indicateur de migraine dans les modèles animaux. Cela a conduit à la nécessité de développer un test pour évaluer l’aversion à la lumière chez la souris.
Le test clair/foncé contient une zone claire et une zone sombre. Il est largement utilisé pour mesurer l’anxiété chez les souris en fonction de leur exploration spontanée de nouveaux environnements qui est contrée par leur aversion innée pour la lumière12. Certaines études définissent 1/3 de la chambre comme zone sombre, tandis que d’autres définissent 1/2 de la chambre comme zone sombre. Le premier paramètre est souvent utilisé pour détecter l’anxiété13. Bien que nous ayons initialement choisi des chambres claires / sombres de taille égale, nous n’avons pas comparé les deux tailles relatives. Nous pouvons faire remarquer que la taille globale des deux chambres n’est pas un facteur majeur puisque la boîte d’essai initiale14 était considérablement plus grande que l’appareil suivant15, mais les résultats étaient essentiellement les mêmes.
Deux modifications essentielles apportées à ce test lumière/obscurité pour évaluer l’aversion à la lumière étaient : la condition d’essai et l’intensité lumineuse (Figure 1). Tout d’abord, les souris sont préexposées à la chambre claire/sombre pour réduire l’entraînement exploratoire16 (Figure 1A). La nécessité et les délais de pré-exposition dépendent des souches et des modèles de souris. Les souris Wildtype C57BL/6J nécessitent généralement deux pré-expositions10, tandis qu’une seule pré-exposition pour les souris CD1 est suffisante17. De cette manière, le comportement aversif à la lumière peut être démasqué dans ces deux souches de souris. Deuxièmement, l’éclairage de la chambre a été adapté pour inclure une plage réglable d’intensités lumineuses allant de faible (55 lux) à lumineux (27 000 lux) où 55 lux est comparable à une journée sombre et couverte, et 27 000 lux est comparable à une journée ensoleillée à l’ombre10. Nous avons constaté que l’intensité lumineuse requise varie en fonction de la souche et du modèle génétique. Pour cette raison, les individus devraient d’abord évaluer l’intensité lumineuse minimale pour leur paradigme expérimental.
Même avec ces modifications du test, qui peuvent révéler un phénotype aversif à la lumière, il est nécessaire de tester un comportement anxieux pour faire la distinction entre l’aversion à la lumière due à la lumière seule et l’anxiété. Le test en plein champ est un moyen traditionnel de mesurer l’anxiété basée sur l’exploration spontanée de nouveaux environnements. Il diffère du test lumière/obscurité en ce que l’entraînement exploratoire est contré par l’aversion innée pour les espaces ouverts non protégés. Le centre et les bords de la chambre sont à la lumière, de sorte que le test en champ ouvert est un test d’anxiété indépendant de la lumière. Ainsi, la combinaison des tests lumière/obscurité et champ ouvert nous permet de distinguer entre l’aversion à la lumière due à un évitement de la lumière et une augmentation globale de l’anxiété.
Le CGRP est un neuropeptide multifonctionnel qui régule la vasodilatation, la nociception et l’inflammation18. Il est largement exprimé dans les systèmes nerveux périphérique et central. Il joue un rôle important dans la physiopathologie de la migraine18. Cependant, le mécanisme sous-jacent à l’action du CGRP dans la migraine n’est pas clair. En utilisant les tests lumière/obscurité et champ ouvert avec ce paradigme de test modifié, nous avons pu identifier le comportement aversif de la lumière chez les souris suivant l’administration de CGRP périphérique10,16 (Figure 2) et centrale14,15,16,19. En plus des neuropeptides, l’identification des régions du cerveau impliquées dans l’aversion à la lumière est également importante pour comprendre la physiopathologie de la migraine. Les noyaux thalamiques postérieurs sont une région intégrative du cerveau pour le traitement de la douleur et de la lumière19, et le thalamus est activé pendant la migraine20. Ainsi, nous avons ciblé les noyaux thalamiques postérieurs en injectant le virus adéno-associé (AAV) contenant de la channelrhodopsine-2 (ChR2) ou de l’eYFP dans cette région. En combinant cette approche optogénétique avec ces deux essais, nous avons démontré que la stimulation optique des neurones exprimant ChR2 dans les noyaux thalamiques postérieurs induisait une aversion à la lumière19 (Figure 3). Dans cette expérience, étant donné l’effet dramatique sur l’aversion à la lumière évoquée chez ces souris manipulées optogénétiquement, les pré-expositions à la chambre ont été ignorées.
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Protocol
Les procédures animales ont été approuvées par le comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de l’Iowa et effectuées conformément aux normes établies par les National Institutes of Health.
1. Essai clair/foncé
- Installation d’un appareil à chambre claire/sombre (voir tableau des matériaux). Tout l’équipement de cette section est disponible dans le commerce.
- Sur une étagère, placez la cabine insonorisante (intérieur : 59,7 x 38 x 35,6 cm en L x H x P) contenant un tiroir coulissant pour un accès facile à la chambre et un insert sombre.
- Connectez l’alimentation CC et une alimentation régulée CC à la cabine d’atténuation acoustique.
- Placez la chambre à champ ouvert transparente sans soudure (27,31 x 27,31 x 20,32 cm en L x L x H) sur le tiroir coulissant de la cabine.
- Placez l’insert noir en plastique transparent infrarouge (IR) sombre (28,7 X 15 X 20,6 cm en L x L x H) dans la chambre à champ ouvert. Assurez-vous que la chambre est divisée en deux zones de taille égale : une zone sombre et une zone claire.
- Connectez trois ensembles de matrices IR à 16 faisceaux sur les axes X, Y et Z de la chambre de champ ouvert au contrôleur USB IR via des câbles.
- Connectez le contrôleur USB IR à un ordinateur.
- Installez le logiciel de suivi sur l’ordinateur qui peut enregistrer et collecter l’emplacement et l’activité de la souris.
- Pour la configuration du panneau lumineux, retirez d’abord le panneau lumineux à diode électroluminescente (LED) (27,70 x 27,70 cm en L x L; 360 LED, couleur équilibrée à la lumière du jour, 5600K, faisceau d’inondation à 60 °) de son boîtier d’origine.
- Assemblez le panneau lumineux avec le pilote LED, le dissipateur de chaleur et le bloc d’alimentation. Plusieurs panneaux lumineux LED peuvent être connectés à une alimentation, un dissipateur de chaleur et un pilote LED pour obtenir un contrôle uniforme du panneau lumineux.
- Construire une plate-forme acrylique personnalisée (29,77 x 27,70 x 8,10 cm en L x L x H) comprenant 7 étagères identiques à des intervalles de 0,53 cm (Figure 1B). Fixez en permanence l’étagère en acrylique personnalisée au plafond à l’intérieur de la cabine au-dessus de la chambre.
- Insérez le panneau lumineux LED dans la fente entre les deux étagères inférieures. Ajustez le panneau lumineux à différentes hauteurs (Figure 1B,C), si nécessaire (par exemple, si vous utilisez des souris optogénétiques. Les détails sont discutés à la section 3).
- Allumez le dissipateur de chaleur, le pilote LED et le bloc d’alimentation. Vérifiez que le pilote LED peut dicter l’intensité lumineuse led en mesurant l’intensité lumineuse sur le sol de la chambre et confirmez que le sol est éclairé uniformément.
- Procédure de test comportemental
REMARQUE: Les souris sont logées sur un cycle de lumière de 12 heures. Toutes les expériences comportementales sont effectuées pendant le cycle de lumière. Des souris, y compris des mâles et des femelles, âgées de 10 à 20 semaines, sont utilisées. Dans ce protocole, les souris naïves de type sauvage CD1 et C57BL/6J subissent deux pré-expositions à la chambre claire/sombre suivies d’une exposition avec traitement et d’une exposition post-traitement. Il y a un intervalle de trois jours entre chaque exposition pour permettre aux souris de se rétablir (jours 1, 4, 7 et 10 comme décrit ci-dessous et figure 1A). Cependant, les souris CD1 ne nécessitent pas la 2ème pré-exposition et peuvent être testées dans la pénombre.- Le jour 1 (prétraitement 1), allumez l’appareil de dosage lumière/obscurité et réglez l’intensité lumineuse à 27 000 lux.
- Ouvrez le logiciel de suivi et configurez un nouveau protocole. Dans le paramètre Nouveau protocole , définissez la durée sur 30 min. Dans le paramètre Nouvelle analyse , définissez Les bacs de données par durée sur 300 s.
- Dans le paramètre Nouvelle zone , choisissez Zones prédéfinies. Choisissez 2 , puis Horizontal. Vérifiez si la chambre est divisée en deux zones de taille égale horizontalement pour l’enregistrement.
- Habituez les souris à la salle de test pendant 1 h avant le test. Pendant l’accoutumance, gardez la lumière de la pièce allumée pour ne pas perturber le rythme circadien de la souris. Assurez-vous que tout l’équipement pour le test clair/foncé est allumé, ce qui permet aux souris de s’acclimater complètement à l’environnement de la salle de test.
- Sélectionnez Acquérir des données. Entrez les ID de souris. Démarrez le protocole.
- Tirez le tiroir à l’extérieur de la cabine d’atténuation du son pour accéder à la chambre de lumière / obscurité et à l’insert sombre. Prenez doucement la souris par la base de la queue, placez-la dans la zone de lumière de la chambre et poussez le tiroir à l’intérieur de la cabine. Assurez-vous que le logiciel détecte immédiatement la souris et commence à enregistrer l’activité.
- Attendez que l’enregistrement s’arrête automatiquement après 30 minutes. Remettez la souris dans sa cage d’origine.
- Nettoyez la chambre et l’insert foncé à l’aide de lingettes jetables germicides à odeur d’alcool contenant 55,0 % d’alcool isopropylique, 0,25 % d’alkyle C12-18 diméthyl-éthylbenzylammonium et 0,25 % de chlorure d’alkyl C12-18 diméthylbenzymonium comme ingrédients actifs antimicrobiens pour éradiquer les signaux olfactifs laissés par la souris précédente.
- Le jour 4 (prétraitement 2), répétez les étapes 1.2.1 à 1.2.8.
- Le jour 7 (le jour du traitement), répétez les étapes 1.2.1 et 1.2.4. Après l’accoutumance, administrer le CGRP (0,1 mg/kg, 10 μl/g en fonction du poids corporel de la souris, injection intrapéritonéale (i.p.)), incliner la tête de la souris vers l’avant et injecter dans le quadrant inférieur droit. Remettez la souris dans la cage d’accueil.
- Après 30 minutes, démarrez le protocole et exécutez la souris dans la chambre claire/sombre comme mentionné aux étapes 1.2.5 à 1.2.7. Le temps de récupération dans les cages à domicile après les injections peut être raccourci ou allongé en fonction du traitement21.
- Nettoyez la chambre et l’insert sombre comme décrit à l’étape 1.2.8.
- Le jour 10 (jour post-traitement), répétez les étapes 1.2.1 à 1.2.8. L’expérience peut être suspendue à l’étape 1.2.13 avant de commencer le test en champ ouvert.
2. Essai en champ ouvert
- La configuration de l’appareil
- Configuration de la chambre de champ ouverte : Utilisez la même cabine d’atténuation du son et la même chambre à champ ouvert que celles utilisées dans le test clair/foncé, sans utiliser l’insert sombre.
- Configuration du panneau lumineux : utilisez la même configuration que celle utilisée dans le test clair/foncé. Assurez-vous que l’intensité lumineuse est la même que celle utilisée dans le test lumière/obscurité.
- Procédure de test comportemental
- Allumez l’appareil. Réglez l’intensité lumineuse à 27 000 lux.
- Ouvrez le logiciel de suivi.
- Configurez un nouveau protocole, le même que celui utilisé dans le test clair/foncé, à l’exception des paramètres Nouvelle zone . Choisissez 1 suivi du Centre dans les paramètres Nouvelle zone . Définissez la périphérie à 3,97 cm du périmètre et le centre à 19,05 × 19,05 cm.
- Habituez les souris à la salle d’essai comme décrit à l’étape 1.2.4.
- Administrer le CGRP (0,1 mg/kg, 10 μl/g en fonction du poids corporel de la souris, i.p.), incliner la tête de la souris vers l’avant et injecter dans le quadrant inférieur droit. Remettez la souris dans la cage d’accueil.
- Après 30 min, démarrez le protocole. Tirez le tiroir coulissant à l’extérieur de la cabine d’atténuation du son et placez doucement la souris au milieu de la chambre de champ ouverte. Poussez le tiroir à l’intérieur de la cabine.
- Suivez le comportement pendant 30 min. Ensuite, retournez les souris dans leurs cages d’origine.
- Nettoyez l’appareil comme décrit à l’étape 1.2.8.
3. Test clair/foncé modifié pour les souris optogénétiques
- La configuration de l’appareil
- Apportez deux modifications à l’insert sombre.
- Modifiez l’ouverture de l’insert sombre à 5,08 x 5,08 cm (L x H) avec une petite fente de 0,95 x 10,16 cm (L X H) entre le haut et l’ouverture de l’insert sombre (Figure 1D en haut à gauche).
REMARQUE: Cette modification permet à une souris d’aller dans la zone sombre sans difficulté lorsque la canule à fibre optique sur la tête de la souris est attachée au cordon de raccordement. - Étendez le haut de l’insert sombre sur la zone claire comme un porche triangulaire (H = 6,5 cm) (Figure 1D en haut à droite et en bas à gauche). Coupez un trou circulaire (D = 1,7 cm) dans le porche et insérez un support dans le trou pour placer et stabiliser le joint rotatif, qui relie le laser et les cordons de raccordement à fibre optique (Figure 1D en haut à gauche et en bas à gauche).
REMARQUE: Les modifications entraînent un léger changement dans l’intensité lumineuse atteignant le sol de la zone sombre (17 lux avec modifications contre 14 lux sans modifications, mesurée dans le coin arrière droit de la zone sombre sous 27 000 lux).
- Modifiez l’ouverture de l’insert sombre à 5,08 x 5,08 cm (L x H) avec une petite fente de 0,95 x 10,16 cm (L X H) entre le haut et l’ouverture de l’insert sombre (Figure 1D en haut à gauche).
- Insérez le joint rotatif dans le support de l’insert sombre.
- Connectez le cordon de raccordement à fibre optique de 30,5 cm au joint rotatif. Vérifiez que le joint rotatif peut tourner en douceur afin que le cordon de raccordement puisse tourner sans difficulté lorsque la souris traverse la chambre.
- Pour le reste de l’installation, utilisez la même configuration d’appareil que celle utilisée dans la section 1 (essai clair/foncé).
- Apportez deux modifications à l’insert sombre.
- Procédure de test comportemental
REMARQUE: Contrairement aux souris de type sauvage, les souris optogénétiques ne reçoivent pas de pré-expositions (prétraitements 1 et 2).- Le jour du test, insérez le panneau lumineux LED dans la deuxième fente la plus basse (28,23 cm du sol du carrossage) pour laisser de l’espace pour connecter le cordon de raccordement. Allumez l’appareil de dosage lumière/obscurité et réglez l’intensité lumineuse à 55 lux.
- Utilisez la même configuration de protocole que celle des versions 1.2.2 et 1.2.3, sauf que Data Bins By Duration est défini sur 60 s dans le paramètre Nouvelle analyse pour être conforme au protocole de stimulation laser de l’étape 3.2.3.
- Allumez le bouton d’alimentation laser. Réglez le contrôleur d’impulsion laser pour stimuler pendant 1 min suivi de 1 min sans stimulation sur 30 min.
- Habituez les souris à la salle de test avec la lumière allumée pendant 1 h avant le test.
- Démarrez le protocole. Tirez le tiroir coulissant à l’extérieur de la cabine d’atténuation du son pour accéder à la chambre de lumière / obscurité et à l’insert sombre.
- Retenez doucement la souris et couplez la canule en fibre optique de la tête de la souris au cordon de raccordement à fibre optique via un manchon d’accouplement (Figure 1D en bas à droite). Placez doucement la souris dans la zone de lumière et poussez le tiroir à l’intérieur de la cabine. Assurez-vous que le protocole commencera à enregistrer automatiquement le comportement de la souris.
- À 1 min, allumez le contrôleur d’impulsions, puis mettez la clé de sécurité intégrée sur ON. Assurez-vous que la stimulation laser de la région cérébrale ciblée se produit toutes les deux minutes.
- Après 30 minutes, lorsque le protocole s’arrête automatiquement, désactivez la clé de sécurité intégrée. Éteignez ensuite le contrôleur d’impulsions.
- Découplez la souris et le cordon de raccordement à fibre optique. Remettez la souris dans la cage d’accueil.
- Nettoyez la chambre et l’insert sombre comme décrit à l’étape 1.2.8.
4. Test en champ ouvert modifié pour les souris optogénétiques
- La configuration de l’appareil
- Stabilisez le joint rotatif au-dessus de la chambre à l’aide d’un support et d’une pince (Figure 1E).
- Connectez le cordon de raccordement à fibre optique d’une longueur de 50 cm au joint rotatif. Vérifiez si le joint rotatif peut tourner en douceur.
- Réglez le joint rotatif à la hauteur appropriée sur le support : assurez-vous que le cordon de raccordement à fibre optique ne peut atteindre que tous les coins de la chambre, ce qui aidera à éviter toute interférence avec le mouvement de la souris.
- Pour le reste de l’installation, utilisez la même configuration d’appareil que celle utilisée dans la section 1 (essai clair/foncé), mais sans l’insert sombre.
- Procédure de test comportemental
- Allumez l’appareil de dosage lumière/obscurité et réglez l’intensité lumineuse à 55 lux.
- Utilisez la même configuration de protocole que celle du test clair/foncé modifié (section 3), à l’exception des paramètres Nouvelle zone . Choisissez 1 suivi par Centre dans les paramètres De nouvelle zone . Définissez la périphérie à 3,97 cm du périmètre et le centre à 19,05 × 19,05 cm.
- Allumez le bouton d’alimentation laser. Réglez le contrôleur d’impulsion laser pour stimuler pendant 1 min suivi de 1 min sans stimulation sur 30 min.
- Effectuer l’accoutumance et le reste de l’essai comme décrit aux étapes 3.2.4 à 3.2.10, à l’exception de deux modifications apportées à l’étape 3.2.6: placer doucement la souris au milieu de la chambre au lieu de la zone lumineuse; gardez le tiroir coulissant à l’extérieur de la cabine en raison du cordon de raccordement qui se connecte à la tête de la souris.
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Representative Results
Ce paradigme de test comportemental est conçu pour tester le comportement aversif de la lumière. Il peut être réalisé à la fois sur des souris naïves de type sauvage et des souris optogénétiques pour étudier l’aversion à la lumière en temps réel lors de la stimulation d’une population neuronale ciblée.
Cette procédure a été utilisée pour étudier l’effet du traitement CGRP périphérique chez les souris CD1 et C57BL/6J10,16 et la stimulation optique des neurones dans les noyaux thalamiques postérieurs chez les souris C57BL/6J19 sur le comportement aversif de la lumière. Des souris, y compris des mâles et des femelles, âgées de 10 à 20 semaines, ont été utilisées dans les expériences (Figure 2A, Figure 2B-D et Figure 3). Les résultats ont révélé que l’injection par voie intra-atmosphérique de CGRP réduisait significativement la durée passée dans la zone claire dans le test clair/foncé chez les souris CD1 (Figure 2A) et C57BL/6J (Figure 2B), mais n’affectait pas le temps passé au centre dans le test en plein champ chez les souris CD1 (données non présentées) et C57BL/6J (Figure 2D)10, 16. Cela suggère que le CGRP périphérique induit une légère aversion, mais pas d’anxiété générale. Le traitement par CGRP a également augmenté la durée pendant laquelle les souris se reposaient dans la zone sombre, mais pas dans la zone claire, chez les souris CD1 (données non présentées) et C57BL/6J (Figure 2C).
Pour le protocole optogénétique, nous avons ciblé les neurones exprimant la calmoduline kinase II alpha (CaMKIIa) dans les noyaux thalamiques postérieurs en injectant AAV2-CaMKIIa-hChR2(E123A)-eYFP ou le virus témoin AAV2-CaMKIIa-eYFP19. Dans le même temps, une canule à fibre optique a été implantée dans les noyaux thalamiques postérieurs. Trois semaines après l’injection pour laisser suffisamment de temps pour l’expression de ChR2, nous avons effectué une stimulation optique des neurones dans les noyaux thalamiques postérieurs et avons noté une diminution correspondante de la durée que les souris ont passée dans la zone claire dans le test clair/foncé chez les souris injectées de ChR2 par rapport aux souris injectées par le virus témoin (eYFP) (Figure 3A). Il n’y avait pas de différence notée dans le temps passé au centre dans le test en plein champ entre les souris ChR2 et les souris eYFP témoins (Figure 3C), ce qui indique une réponse aversive à la lumière qui n’était pas uniquement motivée par l’anxiété19. De plus, une augmentation du temps de repos dans la zone sombre, mais pas dans la zone claire, a également été notée (figure 3B). Les mêmes résultats ont été obtenus en utilisant 55 lux et 27 000 lux (Figure 3). La procédure de 55 lux a été incluse parce que les patients migraineux sont sensibles même à la faible lumière.
Figure 1 : Chronologie et appareil du test lumière/obscurité. (A) Chronologie du paradigme d’essai : Après deux pré-expositions à la chambre lumière/obscurité (Pre 1 et Pre 2), les souris reçoivent du CGRP (0,1 mg/kg, i.p.) suivi d’une mesure post-traitement (Post). Au moins un jour après le test clair/foncé, les souris reçoivent à nouveau du CGRP (0,1 mg/kg, i.p.) et sont exécutées dans le test en plein champ. Pré: prétraitement; Tx: traitement; Post: post-traitement (B) Le panneau LED est maintenu en haut de la chambre par une étagère en acrylique et éclaire la zone de test. La hauteur du panneau lumineux peut être ajustée en utilisant des fentes à différentes hauteurs. (C) La chambre claire/sombre contient un insert sombre avec une petite ouverture. Un panneau lumineux LED se trouve au-dessus de la chambre. (D) Vues avant, latérale et supérieure de l’insert sombre modifié. L’ouverture dans l’insert sombre est prolongée par une petite fente pour le mouvement du cordon de raccordement (en haut à gauche). Le haut de l’insert sombre s’étend sur la zone claire comme un porche triangulaire avec un support pour le joint rotatif (en haut à droite et en bas à gauche). Le cordon de raccordement en fibre optique est relié à la canule à fibre optique via un manchon d’accouplement (en bas à droite). (E) Le test modifié en champ ouvert. Le support et la pince maintiennent le joint rotatif. La chambre est tirée à l’avant de la cabine avec les portes laissées ouvertes pour permettre le libre mouvement de la souris avec le cordon de raccordement attaché à la tête de la souris. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : L’administration périphérique de CGRP évoque une aversion à la lumière vive chez deux souches de souris de type sauvage. Les souris CD1 et C57/BL6J ont été testées selon la chronologie décrite à la figure 1A. (A) Le temps passé par les souris CD1 dans la zone lumineuse par intervalle de 5 minutes sur 30 minutes (27 000 lux). Les données de temps dans la lumière sont affichées au fil du temps pendant le test (panneau de gauche) et comme le temps moyen par intervalle de 5 minutes pour les souris individuelles (panneau de droite). Des comparaisons ont été faites entre le véhicule et le CGRP à chaque point temporel, et entre Tx et Pre2 ou Post comme indiqué par des parenthèses. (Veh, n = 19; 0,1 mg / kg CGRP, n = 19) (B) Temps passé par les souris C57BL/6J dans la zone lumineuse par intervalle de 5 min sur 30 min (27 000 lux). Les données sur le temps dans la lumière sont affichées au fil du temps pendant le test (panneau de gauche) et comme temps moyen par intervalle de 5 minutes pour les souris individuelles (panneau de droite) (Veh, n = 42; 0,1 mg / kg CGRP, n = 44). (C) Les souris du panel B ont également été analysées pour leur comportement au repos dans les zones sombres et claires pendant le test lumière/obscurité. (D) Les souris du panel B ont ensuite été testées dans le test en plein champ. Le pourcentage de temps passé au centre de la chambre par intervalle de 5 min sur 30 min après le traitement avec véhicule ou CGRP (0,1 mg/kg, i.p.) (Veh, n = 9; 0,1 mg / kg CGRP, n = 9). Le pourcentage de temps passé dans les données centrales est affiché au fil du temps pendant le test (panneau de gauche) et comme pourcentage moyen du temps passé au centre par intervalle de 5 minutes pour les souris individuelles (panneau de droite). Pour tous les panneaux, le MES moyen± est affiché, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001. Cette figure est modifiée à partir de Mason et al. 201710. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : La stimulation optique des neurones exprimant CaMKIIa dans les noyaux thalamiques postérieurs induit une aversion lumineuse en lumière faible ou vive. (A) Les noyaux thalamiques postérieurs de souris C57BL/6J injectées avec AAV codant soit ChR2 soit eYFP (à 55 lux : eYFP n = 8, ChR2 n = 11 ; à 27 000 lux : eYFP n = 12, ChR2 n = 18) ont été stimulés par laser bleu (473 nm, 20 Hz, largeur d’impulsion de 5 ms, 10 mW/mm2). Le panneau de gauche montre le temps passé par les souris dans la zone lumineuse par intervalle de 5 minutes sur 30 minutes à 55 ou 27 000 lux. Des comparaisons ont été faites entre les groupes eYFP et ChR2 à chaque point temporel. Le panneau de droite montre le temps moyen par intervalle de 5 minutes pour les souris individuelles. (B) Les souris du panneau A ont également été analysées pour leur comportement au repos dans les zones claires (panneau de gauche) et sombres (panneau de droite) pendant le test clair/sombre. (C) Les souris du panel A ont ensuite été testées dans le test en plein champ. Pourcentage moyen du temps passé au centre de la chambre de champ ouvert par intervalle de 5 min sur 30 min (Laser : 473 nm, 20 Hz, largeur d’impulsion de 5 ms, 10 mW/mm2). (eYFP n = 8, ChR2 n = 9). Pour tous les panneaux, le MOYEN±SEM est affiché, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001. Ce chiffre est modifié à partir de Sowers et al. 202019. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le test clair/foncé est largement utilisé pour évaluer les comportements anxieux12. Le test repose sur l’aversion innée des souris pour la lumière et leur volonté d’explorer lorsqu’elles sont placées dans un nouvel environnement (zone lumineuse). Cependant, comme nous le signalons ici, ce test peut également être utilisé pour évaluer le comportement aversif de la lumière.
Il est essentiel de tenir compte du nombre et de la nécessité des pré-expositions avant les tests. Cela dépend de la souche ou du modèle de la souris. Par exemple, dans notre protocole de dosage clair/foncé, les souris naïves de type sauvage CD1 et C57BL/6J sont pré-exposées à la chambre lumière/obscurité deux fois avant de subir la procédure de test de traitement, tandis que les souris optogénétiques ne subissent pas de pré-exposition. Une publication récente a rapporté qu’une pré-exposition est suffisante pour que les souris CD1 présentent une aversion à la lumière après l’administration de CGRP par voie intra-atmosphérique17. Par conséquent, l’importance du paramètre de nouveauté aura diminué à l’arrivée du jour de traitement10,16. Les pré-expositions peuvent démasquer les phénotypes aversifs à la lumière en réduisant l’entraînement exploratoire et en modifiant ainsi l’équilibre entre l’exploration et l’aversion. Dans certains cas, une pré-exposition n’est pas nécessaire. Par exemple, avec des souris génétiquement modifiées présentant une augmentation des récepteurs CGRP dans le système nerveux, une pré-exposition n’était pas nécessaire14. De même, avec les souris manipulées optogénétiquement, chez lesquelles les neurones exprimant CaMKIIa dans les noyaux thalamiques postérieurs étaient ciblés pour la stimulation optique, la pré-exposition n’était pas nécessaire, probablement parce que la réponse aversive à la lumière était si robuste lors de la stimulation directe du cerveau19. Ainsi, le nombre et la nécessité de pré-expositions à la chambre doivent être soigneusement pris en compte lors de l’utilisation de différentes souches ou modèles de souris. En effet, la surexposition des souris à la chambre peut réduire le comportement exploratoire. Cela conduira les souris à occuper préférentiellement la zone sombre, quel que soit le traitement, ce qui réduira la capacité d’observer une réponse aversive à la lumière. Inversement, une pré-exposition insuffisante au test peut conduire à un comportement exploratoire masquant un comportement potentiel aversif à la lumière.
Une exposition post-traitement sert à déterminer si une souris s’est complètement remise de l’injection de CGRP administrée 2 jours auparavant. Ceci est essentiel avant d’exécuter le test en champ ouvert ou tout autre test pour confirmer qu’aucun effet de traitement prolongé n’est présent qui affectera les futurs tests comportementaux.
Nous avons opté pour une durée de protocole de 30 minutes basée sur des observations précédentes10. Nous avons testé des souris dans le test clair/foncé pendant 10 min15, 20 min16 et 30 min10 séparément. Le CGRP a diminué le temps passé par les souris dans la lumière entre 0 et 30 minutes, mais au-delà de 30 minutes, les souris témoins ont préféré passer plus de temps dans l’obscurité par rapport à 0 à 30 minutes, ce qui a conduit à la décision de tester pendant 30 minutes. De la même manière, la durée du test peut être ajustée en fonction de la courbe temps-réponse pour différents modèles murins. Il convient de noter que l’allongement du temps d’exposition à la chambre claire / sombre peut réduire la motivation à explorer la zone de lumière.
Nous avons analysé de nombreux paramètres différents pour évaluer le comportement de l’animal. Une caractéristique essentielle du test lumière/obscurité est une mesure du temps qu’une souris passe dans la zone de lumière, reflétant directement l’aversion à la lumière. Le pourcentage de temps passé au repos, le nombre de ruptures de faisceau vertical (pour mesurer l’activité d’élevage) dans les zones claires ou sombres et le nombre de transitions entre les deux zones sont utilisés pour évaluer la motilité. Le temps de repos et les ruptures verticales du faisceau sont normalisés au temps passé dans chaque zone afin d’éviter de fausses conclusions concernant le mouvement. Nous incluons toutes les souris dans les analyses, sauf : les souris qui restent dans la zone de lumière pendant les 30 minutes de test, les souris qui passent plus de 90% de temps à se reposer au total (zones claires et sombres) et les valeurs aberrantes statistiques (>3 SD de la moyenne). Le nombre de souris exclues est généralement inférieur à 1%. Pour le test en champ ouvert, le pourcentage de temps passé au centre est la principale mesure utilisée pour évaluer le comportement anxieux.
Dans le test lumière/obscurité modifié, le positionnement de la canule à fibre optique dans certaines régions du cerveau peut restreindre considérablement les mouvements de la souris et, dans certains cas, empêcher la souris d’atteindre la zone sombre. Par conséquent, l’entrée dans la zone sombre sera renforcée négativement et, après plusieurs tentatives, la souris peut montrer une préférence apprise pour la lumière, même en restant dans la zone lumineuse pendant toute la période de test. Cela peut être rectifié en modifiant la taille et la forme de l’ouverture dans l’insert sombre. À titre d’exemple, lorsque des canules à fibres optiques ont été installées dans le cervelet de souris de type sauvage C57BL/6J, les souris ont eu du mal à franchir l’ouverture de l’insert sombre. Après avoir modifié la largeur de l’ouverture à 6,10 cm au lieu de 5,08 cm, les souris ont pu traverser l’ouverture librement.
Un cordon de raccordement à fibre optique de 30,5 cm est utilisé dans le test lumière/obscurité modifié, en fonction de la taille de la chambre de champ ouvert, permettant à la souris de se déplacer librement. Une longueur de cordon plus courte empêchera une souris de se déplacer vers les coins, tandis qu’un câble plus long peut s’emmêler et entraver le mouvement. La longueur du cordon de raccordement à fibre optique utilisé pour le test en champ ouvert modifié est de 50 cm. La longueur n’est pas aussi stricte que dans le test clair/foncé puisque la hauteur du joint rotatif peut être ajustée en fonction de la longueur du câble de raccordement à fibre optique, ce qui garantit que la souris peut simplement atteindre les coins de la chambre.
Sur la base des analyses de puissance, 10 à 12 souris par groupe sont nécessaires pour les souris CD1 et C57BL/6J avec CGRP i.p., et pour les souris optogénétiques C57BL/6J pour détecter une aversion significative à la lumière. Cependant, la taille du groupe C57BL/6J était considérablement plus grande que la taille du groupe CD1 (Figure 2A,B) parce que les souris C57BL/6J ne répondaient pas au CGRP dans un sous-ensemble des tests10, ce qui signifie que plusieurs tests ont été effectués pour tenir compte de cette grande variabilité du comportement aversif à la lumière chez ces souris. Plus précisément, deux expériences ont été combinées pour les souris CD1 et quatre expériences ont été combinées pour des souris C57BL/6J avec i.p. CGRP (Figure 2A,B)10. La raison de cette variabilité n’est pas connue, mais les humains montrent également une variabilité dans leurs réponses au CGRP et à la lumière. L’injection intraveineuse (i.v.) de CGRP a induit des crises de migraine chez environ 63 ~ 75% des patients migraineux, avec 70 ~ 90% des patients qui ont présenté des crises de migraine présentant une photophobie22,23,24,25. Au total, le test présente une variabilité considérable et, en plus du nombre de souris, il est essentiel de faire au moins deux et de préférence trois expériences entièrement indépendantes avec différentes cohortes de souris.
La litière n’est pas nécessaire dans la chambre claire/sombre et l’expérimentateur n’est pas tenu de pré-manipuler ou d’habituer les souris. Par mesure de précaution, les deux procédures de pré-exposition servent à acclimater les souris aux signaux olfactifs et physiques de l’expérimentateur; cependant, Ueno H. et al. ont démontré qu’il n’y a pas de différence de temps dans la lumière dans le test lumière/obscurité ou de temps au centre dans le test en plein champ entre les souris après manipulation répétée et les souris sans manipulation26.
Le test en champ ouvert peut évaluer la contribution de l’anxiété à un phénotype aversif à la lumière. Il existe d’autres tests liés à l’anxiété bien validés, tels que le labyrinthe zéro élevé et le labyrinthe plus élevé27; toutefois, le test en champ ouvert est le contrôle le plus pertinent sur le plan procédural pour le protocole lumière/obscurité puisque la même chambre d’essai est utilisée pour les deux essais. Même ainsi, une évaluation de l’anxiété peut être renforcée en utilisant plusieurs tests ou en mesurant plusieurs paramètres dans un seul test, étant donné que l’anxiété est un comportement compliqué et multiforme. Il est important de noter que même s’il n’y a pas de phénotype d’anxiété dans le test en plein champ, cela n’exclut pas une composante d’anxiété au phénotype aversif à la lumière. Par exemple, la lumière peut déclencher une réponse d’anxiété. Le test en champ ouvert indique seulement que l’anxiété seule n’est pas à l’origine de la réponse à la lumière. Alors qu’un médicament anxiolytique, tel que le benzodiazépame, pourrait être utilisé dans ce test, une telle approche aurait des complications, par exemple, les médicaments anxiolytiques affectent la locomotion. Au lieu de cela, nous avons choisi d’utiliser des médicaments anti-migraineux cliniques, y compris le sumatriptan, pour valider le statut migraineux du phénotype aversif léger. Le sumatriptan a réussi à inverser l’aversion lumineuse induite par le CGRP chez les souris CD1 et C57BL/6J10.
Contrairement au test clair/foncé modifié, la chambre du tiroir coulissant se trouve à l’extérieur de la cabine avec les portes de la cabine ouvertes dans le test en champ ouvert modifié en raison du cordon de raccordement se connectant à la tête de la souris. Au lieu de 55 lux, la lumière de la pièce atteint le sol de la chambre à ~ 1000 lux. Même si l’intensité lumineuse est différente, le test en champ ouvert est un test indépendant de la lumière. Dans le détail, l’augmentation de l’intensité lumineuse de 55 à 27 000 lux dans le test en plein champ a entraîné une tendance à la diminution du temps au centre chez les souris C57BL / 6J, suggérant que l’intensité lumineuse peut influencer le comportement de la souris28. Cependant, la différence entre les groupes témoin et expérimental n’était significative ni sous 55 ni 27 000 lux28. De plus, la différence d’intensité lumineuse entre 55 et 1000 lux est beaucoup plus subtile qu’entre 55 et 27 000 lux. L’optogénétique sans fil peut résoudre ce problème car il n’y aurait pas de cordon de raccordement, ce qui permettrait de pousser la chambre de champ ouvert à l’intérieur de la cabine d’atténuation du son.
De plus, le cordon de raccordement limite toujours le mouvement de la souris malgré la sélection d’une longueur optimale. À l’avenir, l’optogénétique sans fil offrira une alternative non invasive aux techniques optogénétiques par câble.
Il convient de noter que nous avons utilisé l’injection aiguë de CGRP, qui ne réplique qu’en partie la libération prolongée de CGRP qui accompagne les crises de migraine. Bien que nous ayons injecté du CGRP à des souris pour modéliser la migraine en partant du principe que les taux plasmatiques de CGRP ont augmenté29 et que le CGRP i.v induit des crises de migraine chez les patients migraineux22,23,24,25,30, cela ne reproduira pas la condition chez le patient où le CGRP est maintenu à des niveaux élevés pendant une période relativement longue (les mesures des patients ont été prises à une médiane 3 heures après le début de la migraine29 ), il ne reproduit pas non plus la migraine chronique lorsque les niveaux seraient élevés même entre les crises31. De plus, d’autres médiateurs induits par la douleur n’ont pas été testés dans notre paradigme.
Le groupe Mogil a modifié le labyrinthe plus élevé pour mesurer l’aversion à la lumière chez les souris, les bras fermés étant éclairés par une lumière vive et les bras ouverts restant sombres32. Le labyrinthe standard élevé plus a souvent été utilisé pour détecter les comportements liés à l’anxiété chez les animaux. Ce test est basé sur le conflit entre le désir inné d’une souris d’explorer un nouvel environnement et le fait d’être placée dans une position compromettante dans les bras ouverts du labyrinthe non protégé. Dans le protocole modifié, les souris sont obligées de choisir entre les bras fermés, qui sont éclairés par une lumière vive, et les bras ouverts non protégés, qui sont sombres. La préférence pour le premier suggère que l’anxiété l’emporte sur l’aversion légère tandis que la préférence pour le second suggère que l’aversion légère prime sur l’anxiété. Le groupe Mogil a également mené un labyrinthe standard élevé plus pour évaluer le comportement anxieux32. Le but est le même que celui de la réalisation du test en champ ouvert dans notre protocole. Des souris mutantes Cacna1a, un modèle familial de migraine hémiplégique, ont montré une photophobie lorsque les bras fermés étaient brillants. En revanche, un comportement anxieux n’a pas été détecté lorsque le labyrinthe standard élevé plus a été mené32. Chez le rat, en utilisant à la fois le labyrinthe plus élevé modifié et le test clair/foncé, il a été démontré que la nitroglycérine (NTG) était capable d’induire une photophobie33,34, qui a été sauvée par le sumatriptan34. Dans le cadre standard élevé plus labyrinthe où la lumière est absente dans les bras fermés, le NTG a induit un comportement anxieux chez les rats34, suggérant que l’aversion à la lumière induite par le NTG s’accompagne d’anxiété. À notre connaissance, il n’y a pas de publications utilisant le test lumière/obscurité et le labyrinthe surélevé modifié dans le même modèle de souris. Dans l’ensemble, le labyrinthe plus élevé modifié et le test lumière/obscurité proposé dans ce protocole ont été démontrés comme des mesures efficaces du comportement aversif à la lumière chez la souris.
Nous utilisons le panneau LED de lumière du jour avec une couleur équilibrée à la lumière du jour (5600K), avec un faisceau d’inondation de 60 °, ne donnant aucun ombrage à une hauteur d’environ 30 cm du sol de la chambre à 55 lux ou 27 000 lux. D’autres études portant sur l’aversion à la lumière ont utilisé le test lumière/obscurité avec des modifications variables. Par exemple, des études ont utilisé différentes intensités lumineuses pour la zone lumineuse, allant de centaines à des milliers de lux35,36,37; utilisé de la lumière à différentes longueurs d’onde (p. ex. bleu et jaune)38; ou utilisé différentes températures de lumière (froide et chaude)39. Des précautions doivent être prises pour la chaleur produite par la lumière car elle peut affecter la température des zones sombres et claires et interférer avec le comportement des souris, provoquant potentiellement une préférence pour une zone spécifique. En outre, il est également important d’utiliser la lumière avec un bon angle de vision pour éviter l’ombre sur le sol de la chambre. L’intensité lumineuse est également importante pour le test. 25 000 à 27 000 lux équivaut approximativement à la lumière du jour. En effectuant le test lumière/obscurité à une intensité lumineuse aussi élevée, il est possible d’amplifier l’effet du traitement; cependant, il est essentiel de considérer les dommages rétiniens40 et l’effet négatif d’une intensité lumineuse aussi élevée sur la volonté d’une souris d’aller dans la lumière. Certaines études ont rapporté que les yeux de souris exposés à la lumière directe41 et les souris exposées à la lumière vive pendant plusieurs heures (par exemple 30 000 lux pendant 4 heures42) ont subi des lésions rétiniennes. Dans le test lumière/obscurité, il y a une zone sombre pour que la souris puisse échapper à la lumière vive si la souris le désire. En outre, des études antérieures ont révélé que les souris du groupe témoin (souris C57BL / 6J) passaient un temps similaire dans la zone lumineuse sous 55, 1000 et 27 000 lux28. Pour les souris CD1, le groupe témoin a passé environ 1/3 du temps dans la lumière sous 27 000 lux10 et des données non publiées avaient montré des résultats similaires à 55 lux. Cela suggère que la lumière de 27 000 lux à elle seule ne rend pas les souris CD1 et C57BL / 6J en détresse. Néanmoins, il faut faire preuve de prudence lorsque l’on opte pour une intensité lumineuse plus élevée.
Outre les différences de réglage de la lumière, les chercheurs ont opté pour diverses approches dans l’analyse des données claires / sombres. Lors de l’évaluation de l’aversion à la lumière, le temps passé dans la zone lumineuse avec la lumière éteinte (ou avec l’éclairage de la lumière rouge de la zone lumineuse, étant donné que les yeux des souris sont moins réceptifs à la lumière rouge) est inclus dans le calcul. Par exemple, aversion index= (time in light0 lux-time in lighttest lux)/ time in light0 lux a été utilisé par le groupe de Gorin pour évaluer l’aversion à la lumière43. Ici, les conditions « lumière éteinte » ou « lumière rouge » sont incluses pour confirmer que l’évitement de la zone lumineuse est conditionnel à la présence de lumière par opposition à la simple préférence de lieu. Nous avons effectué cette procédure avec injection i.p. de CGRP et avons constaté que les souris recevant du CGRP n’avaient pas de préférence de lieu avec la lumière éteinte dans la zone lumineuse, confirmant que l’aversion induite par le CGRP dépend de la lumière16. Enfin, le groupe de Gorin a utilisé le temps passé par les souris à la périphérie de la zone de lumière dans le test lumière/obscurité comme mesure de l’anxiété36. Nous utilisons un test traditionnel pour l’anxiété, le test en plein champ. Quelle que soit la méthode d’analyse choisie, il convient de noter que la contribution de l’anxiété à l’aversion à la lumière ne peut être ignorée. Ce protocole tente de séparer les comportements anxieux et aversifs à la lumière en utilisant les tests lumière/obscurité et champ ouvert en tandem.
Ce protocole traite de l’utilisation des tests lumière/obscurité et champ ouvert pour la détection du comportement aversif de la lumière chez la souris. Cela fournit un outil utile pour identifier les mécanismes des circuits neuronaux et des régions du cerveau à l’origine de la photophobie. Le paradigme du test peut être spécifique à la migraine ou peut être étendu à d’autres troubles impliquant la photophobie. En ce qui concerne la migraine, nous avons testé deux autres neuropeptides associés à la pathogenèse de la migraine : le polypeptide activant l’adénylate cyclase hypophysaire (PACAP) et le peptide intestinal vasoactif (VIP). Il a été démontré que le PACAP et le VIP induisaient une aversion à la lumière chez les souris CD17,21. En plus de la migraine, la photophobie est également un symptôme de nombreux autres troubles, y compris la bradyopsie, les lésions oculaires aiguës ou l’inflammation, les syndromes cérébraux traumatiques, la maladie de Lyme, l’albinisme et la dystrophie conique36. Ainsi, ce paradigme de test fournit un outil pour étudier les mécanismes sous-jacents aux troubles liés à la photophobie. De plus, l’association de méthodes optogénétiques avec des approches pharmacologiques conventionnelles contribuera sans aucun doute au développement de nouvelles thérapies pour les troubles liés à la photophobie.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à signaler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions des NIH NS R01 NS075599 et RF1 NS113839. Le contenu ne représente pas les points de vue de VA ou du gouvernement des États-Unis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Activity monitor | Med Assoc. Inc | Software tracking mouse behavior | |
| Customized acrylic shelf | For adjusting the height of the LED panel | ||
| Dark box insert | Med Assoc. Inc | ENV-511 | |
| DC power supply | Med Assoc. Inc | SG-500T | |
| DC regulated power supply | Med Assoc. Inc | SG-506 | |
| Fiber-optic cannula | Doric | MFC_200/ 240-0.22_4.5mm_ZF1.25_FLT | |
| Germicidal disposable wipes | Sani-Cloth | SKU # Q55172 | |
| Heat Sink | Wakefield | 490-6K | Connecting to LED panel |
| IR controller power cable | Med Assoc. Inc | SG-520USB-1 | |
| IR USB controller | Med Assoc. Inc | ENV-520USB | |
| Mating sleeve | Doric | SLEEVE_ZR_1.25 | |
| Modified LED light panel | Genaray Spectro | SP-E-360D | Daylight-balanced color (5600K) |
| Power supply | MEAN WELL USA | SP-320-12 | Connecting to LED panel |
| Seamless open field chamber | Med Assoc. Inc | ENV-510S | |
| Sound-attenuating cubicle | Med Assoc. Inc | ENV-022MD-027 | |
| Stand and clamp | |||
| Three 16-beam IR arrays | Med Assoc. Inc | ENV-256 |
References
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