Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Analytisk bestemmelse av mitokondriefunksjon av utskilte faste tumor homogenater

Published: August 6, 2021 doi: 10.3791/62875
Automatic Translation
1,2,3, 1, 2,4, 1,3
1Integrated Physiology and Molecular Medicine Laboratory, Pennington Biomedical Research Center, 2Clinical Oncology and Metabolism, Pennington Biomedical Research Center, 3Department of Nutrition, Case Western Reserve University, 4Department of Clinical Nutrition, University of Texas Southwestern Medical Center

Summary

Vi utviklet en praktisk protokoll og analytisk tilnærming for å evaluere mitokondrie oksidativ fosforylering og elektronoverføringskapasitet i friske tumor homogenater. Denne protokollen kan enkelt tilpasses for å kartlegge ulike mitokondriefunksjoner som bidrar til kreftinitiering, progresjon og behandlingsrespons.

Abstract

Mitokondrier er avgjørende for utbruddet og progresjonen av kreft gjennom energiproduksjon, reaktiv oksygenartregulering og makromolekylsyntese. Genetiske og funksjonelle tilpasninger av mitokondrier til tumormiljøet driver proliferativt og metastatisk potensial. Fremveksten av DNA- og RNA-sekvensering fjernet kritiske barrierer for evaluering av genetiske mediatorer av tumorigenesis. Men til dags dato forblir metodologiske tilnærminger for å evaluere tumor mitokondriefunksjon unnvikende og krever tekniske ferdigheter som begrenser gjennomførbarheten, og til slutt reduserer diagnostisk og prognostisk verdi i både eksperimentelle og kliniske omgivelser. Her skisserer vi en enkel og rask metode for å kvantifisere rater av oksidativ fosforylering (OXPHOS) og elektronoverføringskapasitet (ET) i nyutsette faste tumorhomogenater ved hjelp av høyoppløselig respirometri. Protokollen kan reproduseres på tvers av arter og tumortyper, samt tilpasses for å evaluere et mangfold av mitokondrie ET-veier. Ved hjelp av denne protokollen viser vi at mus som bærer en lysende B-mammarykreft, viser defekt nikotinamid adenin dinukleotidbundet åndedrett og avhengighet av succinat for å generere adenosin triphosfat via OXPHOS.

Introduction

Alle celler er nært knyttet sammen av deres behov for å produsere og konsumere adenosin triphosfat (ATP), den molekylære energivalutaen. Ettersom cellulære mutasjoner gir opphav til dannelsen av svulster, sikrer mitokondrier overlevelse gjennom diversifisering av energiproduksjon som ofte er fenotypisk skiller seg fra ikke-kreftvev1,2,3. Som sådan er det et kritisk behov for rask og dyp profilering av mitokondrie respiratorisk funksjon for å lette klassifiseringen av tumortype, kreftinitiering, progresjon og behandlingsrespons.

Åndedrettsfunksjoner av eksisjonerte vevsprøver kan ikke evalueres intakt, da de primære substratene for OXPHOS ikke er cellegjennomtrengelige. For å overvinne denne begrensningen kan mitokondrier tilberedes enten ved isolasjon, kjemisk permeabilisering eller mekanisk homogenisering. Mitokondrieisolasjon anses lenge å være en gullstandard for evaluering av åndedrettsfunksjon. Det krever imidlertid store mengder vev, er tidkrevende, og gir lav avkastning med mulig utvalgsbias for visse brøkdeler av mitokondrier4. Permeabilisering består av mekanisk separasjon og eksponering av vevsseksjoner eller fiberbunter til et mildt vaskemiddel som selektivt forringer plasmamembranen5. Permeabilisering brukes ofte i strikkevev som skjelett og hjertemuskel, da individuelle fiberbunter kan ertes fra hverandre. Sammenlignet med isolasjon gir permeabilisering flere mitokondrier i sitt opprinnelige cellemiljø og fysiske form5. Permeabilisering har blitt brukt i andre vev somtumor 6,7 og placenta8; Reproduserbarhet av permeabiliserte fiberpreparater kan imidlertid være vanskelig på grunn av konsistens av disseksjon og oksygenkrav for å overvinne diffusjonsbegrensninger9. I tillegg kan permeabiliserte fibre være uegnet i visse tumortyper som er tett cellulære og svært fibrotiske. Vev homogenater genereres gjennom mekanisk forstyrrelse av plasmamembranen og ligner permeabiliserte fibre når det gjelder mitokondrieutbytte og integritet10. Vev homogenater minimerer også begrensningene for oksygendiffusjon og kan lett brukes på tvers av vevstyper gjennom optimalisering av mekanisk kraft11,12.

Her skisserer vi en enkel og rask metode for å kvantifisere rater av oksidativ fosforylering (OXPHOS) og elektronoverføringskapasitet (ET) i nyutsette faste tumorhomogenater. Protokollen er optimalt designet for å evaluere friskt vev ved hjelp av Oxygraph-2k (O2k) høyoppløselig respirometer, som krever forkunnskaper om instrumentelt oppsett og kalibrering, men kan tilpasses på samme måte ved hjelp av hvilken som helst Clark-type elektrode, Seahorse-analysator eller plateleser. Protokollen kan reproduseres på tvers av arter og tumortyper, samt tilpasses for å evaluere et mangfold av mitokondrie ET-veier.

Protocol

Alle eksperimenter og prosedyrer som involverte dyr ble godkjent av Pennington Biomedical Research Center Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Reagens forberedelse.

  1. Forbered EO771 cellevekstmedier med 10 mM HEPES, 10% foster bovint serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin (100 U / ml) og 0,2% amfotericin B.
  2. Forbered 1 L biopsibevaringsløsning (BIOPS) i et 1000 ml glassbeger.
    1. Tilsett 3,180 g Na2ATP (5,77 mM endelig konsentrasjon).
    2. Tilsett 1,334 g MgCL2·6H2O (6,56 mM endelig konsentrasjon).
    3. Tilsett 2,502 g Taurin (20 mM endelig konsentrasjon).
    4. Tilsett 3,827 g Na2Fosfokreatin (15 mM endelig konsentrasjon).
    5. Tilsett 1,362 g Imidazol (20 mM endelig konsentrasjon).
    6. Tilsett 0,077 g Dithiothreitol (.5 mM endelig konsentrasjon).
    7. Tilsett 9,76 g MES-hydrat (50 mM endelig konsentrasjon).
    8. Tilsett 800 ml H2O og bland bestanddelene ved hjelp av en magnetisk rører ved 30 °C.
    9. Tilsett 72,3 ml 100 mM K2EGTA (7,23 mM endelig konsentrasjon).
      1. Løs opp 7,608 g EGTA og 2,3 g KOH i 100 ml H2O.
      2. Juster pH til 7.0 med 5 M KOH og ta volumet opp til 200 ml med H2O.
    10. Tilsett 27,7 ml 100 mM CaK2EGTA (2,77 mM endelig konsentrasjon).
      1. Løs opp 7,608 g EGTA i 200 ml H2O og varm opp til 80 °C (100 mM endelig konsentrasjon).
      2. Løs opp 2,002 g CaCO3 i 200 ml varm 100 mM EGTA-oppløsning.
      3. Mens du kontinuerlig rører, tilsett 2,3 g KOH og juster pH til 7,0.
    11. Juster pH til 6,75 ved 23 °C (pH 7,1 ved 0 °C) med 5 M KOH. Ta volumet opp til 980 ml med H2O, og bland løsningen. Kontroller pH en gang til, juster om nødvendig, og ta det endelige volumet opp til 1000 ml med vann.
    12. Aliquot BIOPS i koniske rør (15 ml eller 50 ml) og oppbevar ved -20 °C til bruk. Bare tine en gang, like før bruk.
  3. Forbered 1 L mitokondrie respirasjonsmedium (MiR05) i et 1000 ml glassbeger.
    1. Tilsett 0,190 g EGTA (0,5 mM endelig konsentrasjon).
    2. Tilsett 0,610 g MgCL2·6H2O (3 mM endelig konsentrasjon).
    3. Tilsett 2,502 g Taurin (20 mM endelig konsentrasjon).
    4. Tilsett 1,361 g KH2PO4 (10 mM endelig konsentrasjon).
    5. Tilsett 4,77 g HEPES (20 mM endelig konsentrasjon).
    6. Tilsett 37,65 g D-Sukrose (110 mM endelig konsentrasjon).
    7. Tilsett 800 ml H2O og bland bestanddelene ved hjelp av en magnetisk rører ved 30 °C.
    8. Tilsett 120 ml 0,5 M laktobionsyre (60 mM endelig konsentrasjon).
      1. Løs opp 35,83 g laktobionsyre i 100 ml H2O.
      2. Juster pH til 7.0 med 5 M KOH og ta volumet opp til 200 ml med H2O.
    9. Bland løsningen og juster pH til 7.1 med 5 M KOH.
    10. Vei 1 g BSA, i hovedsak fettsyrefri (1 g/l endelig konsentrasjon), i et konisk rør på 50 ml. Tilsett 40 ml pH 7.1-oppløsning fra trinn 9 til rør, snu forsiktig for å blande og unngå skumming. Overfør oppløst BSA til den gjenværende pH 7.1-oppløsningen fra trinn 9 og rør forsiktig og kontinuerlig. Kontroller pH en gang til, juster om nødvendig, og ta det endelige volumet opp til 1000 ml med H2O.
    11. Aliquot MiR05-mediet til 50 ml koniske rør og oppbevar ved -20 °C til bruk. Bare tine en gang, like før bruk.
  4. Forbered substrater, uncouplers og inhibitors.
    1. Forbered 0,8 M Malate: Løs opp 536,4 mg L-malinsyre i 4 ml H2O. Nøytraliser med 5 M KOH til pH 7 og ta volumet opp til 5 ml med H2O. Del i aliquots og lagre deretter ved -20 °C.
    2. Forbered 1 M Pyruvate: Løs opp 550 mg pyruvisk syrenatriumsalt i 4 ml H2O. Nøytraliser med 5 M KOH til pH 7 og ta volumet opp til 5 ml med H2O. Del i aliquots og lagre deretter ved -20 °C.
    3. Forbered 0,5 M ADP (adenosin 5′-difosfat): Løs opp 1,068 g ADP natriumsalt i 4 ml H2O. Nøytraliser med 5 M KOH til pH 7 og ta volumet opp til 5 ml med H2O. Del inn aliquots og lagre deretter ved -20 °C.
    4. Forbered 2 M Glutamat: Løs opp 3,7426 g L-glutaminsyremonohydrat i 8 ml H2O. Nøytraliser med 5 M KOH til pH 7 og ta volumet opp til 10 ml med H2O. Del i aliquots og lagre deretter ved -20 °C.
    5. Forbered 4 mM Cytokrom c: Løs opp 50 mg Cytokrom c i 1 ml H2O. Del i aliquots og lagre deretter ved -20 °C.
    6. Forbered 1 M Succinate: Løs opp 2,701 g Succinate disodium saltheksahydrat i 8 ml H2O. Nøytraliser med 1 N HCl til pH 7 og ta volumet opp til 10 ml med H2O. Del i aliquots og lagre deretter ved -20 °C.
    7. Forbered 1 mM FCCP (carbonylcyanid-4-(trifluorometoksy)fenylhydrazon): Løs opp 2,54 mg FCCP i 10 ml ren etanol. Del i aliquots og lagre deretter ved -20 °C.
    8. Forbered 150 μM Rotenone: Løs opp 3,94 mg rotenon i 10 ml ren etanol for å forberede 1 mM lager, virvel til den er fullstendig oppløst. Fortynn 225 μL 1 mM Rotenone lagerkonsentrasjon med 1,275 ml rent etanol for å lage 1,5 ml 150 μM Rotenone. Beskytt mot lys, del inn i aliquots, og lagre deretter ved -20 °C.
    9. Forbered 125 μM Antimycin A: Løs opp 11 mg Antimycin A i 4 ml ren etanol for å forberede 5 mM lagerkonsentrasjon av Antimycin A. Fortynn 25 μL 5 mM Antimycin En lagerkonsentrasjon med 975 μL ren etanol for å lage 1 ml 0,125 mM Antimycin A. Del inn i aliquots og lagre deretter ved -20 °C.
    10. Forbered 0,8 M Ascorbate: Løs opp 1,584 g Ascorbate natriumsalt i 8 ml H2O. Juster pH med askorbinsyre til pH 6 og ta volumet opp til 10 ml med H2O. Beskytt mot lys, del inn i aliquots, og lagre deretter ved -20 °C.
    11. Forbered 0,2 M TMPD (tetrametyl-p-fenylenediamin): Løs opp 32,85 mg TMPD i 987,5 μL DMSO. Tilsett 12,5 μL 0,8 M ascorbat (10 mM endelig konsentrasjon av ascorbat). Beskytt mot lys, del inn i aliquots, og lagre deretter ved -20 °C.
    12. Forbered 4 M natriumazid: Løs opp 2,6 g natriumazid i 10 ml H2O. Del i aliquots og oppbevar ved -20 °C.

2. Tumorvekst

  1. Vokse EO771 celler i RPMI 1640 vekstmedier og opprettholde cellene i en 37 °C fuktet inkubator med 5% CO2.
  2. Enkelthus fire uker gamle kvinnelige C57BL / 6J mus, opprettholde dem ved 21-22 °C på en 12 timers lys: mørk syklus. Gi musene ad libitum tilgang til mat og vann.
  3. Når musene når 10 ukers alder, forberede cellene og musene for kreftcelleimplantasjon.
    1. Prøv cellene, deaktiver trypsin med vekstmedier og sentrifugeceller ved 500 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Aspirer supernatanten og resuspend og kombiner cellepellets (etter behov) i media. Tell levedyktige celler ved hjelp av trypanblå og forbered en cellefortynning av 1 x 106 celler i et totalt volum på 60 μL med en 1:1:1 Media / Kjellermembranmatrise / PBS-løsning. Når kjellermembranmatrisen er tilsatt, bland godt og hold cellefjæringen på is. Fyll sprøyter med 60 μL celleoppheng og legg dem på is. Arbeid effektivt og injiser celler i mus innen 1,5 timer etter tilberedning.
    2. Bedøv mus ved isofluraninnånding (3%-5% for induksjon og 1%-3% for vedlikehold). Barber mellom høyre 4og 5th inguinal brystkjertler. Ortopisk injisere de bedøvede musene med EO771 celle suspensjon.
  4. Bruk elektroniske kalipere til å overvåke og måle tumorveksten to ganger i uken i 4 uker. Ved nekropsi, særavgifter, veie, og plasser deretter svulsten (eller minst 60 mg tumorseksjon) umiddelbart i 10 ml iskald BIOPS. Hold røret på våt is.

3. Instrumentoppsett og kalibrering

  1. Varm Opp MiR05-mediet i et vannbad på 37 °C.
  2. Slå på Oroboros O2k-systemet, åpne DATLAB-programvare, skriv inn eller velg Bruker. Klikk Koble til O2k. Kontroller O2k-konfigurasjonen og kontroller at riktig instrument er merket for Power-O2k, og at hvert kammer tilsvarer riktig oksygensensor; klikker du OK. Når O2k-kontrollvinduet åpnes, setter du blokktemperaturen til 37 °C under System-fanen, rørerhastigheten til 750 o/min for begge kamrene, og dataregistreringsintervallet til 2,0 s. Merk av for både Rørekraft og Belysning i Kammerbokser. I kategorien Oksygen, O2 setter du forsterkningen for sensoren til 1 V/μA (forsterkningen må kanskje justeres for eldre instrumentmodeller), polariseringsspenningen til 800 mV, og deretter klikker du koble til O2k. Når en ny eksperimentfil åpnes, gir du filen et navn og klikker Lagre. Når eksperimentet er aktivt, åpnes et protokollvalgvindu. klikk på Avbryt for å kjøre en tilpasset SUIT (Substrat uncoupler inhibitor titration).
  3. Etter protokollvalg åpnes et eksempelvindu for å fylle ut eksperimentell kode, eksempeltype, kohort, eksempelkode, eksempelnummer og delsampenummer etter behov. Tilordne enheten til mg og angi tumor homogenatkonsentrasjon per ml (mengde per kammer vil automatisk fylle). Kontroller at det angitte mediet er MiR05 og at kammervolumet er 2,00 ml. Legg til kommentarer etter behov i den nederste boksen, og klikk OK.
  4. Fjern stopperne og aspirer 70% etanol fra kamrene. Aspirer aldri nær membranen som er eksponert på innsiden av kammeret. Skyll fire ganger med rent vann og fyll kammeret med 2,25 ml MiR05.
  5. Sensortest: Klikk på F9 for å slå av rørerne i 30 s. Når rørerstangen er slått på igjen, må du sørge for at O2-skråningen raskt øker monoeksponentielt i hvert kammer. Hvis kammeret ikke består sensortesten, kontroller de elektriske tilkoblingene og rengjør hvis salter har akkumulert; gjenta testen. Hvis sensoren fortsetter å feile testen, fjerner du polarografisk oksygensensorkontakt (POS) for å inspisere membranen. Hvis det observeres synlig skade på membranen, tung oksidasjon eller betydelig bobleakkumulering, stans de eksperimentelle prosedyrene og fortsett til instrumentservice.
  6. Oksygenkalibrering: Utfør oksygenkalibrering for å oppnå nøyaktige respirasjonsmålinger.
    1. Med en vridningsbevegelse setter du stopperne langsomt inn i volumkalibrert posisjon. Sifon av overflødig medium kastet ut gjennom injeksjon kapillæren som samler seg i brønnen på stopperen. Med en vridningsbevegelse løfter du proppene akkurat nok til å montere stopperavstandsverktøyet tett og etterlate et gassvolum over væskefasen for den endelige luftlikevekten (30-45 min.).
    2. Bruk steady-state oppnådd i løpet av denne perioden til å kalibrere oksygensensoren for å oppnå nøyaktige målinger av åndedrett. O2 skråning neg. (negativ helling av oksygen) er 0 ± 2 pmol/s·mL. Hvis verdien er høyere enn 2 pmol/s·ml, rengjør kammeret og fyll det på nytt med ny tint MiR05. Hvis hellingen er ustabil, fortsett til instrumentservice.
    3. Når du har oppnådd en stabil tilstand, velger du O 2-konsentrasjonskurven og markerer den stødige delen av kurven ved å holde nede skifttasten og venstre museknapp. Når regionen er valgt, klikker du på F5, velger merket for luftkalibrering med rullegardinpilen og klikker på Kalibrer og kopier til utklippstavlen.
  7. Instrumental bakgrunnskalibrering (valgfritt)
    1. Etter luftkalibrering må du påse at det ikke er gassvolum over væskefasen for fluks bakgrunnslikevekt (~15 min) og lukk kamrene helt.
      MERK: Steady-state-raten som oppnås i løpet av denne perioden representerer instrumentell bakgrunn og kan trekkes fra de resulterende dataene for forbedret analytisk presisjon. O2 skråning neg. vil i utgangspunktet øke litt og platå mellom ± 2 til 4 pmol /s·mL.
    2. Hvis verdien er høy (>6 pmol/s·mL), er det potensiell biologisk forurensning. I dette tilfellet rengjør kammeret og fyll det på nytt med ny tint MiR05. Når en steady-state er oppnådd, velger du O2 skråning neg. kurve og markerer den stødige delen av kurven ved å holde nede Skift-tasten og venstre museknappen.
    3. Når du har merket området, klikker du F5, merker registerlinjen og merket for Opprinnelig plan med rullegardinpilen, og klikker OK.

4. Tumor homogenat forberedelse

  1. Plasser en glass homogenisator som inneholder 1 ml MiR05 og en tettsittende glasspøl på våt is.
  2. På tidspunktet for studien, plasser vevet i 1 ml BIOPS i en iskald Petri-tallerken.
  3. Rengjør og disseker vevet for å maksimere løselig materiale, unngå nekrotiske regioner og fjern marginalt tumorvev. Bruk et disseksjonsmikroskop, skalpell og kirurgisk pinsett, fjern eventuelt hår, nekrotisk vev, perifert bindevev og vaskulært vev, og tilstøtende fett, etter behov. Pass på å holde svulsten i iskald BIOPS under disseksjonen.
  4. Skjær svulsten i små biter (~ 5-10 mg hver) og legg de resterende tumorstykkene tilbake i 10 ml BIOPS holdt på is. Bruk dette vevet senere for ytterligere preparater om nødvendig.
    MERK: Utfør følgende trinn raskt for å minimere tiden prøven ikke er fullstendig nedsenket i BIOPS. Når prøven er plassert i MiR05, er tiden essensen. Beveg forsiktig det forberedte homogenatet inn i det kalibrerte kammeret så snart som mulig.
  5. Flekk vevsseksjonene forsiktig på et filterpapir, legg dem på en liten plast tjæreveiebåt, og registrer den første våte vekten. Plasser de ubrukte delene tilbake i det koniske røret på 10 ml biops for fortsatt bevaring.
  6. Senk vevsdelene ned i en iskald homogenisator som inneholder MiR05, og registrer den gjenværende vekten på veiebåten, hvis det er aktuelt.
  7. Ved hjelp av en glasspskade (klaringsområde 0,09-0,16 mm), forstyrrer du forsiktig tumorvevet ved å fullføre 5-7 ned-og-opp slag. For hvert slag roterer du pestle i en klokke-klok-mot-med-med-bevegelse 3 ganger mens du skyver pestle ned og 3 ekstra ganger mens du trekker pestle opp igjen. Pass på at vevet legger seg til bunnen av homogenisatoren mellom slag, men unngå å bringe pestle helt over væskevolumet for å forhindre skumming.
    MERK: Det resulterende homogenatet skal virke overskyet med minimale faste vevsrester.
  8. Hell homogenatet i et 15 ml konisk rør og legg det på is.
  9. Pipette 1-3 ml fersk MiR05 over pestle og inn i homogenisatoren for å vaske gjenværende vev homogenat. Hell MiR05-vasken i det koniske røret som inneholder homogenatet. Gjenta pestle og homogenisator vask 2-3 ganger for å sikre fullstendig overføring av homogenatet. Husk målkonsentrasjonen og nødvendig volum for ikke å overfortynne prøven under vasketrinnene.
  10. For å nøyaktig beregne vevshomogenatkonsentrasjonen, må du nøye inspisere homogenisatoren og homogenatet for gjenværende ikke-homogenisert materiale (dvs. bindevev).
    1. For å fjerne det ikke-homogeniserte materialet fra homogenisatoren som ikke kan nås med pinsett, legg MiR05 til homogenisatoren, aspirer volumet (inkludert vevet) med en pipette og flytt innholdet til en Petri-tallerken.
    2. For å fjerne det ikke-homogeniserte materialet fra homogenatet (avgjort i store stykker på bunnen av det koniske røret), aspirer de store stykkene med en pipette og legg dem på vevshetten på det koniske røret.
    3. Fjern vevet fra petriskålen eller den koniske rørhetten med pinsett og flekk det på filterpapir. Tilsett det gjenværende homogenatet fra den koniske rørhetten tilbake i det koniske røret, hette det, og snu deretter for å blande.
    4. Inspiser homogenisatorene og homogenatet på nytt for ytterligere ikke-homogenisert materiale, og gjenta trinn 4.10.1-4.10.3 for å fjerne materialet etter behov.
  11. Vei og registrer massen av det ikke-homogeniserte materialet som er gjenopprettet fra homogenisatoren. Inspiser homogenatpreparatet for grovt intakt vev som overføres. Fjern de ikke-homogeniserte stykkene og vei etter behov.
  12. Trekk vevsvekten som er gjenvunnet fra veiebåten, homogenisatoren og homogenatet (om nødvendig) fra den opprinnelige våte vekten for å beregne den endelige prøvevekten.
  13. Bruk den endelige prøvevekten, legg til ekstra MiR05 for å bringe homogenat til ønsket konsentrasjon (se trinn 5 for detaljer om optimaliseringsforsøk).
  14. Når homogenatet er veid og forberedt, fortsett å analysen så snart som mulig. Oppbevar prøven lagret på våtis til den overføres til instrumentet.

5. Substrat, uncoupler, hemmertitreringsprotokoll (SUIT)

  1. Når instrumentet er kalibrert, og prøven er forberedt, fjern stopperne med en vridningsbevegelse og aspirer MiR05 fra kamrene (unngå membranen som er eksponert inne i kammeret). Bland homogenatbrønnen og tilsett 2,25 ml av homogenatet til kammeret. Hvis du legger til ett homogenat i flere kamre, pipette 1 ml om gangen i hvert kammer mens du blander homogenatet for å sikre lik vevsfordeling. Klikk F4 for å gi navn til og tidsangivelse av hendelsen, og klikk deretter OK.
  2. Fyll en 50 ml sprøyte med oksygen fra en oksygentank med regulator og gassrør ved hjelp av en stump 18 G nål. Hyperoksygenat kamrene til ~ 500 μM oksygen. For dette, injiser oksygen direkte i kamrene. Sett stopperne løst inn og vent med å lukke til oksygenet når ~480 μM. Med en vridningsbevegelse lukker du kammeret langsomt og lar åndedrettet likevekte (~ 15-20 min). Fyll om nødvendig proppens sentrale kapillær med MiR05.
  3. Analytisk bestemmelse av OXPHOS- og ET-kapasiteten (elektronoverføringstilstand) av N-koblet og NS-koblet og CIV (Complex IV)-aktivitet: Bruk dedikerte mikrosyringer for å injisere substrater, uncouplers og inhibitorer i helt lukkede kamre. Klikk på F4 med hver injeksjon for å navngi og tidsstempel hendelsene for hvert kammer i sanntid. Gjennom hele studien velger du F6 for å justere O2-konsentrasjonen og O2 skråning neg. Etter hver injeksjon, vask sprøytene 3 ganger i vann (for vannløselige forbindelser) eller 70% etanol (for forbindelser oppløst i etanol eller DMSO).
    MERK: N-koblet: O2 flux støttet av definerte NADH-genererende substratkombinasjoner, NS-koblet: O2 flux støttet av konvergensen av definerte NADH-generere substratkombinasjoner og succinate.
    1. Tilsett 5 μL 0,8 M Malate (2 mM endelig konsentrasjon) og fortsett umiddelbart til neste injeksjon. Vask injeksjonssprøyten 3 ganger i vann.
    2. Tilsett umiddelbart 5 μL 1 M Pyruvate (2,5 mM endelig konsentrasjon) og vent på at åndedrettet stabiliserer seg. Vask injeksjonssprøyten 3 ganger i vann.
    3. Tilsett 10 μL 0,5 M ADP (2,5 mM endelig konsentrasjon) og vent til ADP-responsen stabiliserer seg. Vask injeksjonssprøyten 3 ganger i vann.
      MERK: Ytterligere ADP (2,5-10 mM) kan være nødvendig for å sikre at adenylatkonsentrasjonene ikke begrenser seg til luftveisflukser.
    4. Tilsett 5 μL 2 M glutamat (5 mM endelig konsentrasjon) og vent på at åndedrettet stabiliserer seg. Vask injeksjonssprøyten 3 ganger i vann.
    5. Tilsett 5 μL 4 mM Cytokrom c (10 μM endelig konsentrasjon) og vent på at åndedrettet stabiliserer seg. Vask injeksjonssprøyten 3 ganger i vann.
    6. Tilsett 20 μL 1 M Succinate (10 mM endelig konsentrasjon) og vent til åndedrettet stabiliserer seg. Vask injeksjonssprøyten 3 ganger i vann.
    7. Titrate 0,5-1 μL trinn på 1 mM FCCP (2-20 μM endelig konsentrasjon) og vent på at åndedrettet stabiliserer seg etter hver injeksjon, fortsett til det ikke er noen ytterligere økning i åndedrett. Vask injeksjonssprøyten 3 ganger i 70% etanol.
    8. Tilsett 2 μL 150 μM Rotenone (150 nM-2 μM sluttkonsentrasjon) og vent til åndedrettet stabiliserer seg. Tilsett ytterligere 1 μL rotenon for å sikre at det ikke er ytterligere hemming. Hvis det er en nedgang i åndedrett, fortsett med ytterligere injeksjoner til det ikke er noen reduksjon i åndedrett. Vask injeksjonssprøyten 3 ganger i 70% etanol.
    9. Tilsett 2 μL 125 μM Antimycin A (125 nM-5 μM endelig konsentrasjon) og vent til åndedrettet stabiliserer seg. Tilsett ytterligere 1 μL Antimycin A for å sikre at det ikke er ytterligere hemming. Hvis det er en nedgang i åndedrett, fortsett med ytterligere injeksjoner til det ikke er noen reduksjon i åndedrett. Vask injeksjonssprøyten 3 ganger i 70% etanol.
    10. Kontroller oksygenkonsentrasjonen av kammeret; hvis konsentrasjonen er under 125 μM, reoksygenat til romluft eller mildt hyperoksygenat for å sikre at oksygen ikke begrenser luftveiene. Tilsett 5 μL 0,8 M Ascorbate (2 mM endelig konsentrasjon). Vask injeksjonssprøyten 3 ganger i 70% etanol.
    11. Tilsett umiddelbart 10 μL 0,2 M TMPD (1 mM endelig konsentrasjon) vent på en økning i åndedrett sakte. Vask injeksjonssprøyten 3 ganger i 70% etanol.
    12. Tilsett 25 μL 4 M natriumazid (50 mM endelig konsentrasjon) umiddelbart når luftveiene til Ascorbate/TMPD-platåer. Vask injeksjonssprøyten 3 ganger i 70% etanol.
    13. Avslutt studien - klikk på Fil, Lagre og koble fra. Fortsett å vaske kammeret og sprøyten i trinn 9.2-9.3.

6. ADP-følsomhetsprotokoll

  1. Når instrumentet er kalibrert og prøven er forberedt, fjern stopperne med en vridningsbevegelse og aspirer MiR05 fra kamrene (unngå membranen som er utsatt på innsiden av kammeret). Bland homogenatbrønnen og tilsett 2,25 ml av homogenatet til kammeret. Anta å legge til ett homogenat i flere kamre, pipette 1 ml om gangen i hvert kammer mens du blander homogenatet for å sikre lik vevsfordeling. Klikk F4 for å navngi og tidsstempel hendelsen og klikk på OK.
  2. Sett inn stopperne, og med en vridningsbevegelse lukker du kammeret langsomt og lar åndedrettet likevekte (~ 15-20 min). Fyll om nødvendig proppens sentrale kapillær med MiR05.
  3. Analytisk bestemmelse av kortfattet mitokondriell ADP-følsomhet: Klikk på F4 med hver injeksjon for å navngi og tidsstempel hendelsene for hvert kammer i sanntid. Gjennom hele studien velger du F6 for å justere O2-konsentrasjonen og O2 skråning neg.
    1. Tilsett 2 μL 150 μM rotenon (150 nM endelig konsentrasjon).
    2. Tilsett umiddelbart 20 μL 1 M Succinate (10 mM endelig konsentrasjon) og vent på at åndedrettet stabiliserer seg.
    3. Titrate ADP ved trinnvis tilsetning av submetrende konsentrasjoner til maksimal responsrate (VMAX; 2,5-10 mM endelig konsentrasjon).
      MERK: Hastigheten kan platå etter injeksjon på grunn av en liten endring i ADP-konsentrasjonen, og dermed øke injeksjonskonsentrasjonen etter hvert platå og fortsette med titrering til det ikke er ytterligere økning i åndedrett selv med en foldøkning i ADP-injeksjonskonsentrasjonen.

7. Anbefalte optimaliseringseksperimenter

  1. Bestem optimal homogenat- og oksygenkonsentrasjon for protokollen.
    1. Utfør SUIT-protokollen (trinn 5.1-5.3) ved flere vevskonsentrasjoner (f.eks. 30 mg/ml, 20 mg/ml, 10 mg/ml, 5 mg/ml, 2,5 mg/ml, 1 mg/ml og/eller 0,5 mg/ml).
    2. Velg en konsentrasjon som maksimerer luftveiene samtidig som frekvensen av reoksygenasjoner begrenses (ikke mer enn 1-2). Hvis hyppigere reoksygenasjoner er nødvendig, reduser konsentrasjonen av homogenatet.
  2. Bestem det optimale antallet slag med homogenisatoren.
    1. Utfør SUIT-protokollen (trinn 5.1-5.3) på flere homogeniseringsnivåer (f.eks. 5 slag, 10 slag, 15 slag, 20 slag).
    2. Siden det ikke er tilstrekkelige data i litteraturen til å bestemme en terskel for den prosentvise økningen av cytokrom c med tumor homogenatpreparat, velg preparatet med begrenset cytokrom c respons, men tilstrekkelig åndedrett energisert av substratet (e) av interesse.
  3. Bestem de optimale konsentrasjonene av substrat, ADP, uncoupler og inhibitor som kreves for kvantitative og reproduserbare luftveisflukser.
    1. Utfør SUIT-protokollen (trinn 5.1-5.3.9) ved den valgte vevskonsentrasjonen (trinn 7.1). Titrate hvert substrat, uncoupler, inhibitor og ADP til ingen ytterligere respons er observert. Titrat hemmingen med natriumazid i separate eksperimenter.
      1. Tilsett 5 μL 0,8 M Malate (2 mM endelig konsentrasjon) og fortsett umiddelbart til neste injeksjon.
      2. Titrate 1 μL trinn på 1 M Pyruvate og vent på at åndedrettet stabiliserer seg etter hver injeksjon, fortsett til det ikke er noen ytterligere økning i åndedrett.
      3. Titrate 2 μL trinn på 0,5 M ADP og vent på at åndedrettet stabiliserer seg etter hver injeksjon, fortsett til det ikke er noen ytterligere økning i åndedrett.
      4. Titrate 1 μL trinn på 2 M Glutamat og vent på at åndedrettet stabiliserer seg etter hver injeksjon, fortsett til det ikke er noen ytterligere økning i åndedrett.
      5. Tilsett 5 μL 4 mM Cytokrom c (10 μM endelig konsentrasjon) og vent på at åndedrettet stabiliserer seg.
      6. Titrate 5 μL trinn på 1 M Succinate og vent på at åndedrettet stabiliserer seg etter hver injeksjon, fortsett til det ikke er noen ytterligere økning i åndedrett.
      7. Titrat 5 μL trinn på 0,5 M ADP og vent på at åndedrettet stabiliserer seg etter hver injeksjon, fortsett til det ikke er noen ytterligere økning i åndedrett.
      8. Titrate 0,5 μL trinn på 1 mM FCCP og vent på at åndedrettet stabiliserer seg etter hver injeksjon, fortsett til det ikke er noen ytterligere økning i åndedrett.
      9. Titrat 1 μL trinn på 150 μM Rotenone og vent på at åndedrettet stabiliserer seg etter hver injeksjon, fortsett til det ikke er noen reduksjon i åndedrett.
      10. Titrat 1 μL trinn på 125 μM Antimycin A og vent på at åndedrettet stabiliserer seg etter hver injeksjon, fortsett til det ikke er noen ytterligere reduksjon i åndedrett.
      11. Tilsett 5 μL 0,8 M Ascorbate (2 mM endelig konsentrasjon).
      12. Tilsett umiddelbart 5 μL 0,2 M TMPD (.5 mM endelig konsentrasjon) vent på økning i respirasjon sakte. I et eget eksperiment legger du til 10 μL 0,2 M TMPD (1 mM endelig konsentrasjon).
      13. I separate eksperimenter legge til, 10 μL, 25 μL, 50 μL, og 100 μL av 4 M Natriumazid (20 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM endelig konsentrasjon, henholdsvis) umiddelbart når respiratorisk flux av Ascorbate / TMPD platåer.
    2. Velg substrat- og inhibitorkonsentrasjonene som metter i den første injeksjonen for å forbedre tidspunktet for eksperimentet. Bruk ADP ved metning eller undermetningskonsentrasjoner for å kombinere ADP-følsomhetsevalueringer med tradisjonelle SUIT-protokoller.
    3. Bruk submaksimale uncouplerkonsentrasjoner for å demonstrere doseresponsen uten hemming av respirasjonsfluks.

8. Dataanalyse

  1. SUIT-analyse
    1. Velg steady-state eller peak rater fra hver titrering og eksport for analytisk reduksjon.
    2. Ekspress dataene som pmol O2 per sekund per mg vev (pmol/s/mg).
    3. Oppnå analytisk reduksjon av PM-L, PM-P, PMG-P, PMGS-P og PMGS-E ved å trekke antimycin A ufølsom rate fra den respektive hastigheten (dvs. steady-state rate oppnådd etter tillegg av ADP).
      MERK: PM: Pyruvate + Malate; PMG: Pyruvate + Malate + Glutamat; PMGS: Pyruvate + Malate + Glutamat + Succinate; -L:Lekkasje tilstand; -P: Oksidativ fosforyleringstilstand, -E: Elektronoverføringstilstand.
    4. Oppnå den analytiske reduksjonen av CIV-E ved å trekke natriumazid ufølsom hastighet fra topp ascorbate / TMPD-hastigheten.
    5. Oppnå den analytiske reduksjonen av PMG-E ved å trekke rotenon ufølsom hastighet fra PMGS-E-hastigheten.
    6. Oppnå analytisk reduksjon av S-E ved å trekke antimycin A ufølsom hastighet fra rotenon ufølsom hastighet.
    7. Oppnå analytisk reduksjon av cytokrom c kontrolleffektivitet, en markør for ytre membran intakthet, ved følgende ligning:
      jc = ((JCHNOc - JCHNO)/JCHNO) x 100
      I ligningen er jc % økning ved tilsetning av cytokrom c, JCHNOc er oksygenstrømmen etter tilsetning av cytokrom c, og JCHNO er oksygenfluksen før tilsetning av cytokrom c.
  2. Analyse av ADP-følsomhet
    1. Analytisk bestemme kinetikken for ADP-følsomheten i forhold til lekkasjehastigheten av succinate + rotenon (ikke vevshomogenatets hastighet).
    2. Tegn O 2-fluxen (Y-aksen) mot den relative ADP-konsentrasjonen (X-aksen). Bestem maksimal luftveishastighet (Vmax) som topphastigheten oppnådd over ADP-titreringen.
    3. Bestem Michaelis-Menten-kinetikken ved hjelp av en programvare for kurvetilpasning (PRISM, versjon 10.1) for å avsløre ADP-konsentrasjonen der 1/2 VMAX oppnås (Tilsynelatende KM).

9. Instrumental kvalitetskontroll

  1. Utfør instrumental O2-bakgrunn over ønsket oksygenkonsentrasjonsområde (0-600 μM) og nullkalibrering.
    1. Fullfør trinn 3.1 og 3.2
    2. Fjern stopperne og aspirer 70% etanol fra kamrene (unngå membranen som er utsatt på innsiden av kammeret). Skyll 4 ganger med dobbel destillert H2O, og fyll kammeret med 2,25 ml MiR05
    3. Hyperoksygenat kamrene til ~ 600 μM oksygen.
    4. Sett stopperne langsomt i helt lukket stilling. Sifon av overflødig medium kastet ut gjennom injeksjon kapillæren og samlet i brønnen på stopperen og la oksygensignalet stabilisere seg (30-45 min).
    5. For å utføre oksygenkalibrering, velg regionen der både oksygenkonsentrasjonen og skråningen er stabile, åpne kalibreringsvinduet for det respektive kammeret, og velg R1-merket.
    6. Forbered dithionittoppløsningen ved å oppløse 20 mg natriumhydrosulfitt i 0,5 ml vann. Begrens eksponeringen for luft da dithionitt oksideres over tid med eksponering for oksygen.
    7. Når oksygensignalet er stabilisert, injiser 1 μL og observer nedgangen i oksygenkonsentrasjonen. Juster styrken på dithionite-løsningen etter behov.
    8. Injiser tilstrekkelig dithionittløsning for å senke oksygenkonsentrasjonen til henholdsvis 450 μM, 300 μM, 225 μM, 150 μM, 75 μM og 0 μM. Ved hver injeksjon, la oksygenet stabilisere seg og velg et merke for steady-state skråningen. Når oksygenkonsentrasjonen er ~ 0 μM, oksygenkonsentrasjonen.
    9. For å utføre instrumental O2 bakgrunnskorrigering, velg flux / skråningsvinduet for det respektive kammeret, velg O2 Bakgrunnskalibrering, og klikk på Kalibrer for å merke interessen.
    10. For å utføre nullkalibrering, åpne kalibreringsvinduet for det respektive kammeret, og velg R0-merket oppnådd etter dithionite titrering.
  2. Rengjøring av instrumenter
    1. Skyll raskt hvert kammer med rent vann tre ganger. For den første vasken aspirerer du homogenatet, fyller kammeret fullt ut med vann, og aspirerer deretter vannet. For den andre vasken, fyll kammeret 3/4 fullt av vann, sett inn stopperne for å tvinge vann gjennom injeksjonkapillæren, aspirer noe av vannet gjennom injeksjonkapillæren og fjern deretter stopperne for å aspirere vasken helt.
    2. Vask kamrene med 70% etanol i 5 min.
    3. Over en vask eller beger, rengjør stopperne med rent vann, 70% etanol og 100% etanol, og tvinge væske gjennom injeksjonkapillærene ved hjelp av en vaskeflaske.
    4. Skyll raskt hvert kammer med rent vann to ganger.
    5. Inkuber kamrene med 2 ml PBS som inneholder ~2 mg frosne mitokondrier, cellelysat eller levende fibroblaster i 15 minutter.
    6. Vask kamrene med rent vann i 5 min to ganger.
    7. Vask kamrene med 70% etanol i 5 min to ganger.
    8. Vask kamrene med 100% etanol i 10 min.
    9. Fyll kamrene med 70% etanol.
      1. Hvis du kjører et påfølgende eksperiment, la kamrene ligge i 70% etanol i 5 min og fortsett deretter til trinn 3.3.
      2. Hvis forsøkene er fullført, sett dekslene på stopperne og slå av instrumentet.
  3. Etter hver bruk må injeksjonssprøytene rengjøres riktig og sprøytene er dedikert til spesifikk sammensatt bruk for å forhindre overbæring.
    1. Sett sprøyten inn i vaskevæsken og senk injeksjonsnålen helt ned.
    2. Trekk vaskevæsken inn i sprøyten til maksimalt volum.
    3. Fjern sprøyten fra vaskebeholderen, trekk ut vaskevæsken i et beger og flekk deretter sprøyten på et papirhåndkle.
    4. Gjenta trinn 9.3.1-9.3.3 tre ganger så snart som mulig etter hver bruk.

Representative Results

Innledende studier viste at EO771-svulster var lavt oksidative og dermed krevde høye homogenatkonsentrasjoner for tilstrekkelig O2 flux-vurdering. Optimaliseringseksperimenter ble utført for å bestemme det optimale vevshomogenatkonsentrasjonsområdet for studien. Tumor homogenater ble opprinnelig tilberedt ved 40 mg / ml og deretter lineært fortynnet. O2-fluksen normalisert til vevsmasse var konsistent på tvers av konsentrasjoner (Figur 1A-D). Det ble observert at 40 mg/ml resulterte i rask oksygentømming og ikke var egnet for eksperimentering (figur 1A). Oksygenforbruket avtok betydelig med 30 mg/ml og 20 mg/ml, men gikk likevel raskt ned på kort tid i fravær av substrater eller ADP (Figur 1B,C). Konsentrasjonen på 10 mg/ml resulterte i optimal oksygenforbruk (figur 1D) som ville støtte en 90-minutters SUIT-protokoll på lengre tid.

En SUIT-protokoll ble brukt til å evaluere NADH- og succinate-koblet OXPHOS og ET, samt CIV-aktivitet (figur 2A). Pyruvat og malate ble lagt til vevet homogenat i fravær av ADP for å drive lekkasje (L) gjennom NADH. Metning av ADP ble deretter lagt til for å drive maksimal NADH-koblet OXPHOS (P), etterfulgt av tilsetning av glutamat. Cytokrom c ble deretter lagt til for å sikre ytre membranintegritet; Økningen i respirasjonsraten var mindre enn 20 % i alle utvalg (figur 2B). Gitt den svært lave responsen på NADH-tilknyttede substrater, ble cytokrom c-frigjøring også vurdert i nærvær av succinat og rotenon og observert minimal cytokrom c stimulering (Figur 2B). Interessant nok var NADH-koblet OXPHOS ubetydelig i EO771 svulster (Figur 2C). Succinat ble deretter tilsatt i nærvær av pyruvat, malate og glutamat for å stimulere elektronstrømmen gjennom succinat dehydrogenase. FCCP ble deretter titrert for å drive maksimal elektronstrøm (E), som avslørte at i EO771-svulster var fosforylering i stedet for oksidasjon begrenset til åndedrett (figur 2C). Rotenone og antimycin A ble senere titrert for å hemme henholdsvis kompleks I og kompleks III. Ascorbate og TMPD ble deretter lagt til for å drive maksimal elektronstrøm gjennom CIV, som deretter hemmes av natriumazid. Tabell 1 illustrerer analytiske reduksjonsligninger av rådataene (tabell 2) for å kvantisere luftveiene som er plottet inn i figur 2C. Totalt sett er tumor homogenate respiratoriske profiler (Figur 2C) lik de av ikke-implantert digitonin-permeabilized EO771 celler (Figur 2D) med unntak av redusert maksimal elektronoverføring støttet av N- og S-koblede substrater i svulsten.

Siden NADH-koblet åndedrett var ubetydelig, ble respiratoriske kinetikker av succinat ytterligere evaluert av trinnvise titrasjoner av submetrende ADP til maksimal hastighet (VMAX) ble oppnådd (Figur 3A,3B). Den halvmaksimale konsentrasjonen (KM) av ADP i nærvær av succinat + rotenon var 37,5 μM, mens VMAX var ~ 10,5 pmol /s/mg (figur 3C). Til tross for relativt dårlige oksidasjonsrater var EO771-svulster derfor svært følsomme overfor ADP og opprettholdt ATP-syntese ved relativt lave ADP-konsentrasjoner.

Valg av passende områder av rådataene for utvinning er avgjørende for reproduserbarheten av eksperimenter og nøyaktig kvantifisering. For cytokrom cmå et merke velges ved steady-state umiddelbart før injeksjon (Figur 4A, merke 1). Det er ofte en innledende injeksjon artefakt som kan etterfølges av en periode (ca. 5-10 min) hvor O2 flux ikke er jevn. Evaluering av cytokrom c effektivitet gjøres ved å gjøre et ekstra utvalg når O2 flux har stabilisert seg (Figur 4A, 2). Valg etter tilsetning av substrater, ADP eller de fleste inhibitorer gjøres også etter injeksjonsartefakten og når O 2-fluxen har stabilisert seg (Figur 4B). Valget som brukes til å bestemme maksimal usammenhengende respirasjon gjøres ved toppøkningen oppnådd under titrering av FCCP, som ofte ikke er den siste injeksjonen som er gjort (Figur 4C). Valget for TMPD gjøres etter at både ascorbate og TMPD er lagt til og med den største økningen i åndedrett (Figur 4D, merke 1). Like etter denne toppen tilsettes inhibitoren, natriumazid, som raskt reduserer åndedrett, men har også ofte en injeksjonsartefakt lavere enn den hemmet respirasjonshastigheten (Figur 4D). Inhibitormerket merkes umiddelbart etter injeksjonsartefakten (Figur 4D, merke 2). O2-fluxen vil vanligvis ikke stabilisere seg og fortsette å avta.

Tabell 1: Åndedrettsnotasjon og analytisk avledning. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Prøve- og åndedrettsegenskaper ved luminal B-mammarytumor homogenater. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Figure 1
Figur 1: Optimalisering av tumor homogenatkonsentrasjon. O2 Flux (rød) og O2 Konsentrasjon (blå) i mammary tumor homogenater tilberedt ved (A) 40 mg/ml, (B) 30 mg/ml, (C) 20 mg/ml, og (D) 10 mg/ml. Thom: Vev homogenat respirasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Evaluering av OXPHOS og ET-kapasitet ved høyoppløselig respirometri i nyutslettede tumorhomogenater. (A) Representativ plott av oksygenforbruk (rød) og konsentrasjoner (blå) i løpet av et substrat, hemmer, uncoupler-protokoll. PM: Pyruvate + Malate, D: ADP, G: Glutamate, c: Cytochrome c, S: Succinate, F: FCCP, Rot: Rotenone, Ama: Antimycin A, Asc / TMPD: Ascorbate / Tetramethyl-p-fenylenediamine. (B) Prosentvis økning i O2 flux ved tilsetning av cytokrom c. (C-D) Respirasjon støttet av malate, pyruvat, glutamat og succinate i nærvær av ADP, FCCP, og ascorbate / TMPD i (C) EO771-avledede tumor homogenater og (D) ikke-implanterte EO771 digitonin-permeabiliserte celler. Thom: Vev homogenat respirasjon; PM: Pyruvate + Malate; PMG: Pyruvate + Malate + Glutamat; PMGS: Pyruvate + Malate + Glutamat + Succinate; CIV: Kompleks IV; -L: Lekkasje tilstand; -P: Oksidativ fosforyleringstilstand, -E: Elektronoverføringstilstand; N-koblet: O2 flux støttet av definerte NADH-genererende substratkombinasjoner; NS-koblet: O2 flux støttet av konvergensen av definerte NADH-generer substratkombinasjoner og succinat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: EO771 mammary svulster viste høy ADP (adenosin 5′-difosfat) følsomhet. (A) Representativ plott av oksygenforbruk (rød) og konsentrasjoner (blå) gjennom en S-koblet ADP-titreringsprotokoll. Thom: Vev homogenat respirasjon; S/Rot: Succinate/Rotenone; D: ADP. (B) Åndedrett støttet av succinate i nærvær av rotenon og økende konsentrasjoner av ADP (0 μM ADP = S / Rot-L). (C) Maksimal hastighet (VMAX) og halvmaksimal konsentrasjon (KM) av ADP i nærvær av succinate + rotenone. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representativ sporing som illustrerer valg av rå O2-flukser for datautvinning. (A) Cytokrom c-valg: utvalg nummer 1 før Cytokrom c-injeksjonen og seleksjonsnummer 2 etter injeksjonen når O2-fluxen har stabilisert seg. c Cytokrom c. (B) Valg av substrat, ADP og hemmer: utvalg nummer 1 etter injeksjonen (succinate i denne representative tomten) der O2-fluxen har stabilisert seg. S: Succinate. (C) Uncoupler utvalg: utvalg nummer 1 på toppen økning i respirasjon under uncoupler titration. I denne representative FCCP-titreringsplottet reduserer den tredje injeksjonen litt åndedrett og brukes derfor ikke til valg. F: ACCP. (D) TMPD-valg: utvalg nummer 1 ved maksimal økning av åndedrett etter ascorbate- og TMPD-injeksjonene. Natriumazidvalg: utvalg nummer 2 etter den akutte injeksjonsartefakten når åndedrettet først avtar. As/Tm: Ascorbate/TMPD; Azd: Azide. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Tilnærminger til evaluering av mitokondrie respirasjon i kreft har i stor grad vært begrenset til in vitro modeller13,14,15,16. Noe suksess har blitt oppnådd ved måling av mitokondrie respirasjon i svulster ved hjelp av kjemisk permeabilisering6,7,17, men det er ingen jevn, gullstandard tilnærming som kan brukes universelt og sammenlignes på tvers av tumortyper. I tillegg har mangel på konsistent dataanalyse og rapportering begrenset datageneralisering og reproduserbarhet. Metoden som er skissert her gir en enkel, relativt rask tilnærming for å måle mitokondrie respirasjon18 i mitokondriepreparater fra nyutneksomme faste tumorprøver. Tumorer ble dyrket fra ortopisk implantert murine Luminal B, ERα-negativ EO771 brystkreftceller19.

Flid og omsorg med vevshåndtering vil i stor grad forbedre nøyaktigheten og normaliseringen av oksygenforbruket. Vevet og mitokondriene kan lett bli skadet hvis prøven ikke holdes kald, ikke konsekvent nedsenkes i bevaringsmedier, eller håndteres for mye, noe som resulterer i suboptimal rutine og OXPHOS-priser. I tillegg er nøyaktig våtvekt av det homogeniserte vevet av kritisk betydning, da dette er den primære normaliseringsmetoden. Andre normaliseringsmetoder kan vurderes, for eksempel totalt protein eller mitokondriespesifikke markører, for eksempel sitratsyntaseaktivitet20. I tillegg må vevs heterogenitet tas opp, med beslutninger om tumorregioner å inkludere i eksperimenter gjort a priori. Nekrotisk, fibrotisk og bindevev kan ikke homogenisere og/eller respirere godt og bør unngås med mindre du med vilje ser på disse tumorregionene. Spesielt kan svulsten være veldig klebrig avhengig av type og eksisjonsregion, noe som gjør nøyaktig veiing og overføring mer utfordrende. Antall slag som brukes til homogeniseringer bør optimaliseres for å sikre fullstendig forberedelse av mitokondriene samtidig som skade på de ytre mitokondriemembranene reduseres.

For forbedret nøyaktighet og reproduserbarhet anbefaler vi at optimaliseringseksperimenter utføres for antall slag for homogenatpreparat, vevskonsentrasjon og substrat, uncoupler, inhibitorkonsentrasjoner. Studier kan sammenligne det forskjellige antall slag og hvordan de samsvarer med respons på tilsetning av cytokrom c i studien, samt maksimal mitokondrie respiratorisk kapasitet 21. Selv om det er en generell aksept for at mindre cytokrom c-respons er bedre, som en økning i oksygenforbruket etter tilsetning av cytokrom c kan indikere skade på den ytre mitokondriemembranen, er det ingen gullstandard for hva denne terskelen er for hvert vev og bør undersøkes eksperimentelt for å sikre at vevet ikke blir overarbeidet eller underpreparert. I dette tumorvevet ble det funnet at en cytokrom c-respons under ~ 30% ikke svekket åndedrettsfunksjonen. Cytokrom c-bruk blir avgjørende for nøyaktig kvantifisering av luftveiene hvis testen er positiv. I dette tilfellet etterfyller tillegget endogene cytokrom c, som, hvis de er utarmet, vil forårsake en underestimering av luftveiene.

Vevskonsentrasjonstitreringseksperimenter kan utføres over en rekke mulige konsentrasjoner, og ideelt sett vil det bli gjort med SUITer som vil bli undersøkt under studien. Åndedrettskapasiteten vil variere etter tumortype og sammensetning. Dermed vil svulster tett med mitokondrier eller høy åndedrettskapasitet kreve lavere konsentrasjoner (0,5-5 mg / ml). Svulster med få mitokondrier eller lav åndedrettskapasitet vil kreve høyere konsentrasjoner (7-12 mg/ml). I tillegg kan SUITer som er lange eller har svært konsumerte substrater, trenge mindre vev for å forhindre reoksygenering av kammeret eller ADP-begrensningen. Noen vev vil ha en lineær sammenheng i oksygenforbruket, mens andre vil vise forbedret følsomhet og maksimal oksidasjon ved visse konsentrasjonsområder. Den valgte vevskonsentrasjonen bør optimaliseres for å maksimere oksygenfluksen samtidig som antall reoksygeneringshendelser begrenses. I tillegg er det ofte bedre å overvurdere behovet eller sikte på den høyere enden av konsentrasjonsområdet. Inhibitorene, som er avgjørende for mengden respiratoriske fluxer, er mer presise når de brukes i større bassenger av mitokondrier.

En annen viktig vurdering er konsentrasjonen av stoffene som brukes under protokollene. Endringer i homogenatkonsentrasjon kan endre konsentrasjonen av substrater, uncouplers og hemmere som kreves for maksimal respons. Når det optimale konsentrasjonsområdet er valgt, bør det derfor utføres et eksperiment som tester dosene som kreves for SUIT-protokollen. Ytterligere ADP kan tilsettes for å sikre at adenylatkonsentrasjoner ikke begrenser seg til luftveisflukser. Kjemiske uncouplers som FCCP eller CCCP vil hemme respirasjon ved høyere konsentrasjoner22. Som sådan er det viktig å titrate i små mengder for å avsløre maksimal oppnådd hastighet. Inhibitorer, som rotenon og antimycin A, brukes best når de er mettet i den første injeksjonen. Mens optimale konsentrasjoner ble bestemt i foreløpige eksperimenter, har vi også observert behandlingsrelaterte forskjeller som respons på inhibitorer og dermed ofte legge til en ekstra injeksjon av inhibitorer for å demonstrere maksimal hemming som resulterende priser tjener som grunnlag for kvantifisering. Kjemisk hemming av Ascorbate/TPMD er avgjørende for nøyaktig analytisk reduksjon ettersom TMPD gjennomgår autooksidasjon23. Vi kontrollerte for automatisk oksidasjon av ascorbat/TMPD/cytokrom c gjennom tilsetning av natriumazid, en etablert CIV-hemmer. For Km-studiene forhindrer tilsetningen av rotenon i nærvær av succinat alene oksalacetatakacekkumulering som kan hemme succinat dehydrogenaseaktivitet ved lave konsentrasjoner24. Volumet og konsentrasjonen av ADP er svært avhengig av mitokondrienes følsomhet for den rådende substratkombinasjonen. Mitokondriepreparater som er svært følsomme for ADP, vil kreve lavere startkonsentrasjoner. I tillegg er validerte kjemikalier og riktig legemiddelforberedelse med hensyn til pH, lysfølsomhet hvis aktuelt, og lagringstemperatur avgjørende for vellykkede eksperimenter.

Instrumentoppsett og rutinemessig pleie er av avgjørende betydning for suksessen til disse eksperimentene. Tilstrekkelig og riktig rengjøring av kamrene er avgjørende for reproduserbarhet og forebygging av biologisk, protein, inhibitor eller uncoupler forurensning. Clark-type elektroder og O2k-systemer bruker glassreaksjonskamre som er en betydelig kostnadsfordel for platebaserte systemer som er avhengige av forbruksvarer. Glasskamrene må imidlertid rengjøres kraftig og kan være en kilde til inhibitorforurensning i etterfølgende studier. Inkubasjon med mitokondririke prøver under vaskeprosessen (for eksempel isolert hjerte- eller levermitokondrier) kan redusere risikoen for eksperimentell forurensning og anbefales i tillegg til fortynning og alkoholbaserte vaskeprosedyrer. Hvis påfølgende studier kjøres, minimerer rengjøring med etanol og mitokondrier muligheten for hemmerforurensning. Kalibrering av oksygensensoren anbefales før hvert eksperiment for å oppnå nøyaktige målinger av åndedrett i forhold til det rådende delvise oksygentrykket. Hvis flere kalibreringer ikke er mulig, kan en kalibrering om dagen være tilstrekkelig hvis oksygenkonsentrasjonen forblir stabil og konsistent etter vaskeprosedyren.

Prosedyrene som er skissert ovenfor utnytter Oroboros O2k-instrumentet for måling av oksygenforbruk i tumorvev innen 4 timer etter tumorutskillelse ved hjelp av tidligere designet og optimalisert bevaringsløsning og åndedrettsmedier25,26,27. Flere parametere i denne protokollen kan endres for etterfølgende programmer. Instrumentoppsettet og kalibreringen, homogenisatorene som brukes til vevsforberedelse, og optimal homogenat- og kammeroksygenkonsentrasjon kan alle tilpasses for bruk på andre instrumenter med oksygenovervåkingspotensial. For eksempel ble kamrene litt overfylt når de la til homogenat, og dermed når kammeret er helt lukket, forblir kammerkapillæren full. Dette vil forbruke noe oksygen i kammeret, men med optimalisering av prøvekonsentrasjon kan vi redegjøre for dette forbruket for å bestemme hvilket oksygennivå som skal begynne med. Alternativt kan prøven få lov til å likevekte ved omgivelsesoksygen før kammeret lukkes, men dette vil ofte øke tiden før eksperimentet starter og forsinke tilsetningen av substrater. Mens homogenisatorene som brukes i denne protokollen er allment tilgjengelige, kan andre kommersielle homogeniseringsteknikker brukes, for eksempel en vevsmakuleringsmaskin eller automatisert homogenisator28.

I tillegg kan vevsforberedelsen og instrumentprosedyrene brukes med en rekke forskjellige SUITer for å studere åndedrettskontroll ved et mangfold av koblings- og veikontrolltilstander29. Disse SUIT-protokollene er utviklet for å måle funksjonell kapasitet, og dermed har bidraget fra potensielle endogene substrater ingen innvirkning på kapasitetsmålingen. Vi står analytisk for ikke-mitokondrie oksygenforbruk og / eller restforbruk av homogenatet gjennom subtraksjon av antimycin A-rotenon, eller natriumazid ufølsomme priser, etter behov. Mitokondrier kan forbli levedyktige i BIOPS eller tilsvarende konstruerte bevaringsløsninger i lengre perioder (>24 timer) avhengig av vevstype og intakthet30,31. Studier kan utføres på forhånd for å bestemme de tidsmessige lagringsgrensene, da OXPHOS for visse substrater kan ha forskjellige begrensninger. Dette er viktig hvis eksperimentet ikke kan utføres innen flere timer etter vevseksisjon /biopsi. 37 °C er en optimal og fysiologisk temperatur for evaluering av åndedrettsfunksjon i de fleste pattedyrsystemer. Men hvis analysetemperaturen ser ut til å forstyrreevalueringen 32, kan komparative studier utføres over et bredt temperaturområde (25-40 °C) for å sikre tilstrekkelig respons. Instrumentelle begrensninger kan begrense evnen til å gjennomføre slike studier.

Store begrensninger ved den ovenfor beskrevne metoden er 1) potensialet for skade på mitokondrier gjennom mekanisk homogenisering, 2) tilstedeværelse av ATPaser eller andre sub-cellulære biokjemikalier i homogenatpreparater som kan forstyrre samtidig bestemmelse av ATP eller andre interessevariabler og kan kreve ytterligere korreksjonsmetoder eller hemmerbruk33 og 3) evaluering av mange prøver og/eller flere SUITer per prøve er tidkrevende, da ett instrument kan romme to eksperimenter om gangen og krever rengjøring og oppsett mellom påfølgende eksperimenter. Optimaliseringseksperimenter og konsekvent forberedelse av prøver kan minimere betydelig mitokondrieskade som vil bidra til inkonsekvente data.

Betydningen av metoden med hensyn til eksisterende/ alternative metoder er forbedret gjennomførbarhet sammenlignet med mengden startmateriale, utfordring med å isolere mitokondrier eller teknisk utfordring i permeabiliserende vev. Forberedelse av homogenater er raskere, oksygen er ikke på langt nær så begrensende, og er mindre utsatt for variasjon mellom personell sammenlignet med permeabilisert vev. Det er viktig at nesten alle prøvetyper er egnet for homogenatpreparat som muliggjør komparativ analyse på tvers av vev. Høyoppløselig respirometri er gullstandardmålingen av mitokondrie OXPHOS og ET. Anvendelsen av denne metoden i preklinisk og klinisk kreftforskning har kapasitet til å utvide dagens in vitro-undersøkelser til ex vivo-studier. Videre tilbyr den potensielle applikasjoner i kliniske og diagnostiske innstillinger.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter knyttet til dette arbeidet.

Acknowledgments

Vi takker Pennington Biomedical Research Center Comparative Biology Core ansatte for dyrepleie. Denne forskningen ble delvis støttet av National Institute of Health grants U54GM104940 (JPK) og KL2TR003097 (LAG). Alle eksperimenter og prosedyrer som involverte dyr ble godkjent av Pennington Biomedical Research Center Institutional Animal Care and Use Committee.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate Sigma-Aldrich M8250
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt Sigma-Aldrich A2754
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich A2383
Amphotericin B Gibco 15290018
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674
Ascorbate Sigma-Aldrich A4544
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock, fatty acid free Sigma-Aldrich 3117057001 Roche
BD 50 mL Luer-Lok Syringe Fisher Scientific 13-689-8
BD Vacutainer General Use Syringe Needles Fisher Scientific 23-021-020
Calcium carbonate Sigma-Aldrich C4830
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone Sigma-Aldrich C2920
Cytochrome c from equine heart Sigma-Aldrich C2506
Datlab 7.4 software Oroboros Instruments
Dimethylsulfoxide Amresco N182
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
D-Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Dumont # 5 Forceps Fine Science Tools 11251-30 Dumoxel, autoclavable
Dumont # 7 Forceps Fine Science Tools 11271-30 Dumoxel, autoclavable
Digital Calipers 150 mm/6 in World Precision Instruments 501601
EO771 cells CH3 BioSystems SKU: 94APV1-vial-prem Pathogen Tested
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E4378
Female C57BL/6J mice  Jackson Laboratory Stock #000664
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Imidazole Sigma-Aldrich 56750
Kimwipes Fisher Scientific 34120
L-(−)-Malic acid Sigma-Aldrich G1626
Lactobionic acid Sigma-Aldrich L2398
Malate Sigma-Aldrich M6413
Matrigel Matrix Corning 354248
MgCl·6H2O Sigma-Aldrich M2670
Microsyringes Hamilton 87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine Sigma-Aldrich T7394
Oxygraph-2k Oroboros Instruments 10023-03
Oxygraph-2k FluoRespirometer Oroboros Instruments 10003-01
PBS Gibco 10010023
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Phosphocreatine disodium salt hydrate Sigma-Aldrich P7936
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich P1767
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
RPMI 1640 Gibco 21875034
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280
Succinate (disodium) Sigma-Aldrich W327700
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Whatman Filter Paper, grade 5 Sigma-Aldrich 1005-090
Wheaton Tenbroeck Tissue Grinder, 7 mL Duran Wheaton Kimble 357424
Straight Tip Micro Dissecting Scissors Roboz RS-5914SC
Non-Safety Scalpel No. 11 McKesson 1029065
BD Precision Glide Needle 27 G x 1/2 Becton, Dickinson and Company 305109
BD Precision Glide Needle 18 G x 1 Becton, Dickinson and Company 305195
BD 1mL Slip Tip Syringe Becton, Dickinson and Company 309659
Pyrex Reusable Petri Dish, 60 mm Thermo Fisher Scientific 316060
Rodent Very High Fat Diet,  60% kcal from fat, 20% kcal from protein, and 20% kcal from carbohydrate Research Diet D12492
Pyrex Watch Glass, 100 mm Thermo Fisher Scientific S34819

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeBerardinis, R. J., Chandel, N. S. Fundamentals of cancer metabolism. Science Advances. 2 (5), 1600200 (2016).
  2. Bajzikova, M., et al. Reactivation of dihydroorotate dehydrogenase-driven pyrimidine biosynthesis restores tumor growth of respiration-deficient cancer cells. Cell Metabolism. 29 (2), 399-416 (2019).
  3. Martínez-Reyes, I., et al. Mitochondrial ubiquinol oxidation is necessary for tumour growth. Nature. 585 (7824), 288-292 (2020).
  4. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PloS One. 6 (3), 18317 (2011).
  5. Saks, V. A., et al. Bioenergetics of the Cell: Quantitative Aspects. Saks, V. A., et al. , Springer US. 81-100 (1998).
  6. Kaambre, T., et al. Metabolic control analysis of cellular respiration in situ in intraoperational samples of human breast cancer. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (5), 539-558 (2012).
  7. Koit, A., et al. Mitochondrial respiration in human colorectal and breast cancer clinical material is regulated differently. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 1372640 (2017).
  8. Holland, O. J., et al. Changes in mitochondrial respiration in the human placenta over gestation. Placenta. 57, 102-112 (2017).
  9. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
  10. Makrecka-Kuka, M., Krumschnabel, G., Gnaiger, E. High-resolution respirometry for simultaneous measurement of oxygen and hydrogen peroxide fluxes in permeabilized cells, tissue homogenate and isolated mitochondria. Biomolecules. 5 (3), 1319-1338 (2015).
  11. Kondrashova, M. N., et al. Preservation of native properties of mitochondria in rat liver homogenate. Mitochondrion. 1 (3), 249-267 (2001).
  12. Pecinová, A., Drahota, Z., Nůsková, H., Pecina, P., Houštěk, J. Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates. Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).
  13. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292 (1), 125-136 (2007).
  14. Hlozková, K., Starková, J. Assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (141), e58426 (2018).
  15. Zhang, J., Zhang, Q. Cancer Metabolism: Methods and Protocols. Haznadar, M. , Springer. New York. 353-363 (2019).
  16. Wigner, P., Zielinski, K., Labieniec-Watala, M., Marczak, A., Szwed, M. Doxorubicin-transferrin conjugate alters mitochondrial homeostasis and energy metabolism in human breast cancer cells. Scientific Reports. 11 (1), 4544 (2021).
  17. Schöpf, B., et al. Oxidative phosphorylation and mitochondrial function differ between human prostate tissue and cultured cells. The FEBS Journal. 283 (11), 2181-2196 (2016).
  18. Ye, F., Hoppel, C. L. Measuring oxidative phosphorylation in human skin fibroblasts. Analytical Biochemistry. 437 (1), 52-58 (2013).
  19. Le Naour, A., et al. EO771, the first luminal B mammary cancer cell line from C57BL/6 mice. Cancer Cell International. 20, 328 (2020).
  20. Gnaiger, E., et al. Mitochondrial physiology. Bioenergetics Communications. 1, 44 (2020).
  21. Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431 (2011).
  22. Dranka, B. P., et al. Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling. Free Radical Biology and Medicine. 51 (9), 1621-1635 (2011).
  23. Munday, R. Generation of superoxide radical, hydrogen peroxide and hydroxyl radical during the autoxidation of N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine. Chemico-Biological Interactions. 65 (2), 133-143 (1988).
  24. Moser, M. D., Matsuzaki, S., Humphries, K. M. Inhibition of succinate-linked respiration and complex II activity by hydrogen peroxide. Archives of Biochemistry and Biophysics. 488 (1), 69-75 (2009).
  25. Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G., Kapelko, V. I., Saks, V. A. Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers. Biochimica et Biophysica Acta. 892 (2), 191-196 (1987).
  26. Gnaiger, E., et al. Mitochondria in the Cold. Life in the Cold. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , Springer. Berlin, Heidelberg. 431-442 (2000).
  27. Doerrier, C., et al. High-resolution fluorespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).
  28. Rohlenova, K., et al. Selective disruption of respiratory supercomplexes as a new strategy to suppress Her2(high) breast cancer. Antioxidants & Redox Signaling. 26 (2), 84-103 (2017).
  29. Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and respiratory control. Bioenergetics Communications. 5th ed. , (2020).
  30. Barksdale, K. A., et al. Mitochondrial viability in mouse and human postmortem brain. FASEB Journal. 24 (9), 3590-3599 (2010).
  31. Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions. Scientific Reportys. 10 (1), 13179 (2020).
  32. Jorgensen, L. B., Overgaard, J., Hunter-Manseau, F., Pichaud, N. Dramatic changes in mitochondrial substrate use at critically high temperatures: a comparative study using Drosophila. Journal of Experimental Biology. 224, Pt 6 (2021).
  33. Salin, K., et al. Simultaneous measurement of mitochondrial respiration and ATP production in tissue homogenates and calculation of effective P/O ratios. Physiological Reports. 4 (20), 13007 (2016).

Tags

Kreftforskning utgave 174
Analytisk bestemmelse av mitokondriefunksjon av utskilte faste tumor homogenater
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zunica, E. R. M., Axelrod, C. L.,… More

Zunica, E. R. M., Axelrod, C. L., Gilmore, L. A., Kirwan, J. P. Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates. J. Vis. Exp. (174), e62875, doi:10.3791/62875 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter