Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zum Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in den intestinalen murinen Organoiden unter Verwendung qualitativer Bildgebung und quantitativer Zytometrie-Assays. Diese Arbeit kann möglicherweise auf andere fluoreszierende Sonden ausgedehnt werden, um die Wirkung ausgewählter Verbindungen auf ROS zu testen.
Abstract
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) spielen eine wesentliche Rolle bei der intestinalen Homöostase. ROS sind natürliche Nebenprodukte des Zellstoffwechsels. Sie werden als Reaktion auf Infektionen oder Verletzungen auf Schleimhautebene produziert, da sie an antimikrobiellen Reaktionen und Wundheilung beteiligt sind. Sie sind auch kritische sekundäre Botenstoffe, die mehrere Wege regulieren, einschließlich Zellwachstum und -differenzierung. Auf der anderen Seite führen übermäßige ROS-Spiegel zu oxidativem Stress, der für Zellen schädlich sein kann und Darmerkrankungen wie chronische Entzündungen oder Krebs begünstigt. Diese Arbeit bietet eine einfache Methode zum Nachweis von ROS in den murinen Organoiden des Darms durch Live-Bildgebung und Durchflusszytometrie unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen fluorogenen Sonde. Hier beschreibt das Protokoll die Untersuchung der Wirkung von Verbindungen, die das Redoxgleichgewicht in Darmorganoiden modulieren und ROS-Spiegel in bestimmten Darmzelltypen nachweisen, veranschaulicht hier durch die Analyse der mit GFP genetisch markierten Darmstammzellen. Dieses Protokoll kann mit anderen Fluoreszenzsonden verwendet werden.
Introduction
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind natürliche Nebenprodukte des Zellstoffwechsels. Sie können auch aktiv durch spezialisierte enzymatische Komplexe wie die membrangebundenen NADPH-Oxidasen (NOX) und Dual-Oxidasen (DUOX) hergestellt werden, die Superoxidanion und Wasserstoffperoxid1 erzeugen. Durch die Expression von antioxidativen Enzymen und ROS-Aasfressern können Zellen ihr Redoxgleichgewicht fein abstimmen und so die Gewebehomöostase schützen2. Obwohl ROS für die Zellen hochgiftig sein und DNA, Proteine und Lipide schädigen kann, sind sie entscheidende Signalmoleküle2. Im Darmepithel sind moderate ROS-Spiegel für die Proliferation von Stamm- und Vorläuferzellen erforderlich3; hohe ROS-Werte führen zu ihrer Apoptose4. Chronischer oxidativer Stress ist mit vielen Magen-Darm-Erkrankungen wie entzündlichen Darmerkrankungen oder Krebs verbunden. In einem Mausmodell für Wnt-getriebenen Darmkrebs wurde beispielsweise festgestellt, dass eine erhöhte ROS-Produktion durch Aktivierung von NADPH-Oxidasen für die Hyperproliferation von Krebszellen erforderlich ist5,6. Zu definieren, wie Darmzellen, insbesondere Stammzellen, Stammzellen mit oxidativem Stress umgehen und wie die zelluläre Umgebung diese Kapazität beeinflussen kann, ist wichtig, um die Ätiologie dieser Krankheit besser zu verstehen7.
In einem Gewebe weisen verschiedene Zelltypen einen basalen oxidativen Zustand auf, der je nach ihrer Funktion und ihrem Stoffwechsel und der Expression unterschiedlicher Mengen an oxidativen und antioxidativen Molekülen variieren kann4,7. Die Überwachung von ROS in vivo ist eine große Herausforderung. Zellpermeable Farbstoffe, die Fluoreszenz entsprechend ihrem Redoxzustand emittieren, wurden entwickelt, um zelluläre ROS in lebenden Zellen und Tieren sichtbar zu machen und zu messen. Ihre Wirksamkeit hängt jedoch von ihrer Diffusion in lebenden Geweben und ihrer schnellen Auslesung ab, was ihre Verwendung in Tiermodellen erschwert8.
In der Vergangenheit wurde die Untersuchung der Wirkung von Verbindungen auf die ROS-Erzeugung unter Verwendung von Zelllinien durchgeführt, was jedoch möglicherweise nicht die In-vivo-Situation widerspiegelt. Das darmorganoide Modell, das von der Gruppe von Clevers9 entwickelt wurde, ermöglicht das Wachstum von intestinalen Primärzellen ex vivo. Die Kultur von Darmkrypten in Matrizen führt in Gegenwart definierter Wachstumsfaktoren zu dreidimensionalen Strukturen, organoiden (Mini-Darm) genannten Strukturen, die die Krypten-Zotten-Organisation reproduzieren, wobei Zellen aus den verschiedenen Epithellinien ein inneres Lumen auskleiden und die Darmstammzellen in kleinen kryptenartigen Vorsprüngen leben.
Hier wird unter Ausnutzung dieses Modells eine einfache Methode beschrieben, um oxidativen Stress in primären Darmzellen mit der Einzelzellauflösung zu untersuchen, indem ein kommerziell erhältlicher ROS-sensitiver Farbstoff in das Organoidkulturmedium gegeben wird.
Plattenleser werden häufig verwendet, um die ROS-Produktion in einer Gesamtpopulation zu erkennen. Dieses Protokoll verwendet Durchflusszytometrie oder bildgebende Assays, um ROS in einem bestimmten Zelltyp mit genetisch veränderten Zellen oder spezifischer Antikörperfärbung nachzuweisen. Diese Arbeit umfasst die intestinale Organoidkultur der Maus und die ROS-Visualisierung durch konfokale Bildgebung und Quantifizierung durch Durchflusszytometrie. Mit Lgr5-GFP-Mäuse-abgeleiteten Dünndarm-Organoiden ist es möglich, das Niveau des oxidativen Stresses in Darmstammzellen nach verschiedenen Behandlungen spezifisch zu analysieren. Dieses Protokoll kann angepasst werden, um den Einfluss exogener Moleküle, wie z. B. mikrobiota-abgeleitetes Muramyl-Dipeptid (MDP)10, auf die ROS-Waage zu testen, nachdem Organoide mit den ausgewählten Verbindungen stimuliert wurden.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden nach Genehmigung durch das Verwendungskomitee des Institut Pasteur und durch das französische Landwirtschaftsministerium Nr. 2016-0022 durchgeführt. Alle Schritte werden in einer Gewebekulturhaube durchgeführt.
1. Herstellung von Reagenzien und Materialien zur Kultivierung von Darmorganoiden
- Zur Herstellung des Wachstumskulturmediums mischen Sie fortgeschrittenes DMEM/F-12, ergänzt mit 1x Glutamin, 1x Penicillin/Streptomycin (P/S)-Lösung, 10 mM HEPES, 50 ng/ml murinem EGF, 20 μg/ml murinem Noggin 500 ng/ml Maus R-Spondin1 (siehe Materialtabelle). Lassen Sie das Medium während der Extraktion der Krypta bei Raumtemperatur (RT).
HINWEIS: Das nicht verwendete Medium in Aliquots bei -20 °C einfrieren. Einfrieren und Auftauen vermeiden. - Füllen Sie ein 50-ml-Rohr mit 40 ml Advanced DMEM / F-12 und halten Sie es auf Eis.
HINWEIS: Bewahren Sie das unbenutzte Medium bei 4 °C auf. Es wird für Organoide passaging verwendet. - Die Zellkulturplatten (μ-Slide 8 Well Chambers und/oder 96-Well Round Bottom) im Inkubator bei 37 °C vorwärmen.
- Auftauen der Basalmembranmatrix (BMM) (siehe Materialtabelle) aliquots auf Eis (vor Beginn des Protokolls oder mindestens 1 h vor dem Plattieren von Krypten).
HINWEIS: Das BMM erstarrt schnell, wenn es nicht kalt gehalten wird. - Bereiten Sie eine Wasch-/Spüllösung vor, die DPBS (DPBS-P/S) 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung hinzufügt.
- Füllen Sie eine 100 mm Petrischale mit 10 mL kaltem DPBS-P/S. Füllen Sie sechs 15 mL Röhrchen mit 10 mL DPBS und beschriften Sie sie von F1 bis F6.
- 30 ml 10 mM EDTA-Lösung durch Verdünnung von 0,5 M EDTA in DPBS herstellen. Füllen Sie zwei 15-ml-Röhrchen mit 10 mL 10 mM EDTA und beschriften Sie sie mit E1 und E2.
- Halten Sie alle Lösungen bei 4 ° C vorgekühlt und halten Sie sie während des Eingriffs auf dem Eis.
2. Intestinale Organoidkultur
- Opfern Sie eine 8-10 Wochen alte Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) Maus gemäß den nationalen Regeln und Vorschriften.
- Sammeln Sie 5-8 cm des Jejunums, das den Bereich zwischen dem Zwölffingerdarm (5 cm vom Magen) und dem Ileum (10 cm vom Blinddarm entfernt) umfasst, und bewahren Sie DPBS-P / S in kaltem DPBS-P / S auf Eis auf.
- Reinigen Sie den Darminhalt durch Spülen mit 5-10 ml kaltem DPBS-P / S.
HINWEIS: Hausgemachte Spülspritzen können erhalten werden, indem eine 200-μL-Spitze auf eine 10-ml-Spritzendüse gesteckt wird. - Öffnen Sie den Darm längs mit einer Kugelspitzenschere (siehe Materialtabelle) (um eine Schädigung des Gewebes zu vermeiden).
- Mit einer Pinzette das Gewebe in eine Petrischale mit kaltem DPBS-P/S bei Raumtemperatur überführen und zum Spülen schütteln.
- Greifen Sie mit einer Pasteur-Pipette aus Kunststoff den Darm durch Aspiration und übertragen Sie ihn in ein 15-ml-Röhrchen mit der Aufschrift E1 , das 10 ml kalte 10 mM EDTA enthält.
- 3-mal umkehren und 10 min auf Eis inkubieren.
- Übertragen Sie das Gewebe mit einer Pasteur-Pipette aus Kunststoff in das Röhrchen F1 , das 10 ml DPBS enthält. Wirbel für 2 min (bei normalem Wirbel, die Röhre von Hand halten und sicherstellen, dass der Darm schön wirbelt).
- Geben Sie 10 μL der Fraktion in eine Petrischale und beurteilen Sie die Qualität der Fraktion unter einem Mikroskop.
HINWEIS: Alle Wirbelschritte werden mit maximaler Geschwindigkeit durchgeführt, und die Qualität jeder Fraktion sollte unter dem Mikroskop beurteilt werden (Abbildung 1). - Mit einer Kunststoff-Pasteurpipette den Darm durch Aspiration greifen und in Röhrchen F2 mit 10 ml DPBS und Wirbel für 2 min übertragen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.10 und übertragen Sie das Gewebe in Röhrchen F3 mit 10 ml DPBS und Wirbel für 2 min.
- Wiederholen Sie die EDTA-Inkubation wie in Schritt 2.6 und übertragen Sie das Gewebe in das Röhrchen E2 , das 10 mM EDTA enthält.
- 3 Mal die Röhre umkehren und 5 min auf Eis inkubieren.
- Wiederholen Sie Schritt 2.10 und übertragen Sie das Gewebe in Röhrchen F4 mit 10 ml DPBS und Wirbel für 3 min.
- Wiederholen Sie Schritt 2.14 und übertragen Sie das Gewebe in Röhrchen F5 mit 10 ml DPBS und Wirbel für 3 min.
- Wiederholen Sie Schritt 2.15 und übertragen Sie das Gewebe in Röhrchen F6 mit 10 ml DPBS und Wirbel für 3 min.
- Kombinieren Sie die besten Fraktionen, die durch schwerkraftgefiltert werden, durch ein 70 μm-Zellsieb in einem 50-ml-Röhrchen (auf Eis), um Zotten und erhebliche Ablagerungen zu beseitigen.
HINWEIS: Normalerweise sind F5 und F6 die Fraktionen, die zahlreiche Krypten und weniger Trümmer enthalten. - Drehen Sie die Krypten bei 150 x g bei 4 °C für 3 min.
- Entleeren Sie das Rohr, zerlegen Sie das Pellet mechanisch und fügen Sie 5 ml kaltes DMEM/F12 hinzu.
- Geben Sie 10 μL der Suspension in eine Petrischale und zählen Sie die Anzahl der im Aliquot vorhandenen Krypten manuell unter einem Mikroskop.
HINWEIS: Zählen Sie keine einzelnen Zellen oder kleinen Ablagerungen. - Berechnen Sie das Volumen (V) der benötigten Kryptensuspension in μL, wobei zu berücksichtigen ist, dass 300 Krypten pro Vertiefung plattiert sind, W die Anzahl der Vertiefungen und N die Anzahl der Krypten, die von 10 μL der Suspension gezählt werden. Übertragen Sie die Krypten in eine neue 15-ml-Röhre.
HINWEIS: V = 300 x B x 10/N. Wird im geplanten Experiment ein kleines Volumen verwendet, kann ein 1,5 mL Zentrifugenröhrchen verwendet werden. - Drehen Sie die Krypten bei 200 x g bei 4 °C für 3 min.
- Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette.
- Zerlegen Sie das Pellet mechanisch und fügen Sie vorsichtig Wachstumskulturmedium hinzu, um eine Konzentration von 90 Krypten / μL zu erhalten.
- Fügen Sie 2 Volumina unverdünntes BMM hinzu, um eine Endkonzentration von 30 Krypten / μL zu erhalten.
HINWEIS: Bewahren Sie das Rohr immer auf Eis auf, um eine BMM-Erstarrung zu vermeiden. - Platte 10 μL der Krypten/BMM mischen in jede Vertiefung. Verwenden Sie für die Durchflusszytometrie-Analyse runde 96-Well-Platten. Verteilen Sie 10 μL in der Mitte jeder Vertiefung als Kuppel. Für die Bildgebung verwenden Sie μ-Slide 8 Well (siehe Materialtabelle) und legen Sie die 10 μL als dünne Schicht ab.
HINWEIS: Platten Sie die Organoide als dünne Schicht für den Bildgebungstest, um ihre eingehende Bildgebung zu ermöglichen. - Lassen Sie die Platte 5 Minuten bei RT stehen, damit das BMM erstarren kann. Legen Sie die Platte bei 37 °C und 5% CO2 für 15 min in den Inkubator.
- Fügen Sie 250 μL Wachstumsmedium in jede Vertiefung hinzu und achten Sie darauf, das BMM nicht zu lösen.
- Legen Sie die Platten bei 37 °C und 5% CO2 in den Inkubator.
- Führen Sie die ROS-Analyse zwischen den Tagen 4 und 6 der Kultur durch. Andernfalls wechseln Sie das Medium und spalten die Organoide nach dem Auftreten mehrerer und langer knospender Strukturen und wenn sich abgestorbene Zellen in den Organoidlumen ansammeln.
3. Organoide passieren
- Beginnen Sie ab dem 6. Tag der Kultur mit der Übertragung von Dünndarmorganoiden, wenn sich signifikante knospende Strukturen gebildet haben und die Organoidlumen dunkel geworden sind.
HINWEIS: Das Lumen des Organoids wird aufgrund der Ansammlung von toten Zellen, Trümmern und Schleim dunkel. Vermeiden Sie es, die Organoide vor dem Spalten überwachsen zu lassen. Das Spaltverhältnis hängt vom Wachstum der Organoide ab. Es wird empfohlen, die Organoide mit einem Verhältnis von 1:2 an Tag 6 und 1:3 an Tag 10 zu übergeben. - Füllen Sie ein 15-ml-Röhrchen mit 4 ml kaltem Advanced DMEM/F-12 und bewahren Sie es auf Eis auf.
HINWEIS: Hier werden Bände für eine 96-Well-Kulturplatte bereitgestellt. Wenn ein anderes Format verwendet wird, passen Sie die Lautstärke entsprechend an. - Saugen Sie das Medium vorsichtig mit einer Pipette oder einer Vakuumpumpe aus den Vertiefungen ab, ohne die BMM-Kuppeln zu berühren, und entsorgen Sie es.
- Fügen Sie 100 μL kaltes Advanced DMEM/F-12 pro Vertiefung hinzu. Pipettieren Sie auf und ab, um das BMM zu brechen und den Inhalt des Bohrlochs in das 15-ml-Rohr zu übertragen.
- Waschen Sie den Brunnen mit 200 μL kaltem Advanced DMEM/F-12 und sammeln Sie ihn im selben Röhrchen.
HINWEIS: Wenn mehrere Vertiefungen aus derselben Versuchsbedingung bestehen, kann der Inhalt der Vertiefungen im selben 15-ml-Sammelrohr gepoolt werden. - Das 15 mL Auffangröhrchen bei 100 x g für 5 min bei 4°C drehen.
- Verwerfen Sie den Überstand und geben Sie 1 ml kaltes Advanced DMEM/ F-12 in das Pellet. Nehmen Sie mit einer P1000-Spitze eine P10-Spitze (ohne Filter) auf und pipettieren Sie mindestens 20 Mal nach oben und unten.
- Geben Sie 4 ml kaltes Advanced DMEM/F-12 in die Röhre. Bei 300 x g 5 min bei 4°C drehen.
- Saugen Sie den Überstand mit einer Pipette oder einer Vakuumpumpe ab, ohne das Pellet zu stören. Dann stören Sie das Pellet mechanisch.
- BMM verdünnt in Wachstumskulturmedium (Verhältnis 2:1) hinzufügen. Vorsichtig auf und ab pipettieren, ohne Luftblasen in die Mischung einzuführen.
- Platte 10 μL der Krypten/BMM mischen in jede Vertiefung.
- Halten Sie die Platte 5 Minuten bei RT, damit das BMM erstarren kann. Legen Sie die Platte bei 37 °C und 5% CO2 für 15 min in den Inkubator.
- Fügen Sie 250 μL Wachstumsmedium in jede Vertiefung hinzu.
HINWEIS: Achten Sie darauf, das BMM nicht zu lösen. - Legen Sie die Platten bei 37 °C und 5% CO2 in den Inkubator.
4. Herstellung von Reagenzien und Materialien zur Beurteilung von oxidativem Stress in Darmorganoiden
- Bereiten Sie eine 250 mM Stammlösung des Inhibitors N-Acetylcystein (NAC) vor (siehe Materialtabelle), resuspendieren Sie 10 mg mit 245 μL DPBS. Verwendung bei einer Endkonzentration von 1 mM.
- Bereiten Sie eine 50 mM Stammlösung von Induktor Tert-Butylhydroperoxid (tBHP), 70% in Wasser, verdünnen Sie 3,22 μL mit 496,8 μL DPBS. Verwendung bei einer Endkonzentration von 200 μM.
- Für die Durchflusszytometrie-Studie wird eine 250 μM Arbeitslösung einer fluorogenen Sonde (siehe Materialtabelle) durch Verdünnen der Stammlösung 1/10 in DMSO hergestellt. Verwendung bei 1 μM Endkonzentration.
HINWEIS: Wie in den Anweisungen des Herstellers angegeben, ist die fluorogene Sonde licht- und sauerstoffempfindlich. Aktien und Aliquots sollten nicht zu oft geöffnet und geschlossen werden. - Bereiten Sie für die bildgebende Untersuchung eine 1,25 mM Arbeitslösung der fluorogenen Sonde vor, indem Sie die Stammlösung 1/2 in DMSO verdünnen. Verwendung bei einer Endkonzentration von 5 μM.
- Bereiten Sie eine endgültige Lösung von 0,1 μg/ml DAPI in DPBS vor, die für die Unterscheidung toter Zellen im Durchflusszytometrie-Assay verwendet werden soll.
- Hoechst 33342 auf 1,25 mg/ml in DPBS verdünnen. Verwendung bei einer Endkonzentration von 5 μg/ml für die Kernfärbung im bildgebenden Assay.
- DmEM ohne Phenolrot bei 37 °C erwärmen.
ANMERKUNG: Diese Schritte beschreiben die Verwendung von Negativ- und Positivkontrollen, die in alle Assays einbezogen werden müssen, unter Verwendung der in Abbildung 2A angegebenen Bedingungen. Der Assay kann verwendet werden, um anti- oder prooxidative Verbindungen zu testen. Die Schritte sind die gleichen, und der einzige Unterschied besteht darin, dass die Verbindungen vor der Verwendung des fluorogenen Farbstoffs hinzugefügt werden.
5. Visualisierung von oxidativem Stress in 3D-Organoiden mittels konfokaler Mikroskopie
- Nehmen Sie die in den μ-Slide 8 Well-Kammern plattierten Organoide und geben Sie 1 μL NAC-Stammlösung in die entsprechenden Wells, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
- 1 h bei 37 °C und 5% CO2 inkubieren.
- 1 μL tBHP-Stammlösung in die entsprechenden Vertiefungen geben, um eine Endkonzentration von 200 μM zu erhalten.
- 30 min bei 37 °C und 5% CO2 inkubieren.
- Fügen Sie 1 μL pro Vertiefung der 1,25 mM Verdünnung der fluorogenen Sonde hinzu, um eine Endkonzentration von 5 μM zu erhalten.
- 1 μL pro Vertiefung der 1,25 mg/ml Verdünnung von Hoescht wird zugegeben, um eine Endkonzentration von 5 μg/ml zu erhalten.
- 30 min bei 37 °C und 5% CO2 inkubieren.
- Entfernen Sie das Medium, ohne das BMM zu stören. Fügen Sie vorsichtig 250 μL warmes DMEM ohne Phenolrot hinzu.
HINWEIS: Wenn eine langfristige Akquisition geplant ist, fügen Sie DMEM Wachstumsfaktoren ohne Phenolrot hinzu. - Stellen Sie die Organoide mit einem konfokalen Mikroskop vor, das mit einer Thermischen Kammer und einer Gasversorgung ausgestattet ist, die die fluorogene Sonde (ROS) erkennt.
ANMERKUNG: Die Anregung/Emission (ex/em) für die fluorogene Sonde beträgt 644/665, ex/em für Hoechst (Kerne) ist 361/486 und ex/em für GFP (intestinale Stammzelle aus den Lgr5-GFP-Mäusen) ist 488/510. Ein 63-faches Ölimmersionsobjektiv wird verwendet, um Signale in Stammzellen nachzuweisen. Ändern Sie die Lasereinstellungen nicht zwischen den Proben. Ein 20-faches Objektiv könnte verwendet werden, um einen Überblick über die ROS-Produktion zu erhalten. - Verwenden Sie die Positivkontrolle, um die Laserintensität und die Zeitbelichtung für das ROS-Signal einzurichten, und überprüfen Sie, ob dieses Signal in der Negativkontrolle niedriger ist.
- Verwenden Sie den Okularschirm, um die GFP-Organoide zu identifizieren, die die Laserintensität ausdrücken, und anzupassen.
HINWEIS: Dieser Schritt wird manuell ausgeführt. - Definieren Sie Positionen, um ein zusammengefügtes Bild des gesamten Organoids zu erhalten. Richten Sie einen Z-Stack von 25 μm (Schrittweite 5 μm) ein, um einen Abschnitt der Organoide zu erhalten, der eine Zellschicht zeigt.
HINWEIS: Informationen zum Optimieren des Setups finden Sie im Benutzerhandbuch des Mikroskops. Unter Verwendung lebender Zellen sollte der Erwerb innerhalb von 1 h nach dem Ende der Inkubation erfolgen. - Öffnen Sie die Bilder in einer Open-Source-Bildverarbeitungssoftware (siehe Materialverzeichnis).
- Gehen Sie durch den Z-Stapel und wählen Sie den Abschnitt, in dem die Mitte der Organoide gut dargestellt ist, und erstellen Sie ein neues Bild mit dem ausgewählten Bereich.
- Quantifizieren Sie die Bilder gemäß den Schritten 5.15.1 - 5.15.5.
- Wählen Sie das Freihandlinienwerkzeug aus.
- Zeichne eine Linie nach den Kernen.
HINWEIS: Wählen Sie nur Regionen mit GFP-positiven Zellen aus, wenn nur Stammzellen analysiert werden. - Erhöhen Sie die Linienbreite, um die Zellebene mit der Linie zu bedecken, ohne die luminalen Ablagerungen einzubeziehen.
- Wählen Sie den Kanal für das ROS-Signal und messen Sie die Fluoreszenzintensität im ausgewählten Bereich und kommentieren Sie die Werte.
- Zeichnen Sie eine Linie, in der kein Signal vorhanden ist, und messen Sie die Fluoreszenzintensität des Hintergrunds, die auf den vorherigen Wert subtrahiert wird, um die endgültige Intensität zu erhalten.
6. Quantifizierung des oxidativen Stresses auf die dissoziierten Organoide mittels Durchflusszytometer
- 1 μL NAC-Stammlösung in die Vertiefungen für Negativkontrollen geben, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
HINWEIS: Verwenden Sie die Organoide, die in den 96-Well-Rundbodenplatten plattiert sind. - 1 h bei 37 °C und 5% CO2 inkubieren.
- 1 μL tBHP-Stammlösung in die entsprechenden Vertiefungen geben, um eine Endkonzentration von 200 μM zu erhalten.
- 30 min bei 37 °C und 5% CO2 inkubieren.
- Entfernen Sie mit einer Mehrkanalpipette das Medium, ohne das angebrachte BMM zu stören, und übertragen Sie es auf eine weitere runde 96-Well-Bodenplatte. Halten Sie diesen Teller beiseite.
- Fügen Sie 100 μL Trypsin hinzu und pipettieren Sie mit einer Mehrkanalpipette mindestens fünfmal auf und ab, um das BMM zu zerstören.
- Nicht mehr als 5 min bei 37 °C und 5% CO2 inkubieren.
- Mit einer Mehrkanalpipette mindestens fünfmal auf und ab pipettieren, um die Organoide zu dissoziieren.
- Drehen Sie bei 300 x g für 5 min bei RT.
- Verwerfen Sie den Überstand, indem Sie die Platte umkehren. Fügen Sie das in Schritt 6.3 gesammelte Medium zu den entsprechenden Vertiefungen zurück und resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie 5 Mal nach oben und unten pipettieren.
- Die fluorogene Sonde in der Endkonzentration von 1 μM zugeben. 1 μL pro Vertiefung aus der 250 μM Verdünnung zugeben und 30 min bei 37 °C und 5% CO2 inkubieren.
HINWEIS: Fügen Sie die fluorogene Sonde nicht zu den Vertiefungen hinzu, die für die Einstellungen des Geräts erforderlich sind (Abbildung 2B). - Drehen Sie bei 300 x g für 5 min bei RT.
- Resuspendieren Sie die Zellen mit 250 μL 0,1 μg/mL DAPI-Lösung. Übertragen Sie die Proben in die richtigen Durchflusszytometrieröhrchen, halten Sie die Röhrchen auf Eis und fahren Sie mit der Analyse fort.
HINWEIS: Fügen Sie PBS anstelle von DAPI zu den Vertiefungen hinzu, die für die Einstellungen des Instruments erforderlich sind (Abbildung 2B). - Optimieren Sie die Vorwärts- und Seitenstreuspannungseinstellungen für nicht gebeizte Steuer- und Laserspannungen für jeden Fluorophor mit monogefärbten Proben.
- Sammeln Sie mit einer geeigneten Gating-Strategie (Abbildung 4A) mindestens 20.000 Ereignisse.
HINWEIS: 50.000 Veranstaltungen werden bevorzugt. Detaillierte Erfassungseinstellungen variieren je nach verwendetem Gerät.
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Representative Results
Als Proof of Concept des beschriebenen Protokolls wurden die aus der Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 Mauslinie gewonnenen Krypten verwendet, in denen Darmstammzellen eine von Barker et al. etablierte Mosaik-GFP-Expression aufweisen, um Darmstammzellen10 zunächst zu charakterisieren und diese Zellen anhand ihrer GFP-Expression abzubilden. Dabei wird ein Modell bereitgestellt, um die ROS-Spiegel in einer bestimmten Zelltyppopulation bei verschiedenen Behandlungen zu vergleichen. Ein ROS-Inhibitor (NAC) wurde verwendet, und ein Induktor (tBHP), von dem bekannt ist, dass er auf zelluläres ROS wirkt, um Veränderungen in ihren Spiegeln zu visualisieren.
Die Abbildungen 1A und 1B zeigen repräsentative Bilder der Fraktionen F1 und F4, die während des Kryptenextraktionsverfahrens für die intestinale Organoidkultur gewonnen wurden. Jede Fraktion muss während des Extraktionsverfahrens unter einem Mikroskop oder Binokular überprüft werden, um der Ablösung der Krypten zu folgen und die in Krypten angereicherten Fraktionen und nicht in Zotten, einzelnen Zellen oder Trümmern zu definieren. Die ausgewählten Fraktionen werden dann zusammengefasst und durch ein 70 μm-Zellsieb geleitet, um alle verbleibenden Fragmente von Zotten zu entfernen und eine Vorbereitung nur mit Krypten zu erhalten (Abbildung 1C). Die Krypten beginnen sich innerhalb weniger Stunden nach der Einbettung in BMM zu schließen, und bei D1 wurden runde Organoide beobachtet (Abbildung 1D). Nach 3-5 Tagen erscheinen die Organoide mit aufkeimenden Strukturen, die die "neu gebildeten Krypten" darstellen. Die Organoide sind bereit für die ROS-Analyse (Abbildungen 1E und 1F).
Im Protokoll der Abbildung von oxidativem Stress durch konfokale Mikroskopie wurde der objektträger mit den organoiden, mit der Sonde inkubiert, mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop abgebildet, das mit Lasern und Filtern ausgestattet ist, um die Signale von Hoechst (ex/em: 361/486), GFP (ex/em: 488/510) und der fluorogenen Sonde (ex/em): 644/665) zu detektieren. Ein konfokales Mikroskop mit 20x Luft- und 63x Ölimmersionsobjektiv ermöglichte die Visualisierung von ROS. In Lgr5-GFP-Mäusen sind die GFP-positiven Zellen Lgr5-exprimierende Darmstammzellen. Ergänzende Abbildung 1 zeigt repräsentative Bilder, die mit dem 20-fachen Objektiv aufgenommen wurden und einen Überblick über die ROS in mehreren Organoiden geben. Abbildung 3 zeigt repräsentative Bilder, die mit dem 63-fachen Ölobjektiv aufgenommen wurden, von Darmorganoiden, die GFP exprimieren, nicht behandelt (NT) oder mit dem ROS-Inhibitor NAC vorinkubiert oder nicht und mit dem ROS-Induktor tBHP 30 min stimuliert oder nicht stimuliert wurden.
In Gegenwart des Inhibitors ist das einzige Signal der toten Zellen, die im Lumen des Organoids enthalten sind, sichtbar. Im unbehandelten Organoid werden die basalen ROS-Spiegel gezeigt, was beweist, dass Stammzellen eine höhere ROS produzieren als differenzierte Zellen (entsprechend den Mikroskopeinstellungen könnte das ROS-Signal auch in Nicht-Stammzellen sichtbar gemacht werden). GFP-positive Zellen präsentieren in Gegenwart der fluorogenen Sonde ein signifikanteres zytoplasmatisches Signal mit dem Induktor, was zeigt, dass die ROS-Spiegel insbesondere in Stammzellen nach der Behandlung ansteigen.
Abbildung 4 zeigt repräsentative Ergebnisse, die bei der Analyse der ROS-Produktion in intestinalen Organoiden, die mit ROS-Inhibitor oder -Induktor stimuliert wurden oder nicht, unter Verwendung eines Durchflusszytometers mit 405 nm, 488 nm und 630 nm Lasern erhalten wurden. Die in Abbildung 4A dargestellte Gating-Strategie ermöglicht es, die ROS-Produktion auf der Ebene der gesamten Organoidzellpopulation zu bewerten, wobei intakte und lebende Zellen basierend auf physikalischen Parametern und DAPI-Ausschluss (SSC-A vs. FSC-A und DAPI vs. FSC-A) und FSC-H vs. FSC-A) oder nur in den intestinalen Stammzellen definiert werden, die weiter auf Zellen mit GFP-hohem Signal ausgerichtet sind. Abbildung 4B zeigt die ROS-Werte in der Gesamtbevölkerung bei der Erfassung von 50.000 Ereignissen. Die basalen ROS-Spiegel in den nicht behandelten (NT) Zellen nehmen nach Stimulation mit dem Inhibitor (NAC) ab und steigen im Gegenteil nach der Herausforderung mit dem Induktor (tBHP) an. Zellen, die mit dem Inhibitor vorbehandelt und dann mit dem Induktor stimuliert werden, weisen ein niedrigeres Niveau auf als diejenigen, die mit dem Induktor allein stimuliert werden. Die Ergebnisse wurden dann mit einer geeigneten Software analysiert, um die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) zu erhalten. Die erhaltenen Werte werden als Verhältnis zu den unbehandelten Zellen dargestellt, wie in der Grafik rechts in Abbildung 4B dargestellt. Abbildung 4C zeigt die gleichen Parameter, die in Abbildung 4B in den Stammzellen beschrieben sind, die als GFP-positive Zellen eingegrenzt sind, was eine 3,5-fache Abnahme des ROS-Spiegels bei NAC-Behandlung und eine 4-fache Zunahme bei tBHP-Behandlung gegenüber nicht stimulierten Zellen zeigt. Dieses Ergebnis zeigt, dass es nach diesem Protokoll möglich ist, Unterschiede in den ROS-Spiegeln auf der Ebene der gesamten Zellpopulation oder in GFP-positiven Stammzellen bei der Behandlung der Organoide mit spezifischen Verbindungen zu quantifizieren.
Abbildung 1: Repräsentative Bilder von Krypten und Organoiden. (A) Beispiel für den Bruchteil F1, der nach der ersten Inkubation mit EDTA erhalten wurde, angereichert mit Zotten (Quadrat), mit einigen Trümmern (Stern) und Krypten (Kreis). (B) Beispiel für den in Krypten angereicherten Bruch F4. (C) Suspension mit nur isolierten Krypten, die nach der Filtration mit einem 70 μm Zellsieb (Skalenbalken, 200 μm) erhalten wurden. (D, E und F). Typische Organoide wurden nach 1, 3 bzw. 5 Tagen nach einbetten der Krypten in BMM (Maßstabsbalken, 100 μm) erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Gliederung des Versuchsplans. (A) In diesem Protokoll verwendete Bedingungen, die in jedem Versuch enthalten sind: nicht behandelte Vertiefungen (NT), mit Induktoren behandelte Vertiefungen (tert-Butylhydroperoxid - tBHP), mit Inhibitoren behandelte Vertiefungen (N-Acetylcystein - NAC) und mit Inhibitoren und Induktoren behandelte Vertiefungen (NAC-tBHP). (B) Plattenformat für den Durchflusszytometrie-Assay. Jede Bedingung ist dreifach plattiert (Zeile A). Die Linien B, C und D enthalten Vertiefungen für die Einstellung des Durchflusszytometers mit nur der fluorogenen Sonde, nur DAPI oder nicht gefärbten (NS) Proben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative konfokale Bilder der ROS-Färbung in Organoiden. Die zusammengefügten Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen, das mit einer Hochgeschwindigkeits-EMCCD-Kamera, einem 63x/1,4-Ölobjektiv und einem Spalt von 35 μm ausgestattet war, wobei die Laser 405, 488, 640 und die Filter 460/50, 535/50, 700/75 verwendet wurden, um Hoechst, GFP bzw. die fluorogene Sonde zu erfassen. Konfokale optische Schnitte von Organoiden, die nicht behandelt wurden (NT), mit dem ROS-Inhibitor (NAC), mit dem ROS-Induktor (tBHP) behandelt oder mit dem ROS-Inhibitor vorbehandelt und dann mit dem ROS-Induktor (NAC-tBHP) stimuliert wurden. In Grau gefärbte Kerne mit Hoechst; in grünen, Lgr5-GFP-Zellen; rot die fluorogene Sonde (Maßstabsbalken, 50 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative durchflusszytometrische Analyse von ROS in Zellen, die aus Organoiden gewonnen wurden. (A) Schematische Darstellung der in der Durchflusszytometrie-Analyse verwendeten Gating-Strategie: Gating für die Zellform (Ausschluss von toten Zellen und Trümmern, die sich im Lumen der Organoide angesammelt haben), Gating für lebende Zellen (Zellen ohne DAPI-Laser 405), Gating für einzelne Zellen (Dublettenunterscheidung) und Stammzellen (GFP-positive Zellen-Laser 488) (FSC: Vorwärtsstreuung, SSC: Seitenstreuung). Das ROS-Signal wurde mit dem 630-Laser erfasst. (B) Auf der linken Seite wurden Histogramme mit einer geeigneten Software erhalten, die die Intensitäts-ROS-Signale für die gesamte lebende Bevölkerung (nach Gating von etwa 10.000 Ereignissen pro Zustand) in den verschiedenen Stichproben NT: unbehandelt anzeigt; NAC: inhibitorbehandelt; tBHP-Induktor-behandelt; NAC-tBHP: inhibitor- und inducerbehandelt. Rechts ein typisches Beispiel für das berechnete Verhältnis für MFI-Werte zu den NT-Proben, die während eines Experiments ab 3 Proben pro Bedingung (Mittlere ± SD) erhalten wurden (*** P = 0,0003). (C) Wie in B für die GFP-positive Population (1.000 Ereignisse pro Bedingung) (* P = 0,02). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Repräsentative konfokale Bilder der ROS-Färbung in Organoiden. Genähte images wurden mit einem konfokalen Mikroskop erhalten, das mit einer Hochgeschwindigkeits-EMCCD-Kamera, einem 20-fachen Objektiv und einem Spalt von 35 μm ausgestattet war, wobei die Laser 405, 488, 640 und die Filter 460/50, 535/50, 700/75 verwendet wurden, um Hoechst, GFP bzw. fluorogene Sonde zu erfassen. Konfokale optische Schnitte von Organoiden, die nicht behandelt wurden (NT), mit dem ROS-Inhibitor (NAC), mit dem ROS-Induktor (tBHP) behandelt oder mit dem ROS-Inhibitor vorbehandelt und dann mit dem ROS-Induktor (NAC-tBHP) stimuliert wurden. In Grau gefärbte Kerne mit Hoechst; in grünen, Lgr5-GFP-Zellen; in rot, fluorogene Sonde (Skalenbalken, 100 μm). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Diese Arbeit bietet ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Isolierung muriner Jejunalkrypten, zur Kultivierung zu 3D-Organoiden und zur Analyse von ROS in Organoiden durch Kombination einer ROS-empfindlichen fluorogenen Sonde mit qualitativer Mikroskopiebildgebung ganzer Organoide und quantitativer ROS-Messung mittels Durchflusszytometrie an einzelnen Zellen nach Organoiddissoziation.
Der erste kritische Schritt in dieser Methode ist das Extraktionsverfahren für Krypten. In der Tat ist die Qualität der Kryptenvorbereitung der Schlüssel zur erfolgreichen Organoidbildung. Es ist daher wichtig, Fraktionen mit angereicherten Krypten und wenigen Zelltrümmern oder sterbenden Zellen zu erhalten. Die Krypten können in anderen Fraktionen als den im Protokoll angegebenen gefunden werden, da die Dissoziation mit dem Alter und dem Gesundheitszustand der Maus variieren kann. Die Anzahl der EDTA-Inkubationen kann entsprechend angepasst werden. Wenn sich Krypten nach Bruchteil 4 nicht zu lösen scheinen, muss eine 3-minütige EDTA-Inkubation wiederholt werden. Umgekehrt nehmen wir an, dass sich Krypten bereits nach der ersten EDTA-Inkubation lösen. In diesem Fall ist die zweite EDTA-Inkubation möglicherweise nicht erforderlich, und die sequentiellen Wirbelschritte in DPBS sollten durchgeführt werden, bis Brüche mit genügend Krypten ohne Ablagerungen erhalten sind. Wenn keine Dissoziation auftritt, stellen Sie sicher, dass DPBS ohne Ca2+ und Mg2+ zur Vorbereitung der Sammelröhrchen verwendet wird, und ersetzen Sie EDTA durch eine neue Lösung. Krypten sind zerbrechliche Strukturen, daher sollten sie so weit wie möglich auf Eis gehalten und nach der Isolierung schnell plattiert werden.
Verschiedene Platten und Tropfenvolumina können verwendet werden, um Organoide zu kultivieren. Zum Beispiel können Krypten auch in 24 oder 48 Vertiefungsplatten plattiert werden, nachdem die Kryptenkonzentration, das Volumen des BMM-Tropfens und das in jeder Vertiefung hinzugefügte Medium eingestellt wurden. Mehrere Tropfen können in derselben Vertiefung in einer 12- oder 6-Well-Platte plattiert werden. Im Allgemeinen nehmen Krypten an Größe ab und runden sich am Tag 1 der Kultur zu kleinen runden Organoiden auf. Die Bildung neuer Knospen sollte 2-3 Tage nach der Beschichtung beobachtet werden.
Für die Untersuchung von Veränderungen der ROS-Spiegel in intestinalen Stammzellen wurde der Vorteil der Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2-Mauslinie genutzt. Ein Vorbehalt dieses Modells ist das selektive Schweigen des eingeschlagenen Allels und der daraus resultierende Mosaikismus der GFP-Expression, der in Flecken von Stammzellen oder ganzen Krypten fehlen kann. Während des Bildgebungsprotokolls präsentieren nicht alle Organoide Stammzellen, die GFP exprimieren; Daher werden nicht alle Organoide berücksichtigt, es sei denn, es ist möglich, sich auf die räumliche Position der Zellen zu verlassen. Stattdessen muss dies bei der Analyse der GFP-negativen Zellpopulation im Durchflusszytometrie-Protokoll berücksichtigt werden. Da es unmöglich ist, sich auf die räumliche Position zu verlassen, wird die GFP-negative Population aus Nicht-Stammzellen und GFP-negativen Stammzellen bestehen.
Hier wird ein Protokoll für die qualitative Bewertung von ROS in intestinalen Organoiden bereitgestellt. Ein kritischer Aspekt für diesen Teil ist mit dem Arbeitsabstand der verwendeten Ziele verbunden. Die Organoide werden in BMM gezüchtet; Sie sind nicht am Boden des Brunnens befestigt, was eine Entfernung vom objektiven Fokusplan darstellt. Aus diesem Grund ist es wichtig, die Organoide in einer dünnen Schicht BMM zu plattieren, um dieses Problem zu minimieren. Selbst in dieser optimierten Umgebung befinden sich nicht alle Organoide in der richtigen Position, um angemessen abgebildet zu werden.
Eine quantitative Analyse der Bilder könnte mit einer geeigneten Bildanalysesoftware durchgeführt werden, wobei die mittlere Fluoreszenzintensität der Bilder im ROS-Signalkanal wie im Protokoll beschrieben ausgewertet wird. Zu diesem Zweck ist es notwendig, eine hohe Anzahl von Bildern zu erfassen, um eine ausreichende Anzahl von Ereignissen zu erhalten, um statistisch signifikant zu sein. Wie bereits erwähnt, exprimieren bei Verwendung der Lgr5-GFP-Mäuse nicht alle Organoide GFP, so dass eine beträchtliche Anzahl von Proben abgebildet werden muss.
Während des durchflusszytometrischen Verfahrens ist ein kritischer Schritt die Dissoziation der Organoide in einzelne Zellen. Wenn die Dissoziation zu hart ist, können Zellen absterben und DNA freisetzen. Ein Gesteinsinhibitor, Y-27632, um Anoikis entgegenzuwirken, und DNAse können dem Dissoziationspuffer hinzugefügt werden, wenn sie den untersuchten Signalweg nicht stören. Trypsin-Verdünnung oder reduzierte Inkubationszeiten können verwendet werden.
Schließlich ist es wichtig, den besten Zeitpunkt für die Analyse der ROS-Produktion nach den verschiedenen getesteten Behandlungen (Anti- oder Prooxidans) zu definieren. Im Falle von Arzneimitteln, die ROS innerhalb von Minuten oder Stunden schnell induzieren, kann der bildgebende Assay verwendet werden, um festzustellen, wann die maximale Induktion vorliegt, indem die fluorogene Sonde vor den getesteten Verbindungen hinzugefügt wird. Die Fluoreszenzintensität der Sonde nach Organoidstimulation kann zwischen Experimenten, die an verschiedenen Tagen durchgeführt werden, variieren. Daher ist es wichtig, immer das Verhältnis zu den nicht stimulierten Proben zu berechnen und Kontrollen (Oxidationsmittel / Antioxidans) hinzuzufügen, um die Reaktivität der Sonde zu überprüfen. NAC und tBHP wurden als Negativ- und Positivkontrollen verwendet, da sie die schlüssigsten Ergebnisse lieferten. Dennoch können andere Reagenzien verwendet werden, wie Resveratrol als Antioxidans oder Paraquat / Menadion als Oxidationsmittel. Das inkubieren von Zellen für zu lange mit der fluorogenen Sonde kann toxisch sein und sogar das Zell-Redox-Gleichgewicht verändern, so dass auch die Inkubationszeiten streng kontrolliert werden müssen. Mit der Sonde gefärbte Zellen können einige Stunden später fixiert und analysiert werden. In diesem Fall kann der DAPI für die Durchflusszytometrie-Analyse nicht zwischen lebenden und toten Zellen unterscheiden. Stattdessen sollte vor der Fixierung ein fixierbarer Farbstoff für die Unterscheidung von Lebend/ Tot verwendet werden.
Organoide können auch für mehrere Tage (mehr als 7) gezüchtet werden, aber dies erhöht die Anzahl der lebenden und proliferativen Zellen und der toten Zellen, die sich in den Organoidlumen ansammeln, was zu einem hohen Hintergrund führt, insbesondere im bildgebenden Assay. Wenn ein abnormaler Anstieg des fluorogenen Sondensignals beobachtet wird, stellen Sie sicher, dass die Lösung, die zur Resuspendierung stimulierender Verbindungen verwendet wird, nicht per se prooxidativ ist (d. H. Ethanol).
Ein Problem, das bei der Verwendung dieses Protokolls zu berücksichtigen ist, ist, dass Live-Bildgebung und Zelldissoziation, gefolgt von Durchflusszytometrie, oxidativen Stress in Zellen induzieren und ein Hintergrundsignal erzeugen können. Die Fixierung der Organoide kann je nach Experiment in Betracht gezogen werden. Eine weitere Einschränkung ergibt sich aus der Schwierigkeit bei der eingehenden Abbildung von Organoiden, die in einer 3D-Matrix gezüchtet wurden. Wie im Protokoll erwähnt, sollte das BMM als dünne Schicht auf dem Objektträger verteilt werden, um diesen Aspekt zu begrenzen.
Hierbei wird das Protokoll unter Verwendung eines handelsüblichen fluorogenen Farbstoffs entworfen. Sein Hauptvorteil ist seine Kompatibilität mit der mehrfarbigen Färbung von Organoiden, so dass bestimmte Zelltypen. Zum Beispiel kann eine Antikörperfärbung für Zelloberflächenmarker unmittelbar nach der Fluorogensondeninkubation durchgeführt werden, um bestimmte Subtypen nachzuweisen. Die Sonde ist jedoch nicht spezifisch für eine bestimmte ROS-Spezies, da sie Superoxid, Nitritperoxid und Wasserstoffperoxid nachweisen kann11,12,13. Aus diesem Grund wird es im Allgemeinen verwendet, um globalen oxidativen Stress zu erkennen. Obwohl als reine Zytosolsonde kommerzialisiert, konnte festgestellt werden, dass die ausgewählte fluorogene Sonde die Mitochondrien erreicht14. Da seine Spezifität zwischen verschiedenen zellulären Kontexten variieren kann, empfehlen wir, andere komplementäre Ansätze zu verwenden, um ROS nach Möglichkeit zu messen. Alternative Farbstoffe wie Sonden, die spezifisch für den Nachweis von Mitochondrien-erzeugten Superoxid-Anionen sind, könnten verwendet werden10. Ein Repertoire an Chemilumineszenzsonden wurde ebenfalls entwickelt, um spezifische ROS-Spezies mit hoher Empfindlichkeit nachzuweisen, wie z.B. Luciferin-basierte Sonden15,16. Diese haben den Vorteil, dass sie mit der In-vivo-Bildgebung kompatibel sind, aber nicht zur Abbildung der ROS-Produktion mit bestimmten Zelltypen verwendet werden können. Schließlich kann dieses Protokoll auf andere Arten von Organoiden angewendet werden, zum Beispiel auf Kolonorganoide, die aus menschlichen Biopsien stammen. In diesem Fall sollte das Kulturwachstumsmedium entsprechend angepasst werden17. Um die Redoxmaschinerie in Darmzellen weiter zu analysieren, können die in diesem Protokoll beschriebenen Organoidkultur- und Dissoziationsverfahren mit transkriptomischen und proteomischen Ansätzen auf ganzen Organoiden oder Fluoreszenzaktivierten Zellsortierungszellen (FACS) kombiniert werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch den Zuschuss 17-CE14-0022 (i-Stress) der französischen Nationalen Forschungsagentur (ANR) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
References
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