Summary
多くの植物種は、光吸収を最適化するために葉芽細胞の位置を変更します。このプロトコルは、シ ロイヌナズナ の葉緑体の動きを、葉を介した光の伝達の変化をプロキシとして使用して、簡単で自家製の楽器を使用して調べる方法を説明します。
Abstract
葉の葉の葉芽球運動は、光抑制を最小限に抑え、特定の条件下で成長を増加させるのに役立つものが示されている。葉の位置を研究することによって葉芽球の動きについて多くを学ぶことができますが、例えば、共焦点蛍光顕微鏡検査は、このタイプの顕微鏡へのアクセスが制限されています。このプロトコルは葉の伝達の変化を葉緑体運動のプロキシとして使用する方法を記述する。光のインターセプトを最大化するために葉芽が広がると、伝達は低くなります。光を避けるために葉膜が反柱状細胞壁に向かって移動すると、透過が高くなります。このプロトコルは、簡単な、家庭製の楽器を使用して、葉を異なる青色光強度に公開し、リーフ伝送の動的変化を定量化する方法を説明します。このアプローチにより、研究者は、異なる種および突然変異体における葉芽細胞の動きを定量的に記述し、化学物質や環境要因がそれに及ぼす影響を研究したり、新しい変異体のスクリーニングを行ったりして、光知覚から葉芽細胞の動きにつながる過程で欠けている成分を特定することができます。
Introduction
光合成、植物の成長、開発には光が不可欠です。これは、光強度が季節や日の間に変化するだけでなく、クラウドカバーに応じて迅速かつ予測不可能な方法で変化するので、最もダイナミックな不生物的要因の1つです。葉のレベルでは、光の強度はまた、周囲の植生の密度と性質と植物自身のキャノピーの影響を受けます。植物が可変光条件下で光の遮断を最適化することを可能にする重要なメカニズムの1つは、青色光刺激に応答して動く葉芽体の能力である。低光条件下では、葉葉体はいわゆる蓄積応答で光に垂直に広がり(終円細胞壁に沿って)、光のインターセプトを最大化し、光合成を最大化する。高い光条件下では、葉膜はいわゆる回避応答で反クリナル細胞壁に向かって移動し、光の傍受と光抑制の危険性を最小限に抑えます。多くの種では、葉芽細胞はまた、蓄積および回避位置とは異なり、しばしばそれらの2つの間の中間である特定の暗い位置を仮定する3,4。葉芽球体の動きは葉の短期的なストレス耐性のために重要であるだけでなく、植物の成長と生殖の成功、特に可変光条件下での増殖と生殖の成功のために、様々な研究が示されている8,9。
光顕微鏡1を用いた特定の生きた標本(例えば、藻類や葉の薄葉植物など)では、葉緑体の動きがリアルタイムで容易に観察される。しかし、ほとんどの葉の葉の動きを研究するには、光顕微鏡10でサンプルを見る前に葉芽球運動、化学固定、および断面の調製を誘導するための前処理が必要です。共焦点レーザー顕微鏡の導入により、葉巻の3D配置を無傷または固定葉4,11,12に画像化することも可能になりました。これらのイメージング技術は、重要な定性的情報を提供することで、葉芽細胞の運動の理解を大いに助ける。クロロプラスト位置の定量化(例えば、これらの画像のペリクリンまたはアンチクリナル位置の葉芽細胞の割合、または全細胞表面あたりの葉ロプラストで覆われた領域の割合)も可能であるが、特に位置の急激な変化を捉えるために必要な間隔で行われる場合は非常に時間がかかる10,8.特定の種または突然変異体の暗く適合した葉が回避応答に葉緑体の動きが可能かどうかを示す最も簡単な方法は、葉のストリップを高光にさらしながら、葉の領域のほとんどを覆って葉の領域を暗闇の中に保つことです。最低20分の高光露光の後、露出した領域の葉緑体は回避位置に移動し、露出したストリップは葉の残りの部分よりも目に見えて色が明るくなります。これは野生のA型thalianaには当てはまりますが、後で詳細に説明する葉芽球運動変異体の一部には当てはまりません。この方法およびその修飾(例えば、葉のどの部分が露出しているか逆転、光強度を変化させる)は、多数の突然変異体をスクリーニングし、回避または蓄積応答または両方を示す能力を欠くヌル突然変異体を同定するのに有用である。しかし、葉芽球運動の動的変化に関する情報は提供しない。
対照的に、ここで説明する方法は、葉を通る光透過の変化を全体的な葉緑体運動の代理として使用して無傷の葉の葉の葉緑体運動を定量化することを可能にする:葉緑体が蓄積応答で中胞細胞に広がる条件下で、多くの葉緑体が回避応答している場合よりも葉を通してより少ない光が送出される。 反皮細胞壁に沿って自分自身を配置します。したがって、送信の変化は、葉14における全体的な葉葉芽細胞運動のプロキシとして使用することができる。器械の詳細は他の場所で説明されている( 補足ファイルを参照)、基本的には、器具は青い光を使用して葉緑体の動きをトリガし、設定された間隔でその葉を通してどれだけの赤い光が透過するかを測定する。さらに最近では、このシステムの改変が記載されており、これは、改変された96ウェルマイクロプレートリーダー、青色LED、コンピュータ、および温度制御インキュベーター15を使用する。
スクリーニングのための葉の光学的評価を含む方法の組み合わせを使用するオプションは、伝達の動的変化と顕微鏡の使用を測定することによって、基底のメカニズムと葉葉芽細胞運動の生理学的/生態学的意義の両方の理解を大いに助けました。例えば、それは、その動きの特定の側面で損なわれている様々な突然変異体の発見と特徴付けにつながった。例えば、A.タリアナphot1変異体は低光で葉葉芽を蓄積する能力を欠いているが、phot2変異体は回避反応を行う能力を欠いている。これらの型は、2つの青色光受容体16,17,18における障害によるものである。対照的に、chup1変異体は、葉巻をcell11,19内の所望の位置に移動させるために不可欠な葉巻の周りに適切なアクチンフィラメントを形成する能力を欠いている。変異体研究に加えて、研究者は、プロセスの機械学的側面を解明するために葉芽球運動に対する様々な阻害剤の影響を評価しました。例えば、H2O2および種々の抗酸化物質などの化学物質を用いて、このシグナル伝達分子が葉ロプラスト運動20に及ぼす影響を調べた。葉芽細胞運動21におけるカルシウムの役割を解明するために種々の阻害剤が用いられた。これらの方法は、葉芽球運動のメカニズムを明らかにするのに役立つだけでなく、この行動の生態学的および進化的文脈を理解するために、異なる条件で成長した様々な種または突然変異体における葉ロプラストの動きを比較するために使用することができる。例えば、葉葉芽球の移動経路における様々な突然変異の影響の程度は、成長条件に依存していること7,9、そして太陽に適応した植物が葉ロプラストをあまり動かさないように見えることがわかっています。対照的に、動きは、木陰植物10、22、23のために非常に重要です。
この方法論文は、モデルプラント A.thalianaに焦点を当て、以前に開発された機器9の更新版である伝送装置の使用方法を説明しています。この機器は市販されていませんが、エレクトロニクスの基本的な理解や工学や物理学の同僚や学生の助けを借りて、手頃な価格の部品を使用して、詳細な指示に従って楽器を構築することができます( 補足ファイルを参照)。機器を構築するために使用されるオープンソースプラットフォームは、広範なWebサポートと問題が発生した場合のヘルプを提供するコミュニティフォーラムを持っています24。
このプロトコルは、幅広い光の条件にリーフを露出させ、A.タリアナの暗い、蓄積、および回避反応を捕捉する標準的な探索的実行における葉の伝達の変化を決定するために装置を使用する方法 に焦点を当てています。これらのランは、実験の目的に応じて変更することができ、ほとんどの植物種で使用することができます。本論文は 、A.タリアナ 野生型およびいくつかの変異体の伝送データの例を提供し、さらにデータを分析する方法を示す。
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Protocol
1. 走行用の葉の準備
- 8 A.タリアナ 植物を暗闇の中に一晩置き(>6 hはほとんどの種で働く)、葉芽が暗い位置に移動することを保証します。すべてのレプリカは、同等の転送値で始まります。
- あるいは、8つの完全な葉を底に湿ったろ過紙を入れたペトリ皿に入れ、ペトリ皿を閉じて、アルミホイルで包みます。
2. 伝送装置が動作するかどうかのテスト
- 伝送装置を安定した電源に接続し、デバイスの電源スイッチ(オン/オフボタン)を押して機器をリセットします(図1A、B)。
- iPadを安定した電源に接続し、ホーム画面ボタンを押して画面を有効にし、パスコードを入力してログインします。
- [設定] アイコンを押し、画面と明るさアイコンを押し、自動ロックを押して、このオプションを押して [しない] を選択して、画面が永続的に表示されるようにします。そうしないと、画面がスリープ状態になるとプログラムの実行が停止します。ホーム画面ボタンを押して、メイン画面に戻ります。
- ホーム画面ボタンをダブル押して、開いているアプリケーションを確認し、画面の上部に向かってスワイプしてすべてのアプリケーションを閉じます。 ホーム画面 ボタンを押して、メイン画面に戻ります。
- メイン画面で、または左右にスワイプして 、LeafSensor アプリを見つけます。アプリのアイコンを押して開きます( 補足ファイルを参照)。テキストと白のフィールドを含む緑色の画面が表示され、情報が入力されます。
- アプリが送信デバイスと通信していることを示すとおり、画面の下部に 「Connected 」という単語が表示されていることを確認します。「Adafruit NOT Found」というメッセージが表示された場合は、デバイスが接続されていることを確認し、デバイスの開始ボタンをもう一度押します。
- アプリページの最初の4つのフィールドに記入して、実験に名前を付け、葉のない短いテスト実行の条件を設定し、リーフクリップを開きます。
- たとえば、Expt Name というフィールドに TEST と入力して、実験に名前を付けます (8 文字以下の大文字または数字を使用)。
- #光強度という名前のフィールドに 3 を入力して、実験で使用される青色 光の強度の数を選択します。
- この実行の青色光強度を選択します(0から3000の整数を選択し、カンマで次の数字から各数値を区切ります。これらの数値をLEDの実際の青色光強度に変換する方法については補足ファイルを参照してください)。
- 青い光の強度が葉に輝く時間の長さを選択します(各数値をカンマで区切ります)、例えば、Blue Duration(分)という名前のフィールドに2,2,2と入力します。
- 画面中央のセクションで [実験の開始 ]を押します。画面の下部に8ハイフンとメッセージ「 実験 開始」が表示されます。
- 最初の2分間、LEDから光が出ないようにし、弱い青色光が発色し、2分後に青色光強度が増加していることを確認します。
- 測定のために、LEDから1分間に1回強い赤色光が出ることを確認します。
注: 実験が実行されると、8 つのセンサーのそれぞれに対してアプリ ページに数字が表示され、1 分に 1 回データが更新されます。フォトダイオードからの出力番号が1000-1023程度であることを確認します(部屋が暗い場合)。左下の更新は、これまでに行われた測定の数を示しています。 - 実験が完了したら、アプリ ページの左下で 実験が終了 した外観を確認します。これで、楽器は葉で実行する準備が整いました。
- ホーム画面ボタンを2回押し、アプリの外にスワイプしてもう一度開きます。機器のオン/オフボタンを押してリセットします。
3. リーフクリップの葉の設定
注:このステップは、緑の光源(例えば、電球の前に緑色のフィルターを置く)で暗闇の中で行われ、葉緑体の動きを誘発しないようにする必要があります。または、非常に低い白色光と葉クリップの暗い期間を延長して使用します。リーフクリップの一部はLED(大きな開口部)を保持し、もう一方はフォトトランジスタを保持します(図1C)。
- 植物が全体に暗く適応している場合は、LEDをカバーするのに十分な幅の8つの葉を選びます。それ以外の場合は、ペトリ皿から葉を取り除きます。葉クリップの長さについて8枚のフィルターペーパーを用意し、LEDを覆わないには上部に穴を開けて準備します。
- フィルターペーパーを湿らせ、LED を保持しているリーフ クリップ部分に置きます。8 つのリーフ クリップのそれぞれについて、この手順を繰り返します。
- 各葉をリーフクリップの湿ったフィルター用紙の上に置きます。正しいリーフ側が LED に向かっていることを確認します(通常、実験は、LED に面したアダクシャルリーフサーフェスで行われます)。
- LEDの上に葉のミドリブを置くことを避け、より一貫した結果を得るには、各葉の類似部分(例えば、葉の最も広い部分)をLEDの上に置きます。
- フォトトランジスタを上に置いて、もう一方のリーフクリップパーツを置きます。必要に応じて、2 つのリーフ クリップ パーツを一緒に保持するために、ラバー バンドを使用します(図 1C、D)。
- 各葉クリップを「ボート」に入れ、ピペットを使って貯水池に水を入れます。葉の中に葉の脱水を避けるために、葉または少なくとも濾紙が水に触れていることを確認してください(図1D)。
4. 実行を実行する
注:標準的な探索的な実行のために、暗闇の4 h(0 μmol光子m-2 s-1)から始め、低い青色光の7時間(2 μmol photon m-2 s-1)、続いて5、10、30、40、50、60、90、100 μmol photon m-1-1の青い光のそれぞれ60分続きます。これは、葉が暗い透過を示し、葉葉の動きを最大蓄積に誘導し、異なる程度の回避応答を示すことを誘導する。
- iPad で、次の手順に従って LeafSensor アプリをセットアップします。
- Expt 名という名前のフィールドに、EXPLORA1 と入力します。
- #光強度という名前のフィールドに 10 を入力します。
- 0,1,60,160,550,750,950,1150,1350,1950 を「青強度」というフィールドに入力します。
- 「ブルーデュレーション」フィールドに「240,420,60,60,60,60,60,60」と入力します。
- [実験の開始] を押します。最初の分の後、出力値(通常は 990 ~ 820)が画面に表示されます。値が遠く離れている場合は、リーフクリップに正しく配置されているかどうかを確認します。
- 実行が完了したら、画面の左下に「 実験完了 」というメッセージが表示されていることを確認します。データは自動的に保存されます。
- 画面を(水平ではなく)直立した位置に配置します。画面には、 保存 とユーティリティという 2 つの新しいオプション が表示されます。
- ユーティリティを押すと、保存されたファイルのリストが表示されます。対象となるファイル (この場合は、EXPLORA1) を選択します。
- ファイルの一覧の下にある [選択された Expt: EXPLORA1] を探します。 [電子メール]を押して メールアドレスを入力すると、データファイルが自動的にメッセージに添付されます。 [送信] を押します。
注:ファイルが到着するまでの時間が長い場合は、アプリを再起動し、ファイルをもう一度送信します。
- 実行が中止されたが、その時点までのデータが対象となる場合は、[ユーティリティ]を選択する前に[保存]を押します。数回実行した後、メモリ領域をクリーンアップする:ユーティリティを押して、一度に1つのファイルを選択し、ファイルの隣で左にスワイプし、Deleteキーを押してファイルを削除します。
- 別の実験を実行するには 、または 完了した場合は、ホーム画面ボタンを押して、メイン画面にスワイプし、 設定を押し、 画面と明るさを押し、 オートロックを押し、 2分を押します。
5. データ分析
- 電子メールからファイル EXPLORA1 をダウンロードし、ファイルに拡張子.csvを追加し、ファイルをダブルクリックします。データは、8つの異なるセンサーのデータを別々の列にソートしたスプレッドシートにソートされます。最後の列には、データが収集された時刻 (秒) が表示されます。見出しの下の最初の行 (Sensor1-8) に無意味なデータが含まれている場合は削除します。
- 各センサーの結果を別々のシートに含め、各リーフクリップとセンサーのキャリブレーションから得られた式を使用して出力値を % 伝送値に変換するマスターデータシートを設定 します (補足ファイルを参照)。
- 各データ セットを別々のデータ シートにコピーします (たとえば、列 A には時刻が含まれ、列 C には Sensor1 のデータが含まれます)。
- 列 B を設定して、時間を秒から分に変換します。列 D を設定して、キャリブレーションの式を使用して電圧を % 伝送に変換する式を含めます。
- 各センサに同様のデータシートを設定し、電圧出力を%伝送値に変換するために使用される式は、センサごとに異なる場合があります。
- 時間に対するプロット%伝送(T)、分(図2)。
- マスター データ シートを再利用できるように、新しい名前でデータ シートを保存します。
- さらにデータを分析するには(図2)、 ΔT( 例えば、暗い時のTと比較して最大蓄積時のTの変化)、 ΔT( 例えば、暗い時のTと比較して最大回避時のTの変化)、または dT/dt(%/h) (例えば、蓄積または反応の最も速い部分の間にTの変化)を計算する。詳細については 、8 を参照してください。
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Representative Results
伝送装置の異なる部分を 図1に示します。マイクロコントローラはデバイスの制御ユニットであり、黒い葉クリップで固定された葉が発生している光の状態を制御し、受け取った光伝送データを格納します(図1A、B)。計測器の制御ユニットのクローズアップには、オン/オフボタン、データストレージ機能用のSDカード、Bluetoothシールド( データをLeafSensor アプリに送信)、LED(発光ダイオード)とフォトトランジスタに接続するケーブルが表示されます。マイクロコントローラは計測器の底部に配置され、画像にはエッジのみが表示されます(図1B)。3D プリントされた黒いリーフ クリップは、葉、LED、フォトトランジスタを所定の位置に保持します。湿ったフィルターペーパーは、LED が遮られないような LED でリーフ クリップの一部に配置され、暗く適合したリーフは、LED に面したアダメシャル リーフ サーフェスと共に配置されます。この回路図は、LEDとフォトトランジスタが葉の反対側に配置されていることを示しています。LEDは青色または赤色の光を発する可能性があります。青色光は葉緑体の動きを誘発するために使用され、赤い測定光が葉に照らされる1分ごとに短い期間オフにされます。リーフの反対側に配置されたフォトトランジスタは、リーフを通してどのくらいの赤色光が送られ、マイクロコントローラとSDカードにデータを送信します(図1C)。リーフクリップの2つの部分は組み立てられ、水で満たされ、実験中に葉を湿らせた状態に保つのに役立つ3Dプリントの「ボート」に置かれます(図1D)。
図2は、時間(分)に対して%伝送データをプロットする一般的なデータセットを示しています。この特定のトランスミッションランは、1時間の暗闇に続き、低青色光(2μmol光子m-2 s-1)の3時間、中間(30μmol光子m-2 s-1)と高青色光(100μmol光子m-2 s-1)のそれぞれ1時間が続いた。このデータは、 A.thaliana の透過が低光強度(蓄積応答)で減少し、光強度がさらに増加すると回避応答が誘発されることを示している。これはすべてまたは何も応答ではなく、暗い値に対する変化の度合いは正確な青色光強度に依存します。これらの伝送のパーセント変化(ΔT)は、データの下に示す式を使用して計算することができる。また、蓄積応答や回避応答がトリガされる初期の伝送変化時の伝送変化速度(dT/dt)は、曲線の傾きを用いて計算することができます。
野生型(WT)の平均%透過値(図3A)、ならびにphot 1およびphot 2変異A.タリアナ葉(図3B)を19時間のロングランの間に示す図である。このような拡張された探索的な伝送実行は、将来の実行で使用する青色光強度を確立するのに役立ちます。葉は最初に4時間の暗闇にさらされ、一貫した送信値は葉が完全に暗く適応していたことを示し、レプリカ間のデータの一貫性が高くなります。次の7時間の間、葉は低い青色光(2μmol光子m-2 s-1)にさらされた。WTおよびphot 2では、送信の初期の急速な減少は、葉ロプラストが蓄積応答に移動していたことを示す遅い減少が続く。使用される種に応じて、可能な限り低い伝達を得るのに異なる時間がかかる場合があります。多くの場合、研究者は特定の時点で様々な変異体を比較することにしか興味がない場合があるため、非常に低い光への暴露は1時間に制限される可能性があります。WTと比較して、phot 1は蓄積応答の低下を示す。低青色光への長時間の露出は、毎時青色光強度の段階的な増加(5、10、30、40、50、60、90、100 μmol光子m-2 s-1)に続きます。A.タリアナWTおよびphot1の%透過率は光強度の増加に伴って増加し、葉内芽細胞が回避応答に移動することを示すが、これはphot 2では見られない。暗い値(ΔT)に対する透過度は、正確な青色光強度に依存し、遺伝子型によって異なる場合があります(図3C)。例は、青色強度が5から10 μmol光子m-2 s-1に増加すると回避がトリガされたときの送信の初期応答中の伝送変化の速度(dT/dt)を示しています(図3D)。速度は、WTとphot 1のために同じですが、phot 2変異体では非常に遅いです。
図1:伝送装置の概要 右下のブラックボックスにコントロールユニット、上と左下(A)にリーフクリップを備えた自家製伝送装置の画像。ON/OFFボタン、データ保存機能用のSDカード、無線通信用のBluetoothシールドを備えた制御ユニットのクローズアップ。ケーブルは、コントロールユニットを発光ダイオード(LED)とフォトトランジスタに接続します。マイクロコントローラは計測器の底部に配置され、この写真にはエッジのみが表示されます(B)。3Dプリントされた黒い葉クリップ:左側にLEDを保持しているリーフクリップ部分が表示され、右側にはフォトトランジスタを保持するリーフクリップ部分が表示されます。ランを設定するには、LEDを隠すことなく、湿ったフィルターペーパー(LEDのサイズに穴が開いた)をクリップに配置します。その後、リーフはLEDを覆うクリップに配置されます。この回路図は、各リーフクリップの2つの部分が組み立てられると、LEDとフォトトランジスタ(PT)が互いに対向し、葉の近くに位置していることを示しています(C)。葉クリップは、水で満たされた3Dプリントの「ボート」に配置され、葉とフィルターペーパーを水分補給(D)に保ちます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:典型的な A.タリアナ 葉の伝送データ。 1時間暗く曝露された A.タリアナ 葉の透過(T)データ、次いで低光(2μmol光子m-2 s-1)の3時間、中間体(30μmol光子m-2 s-1)と高青色光(100μmol光子m-2 s-1)のそれぞれ1時間が続く。低い光強度は蓄積応答を誘発し、一方、高い光強度は異なる程度の回避応答を誘発した。暗い T レベルはベースライン (青い線) として機能します。暗黒レベル(ΔT)に対するTの変化率は、例えば、最大蓄積または異なるレベルの回避(暗いTとの違いは青い矢印で示される)で計算することができる。また、Tが変化する速度(dT/dt)は、例えば、回避応答の初期段階の間に、時間に対してプロットされたTの傾きから計算することができる(青色の三角形で示される)。方程式はグラフの下に表示されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:野生型および変異体A.タリアナ葉における葉芽球運動。暗く適合した成熟した葉は4時間暗く露出し、続いて2μmol光子m-2 s-1に7時間曝露し、その後、毎時青色光強度のステップワイズ増加(5、10、30、40、50、60、90、100 μmol光子m-2 s-1)を続けた。WT(A)の平均伝送率(T)値(n=20)とphot 1およびphot 2葉(B)の平均値。暗い値に対する % T の変化: 負の値は、葉が累積応答を示したことを示し、正の値は回避応答を示します。右側の数字は、ΔT データが計算された青色光強度を示します。配色パターンは、図の残りの部分 (C) と同じです。dT/dtデータは、葉が青色光強度が5から10μmol光子m-2 s-1に増加し、1時間当たり%Tが変化した速度(D)を示すように計算された。AおよびBのデータは平均であり、CおよびDはSD±を意味する(n= 20)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
しなめのファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
デバイスは非常に使いやすいですが、LEDとフォトトランジスタの位置がリーフクリップからリーフクリップにわずかに異なる場合があるため、伝送デバイスの各リーフクリップの設定を独立して較正することが重要です。LEDとフォトトランジスタが安定して挿入されていることを確認し、データがオフに見える場合はキャリブレーションを再確認します。デバイスに水を入れないようにしてください。葉クリップの葉は水のストレスを避けるために水で満たされた「ボート」に置かれる。これらのボートは、例えば、制御ユニットから分離された低縁のプラスチック容器に入れて、それらをノックしないでください。ケーブル接続を取り外したり曲げたりしないでください。葉を葉クリップに挿入する際は注意が必要です。
初期伝送値が暗い位置を表すのに十分な長さで葉を暗く適応させることが重要です。デバイスの暗い期間の値が葉に青色光を照らす前に、少なくとも30分安定していることを確認してください。それでない場合は、次の実行前に長い期間葉を暗着させるか、送信デバイスの暗い期間を延長して、葉が安定した状態に達するまでにかかる時間を監視します。一般的に、透過データは、暗い値(ΔT)に対する特定の青色光強度での伝送の変化%として提示される。したがって、正しいベースライン値を取得することが重要です。
探索的な実行は、葉の領域が葉クリップのLEDを覆うのに十分な大きさであり、葉が厚すぎない限り、任意の A.タリアナ 突然変異体(植物の生理学の他の側面に影響を与えることを知られている変異体を含む)または異なる種に使用することができる。本プログラムは、研究者のニーズを満たすように容易に適応することができ、例えば、青色光強度は、葉芽細胞運動を引き起こす(反応が100μmol光子m-2 s-1の周りに飽和する)を引き出すことを示した範囲内で変化させることができる、露光時間を変更することができ、連続した光条件の数を変更することができる。さらに、葉は、例えば、クロロプラスト運動を調節するシグナル伝達経路の空白を埋めたい研究者にとって重要であるアクチン重合またはシグナル伝達経路成分の阻害剤を用いて、デバイスで実行される前に前処理することができる。
すべての方法と同様に、これもその制限と欠点があります。この手順は、葉の光学特性の変化、すなわち光がどれだけ透過されているかに依存する。したがって、比較的薄い葉では最適に機能し、厚い葉は多くの場合、ノイズレベルを超えて検出される赤信号の十分な伝送を可能にしません。透過装置を変更して、葉に輝く赤い光強度を高め、抵抗を変えることでフォトトランジスタの感度を高めることができる。この方法は、すべての細胞および細胞層における葉芽細胞の動きの統合的尺度のみを提供するので、例えば微妙な変化を見逃す可能性があり、反対方向に移動する葉芽細胞は正味の伝達変化を生じさせないかもしれない。特に、以前に特徴のない変異体または種を扱う場合、顕微鏡を用いた葉芽細胞の位置決めの画像で透過結果を補うことが重要である。例えば、青色光強度の変化に応じて伝達の遅い変化がA.タリアナ突然変異体で観察され、様々な理由による可能性がある。顕微鏡検査では、細胞は通常の葉ロプラストよりもはるかに大きい2つの葉芽体しか持っていなかったことが明らかになった。変異体は後に、葉芽細胞分裂変異体である6-125であることが確認された。
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Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
資金はフィスケ賞とウェルズリーカレッジ教員賞によって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | |||
| Dark adapted leaves | |||
| Filter paper | |||
| iPad with LeafSensor app installed (see Supplemental Info) | |||
| Pipette | Any | ||
| Petri dish | Any | ||
| Transmission device (see Supplemental info) | |||
| Water |
References
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