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Summary
このプロトコルは、 黄色ブドウ球菌 の内在化の程度とヒト宿主細胞内で生き残る能力、ならびに抗菌性化合物の細胞内有効性を研究する方法を説明することを目的とする。
Abstract
黄色ブドウ球菌 は、真核生物細胞への内在化を引き起こし、異なる細胞内の内膜で生き残るために病原性因子を発現する。本論文では、S .アウレウス 内在化の程度と、その細胞内生存率を、接着非専門食細胞(NPPCs)で研究する酵素保護アッセイと、抗菌性化合物の細胞内有効性について述べている。NPCは、合流率が100%になるまでマルチウェルプレートで成長します。 S.アウレウス 培養物は、細胞培養培地中で一晩増殖する。細菌懸濁液は、制御された感染の多重度で細胞を接種するために、ウェル当たりの細胞数に応じて希釈される。接種細胞を2時間インキュベートして、細菌をNPPCによって内在化させ、その後リゾスタフィンを培地に添加して細胞外細菌を選択的に殺す。リソスタフィンは、残りの実験のための培地中に存在する。
この時点で、感染した細胞は抗菌化合物と共にインキュベートされ、 S.アウレウスに対する細胞内活動を評価することができた。次に、細胞を3回洗浄して薬物を除去し、次いで細胞内 S.アウレウス 負荷を寒天プレート上で培養して定量する。あるいは、細胞内生存および細胞毒性に関与するブドウ球菌毒性因子を研究するために、リソスタフィンをプロテイナーゼKで不活性化して洗浄工程の必要性を排除することができる。このヒントは、細胞内S. アウレウスの増殖のために細胞が重く感染したときに培養プレートから脱離する傾向がある場合に特に、細胞内細菌負荷定量の信頼性を向上させる。これらのプロトコルは、事実上すべてのタイプの付着性NPPCとオルガノイドなどの3D細胞培養モデルで使用できます。
Introduction
黄色ブドウ球菌は、生命を脅かす病原体であり、皮膚のコメンサル細菌であり、世界中の20億個の個体を植民地化する粘膜である1。ヒトでは、S.アウレウスの鼻キャリアは、馬車の独自の株で感染のリスクが高くなります。しかし、S.アウレウス粘膜キャリッジの多因子決定因子は依然として不明である。急性感染症に加えて、患者は治癒にしばしば困難である慢性S.アウレウス感染症を発症する可能性があります3。植民地化および感染時の宿主と病原体の相互作用をよりよく理解することは、新しい治療戦略を開発し、患者管理を改善するために極めて重要である。
インビトロでは、S.アウレウスは、α5β1 integrin4を発現する宿主細胞への内在化を引き起こすことができる。S.アウレウスの細胞壁に固定されたブドウ球菌フィブロネクチン結合タンパク質と、フィブロネクチン、および宿主細胞表面で発現されるβ1インテグリンとの間の三者間相互作用は、角化細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、および上皮内皮細胞などのNPPCにおけるS.アウレウス内在化の主な経路としてよく知られている。最近の研究では、S.アウレウスは、鼻の植民地化中にヒト細胞の中で見つけることができることを示しています5,6、および感染7。しかし、S.アウレウス感染の病因における細胞内貯留部の役割は不明のままである。宿主細胞は、免疫系8および最も抗菌性化合物6,9の両方から保護されているS.アウレウスの避難所として機能する可能性がある。
1980年代の初めにProctor10によって説明されたリソスタフィン保護アッセイは、S.アウレウス分離株の内在化に関与する細菌および宿主因子の研究を可能にする。リソスタフィンは、ブドウ球菌シミュランによって産生されるバクテリオシンであり、抗生物質耐性株11を含むほぼすべてのS.アウレウス分離株に対して強力な活性を示す。リソスタフィンは、細胞外S.アウレウスのみを破壊し、生き生きとした細胞内細菌12のみのカウントを可能にするために使用されてきた。この技術は広く使用されており、S.アウレウスのいくつかの毒性因子の発見に貢献してきました。ゲンタマイシンは、単独で、リソスタフィンと組み合わされ、細胞内細菌の研究にも広く用いられている。
しかし、最近の研究では、ゲンタマイシンが真核細胞に入り、時間と濃度に依存する方法で内在化細菌に到達することを示した13。また、リソスタフィンが真核細胞に入らないということも明らかになって、リソスタフィン系酵素保護アッセイ(EPA)が培養13によって細胞内S.アウレウス負荷を定量する最も正確なアッセイであることを確認した。どの化合物が細胞外細菌(例えば、リソスタフィンまたはゲンタマイシン)を破壊するために使用されるかに関係なく、寒天プレート上の細胞内S.アウレウスをめっきする前に細胞を洗浄することによって除去されるべきである。連続的な開封は細胞の剥離、特に接着性の悪い細胞(例えば、重い感染細胞)をもたらし、細胞内S.アウレウス負荷の過小評価につながる。本論文では、EPAを用いて細胞内S.アウレウス負荷を定量化し、インビトロモデルを用いて抗菌化合物の細胞内有効性を測定する方法について詳しく説明する。なお、集中的な清打を避けることで細胞内負荷定量の信頼性を向上させる簡単な方法が提案されている。
Protocol
ヒト上皮細胞の培養
- Dulbeccoの修飾Eagle培地(DMEM)高グルコースをフェノールレッドで完全な培養培地を調製し、抗生物質を含まない10%ウシ胎児血清(FBS)を補う。
- A549上皮細胞を完全な培養培地で5%CO2で36±1°Cで増殖させる。適切なサイズの培養容器を使用して、後続のステップに十分な細胞を確保してください(ステップ1.10参照)。
注:1つの75 cm2 (T-75)フラスコは、2つの24ウェルプレートを播種し、細胞をサブ培養するのに十分です。 - 感染の2日前に、単一の24ウェルプレートを調製する。
- 使用済み培養培地をT-75フラスコから取り出して捨て、10mLのDulbeccoのリン酸緩衝生理食塩(DPBS)で細胞を1回洗浄します。
- 5 mLのトリプシン-EDTAを加え、5%CO2で36±1°Cで5分間培養します。
- 5 mLの完全な培養培地を加え、細胞をチューブに移します。
- 300×gで5分間細胞を遠心分離 する。
- 上清を捨て、10mLの新鮮な完全な培養培地で細胞を再懸濁する。
- 自動セルカウンター(または計数チャンバー)を持つセルをカウントします。
- 完全な培養培地で細胞を希釈し、105 個の細胞/mLの濃度2.0×で30mLの細胞懸濁液を調製する。
- 24ウェルプレートのウェルに1mLのセルサスペンションを加え、2cm²のウェルエリアに対して約1.0×105 セル/cm²のセル密度に対応します。
- 5%CO2 で36±1°Cで48時間培養し、合流率100%に達します。
注:テストする条件に加えて、3つの井戸は、感染の日にセルカウントのために予約する必要があります(ステップ3.1.4を参照してください)。試験される条件の数に応じて、24ウェルプレートまで同時に準備することができます。プロトコルに示されているボリュームは、それに応じて増やす必要があります。
2. S. アウレウス 株の培養
- 感染の2日前に、フェノールレッドを含まないDMEM高グルコースで完全感染培地を調製し、抗生物質を使わずに10%FBSを補う。
- 寒天プレート上で試験されるS. アウレウス 株を解凍する。
- 寒天プレートを36±1°Cで18〜24時間インキュベートします。
- 接種の前日に、完全感染培地の10mLで試験される S.アウレウス 株の1コロニーを接種する。
- 160rpmで振盪して36±1°Cで18〜24時間細菌をインキュベートします。細菌の沈降を避けるために45°で保持された50 mLの管を使用してください。
注:新しい株で開始する前に、さらなる実験(培地、細菌負荷、リソスタフィン濃度およびインキュベーション時間)に使用される同じ条件の培養でリソスタフィン感受性を確認することをお勧めします。また、1つの株から別の株にわずかに異なる可能性があるため、0.5のOD600nm に対応する細菌負荷を決定することも重要です。細菌株の培養条件は、実験目的に応じて適合することができる。
3. S. アウレウスによる感染アッセイ
- 細胞密度と生存率の決定
- A549細胞を数える専用の3つのウェルから使用済み培地を取り出して廃棄する。
- 5 μg/mL の Hoechst 33342 と 1 μg/mL のヨウ化プロピジウムを含む完全感染培地を 1 mL 加えます。
注意: Hoechst 33342は既知のミュータゲンであり、注意して取り扱う必要があります。ヨウ化プロピジウム(潜在的な変異原)は、注意して取り扱い、適用される規制に従って安全に処分する必要があります。 - 5%CO2で36±1°Cで30分間培養します。
- 細胞数を数え、振り込み場蛍光顕微鏡を用いて細胞生存率を計算する。
注:蛍光顕微鏡が利用できない場合、細胞密度と生存率は、細胞計数チャンバーを使用してトリパンブルー染色で計算することができます。
- 細菌懸濁液の調製
- 完全な感染媒体の25 mLをチューブに分配し、36±1°Cで予温する。
- 細胞密度計を用いて完全感染媒体中の0.5のaOD600nmにS.アウレウス懸濁液を調整します。
- 完全感染媒体中の0.5 OD600nm を希釈して細胞接種用の細菌懸濁液20mLを調製し、ウェル当たりの細胞数に応じて1の多重性の感染(MOI)を達成する。
注:MOIは、各ウェルの細胞当たりの細菌の数に対応しています。たとえば、1.0 × 106 細胞を持つ 1.0 の MOI をウェルあたり 106 個のセルで実現するには、2.0 × 106 CFU/mL で細菌懸濁液を用意し、106 CFU を 500 μL の体積で追加できるようにします(ステップ 3.3.3 を参照)。MOIは、試験される細胞タイプおよび細菌株に応じて調整することができる。 - 自動スパイラルプラターを使用して、細胞接種ステップに使用する希釈細菌懸濁液の S.アウレウス 負荷を決定します。
- 寒天プレートを36±1°Cで18〜24時間インキュベートします。
- 翌日、コロニーカウンターを持つコロニーの数を数え、検査された各株の正確なMOIを計算します。
注:自動スパイラルプラターが利用できない場合、細菌の負荷は寒天プレートの連続希釈によって決定することができます。詳細14については、細菌学的分析マニュアルを参照してください。
- 細胞接種
- 細胞が健康で期待どおりに成長していることを確認するために、低倍率顕微鏡で24ウェルプレートのすべての井戸を観察します。
- 24ウェルプレートから使用済み細胞培養培地を取り出し、廃棄します。
- 100%コンフルエント細胞を持つ各ウェルに接種のための細菌懸濁液の500 μLを加えます。
- 1°Cおよび5%co2±36で細胞を2時間インキュベートする。
注:試験(三重)をテストする各条件のためにプレートの3つのウェルを使用し、少なくとも3つの独立した実験を行うことをお勧めします。インキュベーションの遅延は、実験目的に応じて適合させることができる。
- 酵素保護アッセイ(iEPA)を改良した細胞内細菌の定量化
- 滅菌水に3.5 mLの2%トリトンX-100とトリプシン-EDTAの3.5 mLを用いて、4xリシスバッファー7 mLを調製します。
- 酢酸緩衝液中10mg/mLのリゾスタフィンストック溶液と25μLのアリコート液をクライオビアルに調製します。-80°Cで6ヶ月間保管してください。
- リソスタフィンストック溶液25μL(10mg/mL)と0.1 M Tris-HClの225 μLを混合して、1mg/mLで250μLのリソスタフィン作業溶液を調製します。4°Cで48時間まで保管してください。
- リソスタフィンの働く溶液の250 μLに完全な感染培地の6 mLを加えることによってリソスタフィンを補充する完全な感染培地の6.25 mLを準備する。
- リソスタフィンを補った完全な感染培地250μLを各ウェルに加え、手でプレートを回転させることでプレートを軽く攪拌します。
- 細胞を5%CO2 で36±1°Cで1時間培養し、リソスタフィンが細胞外細菌を殺すようにします。
- インキュベーション時間の終了時に、各ウェルに10mg/mLのプロテイナーゼKを10μL加えて、リソスタフィンを不活性化します。
- 室温で2分間細胞をインキュベートする。
- 4xリシスバッファーの250 μLを加え、浸透衝撃で細胞を分解します。
- 細胞を36分1°Cで10分間インキュベート±。
- ウェルの底全体に10回上下にピペットを入れ、細胞が完全に溶かされ、均質化されるように徹底的に混合します。
- 自動スパイラルプラターを使用して、各ウェルの S.アウレウス 負荷を決定します。
- 寒天プレートを36±1°Cで18〜24時間インキュベートします。
- 翌日、コロニーカウンターを有するコロニー数をカウントし、各ウェルの細胞内 S.アウレウス負荷を 計算する。
- 酵素保護アッセイ(EPA)による抗菌性化合物の細胞内有効性の測定
- 滅菌水に3.125 mLのトリトンX-100、トリプシン-EDTA 6.25 mL、滅菌水15.625 mLの1xリシスバッファー25 mLを調製します。
- リソスタフィンストック溶液25μL(10mg/mL)と0.1 M Tris-HClの225 μLを混合して、1mg/mLで250μLのリソスタフィン作業溶液を調製します。
- リソスタフィンの作業溶液の250 μLに完全な感染培地の24.75 mLを加えることによって、リソスタフィンを補った完全な感染培地の25 mLを準備します。
- 試験対象の各抗菌化合物について、研究対象の濃度でリソスタフィンおよび抗菌化合物を添加した完全感染培地3.1mLを調製する。
- 24ウェルプレートから使用済み細胞培養培地を取り出し、廃棄します。
- リソスタフィンを添加した完全な感染培地の1 mLを加える。
- 細胞を5%CO2 で36±1°Cで1時間培養し、リソスタフィンが細胞外細菌を殺すようにします。
- 24ウェルプレートからリソスタフィンを添加した培地を取り出し、廃棄します。
- リソスタフィンと試験する抗菌化合物を添加した培地の3つのウェルを満たします。
- 試験対象の各抗菌化合物について、ステップ3.5.9を繰り返します。
- 制御条件については、抗菌化合物を含まずにリソスタフィンを添加した培地1mLで3つのウェルを充填します。
- 細胞を5%CO2で36±1°Cで24時間培養します。
- インキュベーション期間の終わりに、使用済み培地を取り除いて捨て、CaCl2 およびMgCl2で滅菌DPBSで3回ずつゆっくりと洗浄します。
- 各ウェルに1mLの1mLのライシスバッファーを加え、浸透衝撃によって細胞を剥離して分解します。
- 細胞を36分1°Cで10分間インキュベート±。
- 細胞が完全に溶かされ、均質化されていることを確認するために、ウェル全体に10回上下にピペットを介して徹底的に混合します。
- 自動スパイラルプラターを使用して、各ウェルの S.アウレウス 負荷を決定します。
- 寒天プレートを36±1°Cで18〜24時間インキュベートします。
- 翌日、コロニーカウンターを有するコロニー数をカウントし、各ウェルの細胞内 S.アウレウス負荷を 計算する。
注:各抗菌化合物の細胞内活性は、制御条件の細菌負荷に応じて計算する必要があります。また、コントロールと化合物の間に認められる差異が細胞死によるものではないことを証明するために、すべての抗菌性化合物の細胞毒性をチェックすることも重要です。
Representative Results
A549上皮細胞による S.アウレウス 内在化の結果を 図1Aに示す。A549細胞は、フィブロネクチン結合タンパク質AおよびBを欠く S.アウレウス SF8300 WTおよびSF8300 ΔfnbA/Bを1対2時間のMOIで接種した。細胞外 S.アウレウスを破壊するために、リソスタフィンを培地に添加し、細胞を1時間インキュベートした。次に、リソスタフィンは、EPA用の洗浄によって除去されるか、またはiEPA用プロテアーゼKで不活性化された。次いで、細胞をリシス緩衝液中で破壊し、培養により細菌負荷を定量した。EPAを用いることで、平均細胞内負荷は、SF8300 WTおよびSF8300 ΔfnbA/Bに対してそれぞれ4.46および0.49 Log CFU/mLであった(図1A、緑色のバー)。iEPAを用いた平均細胞内負荷は、SF8300 WTおよびSF8300 ΔfnbA/Bに対してそれぞれ4.53および0.56 Log CFU/mLであった(図1A、赤色の棒)。興味深いことに、EPAとiEPAの両方が同様の結果を示し、細胞が良好な状態にあるときに、そして S.アウレウス誘発細胞毒性がこれらの実験設定で非常に低いため、この方法で、この方法で説明することができます(データは示しません)。
S.アウレウスに対するバンコマイシン、リファンピシン、レボフロキサシンの細胞内活性の結果を図1Bに示す。これらの抗生物質の細胞内活性を測定するために、HaCaT細胞を2時間1のMOIでS.アウレウスATCC 29213で接種した。細胞をリソスタフィンでインキュベートし、試験対象の抗菌化合物の有無にかかわらず、24時間培養した。次に、リソスタフィンおよび抗菌性化合物を洗浄により除去した。細胞をリシス緩衝液中で破壊し、細菌の負荷を培養によって定量した。平均細胞内負荷は、それぞれ4.57、4.51、3.03、および2.91 log CFU/mL(制御用)、バンコマイシン(50μg/mL)、リファンピシン(7 μg/mL)、レボフロキサシン(10μg/mL)であった(図1B)。
図1:上皮細胞における細胞内ブドウ球菌負荷(A)酵素保護アッセイ(緑色の棒)およびS.アウレウスSF8300 WTおよびΔbfnA/Bに感染したA549細胞における酵素保護アッセイ(赤いバー)の改善された酵素保護アッセイ(B)は、尿素を感染させたHaCaT細胞における抗菌性化合物の細胞内活性。 ATCC 29213.棒は三重で行われた3つの独立した実験の平均値を表します。誤差範囲は標準偏差を表します。p < 0.0001.省略形: Ctrl = コントロール;cfu = コロニー形成ユニット。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
ここで説明するアッセイは、NPPCにおけるS.アウレウスの内在化と細胞内生存の程度、ならびに抗菌性化合物の細胞内有効性6,15,16を研究するのに有用である。両方のアッセイプロトコルの一部のステップは重要です。細胞の健康状態と密度は、独立した実験の間で完全に制御され、一貫している必要があります。細菌接種は、標的理論MOIに近い実のMOIを得るために慎重に標準化されなければならない。一般に、ピペット処理中に細胞を取り外さないように注意する必要があります。リソスタフィンおよび抗生物質を除去するためのすすが、EPAの重要なステップである。プロテイナーゼKの使用は、抗生物質を使用しない場合にこのステップを改善することが判明した(下記参照)。最後に、細胞は各井戸に完全に剥離し、リシスバッファーでインキュベーション後に完全に均質化して、S.aureus細胞内負荷を確実に定量化する必要があります。
場合によっては、問題が発生する可能性があり、いくつかのポイントを最初にチェックする必要があります。再現性が不足している場合は、 S.アウレウス が塊を形成し、吸光度による定量を不正確にすることを念頭に置く必要があります。細菌の凝集は、培養培地を置換する場合(例えば、分泌タンパク質を排除するため)遠心分離および洗浄工程によって増加させることができる。細菌は室温で増殖し続けるため、細菌懸濁液を迅速に使用する必要があります。リソスタフィンの有効性は、誤った保存条件、培養培地中の酵素活性に対する最適でないpH、バッチと提供者間の酵素活性の変動、および特定の成長条件におけるいくつかの株のリソスタフィン感受性の欠如のために低下する可能性がある。フェノールレッドは、特に培養培地が細菌の増殖に使用される典型的なスープと比較して栄養素が比較的貧弱な場合、わずかな静菌効果を有する可能性がある。したがって、フェノールレッドを含まない細胞培養培地を用いることが推奨され、バックグラウンドノイズを低減させることで蛍光顕微鏡観察も向上する。
この方法は、異なる株の細胞内運命を研究するための貴重なツールであるが、方法のいくつかの制限を考慮する必要があります。非常に高いMOIの使用は、NPPCによる内在化の能力を過負荷にし、テストされた異なる株間の違いを平準化することができます。リソスタフィン(または抗生物質)が損傷した細胞によって放出される S.アウレウス を急速に破壊するため、最も細胞傷害性株の内在化の程度は過小評価される可能性がある。したがって、長期間の実験(すなわち、抗生物質の細胞内生存または細胞内活性を研究する)は、低細胞毒性を有する株でセットアップすることが容易である。したがって、インキュベーション時間とMOIは、菌体、細胞型、および実験的目的に応じて正確に調整されるべきである。
リソスタフィンを用いた方法は、リソスタフィンとは異なり、ゲンタマイシンが宿主細胞13によって内在化される傾向があるため、ゲンタマイシンに基づくものよりも信頼性が高い。もう一つの利点は、リソスタフィンを不活性化する可能性です。リソスタフィン活性の阻害は、亜鉛イオンまたは1,10 フェナントロリンをキレートするEDTAの使用とのKim et al.13によって報告されました;しかし、細菌のめっき前に酵素を除去するために集中的な打ち込みが必要です。ここで、プロテイナーゼKはリソスタフィンの急速な不活性化を可能にする。細胞内 S.アウレウスの増殖により、細胞が大きく感染すると、細胞が培養板から剥離する傾向があることを観察した。最終的な洗浄ステップをスキップすることにより、iEPA法は技術的な取り扱いを大幅に簡素化し、緩やかに接着または既に剥離された細胞における内在化細菌の回収を可能にした。
iEPAで使用されるより濃縮された試薬および緩衝剤はまた、ピペットの努力を減らし、細胞の損失を最小限に抑えるのに役立った。さらに、iEPAは、細胞を懸濁液に加え、洗浄が困難なオルガノイドと共に使用することができる。結論として、酵素保護アッセイは、 S.アウレウスの細胞内活性の程度、ならびに異なる インビトロ モデルを有する抗菌薬の細胞内活性の研究を可能にする。細胞内の アウレウス に到達可能な薬剤を開発することの重要性をより良く理解するために、内在化と細胞傷害性の関係をより良く特徴付けるために改善すべきである。
Disclosures
著者は宣言する利害の対立を持っていません。
Acknowledgments
S. アウレウス 株 SF8300 WT と SF8300 ΔfnbA/B はビン・ディープ教授(カリフォルニア大学サンフランシスコ校、米国)によって寛大に贈られました。この研究は、リヨン大学財団のイージスの下でFINOVI協会(#AO13 FINOVI)の助成金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | CORNING-FALCON | 353047 | |
| A549 cell line | ATCC | CCL-185 | |
| Acetate buffer solution pH 4.6 | Fluka | 31048 | Used to prepare lysostpahine stock solution at 10 mg/mL in 20 mM sodium acetate. |
| AMBICIN (Recombinant lysostaphin) | AMBI | LSPN-50 | Lyophilized recominant lysostaphin. Freeze at -80 °C for long-term storage. |
| COS - Colombia agar + 5% sheep blood | Biomerieux | 43049 | Any agar plate suitable for growing staphylococci can be used instead. |
| Densitometer WPA CO8000 | Biochrom Ltd. | 80-3000-45 | Cell density meter |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose with phenol red | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose without phenol red | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline with MgCl2 and CaCl2, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Easyspiral dilute | Interscience | 414000 | Automatic diluter and spiral plater |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| HaCaT cell line | Cell lines service (CLS) | 300493 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water | Fisher scientific | 11534886 | |
| Propidium iodide, 1.0 mg/mL solution in water | Invitrogen | P3566 | |
| Proteinase K, recombinant 20 mg/mL | Eurobio | GEXPRK01-B5 | > 30 U/mg, lot 901727 |
| Scan 4000 | Interscience | 438000 | Automatic colony counter |
| Sterile water | OTEC | 600500 | |
| T-75 culture flask | CORNING-FALCON | 353136 | |
| TC20 Automated cell counter | Biorad | 1450102 | Automatic cell counter |
| Tris 1 M pH 8.0 | Invitrogen | AM9855G | Used to prepare lysostaphine working solution at 1 mg/mL in 0.1 M Tris-HCl. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trypsin - EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | 0.05% porcine trypsin and 0.02% EDTA in Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red |
| Wide-field fluorescence microscope | Nikon | Ti2 |
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生物学,175号Erratum
Formal Correction: Erratum: Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds
Posted by JoVE Editors on 01/19/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds. One of the affiliations was updated.
The fifth affiliation was updated from:
Département de Bactériologie, Institut des Agents Infectieux, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France
to:
Department of Bacteriology, Institute for Infectious Agents, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France
