Summary
Her beskriver vi et optimalisert direkte omprogrammeringssystem for melanocytter og et høyeffektivt, konsentrert virusemballasjesystem som sikrer jevn direkte omprogrammering.
Abstract
Tap av funksjon av melanocytter fører til vitiligo, noe som alvorlig påvirker den fysiske og mentale helsen til de berørte individene. For tiden er det ingen effektiv langsiktig behandling for vitiligo. Derfor er det viktig å utvikle en praktisk og effektiv behandling for vitiligo. Regenerativ medisinteknologi for direkte omprogrammering av hudceller til melanocytter ser ut til å være en lovende ny behandling av vitiligo. Dette innebærer direkte omprogrammering av pasientens hudceller til funksjonelle melanocytter for å bidra til å forbedre tapet av melanocytter hos pasienter med vitiligo. Denne metoden må imidlertid først testes på mus. Selv om direkte omprogrammering er mye brukt, er det ingen klar protokoll for direkte omprogrammering til melanocytter. Videre er antall tilgjengelige transkripsjonsfaktorer overveldende.
Her presenteres en konsentrert lentivirusemballasjesystemprotokoll for å produsere transkripsjonsfaktorer valgt for omprogrammering av hudceller til melanocytter, inkludert Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 og Snai2. Mus embryonale fibroblaster (MEFer) ble infisert med konsentrert lentivirus for alle disse transkripsjonsfaktorene for direkte omprogrammering av MEF-ene til induserte melanocytter (iMels) in vitro. Videre ble disse transkripsjonsfaktorene screenet, og systemet ble optimalisert for direkte omprogrammering til melanocytter. Uttrykket av de karakteristiske markørene til melanin i iMels på gen- eller proteinnivå ble betydelig økt. Disse resultatene tyder på at direkte omprogrammering av fibroblaster til melanocytter kan være en vellykket ny terapeutisk strategi for vitiligo og bekrefte mekanismen for melanocyttutvikling, noe som vil gi grunnlag for videre direkte omprogrammering av fibroblaster til melanocytter in vivo.
Introduction
Vitiligo er en hudsykdom som alvorlig påvirker den fysiske og mentale helsen til de berørte individene. Av ulike grunner, inkludert metabolske abnormiteter, oksidativt stress, generering av inflammatoriske mediatorer, celleavløsning og autoimmun respons, går de funksjonelle melanocyttene tapt, og sekresjonen av melanin stoppes, noe som fører til utvikling av vitiligo 1,2. Denne tilstanden oppstår mye og er spesielt problematisk i ansiktet. Hovedbehandlingen er systemisk bruk av kortikosteroider og immunmodulatorer. Fototerapi kan brukes til systemiske eller lokale sykdommer, og det er kirurgiske behandlinger, for eksempel perforert hudtransplantasjon og autolog melanocyttransplantasjon 3,4,5. Imidlertid er pasienter som bruker medikamentell terapi og fototerapi utsatt for tilbakefall, og disse behandlingene har dårlige langsiktige terapeutiske effekter. Kirurgisk behandling er traumatisk og bare moderat effektiv 2,6. Derfor er det nødvendig med en ny og effektiv terapeutisk strategi for vitiligo.
Omprogrammeringen av induserte pluripotente stamceller (iPSCer) reverserer disse cellene fra terminaltilstanden til en pluripotent tilstand, en prosess formidlet av transkripsjonsfaktorene, Oct4, Sox2, Klf4 og c-Myc7. Men på grunn av muligheten for tumorigisitet og lang produksjonstid, har denne teknologien blitt møtt med skepsis når den brukes på kliniske innstillinger8. Direkte omprogrammering er en teknologi som gjør at én type terminalcelle forvandles til en annen type terminalcelle9. Denne prosessen oppnås ved egnede transkripsjonsfaktorer. Ulike celler har allerede blitt direkte omprogrammert vellykket, inkludert kardiomyocytter10, nevroner11 og cochleahårceller12. Noen forskere har til og med omprogrammert hudvev direkte in situ, som kan brukes til sårreparasjon13. Fordelene med direkte omprogrammering inkluderer reduserte ventetider og kostnader, lavere risiko for kreft, færre etiske problemer og en bedre forståelse av mekanismen som ligger til grunn for celle skjebnebestemmelse9.
Selv om den direkte omprogrammeringsmetoden er mye brukt, er det for tiden ingen bestemt metode for direkte omprogrammering av hudceller til melanocytter, spesielt på grunn av de mange transkripsjonsfaktorene som skal betraktes som14,15. Transkripsjonsfaktorene Mitf, Sox10 og Pax3 har blitt brukt til direkte omprogrammering av hudceller til melanocytter14. Kombinasjonen av MITF, PAX3, SOX2 og SOX9 har derimot også blitt brukt til direkte omprogrammering av hudceller til humane melanocytter i en annen studie15. I denne protokollen, til tross for bruk av en annen screeningmetode, ble det samme resultatet oppnådd med kombinasjonen av Mitf, Sox10 og Pax3 for direkte omprogrammering av hudceller til melanocytter som beskrevet tidligere14. Å utvikle et system for å generere melanocytter fra andre hudceller kan gi en ordning for å transformere andre hudceller av vitiligo-pasienter til melanocytter. Derfor er det avgjørende å konstruere en enkel og effektiv metode for denne direkte omprogrammeringen for å generere melanocytter med hell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dette arbeidet ble godkjent av Laboratory Animal Management and Use Committee ved Jiangsu University (UJS-IACUC-AP--20190305010). Forsøkene ble utført i henhold til standardene fastsatt av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International). Det var ingen eksperimenter som involverte mennesker, så dette arbeidet trengte ikke godkjenning fra den menneskelige forskningsetiske komiteen. Se materialfortegnelsen hvis du vil ha mer informasjon om reagenser.
1. Bygging av et konsentrert lentivirusemballasjesystem for transkripsjonsfaktorer
- Produksjon av det konsentrerte viruset (figur 1A, B)
- Plate 1,5 × 106 HEK-293T celler i en 60 mm tallerken og kultur disse cellene med normalt medium (se tabell 1) ved 37 °C i en fuktet inkubator med 5 % CO2.
MERK: Hvis viruset må pakkes i grupper, kan en 100 mm cellekulturrett brukes (for detaljer, se tabell 2). - Etter 24 timer må du sørge for at HEK-293T-cellene har nådd 80-90% sammenløp på transduksjonsdagen, og erstatt mediet med 3,5 ml DMEM (150 μL DMEM per 1 cm2). La cellene ligge ved 37 °C i en fuktet inkubator med 5 % CO2 i 2 timer.
MERK: Erstatningsmediet må være serumfritt, slik at cellene kan "sultes" for bedre plasmidtransfeksjon. - Forbered blandingen av plasmider (blanding A) som inneholder 3 μg av målplasmidene til Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 eller Snai2; 1 μg av emballasjen plasmid PMD2. G, og 2 μg av emballasjen plasmid PSPAX2. Utgjør volumet av blanding A til 150 μL med serumfri DMEM. Forbered blandingen av transfeksjonsreagenset (blanding B) ved å legge til 12 μL av transfeksjonsreagenset (volumet er dobbelt så mye som den totale massen av alle plasmidene), og utgjør volumet av blanding B til 150 μL med serumfri DMEM.
MERK: Når du forbereder blandingene, er det viktig å tilsette væske sakte for å unngå luftbobler. - Kombiner bland A og bland B etter at du har latt dem stå i 5 minutter ved romtemperatur. Inkuber blandingen ved romtemperatur i 20-30 min for å danne transfeksjonskomplekset.
- Ta HEK-293T-cellene ut av inkubatoren, erstatt mediet med DMEM + 2% FBS, tilsett blandingen fra trinn 1.1.4 dropwise, og bland væsken forsiktig.
- Etter 8 timer, bytt medium med 3,5 ml normalt medium. Etter å ha endret mediet, samle viruset supernatant hver 24 h og 48 h.
- Bland viruset supernatants samlet på to forskjellige tidspunkter. Sentrifuge ved 200 × g i 5 min ved 4 °C. Før supernatanten gjennom 0,45 μm-filtre og samle den i et 50 ml sterilt konisk rør.
MERK: Viruset som samles inn i 24 timer, kan oppbevares ved 4 °C og blandes med viruset som samles inn i 48 timer. - Konsentrer viruset supernatant ved sentrifugering ved 6000 × g ved 4 °C over natten (~16 h). Påse at viruspelleten er synlig på bunnen av det koniske røret etter sentrifugering.
- Hell ut supernatanten sakte. Løs opp viruspellet i et volum av normalt medium som er 1/100th av volumet av viruset supernatant. Bruk en P1000 mikropipette, pipette opp og ned forsiktig til en homogen blanding oppnås. Del det konsentrerte viruset i mikrosenterrør etter behov. Oppbevars ved −80 °C.
MERK: Viruset er konsentrert 100x med denne metoden. Det konsentrerte viruset (100x) kan oppbevares i >1 år ved −80 °C. Unngå gjentatt frysing og opptining av viruset.
- Plate 1,5 × 106 HEK-293T celler i en 60 mm tallerken og kultur disse cellene med normalt medium (se tabell 1) ved 37 °C i en fuktet inkubator med 5 % CO2.
- Påvisning av konsentrert virustitl (figur 1C)
- Plate 1 × 105 HEK-293T celler i en brønn på en 6-brønns plate. Husk å legge til en brønn og en negativ kontroll. Kultur disse cellene med normalt medium ved 37 °C i en fuktet inkubator med 5 % CO2.
- Tilsett 0,1 μL eller 0,2 μL fluorescerende konsentrert virus (100x) til hver brønn etter 24 timer, og tilsett 4 ng/μL av det kationiske polymeriske transfeksjonsreagenset til hver brønn. Ca 8-12 timer etter infeksjon, erstatt mediet med normalt medium.
MERK: For å sikre nøyaktigheten og effektiviteten til fluorescensdeteksjonen må infeksjonsraten være 10-30%. Tilsetning av 0,1 μL eller 0,2 μL av det fluorescerende konsentrerte viruset kan opprettholde infeksjonseffektiviteten innenfor dette området. Den konsentrerte virustitren kan nå minst 1 × 108 transduserende enheter (TU)/ml. - Ca. 48 timer etter infeksjon, vask fatet med 1 ml steril fosfatbufret saltvann (PBS) for å fjerne døde celler.
- Prøv disse cellene ved hjelp av 250 μL 0,05% trypsin-EDTA per brønn i en 6-brønns plate i 1 min ved romtemperatur. Sentrifuge ved 200 × g i 5 min ved 4 °C og fjern deretter supernatanten.
- Resuspend cellepellet i 1 ml PBS, legg suspensjonen til et 5 ml polystyren rundbunnsrør, og oppdag infeksjonseffektiviteten til virusets fluorescens (grønt fluorescerende protein, GFP +) ved hjelp av strømningscytometri.
- Beregn den konsentrerte virustitren ved hjelp av følgende formel: 105 (cellevolum) × infeksjonsrate (GFP+%)/ekstra virusvolum (0,1 μL eller 0,2 μL).
2. Direkte omprogrammering av fibroblaster til melanocytter (figur 2A)
- Belegge en brønn av en 6-brønns cellekulturplate med 1 ml 0,1% gelatinoppløsning ved romtemperatur i 15-30 min. Påse at brønnen er helt dekket med 0,1% gelatinoppløsningen. Aspirer 0,1% gelatinoppløsningen etter belegg.
MERK: Forbered 0,1% gelatinoppløsning (100 ml) som følger: 0,1 g gelatinpulver oppløses i 100 ml ultrarent vann i en autoklavert glassflaske og lagres deretter ved 4 °C i ikke mer enn 2 måneder. - Plate 5 × 104 MEF-er i en brønn av en 6-brønns plate belagt med 0,1% gelatin (som i trinn 2.1), og kultur disse cellene med normalt medium ved 37 °C i en fuktet inkubator med 5% CO2 over natten.
- Etter 24 timer, bekreft at MEF-ene har nådd 40-50% samløp. Skift ut mediet med normalt medium.
- På dag 0, ta ut det konsentrerte viruset fra fryseren og smelte viruset på is. Beregn volumet av viruset som skal legges til ved hjelp av eq. (1). Tilsett det konsentrerte viruset for de seks transkripsjonsfaktorene, Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 og Snai2 (se Tabell over materialer) til hver brønn i henhold til det beregnede volumet, og tilsett deretter 4 μg/ml av det kationiske polymertransfeksjonsmiddelet.
Cellenummer (5 × 104) × 30 (multiplisitet av infeksjon, MOI)/virustiter (1) - På dag 1, 8-12 timer etter infeksjon, fjern mediet som inneholder viruset og erstatt det med friskt normalt medium mens du legger til 0,5 μg / ml puromycin for å screene stabile infiserte cellelinjer.
- På dag 2, 48 timer etter infeksjon, erstatt det supernatante mediet gradvis med omprogrammeringsmediet. Først endrer du 1/4tonn av det totale mellomvolumet, og legger til 3 μM CHIR99021.
- Fra dag 3 til dag 7, avhengig av tilstanden til cellene, endrer du mediet ved å erstatte med en høyere andel av omprogrammeringsmediet (se tabell 1) gradvis, og bytter til fullstendig omprogrammeringsmedium innen 5 dager.
MERK: I denne perioden må puromycin og CHIR99021 brukes hver dag. Mange døde celler vises første og andre dag etter at du endrer omprogrammeringsmediet. Dette er normalt ettersom cellene gradvis tilpasser seg transformasjonen. Derfor må mediet endres gradvis for å sikre sunn spredning av cellene. - For å passere cellene, legg til 500 μL av 0,05% trypsin-EDTA for å fordøye cellene i 3 minutter ved romtemperatur. Når ~ 60% av cellene har fløt opp, stopp fordøyelsen ved å legge til normalt medium 2x volumet av fordøyelsesenzymet. Samle cellefjæringen i et 15 ml sterilt konisk rør, sentrifuge ved 200 × g i 5 min ved 4 °C, fjern supernatanten, resuspend cellepelleten med omprogrammeringsmediet, og skriv cellene i en 60 mm steril tallerken med en tetthet på 3 × 104/cm2. Kultur disse cellene ved 37 °C i en fuktet 5% CO2 inkubator.
MERK: Fra dag 8 til dag 21 blir disse cellene underkulturert hver 3-5 dager og dyrket i 60 mm sterile retter for å ekspandere. De kan dyrkes for å nå minst passasje 5.
3. Optimalisering for direkte omprogrammering og identifisering
- Screening for de optimaliserte transkripsjonsfaktorene
- Gjenta trinn 2.1-2.7, og reduser en av de seks transkripsjonsfaktorene hver gang. Infiser MEF-ene med viruset med kombinasjoner av fem transkripsjonsfaktorer.
- Syv dager etter infeksjon, trekk ut RNA i disse cellene16, og analyser uttrykksnivåene til deres melanocytiske gener ved hjelp av omvendt transkripsjon PCR (RT-PCR)17 for å screene for transkripsjonsfaktorene med størst innvirkning på konvertering til melanocytter ved å fjerne dem en etter en (figur 3A).
- Bruk de tre viktigste transkripsjonsfaktorene som påvirker konverteringen til melanocytter for å infisere MEF-ene. Gjenta trinn 2.1-2.7.
MERK: Syv dager etter infeksjon skal de melanocytiske genene påvises i disse transformerte cellene (figur 3B). Primerinformasjon for iMels-karakterisering er inkludert i tabell 3.
- Identifikasjon av induserte melanocytter (iMels)
- Bruk immunfluorescensfarging18 for å bekrefte at iMels uttrykker melanocytiske proteiner, inkludert TYRP-1 og DCT (figur 4A).
- Melaninspesifikk 3,4-dihydroksyfenylalanin (DOPA) farging (figur 4B)
- Forbered 4% paraformaldehyd (10 ml) som følger: oppløs 0,4 g paraformaldehydpulver i 10 ml PBS. Plasser oppløsningen i en ovn ved 56 °C i 2 timer for å fremme oppløsning.
MERK: Oppløsningen kan oppbevares ved 4 °C i ikke mer enn én måned. - Kultur iMels i en 30 mm tallerken og vask parabolen to ganger med forvarmet PBS. Tilsett 1 ml 4% paraformaldehyd for å fikse cellene i 20 min, og vask parabolen 3 ganger med PBS.
- Forbered 0,1% DOPA flekkoppløsning (10 ml) rett før bruk ved å oppløse 0,01 g L-DOPA pulver i 10 ml PBS. Plasser løsningen i et vannbad ved 37 °C i 30 minutter; rist den flere ganger for å fremme oppløsning.
- Tilsett 1 ml nytilberedt 0,1% DOPA fargingsoppløsning. Inkuber i en ovn ved 37 °C i 2-5 timer. Hvis det ikke er noen brun-svarte partikler, fortsett å inkubere ved 37 °C i ytterligere 2 timer, men ikke i >5 timer. Sjekk prøvene hvert 30.
- Vask retten 3 ganger med PBS i 1 min hver gang. Flekk kjernen med 1 ml hematoksylinfargingsoppløsning i 2 min.
- For langtidslagring, dehydrer prøvene ved hjelp av 95% etanol i 3 min og deretter 100% etanol i 5 min. Forsegle fatet med xylen og nøytral balsam.
- Forbered 4% paraformaldehyd (10 ml) som følger: oppløs 0,4 g paraformaldehydpulver i 10 ml PBS. Plasser oppløsningen i en ovn ved 56 °C i 2 timer for å fremme oppløsning.
- Melaninspesifikk Masson-Fontana-farging (figur 4B)
- Plate iMels i en 30 mm tallerken og fest cellene med 4% paraformaldehyd i 20 min; vask parabolen 3 ganger med PBS.
- Tilsett 1 ml oppløsning A (ammoniakk sølvoppløsning) fra Masson-Fontana fargesett (se Materialbord), legg parabolen i en mørk boks, og legg den mørke boksen i en ovn ved 56 °C i 15-40 min.
MERK: Hvis brun-svarte partikler ikke er synlige etter 15 min i ovnen, må prøvene returneres til 56 °C-ovnen for å fortsette inkuberingen, men ikke i >40 min. Noe vann kan legges til den mørke boksen for å forhindre tørking. - Aspirer løsning A og vask parabolen 5-6 ganger med destillert vann, 1-2 min hver gang.
- Tilsett 1 ml oppløsning B (hypooppløsning) fra Masson-Fontana fargesett, og la parabolen stå ved romtemperatur i 3-5 min.
- Aspirer oppløsning B og vask parabolen med vann fra springen 3 ganger, 1 min hver gang.
- Tilsett 1 ml oppløsning C (nøytralt rødt fargestoff) fra Masson-Fontana fargesett, og la parabolen stå ved romtemperatur i 3-5 min.
- Aspirer oppløsning C og vask parabolen 3 ganger med destillert vann, 1 min hver gang.
- Tilsett 1 ml 100% etanol for rask dehydrering, og aspirer etanol etter 3 min.
MERK: Fargede prøver kan lagres i lang tid etter tetting med xylen og nøytral balsam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne artikkelen inneholder protokollene til et konsentrert lentivirusemballasjesystem for å produsere lentivirus av transkripsjonsfaktorer for direkte omprogrammering av fibroblaster til melanocytter og protokoller for screening for transkripsjonsfaktorer og direkte omprogrammering av melanocytter fra MEFer.
Suksessen med konsentrert lentivirusproduksjon ble evaluert ved å observere fluorescensintensiteten til GFP (figur 1A) eller ved strømningscytometri (figur 1B) etter å ha smittet HEK-293T-celler i 48 timer med ukonsentrert lentivirus (1x) og konsentrert lentivirus (100x). Titeret til det konsentrerte viruset var 108 TU/ml eller mer, noe som er relativt høyt (figur 1C).
Direkte omprogrammering av fibroblaster til melanocytter oppnås gjennom infeksjonen med transkripsjonsfaktor lentivirus og transformasjon med det optimaliserte omprogrammeringsmediet. Ordningen for generering av iMels fra MEF-er er vist i figur 2A. Cellemorfologi endres gradvis under direkte omprogrammering. Cellesynapser blir langstrakte, og cellekjerner forstørres. Imidlertid blir disse cellene gradvis eldre etter ~ Dag 20 (~ 5 passasjer) (figur 2B).
En transkripsjonsfaktor ble fjernet om gangen fra det opprinnelige settet med seks transkripsjonsfaktorer (Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 og Snai2) for å bestemme transkripsjonsfaktoren med størst innvirkning på omprogrammering. Fjerning av Mitf, Pax3 eller Sox10 resulterte i silencing av uttrykket av melanocytiske gener Tyr, Tyrp1 og Mlana (figur 3A), noe som indikerer at disse tre transkripsjonsfaktorene hadde størst innvirkning på fibroblastkonvertering til melanocytter. Uttrykket av melanocytiske gener indusert av direkte omprogrammering med tre transkripsjonsfaktorer var høyere enn for alle seks transkripsjonsfaktorene (figur 3B).
Til slutt ble egenskapene til iMels oppnådd ved hjelp av dette optimaliserte systemet for direkte omprogrammering identifisert. Uttrykket av melanocytiske markører (TYR, TYYP1) ble påvist ved hjelp av immunfluorescerende farging (figur 4A). Melaninspesifikke fargingsmetoder, inkludert DOPA- og Masson-Fontana-farging, viste også positive resultater (figur 4B).
Figur 1: Produksjon av konsentrert virus og estimering av titer. (A) Fluorescensintensitet av GFP etter infeksjon av HEK-293T celler med ukonsentrert lentivirus (1x) og konsentrert lentivirus (100x) (B) Sammenligning av infeksjonsratene for ukonsentrert lentivirus (1x) og konsentrert lentivirus (100x) som oppdaget ved strømning cyetomi. (C) Titerestimering av konsentrert lentivirus. Skalastenger = 250 μm. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; TU = transduseringsenheter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Generering av iMels fra MEFer. (A) Skjematisk diagram over iMels-generering. (B) Endringer i cellemorfologi under konvertering fra MEFer til iMels i direkte omprogrammering på dag 0, dag 3, dag 10 og dag 20+. Skalastenger = 100 μm. Forkortelser: iMels = induserte melanocytter; MEFs = mus embryonale fibroblaster. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Screening for optimaliserte transkripsjonsfaktorer. (A) qRT-PCR for Tyr-, Tyrp1 - og Mlana mRNA-nivåer i celler transdusert med fem transkripsjonsfaktorer (en av de opprinnelige seks transkripsjonsfaktorene er fjernet). MEF + EV og MEF + 6F brukes som henholdsvis negativ kontroll og positiv kontroll. mRNA-uttrykket normaliseres til Gapdh-uttrykk . (B) qRT-PCR av Tyr-, Tyrp1 - og Mlana mRNA-nivåer i celler transdusert med de opprinnelige seks transkripsjonsfaktorene og med tre transkripsjonsfaktorer. MEF, MEF + EV og MMC brukes som henholdsvis en tom, negativ kontroll og positiv kontroll. mRNA-nivåene normaliseres til Gapdh-nivåer . Alle verdier er gjennomsnittlige ± SD for tre uavhengige eksperimenter. Primersekvensene vises i tabell 3. Forkortelser: qRT-PCR = kvantitativ omvendt transkripsjon PCR; MEF = mus embryonale fibroblaster; MEF +EV = mus embryonale fibroblaster + tom vektor; MMC = mus melanocytt; 6F = seks transkripsjonsfaktorer som består av Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 og Snai2; 3F: tre transkripsjonsfaktorer som består av Mitf, Pax3 og Sox10. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Funksjonell identifikasjon av iMels. (A) Immunostaining av melanocytiske markører (TYR, TYYP1) i iMels. Skalastang = 50 μm. Se materialtabellen for fortynning av antistoffer som brukes i denne studien. (B) Masson-Fontana farging og DOPA farging. MEF og Melan-a-cellelinjen brukes som henholdsvis negativ kontroll og positiv kontroll. Skalastang = 50 μm. Forkortelser: iMels = induserte melanocytter; DOPA = 3,4-dihydroksyfenylalanin; MEF = mus embryonal fibroblast. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Komponenter | Dose (konsentrasjon, volum) | Endelig konsentrasjon | |
| Normal middels (100 ml) | DMEM/HØY GLUKOSE | 89 ml | |
| Varmeinaktivert FBS | 10 ml | ||
| Antibiotika (Penn/Strep) | 10000 U/ml, 1 ml | 100 U/ml | |
| Omprogrammeringsmedium (100 ml) | RPMI-1640 | 88 ml | |
| Varmeinaktivert FBS | 10 ml | ||
| Rekombinant menneskelig SCF | 200 μg/ml, 50 μL | 100 ng/ml | |
| Rekombinant human bFGF | 4 μg/ml, 250 μL | 10 ng/ml | |
| Rekombinant humant insulin | 10 mg/ml, 50 μL | 5 μg/ml | |
| EDN3 menneskelig | 100 μM, 100 μL | 0,1 μM | |
| Koleratoksin | 0,3 mg/ml, 0,56 μL | 20 pM | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetat (TPA) | 1 mM, 20 μL | 200 nM | |
| Hydrocortisone | 100 μg/ml, 500 μL | 0,5 μg/ml | |
| Adenin | 40 mg/ml, 60 μL | 24 μg/ml |
Tabell 1: Komponenter i normale medier og omprogrammeringsmedier.
| Kulturrett | Såing Tetthet (celler/tallerken) | Middels (ml) | Plasmid System | Transfeksjon reagens (μL) | ||
| Mål plasmid (μg) | PMD2. G (μg) | PSPAX2 (μg) | ||||
| 35 mm | 6 ×105 | 1.5 | 1.5 | 0.5 | 1 | 6 |
| 60 mm | 1,5 × 106 | 3.5 | 3 | 1 | 2 | 12 |
| 100 mm | 4 × 106 | 8 | 8 | 3 | 6 | 34 |
Tabell 2: Detaljer om lentivirusemballasjesystemet.
| RT-PCR Primers | |
| Mål | Primer sett |
| Gapdh | Fremover: CAACGACCCCTTCATTGACC |
| Omvendt: CATTCTCGGCCTTGACTGTG | |
| Tyr | Fremover: GGGCCCAAATTGTACAGAGA |
| Omvendt: ATGGGTGTTGACCCATTGTT | |
| Tyrp1 | Fremover: AAGTTCAATGGCCAGGTCAG |
| Bakside: TCAGTGAGGAGAGGCTGGTT | |
| Mlana | Fremover: AGACGCTCCTATGTCACTGCT |
| Omvendt: TCAAGGTTCTGTATCCACTTCGT |
Tabell 3: Primer-informasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvaliteten på viruset er avgjørende for suksessen med direkte omprogrammering til melanocytter i denne protokollen. Metoden for pakking og konsentrerende virus i denne protokollen er enkel og enkel å gjenta og er ikke avhengig av noe annet ekstra konsentrert reagens. Denne protokollen kan følges i de fleste laboratorier. For å sikre kvaliteten på det konsentrerte viruset, trenger følgende punkter spesiell oppmerksomhet. Den ene er cellestatusen til HEK-293T. Selv om HEK-293T-celler er udødelige celler, må cellene som brukes til å lage det konsentrerte viruset være sunne celler innen 10 passasjer (titeret reduseres med høyere passasjer).
Et annet kritisk punkt er andelen av transfeksjonsreagenset (i dette tilfellet lipofektamin) som brukes. Ettersom celler er skadet etter å ha lagt til transfeksjonsreagenset, må forholdet mellom reagenset og plasmidene kontrolleres gjentatte ganger for å sikre optimal tilstand av cellene og kvaliteten på viruset. 2: 1-forholdet mellom transfeksjonsreagens og plasmider er mest egnet for HEK-293T-celler for pakking av viruset i dette systemet. I tillegg krever alle trinn skånsom håndtering gjennom hele prosessen. Siden viruspartikler kan absorberes etter belegg, noe som påvirker virustitren, er det ikke tilrådelig å belegge parabolen med noen matrise når du pakker viruset. På grunn av muligheten for løsrivelse av HEK-293T, må supernatanten byttes forsiktig ut, spesielt når friskt medium tilsetts etter å ha samlet viruset supernatant etter 24 timer. Noen andre hensyn inkluderer celletetthet, lengden på transfeksjonstiden og seruminnholdet i mediet. Dette er viktige problemer som påvirker transfeksjonseffektiviteten. Forholdene som presenteres i denne protokollen er de mest egnede, basert på resultater oppnådd etter mange gjentatte eksperimenter.
I prosessen med direkte omprogrammering til melanocytter er det viktig å vurdere tilstanden til de opprinnelige celle-MEF-ene og tettheten av MEFer som brukes til direkte omprogrammering. Før du starter direkte omprogrammering, må MEFer dyrkes i ikke-belagte cellekulturretter. Celler i spredningsfasen (40-50% samløp) bør velges for direkte omprogrammering; infeksjonseffektiviteten reduseres med økende celletetthet. De omprogrammerte cellene må være belagt i gelatinbelagte kulturretter.
Tiden som trengs for at viruset skal infisere celler er også kritisk; for lang infeksjonstid vil svekke celleoverlevelsen, mens for kort infeksjonstid vil redusere effektiviteten. Åtte timer ble funnet å være passende for det konsentrerte viruset å infisere MEFer i denne protokollen. Det siste kritiske punktet er den riktige måten å endre omprogrammeringsmediet på. MEFer må tilpasse seg et nytt medium. Tilstanden til cellene må kontrolleres hver dag, og mediet må endres nøye i henhold til cellestatusen. Hvis du endrer omprogrammeringsmediet for raskt, vil et stort antall celler dø.
Ved dyrking og subkulturering av iMels er passasjetettheten til cellene kritisk. iMels trenger en relativt høy tetthet for å opprettholde veksten. Cellesynapser bør være i kontakt med hverandre for normal spredning av disse cellene. Hvis tettheten er for lav, kan cellene slutte å spre seg. Her ble tettheten på 3 × 104/cm2 funnet å være en passende passasjetetthet for iMels. Etter 5 passasjer begynner iMels aldring (figur 2B); melanin er mer moden på dette tidspunktet, og de resulterende cellene kan brukes til immunfluorescens, DOPA eller Masson-Fontana farging. Tidligere passasjer av celler kan brukes til RT-PCR fordi uttrykket av gener vil endres på et relativt tidlig stadium.
Selv om direkte omprogrammering er mye studert, er det lite forskning på direkte omprogrammering av fibroblaster til melanocytter. Ulike studier har brukt forskjellige transkripsjonsfaktorer14,15, noe som fører til mye forvirring. Denne protokollen forklarer hvordan du produserer konsentrerte virus av høy kvalitet og screener flere transkripsjonsfaktorer for å velge de viktigste for direkte omprogrammering til melanocytter. Mediet ble supplert med ernæringsmessige faktorer for direkte omprogrammering til melanocytter i denne protokollen (tabell 2). Til slutt ble funksjonelle iMels identifisert. Det klare og optimaliserte melanocytt direkte omprogrammeringssystemet kan gi nye behandlingsstrategier for depigmenteringssykdommer som vitiligo.
Imidlertid er det fortsatt noen begrensninger for teknologien som presenteres i denne artikkelen. For det første er det utfordrende å estimere effektiviteten til denne protokollen. CRISPR-Cas9 genredigering kan kombineres med denne protokollen for å banke inn melanocytiske gener, for eksempel Tyr eller Tyrp-1, inn i de første cellene for å observere prosentandelen induserte celler under omprogrammeringsprosessen. I tillegg kan lentivirusintroduksjonssystemet som brukes i denne protokollen, medføre risiko for gengasjekombinasjon og innsettingsmutasjon19. I fremtiden kan mer effektive og sikrere introduksjonsmetoder brukes, for eksempel ikke-virale rekombinante proteinuttrykksvektorer eller mRNA-vektorer. Eksperimentet i denne protokollen er fortsatt på in vitro-scenen . Det neste trinnet er å omprogrammere melanocyttene direkte in vivo, noe som får ikke-pigmentert hud til å bli pigmentert og bruke det direkte omprogrammeringssystemet til å designe en effektiv behandling av vitiligo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble delvis støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (82070638 og 81770621) og Natural Science Foundation of Jiangsu-provinsen (BK20180281).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | Stored at -20 °C |
| 0.45 μM filter | Millipore | SLHVR33RB | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 95%/100% ethanol | LANBAO | 210106 | Stored at RT |
| Adenine | Sigma | A2786 | Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL |
| Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a | Invitrogen | A21137 | Dilution of 1:500 to use |
| Antibiotics(Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | Stored at -20 °C |
| Anti-TRP1/TYRP1 Antibody | Millipore | MABC592 | Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| Anti-TRP2/DCT Antibody | Abcam | ab74073 | Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM |
| Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 111-165-144 | Dilution of 1:500 to use |
| DMEM (High glucose) | HyClone | SH30243.01 | Stored at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Stored at RT |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Stored at -20 °C Heat-inactivated before use |
| Gelatin | Sigma | G9391 | Stored at RT |
| GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | Stored at -20 °C |
| Hematoxylin | Abcam | ab220365 | Stored at RT |
| Human EDN3 | American-Peptide | 88-5-10A | Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL |
| L-DOPA | Sigma | D9628 | Stored at RT |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent, stored at 4 °C |
| Masson-Fontana staining kit | Solarbio | G2032 | Stored at 4 °C |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | Stored at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Stored at RT |
| PBS (-) | Gibco | C10010500BT | Stored at RT |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) | Sigma | P8139 | Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM |
| Polybrene | Sigma | H9268 | cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | Stored at -20 °C |
| Recombinant human bFGF | Invitrogen | 13256-029 | Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL |
| Recombinant human insulin | Sigma | I3536 | Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL |
| Recombinant human SCF | R&D | 255-SC-010 | Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | Stored at 4 °C |
| Xylene | Sigma | 1330-20-7 | Stored at RT |
References
- Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N.
- Picardo, M., et al.
- Speeckaert, R., van Geel, N. Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options. American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).
- Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).
- Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H.
- Bishnoi, A., Parsad, D. Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments. International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).
- Yamanaka, S. Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges. Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).
- Xu, J., Du, Y., Deng, H. Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Gascón, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., Götz, M. Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success. Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).
- Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).
- Kurita, M., et al. In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue. Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nature Communications. 5, 5807 (2014).
- Fehrenbach, S., et al. Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage. Scientific Reports. 6, 28891 (2016).
- Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).
- Bachman, J.
- Donaldson, J. G.
- Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
