Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Registrering av nettverksaktivitet i spinale nociceptive kretser ved bruk av mikroelektrodearrayer

Published: February 9, 2022 doi: 10.3791/62920
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2, 1, 1, 2, 1
1School of Biomedical Sciences and Pharmacy, University of Newcastle, 2School of Electrical Engineering, University of Newcastle

Summary

Den kombinerte bruken av mikroelektrode array-teknologi og 4-aminopyridin-indusert kjemisk stimulering for å undersøke nettverksnivå nociceptiv aktivitet i ryggmargens dorsale horn er skissert.

Abstract

Rollene og tilkoblingen til bestemte typer nevroner i ryggmargens dorsale horn (DH) blir avgrenset i rask hastighet for å gi en stadig mer detaljert oversikt over kretsene som ligger til grunn for ryggsmerter. Effektene av disse forbindelsene for bredere nettverksaktivitet i DH forblir imidlertid mindre godt forstått fordi de fleste studier fokuserer på aktiviteten til enkeltneuroner og små mikrokretser. Alternativt gir bruk av mikroelektrodearrayer (MEAer), som kan overvåke elektrisk aktivitet over mange celler, høy romlig og tidsmessig oppløsning av nevral aktivitet. Her beskrives bruk av MEAer med ryggmargsskiver fra mus for å studere DH-aktivitet indusert av kjemisk stimulerende DH-kretser med 4-aminopyridin (4-AP). Den resulterende rytmiske aktiviteten er begrenset til overfladisk DH, stabil over tid, blokkert av tetrodotoksin, og kan undersøkes i forskjellige skiveretninger. Sammen gir dette preparatet en plattform for å undersøke DH-kretsaktivitet i vev fra naive dyr, dyremodeller av kronisk smerte og mus med genetisk endret nociceptiv funksjon. Videre kan MEA-opptak i 4-AP-stimulerte ryggmargsskiver brukes som et raskt screeningsverktøy for å vurdere kapasiteten til nye antinociceptive forbindelser for å forstyrre aktiviteten i ryggmargen DH.

Introduction

Rollene til bestemte typer hemmende og eksitatoriske internevroner i ryggmargen DH blir avdekket med en rask hastighet 1,2,3,4. Sammen utgjør internevroner over 95% av nevronene i DH og er involvert i sensorisk behandling, inkludert nociception. Videre er disse interneuronkretsene viktige for å avgjøre om perifere signaler stiger opp i nevroaksen for å nå hjernen og bidra til oppfatningen av smerte 5,6,7. Til dags dato har de fleste studier undersøkt rollen til DH-nevroner på enten enkeltcelle- eller helorganismenivå av analyse ved bruk av kombinasjoner av in vitro intracellulær elektrofysiologi, nevroanatomisk merking og in vivo atferdsanalyse 1,3,8,9,10,11,12,13,14 . Disse tilnærmingene har betydelig avansert forståelsen av rollen som spesifikke nevronpopulasjoner i smertebehandling. Imidlertid forblir et gap i å forstå hvordan spesifikke celletyper og små makrokretser påvirker store populasjoner av nevroner på mikrokretsnivå for senere å forme utgangen av DH, atferdsresponser og smerteopplevelsen.

En teknologi som kan undersøke makrokrets eller flercellet nivåfunksjon er mikroelektrodematrisen (MEA)15,16. MEAs har blitt brukt til å undersøke nervesystemet funksjon i flere tiår17,18. I hjernen har de lagt til rette for studiet av nevronutvikling, synaptisk plastisitet, farmakologisk screening og toksisitetstesting17,18. De kan brukes til både in vitro og in vivo applikasjoner, avhengig av type MEA. Videre har utviklingen av MEAer utviklet seg raskt, med forskjellige elektrodenumre og konfigurasjoner nå tilgjengelig19. En viktig fordel med MEAer er deres evne til samtidig å vurdere elektrisk aktivitet i mange nevroner med høy romlig og tidsmessig nøyaktighet via flere elektroder15,16. Dette gir en bredere avlesning av hvordan nevroner samhandler i kretser og nettverk, under kontrollforhold og i nærvær av lokalt anvendte forbindelser.

En utfordring med in vitro DH-forberedelser er at det pågående aktivitetsnivået vanligvis er lavt. Her adresseres denne utfordringen i ryggmargens DH-kretser ved hjelp av den spenningsstyrte K + -kanalsblokkeren, 4-aminopryidin (4-AP), for kjemisk å stimulere DH-kretser. Dette stoffet har tidligere blitt brukt til å etablere rytmisk synkron elektrisk aktivitet i DH av akutte ryggmargsskiver og under akutte in vivo forhold 20,21,22,23,24. Disse forsøkene har brukt enkeltcelleplaster og ekstracellulær opptak eller kalsiumavbildning for å karakterisere 4-AP-indusert aktivitet 20,21,22,23,24,25. Sammen har dette arbeidet demonstrert kravet om eksitatorisk og hemmende synaptisk overføring og elektriske synapser for rytmisk 4-AP-indusert aktivitet. Dermed har 4-AP-responsen blitt sett på som en tilnærming som avdekker innfødte polysynaptiske DH-kretser med biologisk relevans snarere enn som et legemiddelindusert epifenomen. Videre viser 4-AP-indusert aktivitet en lignende responsprofil som smertestillende og antiepileptika som nevropatiske smerteforhold og har blitt brukt til å foreslå nye spinalbaserte analgetiske legemiddelmål som connexins 20,21,22.

Her beskrives et preparat som kombinerer MEAer og kjemisk aktivering av spinal DH med 4-AP for å studere denne nociceptive kretsen ved makrokretsen, eller nettverksnivå av analyse. Denne tilnærmingen gir en stabil og reproduserbar plattform for å undersøke nociceptive kretser under naive og nevropatiske "smertelignende" forhold. Dette preparatet er også lett anvendelig for å teste kretsnivåvirkningen av kjente analgetika og for å screene nye analgetika i den hyperaktive ryggmargen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Studier ble utført på hann- og hunnmus c57Bl/6 mus i alderen 3-12 måneder. Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med University of Newcastle's Animal Care and Ethics Committee (protokoller A-2013-312 og A-2020-002).

1. Elektrofysiologi in vitro

  1. Klargjøring av løsninger for klargjøring og registrering av ryggmargsskiver
    1. Kunstig cerebrospinalvæske
      MERK: Kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) brukes i et grensesnittinkubasjonskammer, hvor skiver lagres til opptaket starter og under eksperimenter som både perfusat og fortynningsmiddel for legemidler. Se tabell 1 for detaljert sammensetning.
Kjemisk aCSF (mM) aCSF (g/100 ml) Sukrose-substituert aCSF (mM) Sukrosesubstituert aCSF (g/100 ml) Høy kalium aCSF (mM) Høy kalium aCSF (g/100 ml)
Natriumklorid (NaCl) 118 0.690 - - 118 0.690
Natriumhydrogenkarbonat (NaHCO3) 25 0.210 25 0.210 25 0.210
Glukose 10 0.180 10 0.180 10 0.180
Potasiumklorid (KCl) 2.5 0.019 2.5 0.019 4.5 0.034
Natriumdihydrogenfosfat (NaH2PO4) 1 0.012 1 0.012 1 0.012
Magnesiumklortid (MgCl2) 1 0.01 1 0.01 1 0.01
Kalsiumklorid (CaCl2) 2.5 0.028 2.5 0.028 2.5 0.028
Sukrose - - 250 8.558 - -

Tabell 1: Kunstig cerebrospinalvæskesammensetning. Forkortelse: aCSF = kunstig cerebrospinalvæske.

  1. Forbered aCSF som inneholder (i mM) 118 NaCl, 25 NaHCO3, 10 glukose, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 og 2,5 CaCl2 ved å tilsette de nødvendige mengdene av det ovennevnte, unntatt CaCl2, til 2 liter destillert vann.
  2. Boble løsningen ovenfor med karbogen (95% O2, 5% CO2) i 5 minutter og tilsett CaCl2.
    MERK: Dette trinnet forhindrer CaCl 2-utfelling, det vil si at løsningen ikke blir uklar. For legemiddelapplikasjon under eksperimenter, fortynn legemiddelbestandsløsningene i aCSF til ønskede endelige konsentrasjoner.
  1. Sukrosesubstituert kunstig cerebrospinalvæske
    MERK: Sukrose-substituert aCSF brukes under disseksjon og ryggmargskutting. Som angitt av navnet, er sukrose erstattet av NaCl for å redusere neuronal eksitasjon under disse prosedyrene samtidig som osmolariteten opprettholdes. Se tabell 1 for detaljert sammensetning.
    1. Forbered sukrosesubstituert aCSF som inneholder (i mM) 250 sukrose, 25 NaHCO3, 10 glukose, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 og 2,5 CaCl2 ved å tilsette de nødvendige mengdene av alle de ovennevnte, unntatt CaCl2, til 300 ml destillert vann.
    2. Boble løsningen med karbogen i 5 minutter og tilsett deretter CaCl2.
    3. Oppbevar oppløsningen i en -80 °C fryser i ca. 40 minutter eller til løsningen danner en slurry. Unngå å fryse fast og bruk mens du er i slurry konsistens.
  1. Forberedelse av mikroelektrodematrise
    MERK: Kontaktflaten til MEA krever en forbehandling for å gjøre den hydrofil.
    1. Før forsøket fyller du MEA godt med enten føtalt bovint serum (FBS) eller hesteserum (HS) i 30 minutter.
    2. Fjern FBS eller HS og skyll MEA grundig med omtrent fem vasker destillert vann til det destillerte vannet ikke lenger er skummende. Fyll brønnen med aCSF, klar til bruk.
  2. Akutt forberedelse av ryggmargsskiver
    MERK: Preparatet av ryggmargsskiver er som tidligere beskrevet av Smith et al.2. Ideelt sett bør fjerning av lumbosakralforstørrelsen ikke ta mer enn 8-10 minutter (trinn 1.3.2-1.3.11 nedenfor).
    1. Bedøv musen dypt med 100 mg / kg ketamin (dvs.) og halshugg den deretter ved hjelp av stor kirurgisk saks.
    2. Fjern huden over mageregionen ved å lage et lite kutt i huden på hoftenivået. Trekk huden på hver side av kuttet rostralt til all huden er fjernet, dvs. fra toppen av ribbe buret til toppen av bekkenet (både ventralt og dorsalt).
    3. Plasser kroppen på is og bruk en ventral tilnærming for å eksponere vertebral kolonnen ved å fjerne all innvollene og kutte gjennom ribbeina lateral til brystbenet.
    4. Fjern det ventrale ribbe buret, både scapulae (avskåret ved ca. T2), og underekstremitetene og bekkenet (avskåret på omtrent toppen av sakrummet).
    5. Overfør vertebral kolonnen og ribbepreparatet til et dissekeringsbad som inneholder iskald sukrose aCSF. Fest alle fire hjørner av preparatet (ventral overflate oppover) ved å plassere pinner gjennom nedre ryggmuskler og de vedlagte øvre ribbeina.
    6. Fjern all muskel og bindevev som ligger over den ventrale overflaten av ryggvirvlene med rongeurs og identifiser vertebralområdet over lumbosakralforstørrelsen, som ligger omtrent under T12 til L2 vertebrale legemer.
    7. Fjern en vertebral kropp som er kaudal til lumbosakral utvidelse regionen for å gi tilgang til ryggmargen som den sitter i vertebralkanalen.
    8. Bruk buet fjærsaks, kutt gjennom vertebrale pedikler bilateralt mens du løfter og trekker vertebrallegemet rostralt for å skille de ventrale og dorsale aspektene av ryggvirvlene og eksponere ryggmargen.
    9. Når vertebrale legemer er fjernet for å avsløre lumbosakralforstørrelsen, fjern forsiktig de gjenværende røttene som forankrer ryggmargen med fjærsaks til ledningen flyter fri.
    10. Isoler ryggmargen med rostrale og kaudale kutt godt over og under lumbosakralforstørrelsen, slik at målområdet i ledningen kan "flyte fritt".
      MERK: Den foretrukne skiveretningen vil avgjøre hvordan ledningen deretter monteres for seksjonering (figur 1).
    11. For tverrgående skiver, løft lumbosakralsegmentet med en festet rot og legg den på en forhåndskuttet polystyren (Styrofoam) blokk (1 cm x 1 cm x 1 cm) med en grunne kanal kuttet i midten. Bruk cyanoakrylatlim (se materialtabellen) for å feste blokken og ledningen til seksjonsplattformen og plasser den i skjærebadet som inneholder iskald sukrose aCSF (slurry).
      MERK: Den grunne kanalen bidrar til å sikre og orientere ryggmargen, med dorsalsiden eksponert og thoraxenden av ledningen nederst i blokken.
    12. For sagittalskiver legger du en tynn linje med cyanoakrylatlim på seksjonsplattformen, løfter lumbosakralforstørrelsen med en festet rot og plasserer ledningen langs limlinjen, slik at en sideflate er i limet og de andre ansiktene oppover. Plasser den i skjærebadet som inneholder iskald sukrose aCSF (slurry).
    13. For horisontale skiver, legg en tynn linje med cyanoakrylatlim på seksjonsplattformen. Løft lumbosakralforstørrelsen med en vedlagt rot, og plasser lumbosakralforstørrelsen langs limlinjen, slik at den ventrale overflaten er i limet og dorsaloverflaten vender oppover. Bruk vedlagte røtter for å plassere ledningen. Plasser den i skjærebadet som inneholder iskald sukrose aCSF (slurry).

Figure 1
Figur 1: Ryggmargsskiveorienteringer, monterings- og skjæremetoder. (A) Tverrgående skiver krever en Styrofoam skjæreblokk med et støttespor kuttet inn i den. Ryggmargen hviler mot blokken i støttesporet, den dorsale siden av ledningen vender bort fra blokken. Blokken og ledningen limes på et skjæretrinn med cyanoakrylatlim. (B) Sagittalskiver fremstilles ved å plassere en tynn linje med cyanoakrylatlim på skjæretrinnet og deretter plassere ryggmargen på siden på limet. (C) Horisontale skiver fremstilles ved å plassere en tynn linje med cyanoakrylatlim på skjæretrinnet og deretter plassere ryggmargen ventral side ned på limet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Oppnå 300 μm tykke skiver (L1-L5, samme tykkelse uavhengig av retning) ved hjelp av en vibrerende mikrotom med følgende innstillinger: hastighet 0,06 mm / s, amplitude 2,50 mm og kalibrert til innenfor ±0,02 høyde amplitudeavvik.
  2. Overfør skivene til et luftgrensesnitt inkubasjonskammer som inneholder oksygenert aCSF.
  3. Før opptak, la skivene balansere i 1 time ved romtemperatur (20-24 °C).
  1. Mikroelektrode array opptak
    MERK: Følgende trinn beskriver hvordan du bruker postdata fra MEA-baserte eksperimenter på ryggmargsskiver. Flere MEA-design kan brukes avhengig av eksperimentet. Designdetaljer for MEAer som brukes i disse eksperimentene, vises i Tabell 2 og Figur 2. Detaljert designinformasjon er publisert av Egert et al.26 og Thiebaud m.fl.27 for henholdsvis plane og 3-dimensjonale (3D) MEAer. Begge MEA-typene består av 60 titannitridelektroder, med et silisiumnitridisolerende lag og titannitridspor og kontaktputer.
    1. Eksperimentelt oppsett
      1. Slå på datamaskinen og grensesnittkortet, og start innspillingsprogramvaren.
      2. Last inn den forhåndsmonterte opptaksmalen (figur 3A). Navngi filene for dagen i opptakerfanen.
      3. Kontinuerlig boble aCSF med karbogen (5% CO2, 95% O2) i løpet av forsøket.
      4. Slå på perfusjonssystemet, som styres av en peristaltisk pumpe. Plasser innløpsledningen i aCSF og innløpsenden i et avfallsbeger. Prime perfusjonslinjene med aCSF.
      5. Klargjør 4-AP og andre legemiddelløsninger ved å fortynne lagrene i 50 ml aCSF til den nødvendige endelige konsentrasjonen (f.eks. 200 μM for 4-AP).
      6. Plasser stoffløsningene i narkotikapotter og boble dem med karbogen.
    2. 4-AP aktivitet
      1. Etter inkubering, overfør en enkelt skive fra inkubatoren ved hjelp av en pasteurpipette med stor spiss fylt med aCSF.
      2. Legg skiven i MEA-brønnen og tilsett ekstra aCSF.
      3. Plasser skiven over opptaksmatrisen med 60 elektroder ved hjelp av en pensel med kort hår. Unngå å kontakte elektrodene med penselen eller dra vevet over elektrodene, spesielt hvis du bruker 3D-matriser.
        MERK: Avhengig av MEA-oppsettet, kan dette gjøres med eller uten hjelp av et mikroskop for nøyaktig posisjonering.
      4. Etter å ha plassert skiven, legg et vektet nett over vevet for å holde det på plass og fremme god kontakt med MEA-elektroder.
        MERK: Stykket må kanskje flyttes etter nettplassering.
      5. Plasser MEA i opptakshodet (figur 2A, B).
      6. Kontroller vevets posisjon over elektrodene ved hjelp av et invertert mikroskop (2x forstørrelse) for å bekrefte at så mange elektroder som mulig er under overfladisk DH (SDH). Sørg for at minst 2-6 elektroder ikke kommer i kontakt med skiven, da disse elektrodene er viktige for å trekke fra støy og registrere artefakter under analyse (figur 2E).
      7. Slå på kameraet, koble det til enheten, og ta et referansebilde av stykket i forhold til MEA for bruk under analysen.
      8. Trykk på Start DAQ i opptaksprogramvaren, og bekreft at alle elektrodene mottar et klart signal.
        MERK: Hvis signalet er støyende, løsne hodestøtten og rengjør både MEA-kontaktputene og gullfjærkontaktene med 70% etanol (bruk en laboratorieserviett for å sikre at putene og kontaktene er tørre etter rengjøring). Hvis signalet fortsatt er støyende, slår du av elektrodene som ikke fungerer i opptaksprogramvaren eller noterer ned for utelukkelse senere under analysen.
      9. Fest perfusjonsinnløps- og utløpslinjene til MEA-brønnen (tidligere fylt med aCSF) og slå på perfusjonssystemet. Kontroller strømningshastigheten, ideelt 4-6 badevolumer per minutt, og sørg for at utstrømningen er tilstrekkelig til å forhindre overløp av superfusatet.
      10. La vevet balansere i 5 minutter, og registrer deretter 5 minutter med rå, ufiltrerte baselinedata.
      11. Flytt innløpslinjen for perfusjon fra aCSF til en 4-AP-løsning og vent i 12 minutter på at den 4 AP-induserte rytmiske aktiviteten skal nå steady state (2 minutter for at legemidler skal nå badet og 10 minutter for aktiviteten å toppe og deretter platå).
      12. Ta opp 5 minutter med 4 AP-indusert aktivitet. Vær forberedt på påfølgende opptak for å teste stoffene eller for å kontrollere stabiliteten til 4-AP.
Oppsett for mikroelektrodematriser
Mikroelektrode Array Modell 60MEA 200/30iR-Ti 60-3DMEA 100/12/40iR-Ti 60-3DMEA 200/12/50iR-Ti 60MEA 500/30iR-Ti
Plan eller 3-dimensjonal (3D) Plan 3D 3D Plan
Elektrode rutenett 8 x 8 8 x 8 8 x 8 6 x 10
Elektrodeavstand 200 μm 100 μm 200 μm 500 μm
Elektrode diameter 30 μm 12 μm 12 μm 30 μm
Elektrodehøyde (3D) N/a 40 μm 50 μm N/a
Eksperimenter Tverrgående stykke Tverrgående stykke Sagittal + Horisontal Sagittal + Horisontal

Tabell 2: Oppsett for mikroelektrodematriser.

Figure 2
Figur 2: Vevsposisjonering på mikroelektrodematrisen. (A) Bildet viser en åpen MEA-hodestøtte med en MEA plassert på plass. (B) Samme som A med MEA headstage lukket for opptak og vevsperfusjonssystem på plass. (C) Bildet viser en MEA som leveres av produsenten. Kontaktputer, som grensesnitt med gullfjærer av headstage, og MEA vev bad som holder vev bading løsning og vev skive er vist. Området uthevet av den røde firkanten i midten er plasseringen av elektroderaden. (D) Skjemaer viser de to MEA-elektrodekonfigurasjonene som ble brukt i denne studien, med ytterligere detaljer presentert i tabell 2. Referanseelektroden er betegnet med den blå trapesen. Den venstre MEA-elektrodeoppsettet viser en 60-elektrode kvadratkonfigurasjon, brukt mest i de presenterte arbeidsmodellene 60MEA200/30iR-Ti med 30 μm diameterelektroder fordelt 200 μm fra hverandre, eller 200 μm fordelt og 100 μm fordelt 3-dimensjonale MEA (60MEA200/12/50iR-Ti og 60MEA100/12/40iR-Ti) med elektroder 12 μm i diameter og enten 50 μm eller 40 μm høy, henholdsvis. Det venstre MEA-elektrodeoppsettet viser en 6 x 10 elektrode rektangulær layout-60MEA500/30iR-Ti. (E) Høyforstørrelsesbilde av en 60MEA100/12/40iR-Ti kvadratisk MEA med tverrgående ryggmargsskive plassert for opptak. Skiven sitter på elektroderader 3-8. Den øverste raden av elektroder, som ikke kommer i kontakt med noe vev, fungerer som referanseelektroder. SDH-området vises som et semitransparent bånd. I dette tilfellet ligger SDH over elektroder i rad 4, 5 og 6 og kolonne 2, 3, 4, 5 og 7 i MEA. Skala bar = 200 μm. Forkortelser: MEA = mikroelektrode array; SDH = overfladisk dorsalt horn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Endre stykker
    1. Etter hver innspillingsøkt, skyll linjene med aCSF.
    2. Fjern MEA fra headstage.
    3. Fjern nettet og vevet fra MEA-brønnen, skyll dem godt med aCSF, og gjenta trinnene ovenfor med en ny skive.

2. Databehandling og analyse

MERK: Følgende trinn beskriver hvordan du bruker analyseprogramvaren for MEA-eksperimenter på ryggmargsskiver. En av de 60 elektrodene fungerer som en intern referanse (markert med en trapesformet i figur 2 C,D), mens mellom fire og tjuefem av de resterende 59 er plassert under SDH i en ryggmargsskive hos voksen mus. Påfølgende analyse påviser ekstracellulært aksjonspotensial (EAP) og lokale feltpotensial (LFP) bølgeformer (se figur 3B for eksempler) fra råsignalet i denne regionen.

  1. Behandling av rådata
    1. Åpne analyseprogramvaren og last inn det forhåndsdefinerte analyseoppsettet (figur 3B).
    2. Åpne interessefilen og fjern markeringen av referanseelektroden (elektrode 15 i 8 x 8 MEA- eller elektrode E1 i 6 x 10 MEA-konfigurasjon) og eventuelle elektroder som anses å være svært støyende.
    3. Still inn tidsvinduet for analyse (0:00 → 5:00 min).
    4. Gå til filterfanen på tvers av kanaler . Velg Kompleks referanse , og velg referanseelektrodene basert på bildet som ble tatt og notater som ble gjort under eksperimentet (dvs. de elektrodene som ikke er under vev). For å søke og sjekke dette, trykk utforsk før du fortsetter.
    5. Gå til EAP-filterfanen og bruk et 2. ordre høyt pass Butterworth-filter (200 Hz avskåret) for å fjerne LFP-aktivitet.
    6. Gå til LFP-filterfanen og bruk et 2.-ordens båndpass Butterworth-filter (deltafrekvenser på 0,5-4 Hz) for å fjerne EAP-aktivitet.
    7. Gå til EAP-detektorfanen , og velg Automatisk terskel. Merk av for Rising og Falling edge , og sett Dead time til 0,5 ms.
    8. Angi positive og negative terskler basert på dataene. Inspiser dataene ved å gå tilbake til rådataanalysatorskjermen , flytte tidsmarkøren og deretter gå tilbake til EAP-detektorfanen og trykke utforsk. Gjenta til du er fornøyd med at den angitte deteksjonsterskelen fanger opp EAP-er uten å fange opp støy / ikke-fysiologisk aktivitet. Bruk referanseelektrodene til å identifisere støy/ikke-fysiologisk aktivitet.
      MERK: Det er nødvendig å sikre at et minimalt antall EAP-er oppdages i referanseelektroder der fysiologisk aktivitet ikke vil forekomme. Imidlertid kan ganske små avvik i baseline feilaktig oppdages som EAPs. Dette er mens du fortsatt tar sikte på å maksimere antall virkelige hendelser oppdaget i de aktive elektrodene.
    9. Gå til kategorien LFP-detektor , velg Manuell terskel, merk av for Stigende og Fallende kant , og sett Dødtid til 3 ms.
    10. Gjenta trinn 2.1.8 for én elektrode ved å velge en elektrode med LFP-aktivitet. Når du er fornøyd, velger du Bruk på alle , da terskler bare vil bli brukt på en enkelt elektrode når du utfører manuell tersklering.
    11. Når du undersøker LFP-data i Detektor-fanen , noterer du deg maksimalt antall terskeloverganger for den ene LFP-bølgeformen og maksimal tidsseparasjon av terskeloverganger for den ene LFP-bølgeformen for bruk i senere analyse.
    12. Trykk på Start analyse.
    13. Når analysen er fullført, går du til kategorien EAP-analysator og eksporterer dataene. Gjør det samme på LFP-analysatorfanen .
    14. Gjenta denne prosessen for alle andre filer fra samme stykke.
    15. Etter dataeksport konverterer du filene til xlsx-format slik at de kan leses av programmeringsskriptet som brukes. Navngi filene i henhold til følgende konvensjon for det angitte skriptet for å lese dem: eksperimentnavn (f.eks. eksempeldata) - stykkenummer (f.eks. S1) - opptaksnummer (f.eks. R1) - aktivitetstype (f.eks. pigger eller SP-er, tilsvarende henholdsvis EAP-er eller LFP-er).
      MERK: EAP-analysen beskrevet her behandler spiking fra individuelle kanaler som en enkelt populasjon, selv om denne aktiviteten vanligvis vil oppstå fra flere nevroner i nærheten av opptakselektroden. Hvis antall nevroner som bidrar til EAPs i en kanal er ønskelig, kan multispike sorteringsteknikker beskrevet andre steder brukes til å skille forskjellige populasjoner av pigger basert på bølgeformegenskaper28.

Figure 3
Figur 3: Oppsett av dataregistrerings- og analyseverktøy og eksempelmikroelektrodematriseopptak som viser ekstracellulært handlingspotensial og lokale feltpotensiale bølgeformer. (A) Skjematisk viser forhåndskonfigurerte opptaksmalerbrukt for innsamling av MEA-data. Ved å koble sammen MEA2100 og opptaksverktøyet (headstage/forsterker) kan dataene navngis og lagres. Fire eksempelspor av rådata (høyre, 5-minutters epoker) ble samlet inn av en MEA-kanal som viste aktivitet ved baseline, 12 minutter etter 4-AP-påføring, ytterligere 15 minutter etter etablert 4-AP-aktivitet og etter badpåføring av TTX (1 μM). Merk at tillegg av 4-AP (andre spor) gir en klar økning i bakgrunnsstøy og EAP / LFP-aktivitet. Det er viktig at aktiviteten forblir relativt stabil i minst 15 minutter etter at 4-AP-indusert aktivitet er etablert (tredje spor). Tilsetning av TTX (1 μM) avskaffer all aktivitet (bunnspor). (B) Skjematisk (venstre) viser analysatorprogramvarekonfigurasjon for dataanalyse. Raw Data Explorer-verktøyet brukes til å importere opptak som er samlet inn av opptaksprogramvare. Disse dataene kjøres deretter gjennom et krysskanalfilterverktøy som trekker de valgte referanseelektrodene fra andre elektroder for å fjerne bakgrunnsstøy. Data går gjennom EAP-filteret og LFP-filterverktøyene for å optimalisere signal-til-støy-relasjoner for hver bølgeform. Etter dette trinnet går EAP-banedataene inn i EAP-detektorverktøyet, der terskler angis. EAP-er oppdages og sendes deretter til EAP-analysatorverktøyet der ventetidene for hver hendelse registreres og eksporteres som en txt. fil. En identisk arbeidsflyt oppstår for LFP-data ved hjelp av et tilsvarende LFP-verktøysett. Høyre spor viser data fra en enkelt MEA-kanal som inneholder forskjellige ekstracellulære bølgeformer. Plassering av EAP- og LFP-signaler er uthevet i "telle rastere" ovenfor. Nedre spor er epoker fra øvre opptak (betegnet med røde søyler) som viser bølgeformer på en utvidet tidsskala, inkludert forskjellige LFP-signaler (merk mangfoldet av utseende) og individuelle ekstracellulære EAPs (røde sirkler). Merk at LFP / EAP bølgeform og polaritet varierer i forhold til antall nevroner som produserer disse signalene, deres nærhet til opptakselektroden og deres plassering i forhold til de nærliggende elektrodene. Forkortelser: MEA = mikroelektrode array; EAP = ekstracellulært handlingspotensial; LFP = lokalt feltpotensial; 4-AP = 4-aminopyridin; TTX = tetrodotoksin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Synkronitet analyse
    MERK: Synkronitet, eller antall "sammenfallende" hendelser mellom to elektroder, ble bestemt ved hjelp av tilfeldighetskriteriet innenfor A-SPIKE-synkroniseringsmetoden skissert av Satuvuori et al. 29. Skriptet som brukes her sammenligner bare elektroder ved siden av hverandre for effektivitet (dvs. horisontale, vertikale og diagonale naboer); Skriptet kan imidlertid skrives om for å sammenligne alle elektroder om nødvendig.
    1. Utfør dataanalyse ved hjelp av et egendefinert programmeringsskript, som trekker ut latens tidsstempler for hver elektrode fra .xlsx filer.
      MERK: Dette kan gjøres manuelt.
    2. I trinn 2.1.11 registrerer du maksimalt antall terskeloverganger og maksimal tidsseparasjon av terskeloverganger for den ene LFP-bølgeformen. Endre skriptet for å legge inn disse LFP-definerende parameterne for hvert stykke før du kjører skriptet.
      MERK: Terskelverdier som tidligere er utført i analyseprogramvare, fanger tydelig opp EAP-er som én enkelt hendelse. LFP-er består imidlertid av et variabelt antall topper avhengig av formen på bølgeformen og det påfølgende antall terskeloverganger av den ene hendelsen.
    3. Endre skriptet for å legge inn elektrodene av interesse før analyse.
    4. For å bestemme synkronitet (definert i skriptet ved modifiserbare tidsrammer for synkron aktivitet som skal forekomme innenfor), separer og analyser de ekstraherte latensene for å oppdage sammenfallende hendelser.
      MERK: Skriptet gjør det mulig å angi maksimal tid mellom sammenfallende hendelser. Disse er satt til 20 ms for EAPs og 200 ms for LFP-er.
    5. Kjør skriptet for å trekke ut tidsstempler for ventetid.
      MERK: den .xlsx utdatafilen inneholder tolkninger av latensdata, som er EAP- og LFP-tellinger, frekvenser og sammenfallende hendelsesantall for individuelle elektroder og hele skiver. Disse dataene brukes til å vurdere frekvens, EAP / LFP-tellinger, antall aktive elektroder, antall sammenfallende hendelser, antall koblede elektroder og gjennomsnittsstyrken til disse koblingene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Modell av nettverksaktivitet i ryggmargens ryggmargshorn
Påføring av 4-AP induserer pålitelig synkron rytmisk aktivitet i ryggmargen DH. Slik aktivitet presenterer som økte EAPs og LFP-er. Det senere signalet er en lavfrekvent bølgeform, som tidligere er beskrevet i MEA-opptak30. Endringer i EAP- og/eller LFP-aktivitet etter legemiddelpåføring gjenspeiler endret nevral aktivitet. Eksempler på EAPs og LFP-er er vist i figur 3B og figur 4. Fokuset her er på følgende parametere eller egenskaper ved EAP / LFP-dataene: frekvens, totalt antall, aktive elektrodetall, synkronitet som karakterisert ved antall sammenfallende hendelser oppdaget over flere elektroder, antall koblede tilstøtende elektroder og styrken av koblinger mellom tilstøtende elektroder. Representative resultater er vist i tabell 3 og figur 3, figur 4, figur 5, figur 6, figur 7 og figur 8. De viser en signifikant økning i alle parametrene målt (alle p<0,001 ved paret t-test eller Wilcoxon Signed-Rank ikke-parametrisk ekvivalent test) for både EAPs (figur 5 og figur 6) og LFP -er (figur 7 og figur 8) etter 4-AP-stimulering og deretter relativ stabilitet for resten av opptakene. Data ble testet for normalitet før statistisk analyse. Oppsummert induserer 4-AP EAP- og LFP-aktivitet i ryggmargen DH, og ulike funksjoner i dataene kan trekkes ut fra MEA-opptakene. Aktiviteten er reproduserbar, og mye av aktiviteten, spesielt for LFP-er, er rytmisk og synkron.

Aktivitet Feature Grunnlinje 4-aminopyridin Betydelig forskjell
Ekstracellulære handlingspotensialer (EAPs)
Frekvens 0,07 ± 0,01 0,88 ± 0,09 p<0.001
Totalt antall pigger 261,41 ± 70,62 3289. 57 ± 484,38 p<0.001
Antall aktive elektroder 2,36 ± 0,34 8,95 ± 0,68 p<0.001
Antall sammenfallende pigger 9.26 ± 4.01 966,94 ± 189,21 p<0.001
Antall koblede elektroder 2,03 ± 0,42 24.06 ± 1.96 p<0.001
Styrken av koblinger mellom elektroder 1,97 ± 0,58 29.13 ± 4.60 p<0.001
Lokale feltpotensialer (LFP-er)
Frekvens 0,00 ± 0,00 0,28 ± 0,03 p<0.001
Totalt antall pigger 4,79 ± 0,82 688,47 ± 121,16 p<0.001
Antall aktive elektroder 0,41 ± 0,16 7,64 ± 0,73 p<0.001
Antall sammenfallende pigger 0,43 ± 0,23 108.06 ± 278.22 p<0.001
Antall koblede elektroder 0,24 ± 0,15 22,91 ± 2,46 p<0.001
Styrken av koblinger mellom elektroder 0,34 ± 0,19 29.20 ± 3.59 p<0.001

Tabell 3: 4-aminopyridin-indusert aktivitet. Alt presentert som midler ± SEM.

Figure 4
Figur 4: Eksempel på baseline ekstracellulær handlingspotensialaktivitet. Paneler viser EAP-aktivitet (opptak er fra forskjellige skiver). De fleste elektrodene i et gitt skiveopptak viste ikke baseline EAP-aktivitet (øvre panel). Lavfrekvente sporadiske EAPs ble av og til observert ved baseline, potensielt inneholdende flere piggbølgeformer (midtpanel). Høyfrekvent EAP-aktivitet ble sjelden observert i opptak ved baseline (nedre panel). Innfelt viser individuelle EAPer fra tilsvarende opptak på en utvidet tidsskala. Forkortelse: EAP = ekstracellulært handlingspotensial. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Stykkeretning
DH-kretsene aktivert av 4-AP er koblet i alle tre dimensjoner. Skiveorientering er derfor en viktig faktor for in vitro-preparater . Sagittal eller horisontal kutting kan være fortrinnsrett for å observere intersegmental signalering, mens tverrgående skiver bedre bevarer mediolateral og dorsoventral tilkobling. Gitt disse hensynene, kan man se at 4-AP-stimulering induserer lignende rytmisk aktivitet i SDH, uavhengig av skiveorientering (se figur 9).

Langsiktig stabilitet av 4-AP indusert aktivitet
Stabiliteten av 4-AP-indusert aktivitet er åpenbart avgjørende når man studerer effekten av anvendte stoffer. Derfor ble stabiliteten til 4-AP-induserte aktivitetsparametere karakterisert, og dette er presentert i figur 5, figur 6, figur 7 og figur 8 og tabell 4. Alle aktivitetskarakteristikker, pluss sammenfallet av aktivitet for LFP-er, var stabile basert på likheten mellom 4-AP-indusert aktivitet ved 12 min etter 4-AP-påføring og 15 minutter senere (p>0,05). Andre LFP-synkronitetsegenskaper, antall koblede tilstøtende elektroder og koblingsstyrke mellom tilstøtende elektroder ble redusert over 15 minutter (henholdsvis p = 0,016 og p = 0,033), selv om forskjellen var beskjeden. Denne gradvise endringen kan lett skilles fra de mer umiddelbare virkningene av et testmedikament under farmakologiske studier (se nedenfor). Data ble testet for normalfordeling før statistiske sammenligninger og deretter vurdert ved hjelp av parvise t-tester eller ikke-parametriske Wilcoxon Signed-Rank-tester etter behov.

Aktivitet Feature 4-aminopyridin 4-Aminopyridin (15 min) Betydelig forskjell
Ekstracellulære handlingspotensialer (EAPs)
Frekvens 0,8 ± 0,13 0,85 ± 0,10 s>0.05 (ingen dif.)
Totalt antall pigger 2706,36 ± 510,96 2838.09 ± 447.73 s>0.05 (ingen dif.)
Antall aktive elektroder 9,32 ± 0,70 10.09 ± 0.56 s>0.05 (ingen dif.)
Antall sammenfallende pigger 1037,63 ± 306,84 1013.09 ± 269.80 s>0.05 (ingen dif.)
Antall koblede elektroder 22.00 ± 3.37 22.41 ± 2.56 s>0.05 (ingen dif.)
Styrken av koblinger mellom elektroder 30,44 ± 6,27 31,88 ± 7,68 s>0.05 (ingen dif.)
Lokale feltpotensialer (LFP-er)
Frekvens 0,25 ± 0,03 0,17 ± 0,03 s>0.05 (ingen dif.)
Totalt antall pigger 792,32 ± 155,83 546,32 ± 120,93 s>0.05 (ingen dif.)
Antall aktive elektroder 9,50 ± 1,11 7,86 ± 1,00 s>0.05 (ingen dif.)
Antall sammenfallende pigger 1631,27 ± 734,77 1073,00 ± 490,85 s>0.05 (ingen dif.)
Antall koblede elektroder 26,68 ± 4,58 20,95 ± 3,68 p<0.05
Styrken av koblinger mellom elektroder 33.35 ± 6.19 24,81 ± 5,41 p<0.05

Tabell 4: 4-Aminopyridin aktivitetsstabilitet. Alt presentert som midler ± SEM.

Farmakologisk undersøkelse av aktivitetsegenskaper
For å demonstrere at MEA-registrert 4-AP-indusert aktivitet lett er mottagelig for farmakologiske manipulasjoner, ble avhengigheten av disse signalene på handlingspotensialutladning fremhevet. Badapplikasjon av spenningsstyrt natriumkanalantagonist, tetrodotoksin (TTX, 1 μM), avskaffet både EAP- og LFP-aktivitet, og bekreftet spikeavhengighet av disse signalene. Eksempelspor er vist i figur 3A. Dette resultatet gir også et eksempel på nytten av preparatet for fremtidige farmakologiske undersøkelser, hvor nye forbindelser og etablerte analgetika kan vurderes for deres virkning i aktiverte spinale DH-kretser. Til slutt, for å kaste ytterligere lys over relevansen av 4-AP-aktivering av DH-nettverkene, ble en alternativ tilnærming prøvd for å oppnå beskjeden depolarisering av DH-nettverket. I denne tilnærmingen ble en forhøyet kalium (4,5 mM) aCSF-løsning (tabell 1) påført og vist å fremkalle en lignende DH-respons på 4-AP-stimulering. Denne manipulasjonen fremkalte LFP-aktivitet som inneholdt de samme synkrone egenskapene som 4-AP-induserte responser (figur 10), noe som tyder på en lignende mekanisme og underliggende kretser.

Figure 5
Figur 5: Eksempel 4-aminopyridinindusert ekstracellulær virkningspotensialaktivitet. (A) Rasterplott viser EAP-aktivitet fra aktive kanaler, oppdaget ved baseline (øvre) og to tidspunkter (12 min - etablert og 27 min) etter badtilsetning av 4-AP (midtre og nedre). Vertikale blå vinduer fremhever perioder med synkron aktivitet (nær latens) i mer enn 5 opptakselektroder. (B) Paneler oppsummerer EAP-aktivitetskartanalyse av MEA-data. Venstre skjematisk viser retningen til ryggmargsskiven i forhold til elektroderaden. Midtre venstre panel oppsummerer aktivitet ved baseline (aktive elektroder farget rød) og EAP-frekvens indikert med hvit skyggelegging rundt aktive elektroder (skyggeintensitet betegner økt aktivitet). Midtre høyre panel viser aktivitet i samme skive etter 12 min med 4-AP eksponering. Merk at antall aktive elektroder (rød) økte sammen med EAP-frekvens. I tillegg indikeres synkronisering mellom tilstøtende elektroder med røde forbindelseslinjer, noe som gir et nettverkskart over aktivitet (linjetykkelse angir graden av EAP-likhet mellom elektroder). Høyre panel viser aktivitet i samme skive etter ytterligere 15 minutter med 4-AP eksponering. Merk at antall aktive elektroder (rød), grad av EAP-aktivitet (hvit) og nettverksstruktur (røde linjer) har holdt seg stabil i denne perioden. Forkortelser: 4-AP = 4-aminopyridin; EAP = ekstracellulært handlingspotensial; MEA = mikroelektrode array. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Gruppedatasammendrag av 4-aminopyridinindusert ekstracellulær handlingspotensialaktivitet. (A-F) Gruppedataplott som oppsummerer EAP-egenskaper fra flere eksperimenter som er identiske med EAP-dataene presentert i figur 4 (data også oppsummert i tabell 3 og tabell 4). EAP-frekvens (A), antall (B), sammenfallende hendelser (C), aktive elektroder (D), koblede elektroder (E) og gjennomsnittlig koblingsstyrke (F) steg etter badpåføring av 4-AP og var deretter stabile i 15 minutter etter etablering av 4-AP-indusert aktivitet. Data er fra 11 eksperimenter (data i rødt er fra eksperimentet i figur 5). Forkortelser: 4-AP = 4-aminopyridin; EAP = ekstracellulært handlingspotensial. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: 4-Aminopyridinindusert lokal feltpotensialaktivitet. Data er presentert som i figur 5 med unntak av LFP-data. (A) Rasterplott viser LFP-aktivitet fra flere kanaler, oppdaget ved baseline (øvre) og to tidspunkter (12 min - etablert og 27 min) etter badtilsetning av 4-AP (midtre og nedre). Vertikale blå vinduer fremhever perioder med synkron aktivitet (nær latens) i mer enn 5 opptakselektroder. (B) Paneler oppsummerer LFP-aktivitetskartanalyse av MEA-data. Venstre skjematisk viser retningen til ryggmargsskiven i forhold til elektroderaden. Midtre venstre panel oppsummerer aktivitet ved baseline (aktive elektroder farget rød), med minimal LFP-frekvens indikert med hvit skyggelegging rundt aktive elektroder (skyggeintensitet betegner økt aktivitet). Midtre høyre panel viser aktivitet i samme skive etter 12 min med 4-AP eksponering. Antall aktive elektroder (rød) og LFP-frekvens økes betydelig. I tillegg viser synkronisering mellom tilstøtende elektroder (røde forbindelseslinjer) et sterkt nettverkskart over LFP-aktivitet (linjetykkelse angir graden av likhet mellom elektroder). Høyre panel viser LFP-aktivitet i samme skive etter ytterligere 15 minutter med 4-AP-eksponering. Merk at antall aktive elektroder (rød), grad av LFP-aktivitet (hvit) og nettverksstruktur (røde linjer) er relativt stabile i denne perioden. Forkortelser: 4-AP = 4-aminopyridin; MEA = mikroelektrode array; LFP = lokalt feltpotensial. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Sammendrag av gruppedata av 4-aminopyridinindusert lokal feltpotensialaktivitet. (A-F) Gruppedataplott som oppsummerer LFP-egenskaper fra flere eksperimenter som er identiske med EAP-dataene presentert i figur 7 (data også oppsummert i tabell 3 og tabell 4). LFP-frekvens (A), antall (B), sammenfallende hendelser (C) og aktive elektroder (D) var stabile i 15 minutter etter at 4-AP-effekten nådde toppen (data i rødt er fra eksperimentet i figur 7). Koblede elektroder (E) og gjennomsnittlig LFP-koblingsstyrke (F) ble imidlertid redusert over tid (begge p<0,05). Data er fra 11 eksperimenter (data i rødt er fra eksperimentet i figur 7). Forkortelser: 4-AP = 4-aminopyridin; LFP = lokalt feltpotensial. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: 4-Aminopyridinindusert ekstracellulært aksjonspotensial og lokal feltpotensialaktivitet i sagittale og horisontale skiver. Paneler oppsummerer EAP- og LFP-aktivitet i MEA-nettverkskartanalyse av 4-AP-indusert signalering i sagittale (A) og horisontale (B) ryggmargsskiver. Skjemaer (helt til venstre) viser retningen til ryggmargsskiver i forhold til rektangulære elektroderader. Venstre nettverkskart viser baseline EAP- og LFP-aktivitet i sagittale (A) og horisontale (B) ryggmargsskiver (aktive elektroder er røde, frekvens indikert ved hvit skyggeintensitet og synkronisering mellom tilstøtende elektroder ved røde forbindelseslinjer med tykkelse som angir graden av synkronisering). Høyre nettverkskart viser EAP- og LFP-aktivitet i samme skive etter 12 minutter med 4-AP-eksponering i sagittale (A) og horisontale (B) ryggmargsskiver. Legg merke til den betydelige økningen i antall aktive elektroder, aktivitetsfrekvens og synkronisering av disse signalene etter 4-AP-eksponering, og avmaskerer nettverk i begge skiveretninger. Forkortelser: MEA = mikroelektrode array; EAP = ekstracellulært handlingspotensial; LFP = lokalt feltpotensial; 4-AP = 4-aminopyridin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 10
Figur 10: Forhøyet kalium (høy K+)-indusert lokal feltpotensialaktivitet. Paneler oppsummerer høy K+ (4,5 mM) aCSF-indusert LFP-aktivitet. (A) Eksempelspor fra en MEA-kanal ved baseline og etter badtilsetning av høy K+ aCSF (5-min epoker). Økning av K+- konsentrasjon ga klar LFP-aktivitet som var fraværende ved baseline, tilsvarende den som ble sett ved 4-AP-påføring (figur 3). Innfelt viser en LFP-bølgeform på en utvidet tidsskala. (B) Paneler oppsummerer LFP-nettverksaktivitet indusert av høy K+ aCSF. Venstre skjematisk viser orientering av ryggmargsskiver i forhold til firkantede elektroderader. Nettverkskart sammenligner baseline og høy K+-fremkalt LFP-aktivitet (aktive elektroder rød, frekvens indikert med hvit skyggeintensitet og synkronisering mellom tilstøtende elektroder ved røde forbindelseslinjer med tykkelse som angir grad av synkronisering). Legg merke til den betydelige økningen i antall aktive elektroder, aktivitetsfrekvens og synkronisering av disse signalene etter høy K + aCSF-eksponering, og demaskerer det underliggende nettverket på samme måte som 4-AP. Forkortelser: aCSF = kunstig cerebrospinalvæske; MEA = mikroelektrode array; EAP = ekstracellulært handlingspotensial; LFP = lokalt feltpotensial; 4-AP = 4-aminopyridin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Til tross for betydningen av spinal DH i nociceptiv signalering, behandling og de resulterende atferdsmessige og følelsesmessige responsene som karakteriserer smerte, forblir kretsene i denne regionen dårlig forstått. En sentral utfordring i å undersøke dette problemet har vært mangfoldet av nevronpopulasjoner som utgjør disse kretsene 6,31,32. Nylige fremskritt innen transgene teknologier, ledet av optogenetikk og kjemiogenetikk, begynner å avdekke disse viktige forbindelsene og definere mikrokretsene som behandler sensorisk informasjon 1,2,3,4,8,9,10,11,12,13,14 . Å forene hvordan disse mikrokretsene kommer sammen for å forme aktivitet i større nettverk av DH-nevroner, er fortsatt utfordrende, spesielt for å utvikle nye og mer effektive smertebehandlinger. Her beskrives en funksjonell modell for DH-aktivitet overvåket på MEAer og bruk av 4-AP-stimulert rytmisk aktivitet for å studere bredere nettverkstilkobling. Denne modellen avslører lokal ekstracellulær spiking (EAPs) og større nettverksbaserte LFP-er, som er avhengige av handlingspotensialutladning og kan brukes til å kartlegge endringer i nettverksegenskaper. Ved å kombinere bruken av MEAer for å lette kretsundersøkelse og 4-AP for å avdekke de underliggende kretsene, gjør dette preparatet at DH-kretsfunksjonen kan studeres på regionalt eller "makroskopisk" nivå.

Fordelene med MEA / 4-AP ryggmargsskivemodellen inkluderer tett eksperimentell kontroll av et in vitro-preparat , som er egnet til detaljert farmakologisk undersøkelse og gir høy romlig og tidsmessig oppløsning av nevrale aktivitetsindividuelle, dvs. EAPs og LFP-er over en stor vevsregion og flerkanalsdata som kan vurdere signalering på tvers av nettverk og regioner. Det er viktig at 4-AP-indusert rytmisk aktivitet er pålitelig, reproduserbar og kan studeres i forskjellige ryggmargsskiveretninger. Dette preparatet bidrar til å bygge bro over gapet mellom enkeltcelle- og heldyrundersøkelser og kan avsløre endringer i disse kretsene under både normale og patologiske forhold. Effekten av ulike legemidler på nettverksaktivitet kan også bestemmes. Dermed kan denne plattformen fungere som et screeningsverktøy for å undersøke handlingene til eksisterende og nye analgetika på DH-kretser.

Det er flere kritiske trinn i denne protokollen. For det første er forsiktig vevsforberedelse nøkkelen til å produsere skiver som er levedyktige for eksperimenter og følsomme for 4-AP, uavhengig av skiveorientering. En rekke ressurser er fremhevet her som gir detaljert informasjon og feilsøkingsråd. Kort sagt, nøyaktighet i å lage løsninger, rask, men grundig disseksjon av ryggmargen, optimaliserte skiveparametere for å minimere vevskompresjon og skade, og forsiktighet ved overføring av skiver når som helst er alle viktige faktorer i forberedelsesfasen. Forsiktig håndtering av MEAer, spesielt når de er i nærheten av elektrodene, er nøkkelen til å opprettholde funksjonen til disse komponentene. Den optimale posisjonen til DH over maksimalt antall MEA-elektroder er viktig for å øke opptaksutbyttet for hvert eksperiment. Når du bruker 3D MEAer, er det nødvendig med mer forsiktighet og praksis, spesielt når du plasserer og fjerner skiver. Det er lett å dra vevet over utstående MEA-elektroder og kompromittere fremtidig bruk.

Det er noen forbehold for tilnærmingen som er beskrevet her. I motsetning til i enkeltcelleopptak, hvor identiteten til nevroner som studeres kan bestemmes ved hjelp av enten genetisk merking eller post hoc immunmerking, kan den nøyaktige kilden til de elektriske signalene som oppdages av MEAer ikke bestemmes. En annen utfordring er nivået på baselineaktivitet i ryggmargsskiver. Selv om noen rapporter beskriver tonisk aktive DH-nevroner ved baseline, er det siste arbeidet i ungt neonatalt vev33,34. Videre registreres tonisk aktivitet rapportert i voksent vev vanligvis ved hjelp av en søkestrategi der elektroder er avanserte for først å identifisere og deretter studere denne aktiviteten35. Når en upartisk prøvetakingsmetode brukes, etablerer opptak før vurdering av aktivitet, viser mindre enn 20% av voksne DH-nevroner pågående spiking (28/150-opptak), og regelmessig utslipp ble bare observert i 2% av disse cellene (3/150)36.

Gitt dette forholdet og elektrodenes faste natur i forhold til en vevsskive, er det ikke overraskende at få MEA-elektroder (~ 2 elektroder / skive i disse MEAene) viser aktivitet ved baseline. Denne mangelen på aktivitet er den primære grunnen til at metoden beskrevet her innebærer å stimulere skiver med 4-AP for å forbedre EAPs og fremkalt LFP-aktivitet. Denne tilnærmingen er basert på bruk av 4-AP for å aktivere rytmisk kretsaktivitet i mange in vitro-preparater, fra å studere epileptiforme mekanismer i cortex og hippocampus til fiktiv lokomotorisk aktivitet i det ventrale hornet i ryggmargen 37,38,39. En omfattende litteratur fremhever også at 4-AP induserer aktivitet begrenset til overfladiske DH-kretser i spinalskiver og avhenger av eksitatorisk og hemmende synaptisk overføring samt elektriske synapser 20,21,22. Videre gir in vivo 4-AP-administrasjon en doseavhengig økning i DH-nevronens mottakelige felt uten å endre responser på gradert stimulering i den sentrale mottakelige sonen eller forårsake degenererte responser24. Endelig kan det ses at en beskjeden depolarisering av disse kretsene ved å heve ekstracellulær kaliumionkonsentrasjon også gir sammenlignbar LFP-aktivitet. Sammen støtter disse observasjonene synspunktet om at 4-AP avdekker funksjonelt relevante nettverk innenfor overfladisk DH som kan studeres med MEAer. Endelig er den eksakte kilden til LFP-aktivitet uklar, selv om disse bølgeformene antas å representere en summering av aktivitet oppdaget fra flere nevroner som omgir en elektrode. De kan forholde seg til eller skyldes sprengningsaktivitet i nevroner eller tilsvare synaptiske potensialer30. Uavhengig av deres opprinnelse, kan egenskapene til LFP-er sammenlignes innenfor og mellom skiver (flere opptak / legemiddelapplikasjoner), noe som gir en verdifull avlesning av krets- og nettverksfunksjon.

Naturen av in vitro skivepreparater garanterer også vurdering, med potensiell forstyrrelse av nevronkretser og skade på celler på skiveoverflaten. Til tross for dette gir kutting av vevet mer direkte elektrisk tilgang til de relevante DH-kretsene og uavbrutt farmakologisk tilgang. Disse eksperimentelle fordelene og ulempene bør vurderes nøye, med vekt på viktigheten av å vurdere skiveorientering for maksimalt å bevare tilkoblingen i interessenettverkene. For de aller fleste data som presenteres i dette papiret, presenteres medial-lateral spredning av aktivitet i dorsalhornet og den indre tilkoblingen til nevronene i denne regionen. For å undersøke spredning av rostro-kaudal aktivitet, opprettholder bruk av sagittale eller horisontale skiver fortrinnsvis tilkobling mellom spinalsegmenter, som fremhevet i figur 9.

I tillegg er det uunngåelig at snitting av ryggmargen vil resultere i en viss grad av skade på overflaten av skiver. Minimering av denne skaden kommer tilbake til forsiktig forberedelse av vev, skiveparametere - inkludert langsom hastighet og høyfrekvente bladoscillasjoner - og løsninger og forhold som er nevrobeskyttende under denne prosessen. En detaljert vurdering av nytten av ulike tilstander for ryggmargsskivehelse er publisert tidligere40. Til tross for den potensielle effekten av skivehelse på MEA-registreringer, sikrer intern konsistens i skiveprepareringsprosedyrer at denne faktoren påvirker resultatene på tvers av et datasett likt. Det skal også bemerkes at MEA-elektroder antas å plukke opp signaler som oppstår omtrent 30-100 μm fra aktivitetskilden. Ettersom den skadede skiveoverflaten sannsynligvis vil spenne over det øverste cellelaget, omtrent 15-30 μm, kan effekten av skiverelatert skade på MEA-opptak administreres og reduseres for fortsatt å gi verdifulle datasett og innsikt i DH-nettverksaktivitet15,41.

Oppsummert gir MEA/4-AP ryggmargsskivetilnærmingen beskrevet her en plattform for å forstå tilkoblingen av DH-kretser og hvordan nettverkene de danner driver ryggmargsbehandling. Det er også potensial for ytterligere metodologisk ekspansjon når det gjelder analyseparametere, nettverksstimuleringskilde og dens kapasitet til å bli brukt som en plattform for farmakologisk screening eller bruk med modeller av patologisk smerte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av National Health and Medical Research Council (NHMRC) i Australia (tilskudd 631000, 1043933, 1144638 og 1184974 til B.A.G. og R.J.C.) og Hunter Medical Research Institute (tilskudd til B.A.G. og R.J.C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-aminopyridine Sigma-Aldrich 275875-5G
100% ethanol Thermo Fisher AJA214-2.5LPL
CaCl2 1M Banksia Scientific 0430/1L
Carbonox (Carbogen - 95% O2, 5% CO2) Coregas 219122
Curved long handle spring scissors Fine Science Tools 15015-11
Custom made air interface incubation chamber
Foetal bovine serum Thermo Fisher 10091130
Forceps Dumont #5 Fine Science Tools 11251-30
Glucose Thermo Fisher AJA783-500G
Horse serum Thermo Fisher 16050130
Inverted microscope Zeiss Axiovert10
KCl Thermo Fisher AJA383-500G
Ketamine Ceva KETALAB04
Large surgical scissors Fine Science Tools 14007-14
Loctite 454 Instant Adhesive Bolts and Industrial Supplies L4543G
MATLAB MathWorks R2018b
MEAs, 3-Dimensional Multichannel Systems 60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in an 8x8 square grid. Electrodes are 12 µm in diameter, 40 µm (100/12/40) or 50 µm (200/12/50) high and equidistantly spaced 100 µm (100/12/40) or 200 µm (200/12/50) apart.
MEA headstage Multichannel Systems MEA2100-HS60
MEA interface board Multichannel Systems MCS-IFB 3.0 Multiboot
MEA net Multichannel Systems ALA HSG-MEA-5BD
MEA perfusion system Multichannel Systems PPS2
MEAs, Planar Multichannel Systems 60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in either a 8x8 square grid (200/30) or a 6x10 rectangular grid (500/30). Electrodes are 30 µm in diameter and equidistantly spaced 200 µm (200/30) or 500 µm (500/30) apart.
MgCl2 Thermo Fisher AJA296-500G
Microscope camera Motic Moticam X Wi-Fi
Multi Channel Analyser software Multichannel Systems V 2.17.4
Multi Channel Experimenter software Multichannel Systems V 2.17.4
NaCl Thermo Fisher AJA465-500G
NaHCO3 Thermo Fisher AJA475-500G
NaH2PO4 Thermo Fisher ACR207805000
Rongeurs Fine Science Tools 16021-14
Small spring scissors Fine Science Tools 91500-09
Small surgical scissors Fine Science Tools 14060-09
Sucrose Thermo Fisher AJA530-500G
Superglue cyanoacrylate adhesive
Tetrodotoxin Abcam AB120055
Vibration isolation table Newport VH3048W-OPT
Vibrating microtome Leica VT1200 S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, K. M., et al. Calretinin positive neurons form an excitatory amplifier network in the spinal cord dorsal horn. eLife. 8, 49190 (2019).
  2. Smith, K. M., et al. Functional heterogeneity of calretinin-expressing neurons in the mouse superficial dorsal horn: implications for spinal pain processing. The Journal of physiology. 593 (19), 4319-4339 (2015).
  3. Boyle, K. A., et al. Defining a spinal microcircuit that gates myelinated afferent input: Implications for tactile allodynia. Cell Reports. 28 (2), 526-540 (2019).
  4. Browne, T. J., et al. Transgenic cross-referencing of inhibitory and excitatory interneuron populations to dissect neuronal heterogeneity in the dorsal horn. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 32 (2020).
  5. Graham, B. A., Hughes, D. I. Rewards, perils and pitfalls of untangling spinal pain circuits. Current Opinion in Physiology. 11, 35-41 (2019).
  6. Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
  7. Hughes, D. I., Todd, A. J. Central nervous system targets: inhibitory interneurons in the spinal cord. Neurotherapeutics. 17 (3), 874-885 (2020).
  8. Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
  9. Hachisuka, J., Chiang, M. C., Ross, S. E. Itch and neuropathis itch. Pain. 159 (3), 603 (2018).
  10. Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
  11. Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
  12. Cheng, L., et al. Identification of spinal circuits involved in touch-evoked dynamic mechanical pain. Nature neuroscience. 20 (6), 804-814 (2017).
  13. Peirs, C., et al. Mechanical allodynia circuitry in the dorsal horn is defined by the nature of the injury. Neuron. 109 (1), 73-90 (2021).
  14. Huang, J., et al. Circuit dissection of the role of somatostatin in itch and pain. Nature Neuroscience. 21 (5), 707-716 (2018).
  15. Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2015).
  16. Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
  17. Johnstone, A. F., et al. Microelectrode arrays: a physiologically based neurotoxicity testing platform for the 21st century. Neurotoxicology. 31 (4), 331-350 (2010).
  18. Stett, A., et al. Biological application of microelectrode arrays in drug discovery and basic research. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 377 (3), 486-495 (2003).
  19. Xu, L., et al. Trends and recent development of the microelectrode arrays (MEAs). Biosensors and Bioelectronics. 175 (1), 112854 (2020).
  20. Chapman, R. J., Cilia La Corte, P. F., Asghar, A. U. R., King, A. E. Network-based activity induced by 4-aminopyridine in rat dorsal horn in vitro is mediated by both chemical and electrical synapses. The Journal of Physiology. 587, Pt 11 2499-2510 (2009).
  21. Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. Epileptiform activity in rat spinal dorsal horn in vitro has common features with neuropathic pain. Pain. 105 (1-2), 327-338 (2003).
  22. Kay, C. W., Ursu, D., Sher, E., King, A. E. The role of Cx36 and Cx43 in 4-aminopyridine-induced rhythmic activity in the spinal nociceptive dorsal horn: an electrophysiological study in vitro. Physiological Reports. 4 (14), 12852 (2016).
  23. Jankowska, E., Lundberg, A., Rudomin, P., Sykova, E. Effects of 4-aminopyridine on synaptic transmission in the cat spinal cord. Brain Research. 240 (1), 117-129 (1982).
  24. Semba, K., Geller, H. M., Egger, M. D. 4-Aminopyridine induces expansion of cutaneous receptive fields of dorsal horn cells. Brain Research. 343 (2), 398-402 (1985).
  25. Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. Long-range oscillatory Ca2+ waves in rat spinal dorsal horn. European Journal of Neuroscience. 22 (8), 1967-1976 (2005).
  26. Egert, U., et al. A novel organotypic long-term culture of the rat hippocampus on substrate-integrated multielectrode arrays. Brain Research Protocols. 2 (4), 229-242 (1998).
  27. Thiebaud, P., De Rooij, N., Koudelka-Hep, M., Stoppini, L. Microelectrode arrays for electrophysiological monitoring of hippocampal organotypic slice cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 44 (11), 1159-1163 (1997).
  28. Rey, H. G., Pedreira, C., Quiroga, R. Q. Past, present and future of spike sorting techniques. Brain Research Bulletin. 119, 106-117 (2015).
  29. Satuvuori, E., et al. Measures of spike train synchrony for data with multiple time scales. Journal of Neuroscience Methods. 287, 25-38 (2017).
  30. Mendis, G. D. C., Morrisroe, E., Reid, C. A., Halgamuge, S. K., Petrou, S. Use of local field potentials of dissociated cultures grown on multi-electrode arrays for pharmacological assays. 38th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 952-956 (2016).
  31. Hughes, D. I., et al. Morphological, neurochemical and electrophysiological features of parvalbumin-expressing cells: a likely source of axo-axonic inputs in the mouse spinal dorsal horn. The Journal of Physiology. 590 (16), 3927-3951 (2012).
  32. Peirs, C., Seal, R. P. Neural circuits for pain: recent advances and current views. Science. 354 (6312), 578-584 (2016).
  33. Li, J., Baccei, M. L. Developmental regulation of membrane excitability in rat spinal lamina I projection neurons. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2604-2614 (2012).
  34. Li, J., Baccei, M. L. Pacemaker neurons within newborn spinal pain circuits. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9010-9022 (2011).
  35. Sandkühler, J., Eblen-Zajjur, A. Identification and characterization of rhythmic nociceptive and non-nociceptive spinal dorsal horn neurons in the rat. Neuroscience. 61 (4), 991-1006 (1994).
  36. Lucas-Romero, J., Rivera-Arconada, I., Roza, C., Lopez-Garcia, J. A. Origin and classification of spontaneous discharges in mouse superficial dorsal horn neurons. Scientific Reports. 8 (1), 9735-9735 (2018).
  37. Antonio, L., et al. L. al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration. Journal of Neuroscience Methods. 260, 33-44 (2016).
  38. Avoli, M., Jefferys, J. G. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).
  39. Taccola, G., Nistri, A. Low micromolar concentrations of 4-aminopyridine facilitate fictive locomotion expressed by the rat spinal cord in vitro. Neuroscience. 126 (2), 511-520 (2004).
  40. Mitra, P., Brownstone, R. M. An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse. Journal of Neurophysiology. 107 (2), 728-741 (2012).
  41. Egert, U., Heck, D., Aertsen, A. Two-dimensional monitoring of spiking networks in acute brain slices. Experimental Brain Research. 142 (2), 268-274 (2002).

Tags

Nevrovitenskap utgave 180
Registrering av nettverksaktivitet i spinale nociceptive kretser ved bruk av mikroelektrodearrayer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iredale, J. A., Stoddard, J. G.,… More

Iredale, J. A., Stoddard, J. G., Drury, H. R., Browne, T. J., Elton, A., Madden, J. F., Callister, R. J., Welsh, J. S., Graham, B. A. Recording Network Activity in Spinal Nociceptive Circuits Using Microelectrode Arrays. J. Vis. Exp. (180), e62920, doi:10.3791/62920 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter