На месте Гибридизация у личинок и молоди рыбок данио во время развития мезонефроса

Summary

Рыбка данио является важной моделью для понимания развития почек. Здесь протокол гибридизации in situ оптимизирован для обнаружения экспрессии генов у личинок рыбок данио и молоди во время развития мезонефроса.

Abstract

Рыбка данио образует две почечные структуры за свою жизнь. Пронефрос (эмбриональная почка) образуется во время эмбрионального развития и начинает функционировать через 2 дня после оплодотворения. Состоящий только из двух нефронов, пронефрос служит единственной почкой во время личиночной жизни, пока не потребуется больше функции почек из-за увеличения массы тела. Чтобы справиться с этой более высокой потребностью, мезонефрос (взрослая почка) начинает формироваться во время метаморфоза. Новые первичные нефроны сливаются с пронефрами и образуют соединенные просветы. Затем вторичные нефроны сливаются с первичными (и так далее), чтобы создать разветвленную сеть в мезонефросе. Подавляющее большинство исследований сосредоточено на пронефросах из-за простоты использования эмбрионов. Таким образом, необходимо разработать методы изучения более старых и крупных личинок и молоди рыб, чтобы лучше понять развитие мезонефроса. Здесь протокол гибридизации in situ для анализа экспрессии генов оптимизирован для проникновения зонда, промывки зондов и антител, а также отбеливания пигментов для лучшей визуализации мезонефроса. Трансгенная линия Tg(lhx1a-EGFP) используется для маркировки клеток-предшественников и дистальных канальцев зарождающихся нефронов. Этот протокол заполняет пробел в исследованиях мезонефроса. Это важная модель для понимания того, как новые ткани почек формируются и интегрируются с существующими нефронами и дают представление о регенеративной терапии.

Introduction

Эмбрион рыбки данио является важной моделью для изучения развития тканей из-за его небольшого размера, прозрачности, доступных инструментов и выживаемости без кормления в течение пяти ^дней1,2. Это в значительной степени способствовало пониманию развития почек и сохранения между рыбками данио и млекопитающими3,4,5. Почки играют важную роль в поддержании гомеостаза жидкости, фильтрации крови и выведении ^{отходов6}. Нефрон, функциональная единица почки, содержит фильтр крови, соединенный с длинным к....

Protocol

Использование личинок рыбок данио и молоди одобрено IUP IACUC (протокол No02-1920, No08-1920). Сведения о содержимом решения приведены в Таблице материалов.

1. Разведение личинок

ПРИМЕЧАНИЕ: Для поднятия личинок и молоди до стадии интереса потребуется до 21 дня и более.

1. Настройте взрослую рыбку данио на спаривание, добавив 1 самца и 1 самку рыбы в брачный резервуар ближе к вечеру после их последнего приема пищи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не все пары рыб будут спариваться. Начните с настройки 20 пар для определения скорости спаривания и соответствующей корректировки в будущих экспериментах.
<....

Results

Используя трансгенную линию Tg(lhx1a-EGFP), было продемонстрировано, что этот протокол гибридизации in situ эффективен при маркировке клеток-предшественников почек и различных нефроновых структур во время развития мезонефроса. Как и ожидалось, центральная нервная система также помечена в этой трансгенной линии (не показана). Исходный мезонефрический нефрон образуется примерно на 5,2 мм, дорсальный к пронефру (рисунок 2А), а дистальный каналец этого нефрона помечен

Discussion

Описанный здесь метод гибридизации in situ направлен на изучение развития мезонефроса. Однако его можно применять для изучения развития других тканей и органов во время метаморфоз, таких как кишечник, нервная система, чешуя и ^{пигментация14}. Зонды могут быть сгенерированы для эндогенных генов или флуоресцентных маркеров в трансгенных линиях.

Крайне важно, чтобы личинки оставались нетронутыми, чтобы наблюдать за органами и тканями в их родном контексте. Чтобы сох.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Антифлуоресцеиновое антитело	Roche/Sigma-Aldrich	11426338910
Отбеливающий раствор			0,8% KOH, 0,9% H2O2 в реагенте для
блокирования	Roche/Sigma-Aldrich	11096176001	Используйте для блокирующего раствора, приготовьте в соответствии с инструкцией производителя
Клеточный фильтр	Fisher Scientific	22-363-549	100 μ m
E3 среда			5 мМ NaCl, 0,33 мМ CaCl2, 0,33 мМ MgSO4, 0,17 мМ KCl, 0,0001% метиленовый синий
Манипулятор ресниц	Fisher Scientific	NC1083208	Использование для манипуляций с личинками
Фиксирующий раствор			4% параформальдегид, 1% ДМСО в PBS; нагревание при 65°С; C при встряхивании до растворения порошка, затем добавить ДМСО после его остывания
Синтез флуоресцеинового зонда	Roche/Sigma-Aldrich	11685619910
Стеклянный флакон	Fisher Scientific	03-338B
Инкапсуляция Hatchfry	Argent
Hyb- раствор			50% формамид, 5X SSC, 0,1% раствор
		Tween-20 Hyb+	HYB-, 5 мг/мл торула РНК, 50 мкг/мл гепарин
MAB (10X)			1 М малеиновая кислота, 1,5 М NaCl, pH 7,5
MABT			1X MAB, 0,1% Tween-20
Малеиновая кислота	Sigma-Aldrich	M0375
Параформальдегид	Sigma Aldrich	158127
PBS (10X)			8% NaCl, 0,2% KCl, 1,44% Na2HPO4, 0,24% KH2PO4
PBST			1X PBS, 0,1% Tween-20
PBST2			1X PBS, 0,2% Tween-20
Порошок корма			Смешайте по 2 г капсулы спирулины и вылупляющегося малька в 50 мл воды рыбной системы и хорошо встряхните
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P5568	Используйте для проникновения личинок
Раствор протеиназы K			20  μ г/мл, конечная конечная концентрация ДМСО 1% в
микродисперсном порошке спирулины	Argent
SSC (20X)			3 M NaCl, 0,3 М ацетата натрия безводный, pH 7, автоклав
SSCT (0,2X)	Разбавлен из 20X SSC,
SSCT (2X)	Разбавлен из 20X SSC,
Окрашивающий буфер			100 мМ Tris pH 9,5, 50 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 0,1% Tween-20
Окрашивающий раствор			200 мкм; г/мл йодонитротетразолия хлорида, 200 г/мкм; г/мл 5-Бромо-4-хлор-3-индолилфосфат динатриевая соль, в буфере для окрашивания
Остановочный раствор			1 мМ ЭДТА, pH 5,5, в PBST
Torula (дрожжи) РНК	Sigma-Aldrich	R6625
Трикаин	Sigma Aldrich	E10521	2%, pH 7
Буфер для промывки			50% формамид, 2X SSC, 0,1% Tween-20