Summary
Det nuvarande protokollet förklarar en metod för att mata bekämpningsmedelsförorenade proviant till larverna från de ensamma bina, Osmia excavata. Förfarandet undersöker bekämpningsmedlets ekotoxicitet till larverna hos de ensamma bina.
Abstract
Nuvarande ekologiska riskbedömningar av bekämpningsmedel på pollinatörer har i första hand endast beaktat laboratorieförhållanden. För larver av ensamma bin kan intag av proviant som är förorenat med bekämpningsmedel öka larvernas dödlighet, minska insamlingshastigheten och populationen av vuxna solitära bin under det närmaste året ur ett demografiskt perspektiv. Men det finns begränsade studier om effekterna av bekämpningsmedel på larverna av ensamma bin. Att förstå hur bekämpningsmedel påverkar larverna hos solitära bin bör därför betraktas som en integrerad del av bekämpningsmedlets ekologiska riskbedömning. Denna studie presenterar en metod för att utsätta larverna av ensamt bi, Osmia excavata, för dödliga eller subletala doser av bekämpningsmedel, spårning av larvviktökning, utvecklingstid, eclosionsförmåga och omvandling av livsmedelskonsumtionseffektivitet av intagen mat. För att visa effektiviteten av denna metod matades larverna av O. excavata med bestämmelser innehållande akuta dödliga och subletala doser av klorpyrifos. Därefter undersöktes ovanstående index för de behandlade larverna. Denna teknik hjälper till att förutsäga och mildra risken för bekämpningsmedel för pollinatorer.
Introduction
Pollinatörer spelar en avgörande roll i ekosystemtjänsterna i det moderna globala jordbruket. Medan honungsbin (Apis mellifera; Hymenoptera: Apidae) har traditionellt ansetts vara de viktigaste ekonomiska pollinatorerna av grödor, ny forskning tyder på att Osmia (Hymenoptera: Megachilidae) också är mycket viktigt för att förbättra pollineringen för vissa grödor, öka fruktstorleken och antalet frön och minska andelen asymmetrisk frukt i kommersiella fruktträdgårdar i olika delar av världen1. Osmia excavata har ansetts vara en idealisk art för äppelpollinering, främst i Asien, som i norra och nordvästra Kina och Japan 2,3,4. Det kan tillhandahålla pollineringstjänster för vissa grödor med liknande eller ibland med större effektivitet. I detta avseende har de visat sig ersätta eller fungera i synergi med honungsbina 4,5,6.
De biologiska egenskaperna hos O. excavata är unika jämfört med sociala bin. Dess univoltin, ensamma och häckande aktivitet sker huvudsakligen på våren och försommaren. Boet av O. excavata finns vanligtvis i redan existerande hål, vanligtvis i död ved, ihåliga växter, halmrör och bambustam i det naturliga tillståndet3. Den vuxna O. excavata kommer ut ur sin kokong för att para sig, samla pollen och bygga ett bo för att lägga ägg, som börjar kläckas en vecka senare. De befruktade äggen utvecklas till honor, medan de obefruktade äggen utvecklas till hanar3. Kvinnor fördelas i botten av biröret, och motsvarande bestämmelser är mer signifikanta. Däremot var hanarna i närheten av rörutgången med mindre proviant7, så hanarna kommer ut först och honorna kommer ut senare. Honan blandar pollen med en liten mängd nektar i en fuktig blob, den enda matkällan för varje larv i cellen8.
Flera studier har rapporterat en minskning av populationen av pollinerande insektermed 9,10. Den omfattande användningen av bekämpningsmedel har identifierats som en av de viktigaste faktorerna för att minska pollinatorernas överflöd och mångfald och kan också äventyra pollineringstjänsterna11,12. För att minska och mildra de negativa effekterna av bekämpningsmedel är det nödvändigt att göra en riskbedömning av bekämpningsmedel för pollinatörer. Vissa länder har upprättat regelverk för att säkerställa binas säkerhet från de bekämpningsmedel som används 13,14. Nya studier har visat att Osmia var mer mottaglig för bekämpningsmedel än honungsbin 1,15.
Intressant nog var de flesta riskbedömningar inriktade på vuxna honungsbin 11,12; lite forskning har utförts på O. excavata, särskilt larverna. Dessutom anses dödligheten hos Osmia som direkt orsakas av bekämpningsmedel oftast vara16. Ändå kan de kroniska toxiciteterna som larvviktökning, utvecklingstid, matningsmönster, eklosionsförmåga, efterföljande vuxenbeteende och fecunditet ha samma skada som de akuta dödliga toxiciteterna och ignoreras ofta på grund av brist på en effektiv experimentell metod för de ensamma bina17.
Hittills används två metoder för att utvärdera effekterna av bekämpningsmedel på larverna av ensamma bin: (1) en lämplig mängd bekämpningsmedel applicerades på den lokaliserade proviantplatsen utan att ta bort ägget av ensamma bin 1,18,19,20; (2) ersätta bestämmelserna med konstgjorda pollen-nektarblandningar som innehåller en viss mängd bekämpningsmedel21. Det finns dock vissa begränsningar för ovanstående två metoder. Den förstnämnda kan bara mäta akut toxicitet, men inte kronisk toxicitet eftersom larverna intagit hela dosen på kort tid; det senare skulle leda till en hög dödlighet på grund av mänsklig manipulation1. Här beskrevs nedsänkningsmetoden för att studera bekämpningsmedels ekotoxicitet till O. excavata under mycket kontrollerade forskningsförhållandengenom att simulera beteendet hos larvmatning på kvarvarande bekämpningsmedel i bestämmelserna i den verkliga miljön. Metoden för denna studie löser nackdelarna med ovanstående två metoder och är lämplig för att mäta effekterna av ett farligt ämne på akut och kronisk toxicitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av matningsröret
- Stansa ett hål (~ 0,3 mm diameter) i locket på ett 2 ml centrifugrör med ett elektriskt lindningsjärn (se Materialtabell). Använd ett sådant centrifugrör för att bibehålla en O. excavata larva och dess provianteringsmassa.
2. Beredning av bekämpningsmedel
- Lös upp bekämpningsmedlet av teknisk kvalitet (se materialförteckningen) i aceton för att förvärva stamlösningar på 1 x 104 μg a.i. ml-1. Utför sedan gradientutspädningar av lösningen till mer än fem koncentrationer.
OBS: Klorpyrifos vid 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2, 6,4 μg a.i. ml-1 användes i denna studie.
3. Förberedelse av bestämmelserna
- Skaffa plaströr som innehåller proviant (se Materialtabell) och nykläckta larver av O. excavata från ett massuppfödningsprogram.
OBS: Inga bekämpningsmedel användes från 20 dagar före blomningen till hela blomningsperioden; Kemiska analysresultat visade att vanligt förekommande halter av bekämpningsmedel i slumpmässigt utvalda femtio bestämmelser båda låg under minimitestnivåerna. - Separera proviant och larver försiktigt med en mjuk borste. Välj honlarver baserat på sättningsstorlek och cellposition inom boet9. Placera sedan bestämmelser i enhetlig storlek och utvalda kvinnliga larver i petriskålar (60 mm diameter) och lägg dem åt sidan för användning.
OBS: Femtio bestämmelser valdes slumpmässigt ut för att analysera innehållet i vanliga bekämpningsmedel: klorpyrifos, imidakloprid, fendifenuron, phoxim, avermektin. Parametrarna för mjuk borste är (a) borstens diameter: 0,3 mm, (b) borstens längd: 2 cm, (c) pennans längd: 18 cm.
4. Tillhandahållande av behandling med bekämpningsmedel
- Blötlägg de valda jämnt stora bestämmelserna (från steg 3.2) i utspädd bekämpningsmedel (från steg 2.1; klorpyrifos vid 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2, 6,4 μg a.i. ml-1) i 10 s med hjälp av en bur. Blötlägg kontrollkontrollen (CK) i 0,2% lösningsmedel (aceton i denna studie).
OBS: Det finns tre replikat per koncentrationsbehandling, och varje replikat bestod av 60 bestämmelser. Skillnaden i dosering av varje bestämmelse kan minskas genom att välja jämnt stora avsättningar. - Mät volymen av bekämpningsmedelslösning före och efter behandling av bestämmelserna med bekämpningsmedlet. Beräkna sedan den nedsänkta volymen insektsmedel i varje behandling, inklusive 60 massbestämmelser (kompletterande tabell 1). Placera provianten i separata centrifugalrör med hål (från steg 1.1) efter lufttorkning på ett sterilt arbetsbord.
OBS: Före experimentet, sätt burarna som innehåller bestämmelserna i bekämpningsmedelslösningen och mät sedan volymen av bekämpningsmedelslösning före och efter blötläggning för att eliminera felet. - Överför kvinnliga larver individuellt till ytan av naturligt torkade bestämmelser med en mjuk borste.
OBS: En larv i ett rör.
5. Tillväxtförhållanden
- Baka larverna av O. excavata i en tillväxtkammare i mörkret, 65% -75% relativ fuktighet och 25 ± 2 ° C16.
6. Undersökning av resultaten
- Testet av akut dödlig toxicitet
- Mät larvernas dödlighet efter att ha placerat dem på den behandlade och kontrollbestämmelserna (CK) i 48 timmar.
OBS: Dödskriterierna: när larverna inte svarade på mild beröring med en mjuk borste under svartljuslampor22. Svartljuslampor användes för att simulera larvernas mörka tillväxtförhållanden och undvika påverkan av ljus på larverna vid kontroll av tillväxtindikatorer. För att eliminera den mänskliga faktorn mättes också dödligheterna med och utan avlägsnande av larver från provianten efter 48 timmar i kontrollgrupper. - Väg 60 proviant före och efter 48 timmars insektsuppfödningsförsök för att bestämma mängden proviant som konsumeras av varje larv.
- Beräkna dosen bekämpningsmedel vid varje koncentration som konsumeras av varje larv enligt procentandelen av försörjningen som äts och bekämpningsmedelshalten i varje bestämmelse.
OBS: Ekvationen för dosberäkning är23:
där D är den konsumerade dosen bekämpningsmedel av varje larv; W1 är vikten av 60 bestämmelser före infusion av bekämpningsmedel; W2 är den återstående vikten av 60 bestämmelser efter 48 timmar; V1 är mängden bekämpningsmedel före nedsänkning för 60 proviant; V2 är volymen bekämpningsmedel efter nedsänkning för 60 proviant; C är koncentrationen av bekämpningsmedlet.
- Mät larvernas dödlighet efter att ha placerat dem på den behandlade och kontrollbestämmelserna (CK) i 48 timmar.
- Testet av subletal toxicitet
- Väg larverna före uppfödningsförsök och efter 14 dagars behandlingar för att bestämma larvviktökningen.
- Observera O. excavata dagligen under kokongning under svartljuslampor för att mäta larvutvecklingstiden.
- Väg de återstående delarna av avsättningarna efter 14 dagars utfodring av behandlade och CK-avsättningar för att beräkna konsumtionen och effektiviteten i omvandlingen av förtärda livsmedel (ECI)24.
- Undersök antalet eclosioner genom att prickskjuta kokongerna med en liten sax när kontroll bina dyker upp i vuxna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Innehållet i vanligen använda bekämpningsmedel, klorpyrifos, imidakloprid, fendifenuron, phoxim, avermektin i proviant var mindre än kvantifieringsgränsen (0,01-0,02 mg kg-1) i kontrollgruppen. Dessa resultat uteslöt påverkan av bekämpningsmedelsrester på varje behandling. Dödligheten med och utan att ta bort larver från proviant efter 48 timmar i kontrollgrupper utvärderades; Resultaten visade inga signifikanta skillnader (tabell 1), vilket tyder på ett mindre mänskligt fel.
I testet av akut dödlig toxicitet (tabell 2) dränktes provianten i sju utspädda bekämpningsmedelslösningar (0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2 och 6,4 μg a.i. ml-1 klorpyrifos) och 0,2 % aceton (som kontrollgrupp). En log-probit regressionsanalys utvärderade den genomsnittliga dödliga dosen (LD50-värden) av bekämpningsmedel till O. excavata enligt indelade doser av bekämpningsmedel (från 0,0001-0,005 μg a.i. ml-1) och motsvarande dödlighet hos larver efter 48 timmars behandlingar. Resultaten visade att LD50-värdet av klorpyrifos till larverna av O. excavata var 0,001 (0,001-0,002) μg a.i. Bee-1.
I det subletala toxicitetstestet utvärderades larvviktökning, utvecklingstid, eklosionshastighet, konsumtion och ECI för O. excavata under blötläggningskoncentrationerna 0,1, 0,2, 0,4 och 0,8 μg a.i. ml-1 klorpyrifos. En analys av kovarians (ANCOVA) användes för att bestämma behandlingsrelaterade förändringar i utvecklingen (utom eklosionshastigheten) och livsmedelsutnyttjandet av O. excavata. Däremot användes initial provianteringsmassa som kovariat. När dosen ökade minskade indexvärdena för larvviktökning, konsumtion och ECI för behandlingar, med de lägsta värdena i förhållande till kontrollen som observerades i 0,013 μg a.i. bee-1 klorpyrifos. Omvänt observerades den mest förlängda larvutvecklingsvaraktigheten hos 0,016 μg a.i. bee-1 klorpyrifos jämfört med kontrollbehandlingen (figur 1).
Klorpyrifos effekter på eklosionshastigheten utvärderades med hjälp av envägsanalys av varians (ANOVA) och Tukeys minst signifikanta skillnadstest (LSD). Pearsons korrelation genomfördes också för att analysera förhållandet mellan ide doser av klorpyrifos och eklosionshastigheten för O. excavata. Här visade resultaten av denna analys att det finns ett signifikant negativt linjärt förhållande för behandlingarna (R2 = 0,82, P = 0,03). Eklosionshastigheten var betydligt lägre när de inderade doserna översteg 0,002 μg a.i. bi-1 än de som behandlades med kontroll (figur 2).
Figur 1: Effekt av klorpyrifos på tillväxt, utveckling och utfodring av O. excavate. (A), (C), (D): efter 14 dagars behandling; (B): före kokongning av O. utgrävning. Olika små bokstäver indikerar signifikanta skillnader mellan behandlingar vid P < 0,05. Siffrorna för varje datapunktsgenomsnitt med SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Förhållandet mellan ita doser av klorpyrifos och eklosionshastighet för O. excavate. Olika små bokstäver indikerar signifikanta skillnader mellan behandlingarna vid P < 0,05; Siffrorna för varje datapunktsgenomsnitt med SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Behandlingar | Dödlighet | |
| Upprepning | Betyda | |
| Med avlägsnande av larver | 11.91% | 9,67% a |
| 7.63% | ||
| 9.46% | ||
| Utan avlägsnande av larver | 6.88% | 8,28% a |
| 7.37% | ||
| 10.59% | ||
Tabell 1: Dödligheten med och utan att ta bort larver från proviant efter 48 timmar i kontrollgrupper. Samma små bokstäver indikerar inga signifikanta skillnader mellan behandlingar vid P < 0,05.
| Insekticid | Lutning ± SE | Df | χ2 (P) | LD50 (95 % CI) (μg a.i. bi−1) |
LD90 (95 % KI) (μg a.i. bi−1) |
| Klorpyrifos | y=3,23+0,30x | 5 | 5.38 (0.37) | 0.001 (0.001-0.002) | 0.02 (0.012-0.038) |
Tabell 2: Klorpyrifos toxicitet för Osmia excavata efter 48 timmars behandlingar. SE - standardfel; Df - grad av frihet; χ2- värden på Chi-kvadrat; CI - konfidentiellt intervall.
Kompletterande tabell 1: Den nedsänkta volymen insektsmedel vid varje behandling, inklusive 60 massbestämmelser. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För vuxna pollinatörer finns det två huvudmetoder för att mäta bekämpningsmedels ekotoxicitet. En är kontaktmetoden, där bekämpningsmedlet appliceras på prothoraxen hos de vuxna insekterna; den andra är magtoxicitetsmetoden, där de vuxna pollinatörerna matas med honungsvatten som innehåller bekämpningsmedel25,26. Under de senaste åren har det visat sig att pollineringseffekten och eklosionshastigheten för O. excavata är relativt låg27. Det spekuleras i att påverkan av applicering av bekämpningsmedel på larvernas tillväxt och utveckling är en av de främsta orsakerna. Det finns dock få rapporter om toxicitetsbedömningsmetoder för bekämpningsmedel till larverna av O. excavata. I denna studie föreslås en effektiv metod för att utvärdera effekterna av bekämpningsmedel på dödlighet, tillväxt och utveckling och utfodring av larverna av O. excavata genom att förorena försörjningsmassorna med bekämpningsmedel.
Många studier använde sackaroslösning innehållande dödliga medelkoncentrationer för att utvärdera bekämpningsmedels toxicitet för honungsbin 28,29,30. De viktigaste vägarna för exponering för bekämpningsmedel för solitära bin var larv- eller vuxenintag, kontakt och transovarisk överföring31. Metoden i denna studie simulerade svaret från ensamma vuxna bin vid direktkontakt och utfodring av mat som innehåller bekämpningsmedel i fältet. För ensamma bi larver var dess svar utfodring av det återstående bekämpningsmedlet i försörjningsmassorna enligt den biologiska egenskapen. Dessutom skulle bekämpningsmedlet som utsätts för proviant i fältet medföra nedbrytning, förångning, ledning till andra vävnader innan de äts av larverna från O. excavata. Därför är det bättre att utvärdera bekämpningsmedels ekotoxicitet till O. excavata genom att analysera bekämpningsmedelsdosen som intas av larver än att använda bekämpningsmedelskoncentrationen för nedsänkning.
Bestämmelserna varierar avsevärt i storlek, vilket väsentligt kan påverka larvernas och vuxnas massa. Proviant och honlarver valdes för att minimera felet baserat på avsättningsstorlek och cellpositionen i boet. Efter screening med ovanstående metod valdes dessutom bestämmelser med liknande storlekar ut ytterligare. Även om denna del av arbetsbördan är relativt stor är den viktig för statistiken över livsmedelskonsumtion per larv och mängden bekämpningsmedel vid varje koncentration i den aktuella studien. Följaktligen kan intagsmängden av bekämpningsmedlet beräknas exakt. Uppföljningsarbete som bestämmer bekämpningsmedelsresterna i avsättningar vid olika tidpunkter efter fältapplicering kommer att bidra till att styra frisättningstiden för den vuxna O. excavata och minska bekämpningsmedlens negativa effekt på larverna i O. excavata.
Klorpyrifos har en hög dödlighet för larverna av O. excavata, vilket liknade resultat som rapporterats på vuxna pollinatorer (Apis mellifera och Apis cerana)32,33. Det kan ses att metoden i denna studie kan förutsäga toxiciteten hos bekämpningsmedel för larverna av O. excavata. Tidigare studier har dock visat att låg dödlighet inte är ett enhetligt stressrespons och inte indikerar några negativa effekter på pollinatörer. Till exempel är neonicotinoider otillräckliga för att orsaka akut död hos bin34 men kan försämra förmågan hos luktinlärning och minne och häcknings- och insamlingsaktiviteter 35,36,37,38,39,40. Därför är det viktigt att utvärdera den kroniska toxiciteten hos bekämpningsmedel på larverna i O. excavata för en övergripande förståelse av bekämpningsmedels ekotoxicitet för pollinatorer ur ett demografiskt perspektiv. Men denna metod bedömde larvviktökning, utvecklingstid, matningsmönster och eclosionsförmåga hos larverna i O. excavata. Förmågan att flyga och fecundity efter uppkomst till vuxna utvärderades inte.
Den föreliggande studien har fortfarande vissa begränsningar. Det antogs att bestämmelserna absorberade 100% av den nedsänkta lösningen. Detta antagande bör dock verifieras analytiskt eftersom volymerna och fuktigheten i varje bestämmelse kan leda till olika koncentrationer, vilket tyder på att både idelade livsmedel och kontroll av de nominella testkoncentrationer som används i livsmedel krävs vid rapportering av endpoints för toxicitet på dosbasis. Det är därför fortfarande nödvändigt att kontrollera halterna av bekämpningsmedel i bestämmelserna med hjälp av en analysmetod i framtiden.
Sammanfattningsvis kommer den presenterade metoden att hjälpa forskare att förbättra den ekologiska risken för bekämpningsmedel för larverna hos ensamma bin genom att bedöma slutpunkter relaterade till dödlighet, larvviktökning, utvecklingstid, eclosionsförmåga och matningsmönster. Tekniken kan potentiellt förbättra säkerheten vid användning av bekämpningsmedel genom att generera kvantitativa data om larverna hos ensamma bin som skulle vara svåra att förvärva med hjälp av halvfälts- och fältförsök. De negativa effekterna av bekämpningsmedel på solitära bin kan bättre förutsägas och mildras med hjälp av denna teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av National Key R&D Program of China (2017YFD0200400), Major Scientific and Technological Innovation Project (2017CXGC0214), Bee Industry Innovation Team of Shandong Province, Agricultural Science and Technology Innovation Project of Shandong Academy of Agricultural Sciences (CXGC2019G01) och Agricultural Science and Technology Innovation Project of Shandong Academy of Agricultural Sciences (CXGC2021B13).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Abamectin | Jinan Lvba Pesticide Co. Ltd | ||
| Black-light lamps | Kanghua Medical Device Co., Ltd | ||
| Centrifugal tube box with 100 Wells | Shanghai Rebus Network Technology Co., Ltd | ||
| Centrifuge tube | Shanghai Rebus Network Technology Co., Ltd | 2 mL; Serve as bee tube | |
| Electric soldering iron | Kunshan Kaipai Hardware Electromechanical Co., Ltd | ||
| Electronic scale | Sartorius Scientific Instruments (Beijing) Co., Ltd | 3137510295 | |
| Graduated cylinder | Anhui Weiss Experimental Equipment Co. Ltd | ||
| Petri dishes (60 mm diameter) | Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD | ||
| Pollen provision | Yantai Bifeng Agricultural Science and Technology Co. Ltd | ||
| Soft brush | Wengang Wenhai painting material factory | ||
| Solitary bees | Yantai Bifeng Agricultural Science and Technology Co. Ltd |
References
- Sgolastra, F., Tosi, S., Medrzycki, P., Porrini, C., Burgio, G. Toxicity of spirotetramat on solitary bee larvae, Osmia cornuta (hymenoptera: megachilidae), in laboratory conditions. Journal of Apicultural Science. 59 (2), 73-83 (2015).
- Wei, S. G., Wang, R., Smirle, M. J., Xu, H. L. Release of Osmia excavata and Osmia jacoti (Hymenoptera: Megachilidae) for apple pollination. TheCanadian Entomologist. 134 (3), 369-380 (2002).
- Men, X. Y., et al. Biological characteristics and pollination service of Mason bee. Chinese Journal of Applied Entomology. 55 (6), 973-983 (2018).
- Bosch, J., Kemp, W. P., Trostle, G. E. Bee population returns and cherry yields in an orchard pollinated with Osmia lignaria (Hymenoptera: Megachilidae). Journal of Economic Entomology. 99 (2), 408-413 (2006).
- Winfree, R., Williams, N. M., Dushoff, J., Kremen, C. Native bees provide insurance against ongoing honey bee losses. Ecology Letters. 10 (11), 1105-1113 (2007).
- Garibaldi, L. A., Steffan-Dewenter, I., Winfree, R. Wild pollinators enhance fruit set of crops regardless of honey bee abundance. Science. 339 (6127), 1608-1611 (2013).
- Bosch, J., Sgolastra, F., Kemp, W. P. Life cycle ecophysiology of Osmia. mason bees used as crop pollinators. Bee Pollination in Agricultural Ecosystems. James, R. R., Pitts-Singer, T. L. , Oxford University Press. Oxford, UK. 83-104 (2008).
- Liu, L., et al. Population investigation and restriction factors analyses of Osmia excavata Alfken in Jiaodong. Apiculture of China. 69 (9), 68-71 (2018).
- Biesmeijer, J. C., Roberts, S. P. M., Reemer, M. Parallel declines in pollinators and insect-pollinated plants in Britain and the Netherlands. Science. 313 (5785), 351-354 (2006).
- Potts, S. G., Biesmeijer, J. C., Kremen, C. Global pollinator declines: trends, impacts and drivers. Trends in Ecology & Evolution. 25 (6), 345-353 (2010).
- Chen, L., Yan, Q., Zhang, J., Yuan, S., Liu, X. Joint toxicity of acetamiprid and co-applied pesticide adjuvants on honeybees under semi-field and laboratory conditions. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (9), 1940-1946 (2019).
- Sgolastra, F., Medrzycki, P., Bortolotti, L., Renzi, M. T., Bosch, J. Synergistic mortality between a neonicotinoid insecticide and an ergosterol-biosynthesis-inhibiting fungicide in three bee species. Pest Management Science. 73 (6), 1236-1243 (2017).
- Bireley, R., et al. Preface: Workshop on pesticide exposure assessment paradigm for non-Apis bees. Environmental Entomology. 48 (1), 1-3 (2019).
- European Food Safety Authority. EFSA Guidance Document on the risk assessment of plant protection products on bees (Apis mellifera, Bombus spp. and solitary bees). EFSA Journal. 11 (7), 3295 (2013).
- Rundlof, M., et al. Seed coating with a neonicotinoid insecticide negatively affects wild bees. Nature. 521 (7550), 77-80 (2015).
- Yuan, R., et al. Toxicity and hazard assessment of six neonicotinoid insecticides on Osmia excavata (hymenoptera:megachilidae). Acta Entomologica Sinica. 61 (8), 950-956 (2018).
- Lin, Z., Meng, F., Zheng, H., Zhou, T., Hu, F. Effects of neonicotinoid insecticides on honeybee health. Acta Entomologica Sinica. 57 (5), 607-615 (2014).
- Gradish, A. E., Scott-Dupree, C. D., Cutler, G. C. Susceptibility of Megachile rotundata to insecticides used in wild blueberry production in Atlantic Canada. Journal of Pest Science. 85, 133-140 (2012).
- Hodgson, E. W., Pitts-Singer, T. L., Barbour, J. D. Effects of the insect growth regulator, novaluron on immature alfalfa leafcutting bees, Megachile rotundata. Journal of Insect Science. 11, 43 (2011).
- Konrad, R., Ferry, N., Gatehouse, A. M. R., Babendreier, D. Potential effects of oilseed rape expressing oryzacystatin-1 (OC-1) and of purified insecticidal proteins on larvae of the solitary bee Osmia bicornis. PLoS ONE. 3 (7), 2664 (2008).
- Abbott, V. A., Nadeau, J. L., Higo, H. A., Winston, M. L. Lethal and sublethal effects of imidacloprid on Osmia lignaria and clothianidin on Megachile rotundata (Hymenoptera: megachilidae). Journal of Economic Entomology. 101, 784-796 (2008).
- Yan, Z., Wang, Z. Sublethal effect of abamectin on 3rd instar larvae of Prodenia litura. Chinese Journal of Tropical Crops. 32 (10), 1945-1950 (2011).
- Song, Y., et al. Comparative ecotoxicity of insecticides with different modes of action to Osmia excavata (Hymenoptera: Megachilidae). Ecotoxicology and Environmental Safety. 212 (5), 112015 (2021).
- Chen, F. J., Wu, G., Ge, F., Parajulee, M. N., Shrestha, R. B. Effects of elevated CO2 and transgenic Bt cotton on plant chemistry, performance, and feeding of an insect herbivore, the cotton bollworm. Entomologia Experimentalis Et Applicata. 115 (2), 341-350 (2005).
- Cang, T., et al. Toxicity and safety evaluation of pesticides commonly used in strawberry production to bees. Zhejiang Agricultural Sciences. (4), 785-787 (2009).
- Cang, T., et al. Acute toxicity and safety assessment of chiral fipronil against Apis mellifera and Trichogramma ostriniae. Ecotoxicology. 7 (3), 326-330 (2012).
- Liu, X., Pan, W. Measures to ensure pollination effect and cocoon recovery rate of Osmia excavata in apple orchard. Northwest Horticulture. (3), 20-21 (2017).
- Meikle, W. G., Adamczyk, J. J., Weiss, M., Ross, J., Beren, E. Sublethal concentrations of clothianidin affect honey bee colony growth and hive CO2 concentration. Scientific Reports. 11 (1), 4364 (2021).
- Meikle, W. G., Adamczyk, J. J., Weiss, M., Ross, J., Beren, E. Sublethal concentrations of clothianidin affect honey bee colony behavior and interact with landscapes to affect colony growth. BioRxiv. , (2020).
- Wang, Y. F., et al. Combination effects of three neonicotinoid pesticides on physiology and survival of honey bees (Apis mellifera L). Journal of Environmental Entomology. 41 (3), 612-618 (2019).
- Kopit, A. M., Pitts-Singer, T. L. Routes of pesticide exposure in solitary, cavity-nesting bees. Environmental Entomology. 47 (3), 499-510 (2018).
- Cheng, Y., et al. Chronic oral toxicity of chlorpyrifos and imidacloprid to adult honey bees (Apis mellifera L). Asian Journal of Ecotoxicology. 11 (2), 715-719 (2016).
- Li, M., Ma, C., Xiao, L., Li, Z., Su, S. Effects of chlorpyrifos on behavior response of Apis mellifera and Apis cerana. Apicultural Science Association of China. , (2016).
- Cresswell, J. E. A meta-analysis of experiments testing the effects of a neonicotinoid insecticide (imidacloprid) on honey bees. Ecotoxicology. 20 (1), 149-157 (2011).
- Nauen, R., Ebbinghaus-Kintscher, U., Schmuck, R. Toxicity and nicotinic acetylcholine receptor interaction of imidacloprid and its metabolites in Apis mellifera (Hymenoptera; Apidae). Pest Management Science. 57 (7), 577-586 (2001).
- Colin, M. E., et al. A method to quantify and analyze the foraging activity of honey bees: relevance to the sublethal effects induced by systemic insecticides. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 47 (3), 387-395 (2004).
- Decourtye, A., et al. Comparative sublethal toxicity of nine pesticides on olfactory learning performances of the honeybee Apis mellifera. Archives of Environmental Contamination & Toxicology. 48 (2), 242-250 (2005).
- Williamson, S. M., Wright, G. A. Exposure to multiple cholinergic pesticides impairs olfactory learning and memory in honeybees. Journal of Experimental Biology. 216 (10), 1799-1807 (2013).
- Henry, M., et al. A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees. Science. 336 (6079), 348-350 (2012).
- Matsumoto, T. Reduction in homing flights in the honey bee Apis mellifera after a sublethal dose of neonicotinoid insecticides. Bulletin of Insectology. 66 (1), 1-9 (2013).
