Summary
我们设计并建造了一个移动实验室，以测量在野外捕获的野生动物分离的线粒体的呼吸速率。在这里，我们描述了移动线粒体实验室的设计和装备以及相关的实验室协议。
Abstract
线粒体能量学是动物生物化学和生理学的中心主题，研究人员使用线粒体呼吸作为研究代谢能力的指标。为了获得线粒体呼吸的测量值，必须使用新鲜的生物样品，并且必须在约2小时内完成整个实验室程序。此外，需要多台专用设备来执行这些实验室检测。这给测量远离生理学实验室的野生动物组织中的线粒体呼吸带来了挑战，因为在野外收集活组织后无法保存很长时间。此外，长距离运输活体动物会引起压力，从而改变线粒体能量学。
这份手稿介绍了奥本大学 （AU） MitoMobile，这是一个移动的线粒体生理学实验室，可以带到现场并在现场用于测量从野生动物收集的组织中的线粒体代谢。介绍了移动实验室的基本特征以及测量分离线粒体呼吸速率的分步方法。此外，所提供的数据验证了装备移动线粒体生理学实验室和进行线粒体呼吸测量的成功。移动实验室的新颖之处在于能够开车到现场并对现场捕获的动物组织进行线粒体测量。
Introduction
迄今为止，旨在测量线粒体能量学的研究仅限于实验动物或在已建立的生理学实验室附近捕获的动物，这使得科学家无法对在迁徙、潜水和冬眠等活动中从动物身上收集的组织进行线粒体生物能量研究1,2,3,4,5,6 .虽然许多研究人员已经成功地测量了野生动物的基础和峰值代谢率以及每日能量消耗7,8，但研究人员测量线粒体性能的能力仍然有限（但见1,4,9）。这部分是由于需要用于分离线粒体的新鲜组织，以及在获得新鲜组织后约 2 小时内进行分离的实验室设施。一旦线粒体被分离，线粒体呼吸测量也应在~1小时内完成。
分离的线粒体呼吸速率通常通过测量连接到 Clark 电极的密封容器中的氧浓度来执行。这种方法背后的理论建立在基本观察的基础上，即氧气是氧化磷酸化过程中线粒体呼吸的最后一个电子受体。因此，当实验过程中氧浓度下降时，假设发生三磷酸腺苷（ATP）的产生10。消耗的氧气是产生的ATP的代名词。研究人员可以使用不同的底物创建特定的实验条件，并通过向腔室中添加预定量的 ADP 来启动二磷酸腺苷 （ADP） 刺激的呼吸（状态 3）。外源性ADP磷酸化为ATP后，耗氧率降低，达到状态4，可以测量。此外，添加特异性抑制剂可以获得有关漏呼吸和不偶联呼吸的信息10。状态 3 与状态 4 的比率决定了呼吸控制比率 （RCR），它是整体线粒体偶联的指标10,11。较低的 RCR 值表明整体线粒体功能障碍，而较高的 RCR 值表明线粒体偶联程度更大10。
如前所述，生物材料的收集、线粒体分离和呼吸速率的测量必须在获得组织后 2 小时内完成。为了在不将动物长途运输到已建立的实验室的情况下完成这项任务，建造了一个移动线粒体生理学实验室，将其带到可以收集这些数据的现场位置。2018 年的 Jayco Redhawk 休闲车被改装成移动分子生理学实验室，并命名为奥本大学 （AU） MitoMobile （图 1A）。之所以选择休闲车，是因为内置冰箱、冰柜、储水箱和管道、由 12 伏电池供电的电力、气体发生器、丙烷罐和自流平系统。此外，休闲车提供了在偏远地点过夜以收集数据的能力。车辆的前部没有改变，提供了驾驶和睡眠区 （图1B）。之前安装在车辆后部和炉灶的卧室设施（床、电视和橱柜）被拆除。
安装了定制的不锈钢搁板和由 80/20 铝框架支撑的定制石英台面，以代替卧室设施和炉灶 （图 1C）。实验室工作台为数据收集提供了足够的空间 （图1D）。每台设备（即冷冻离心机、线粒体呼吸室、酶标仪、计算机、均质机、秤、便携式超速冷冻机和其他一般实验室用品）的功耗都被考虑在内。为了支持离心机的大电压和电流需求，电气系统升级为航空级设备。车辆后部的外部隔间被改造成液氮储存舱，符合美国交通部的液氮储存和运输指南。该存储单元由不锈钢制成，并具有适当的通风功能，以防止任何膨胀的氮气泄漏到车辆的乘客舱中。
为了确认移动实验室可用于线粒体生物能量研究，分离了线粒体，并测量了野生家鼠（Mus musculus）后肢骨骼肌的线粒体呼吸速率。由于Mus musculus是一种模式生物，因此该物种的线粒体呼吸速率已确定为12,13,14。尽管先前的研究已经记录了通过差速离心进行线粒体分离15,16,17，但下文简要概述了移动线粒体生理学实验室方法中使用的方法。
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Protocol
以下各节介绍线粒体实验室方法。所有动物处理和组织收集程序均已获得奥本大学机构动物护理和使用委员会 （#2019-3582） 的批准。
1. 用于数据收集的缓冲区说明
注意：这些缓冲液可以在固定实验室中制备，并在实地考察之前移动到移动实验室（除非下面另有说明）。
- 用牛血清白蛋白（BSA）制备骨骼肌线粒体分离缓冲液，如 表1所示。
- 将化学品溶解在去离子水（~90%体积）中，不含脂肪酸的BSA 除外 。将缓冲液放入冰箱中，直到温度为4°C。
- 将溶液调节至pH值为7.5，同时将温度保持在4°C。
- 加入不含脂肪酸的BSA，将体积增加到100%。将溶液分装到 50 mL 锥形管中。将该溶液储存在-20°C直至使用。
- 制备不含BSA的骨骼肌线粒体分离缓冲液，如 表1所示。
- 将化学品溶解在去离子水（~90%体积）中。将缓冲液放入冰箱中，直到温度为4°C。
- 将溶液调节至pH值为7.5，同时将温度保持在4°C。
- 将音量调高至 100%。将溶液分装到 50 mL 锥形管中。将该溶液储存在-20°C直至使用。
- 制备骨骼肌再悬悬缓冲液，如 表1所示。
- 将化学品溶解在去离子水（~90%体积）中。将缓冲液放入冰箱中，直到温度为4°C。
- 将溶液调节至7.4的pH值，同时将温度保持在4°C。
- 将音量调高至 100%。将溶液分装到 50 mL 锥形管中。将该溶液储存在-20°C直至使用。
- 制备骨骼肌呼吸缓冲液，如 表2所示。
- 将化学物质溶解在去离子水（~90%体积）中，不含脂肪酸的BSA 除外 。加热缓冲液直至温度为37°C。
- 将溶液调节至7.0的pH值，同时将温度保持在37°C。
- 加入不含脂肪酸的BSA，将体积增加到100%。将溶液分装到 50 mL 锥形管中。将该溶液储存在-20°C直至使用。
- 制备呼吸底物， 如表2所示。
- 确保在数据收集当天在100mM Tris-HCl（pH 7.4）中使这些底物新鲜。储存在冰上直至使用。
注意：提供的值是为了使足够的底物被线粒体吸收的足够浓缩的溶液。底物的最终浓度为2mM丙酮酸，2mM苹果酸，10mM谷氨酸和5mM琥珀酸。
- 确保在数据收集当天在100mM Tris-HCl（pH 7.4）中使这些底物新鲜。储存在冰上直至使用。
2. 进行线粒体分离（图2）
注意：线粒体分离和线粒体呼吸测量在移动实验室的实验室工作台区域进行，除非另有说明，否则所有溶液均应保持在4°C。
- 将移动实验室停放在平坦的地面上。打开发电机并将车辆调平。展开滑轨并设置设备。
- 解冻所需量的缓冲液。
注意：通常，每块肌肉需要 30 mL 骨骼肌隔离缓冲液和 10 mL 不含 BSA 的骨骼肌隔离缓冲液。 - 根据制造商的说明，设置线粒体呼吸室并将其校准到所需的实验温度和当前气压。有关实验中使用的特定腔室 ，请参阅材料表 。
- 通过斩首对动物实施安乐死。
注：目前的研究使用斩首进行安乐死。一些气体，如二氧化碳和异氟醚，影响线粒体功能18,19,20;在为每项研究选择最佳安乐死方法时，应考虑这些影响。每项研究应采用哪种方法将取决于所提出的科学问题。 - 切除骨骼肌，快速修剪掉脂肪和结缔组织，称重，然后将肌肉放入含有 BSA（至少 1/10 w/v）的骨骼肌隔离缓冲液中（例如，将 1 g 骨骼肌放入 10 mL 缓冲液中）。
- 用剪刀在冰上切碎骨骼肌。
- 使用切开的 5 mL 移液器吸头将切碎的组织转移到 50 mL 离心管中。用刀片（参见 材料表）以 50% 的功率将其均质化 5 秒。加入蛋白酶（5mg / g湿肌肉）并消化7分钟，每30秒混合一次溶液。通过加入等体积的BSA分离缓冲液终止反应。
- 将匀浆以500× g 离心10分钟。使用切开的 5 mL 移液器吸头将上清液通过双层粗棉布转移到干净的 50 mL 离心管中。将上清液以3,500× g 离心10分钟，沉淀棕色线粒体沉淀。
- 倒出剩余的上清液。向离心管中加入相同体积的含有BSA的分离缓冲液。通过轻轻地将线粒体颗粒从离心管壁上移开，用柔性刮刀（警察）重悬线粒体沉淀。以3,500× g 离心10分钟。
- 倒出剩余的上清液。向离心管中加入相同体积的不含BSA的分离缓冲液。用干净的警察轻轻地将线粒体颗粒从离心管壁上移开，重悬线粒体颗粒。以3,500× g 离心10分钟。
- 倒出上清液，并用干净的警察轻轻地将线粒体沉淀从离心管壁上移开，将线粒体沉淀重悬于重悬缓冲液中。
注意：重悬缓冲液的体积将取决于线粒体沉淀的大小。 - 将重悬的线粒体转移到带有切开的 1 mL 移液器吸头的 Dounce 匀浆器中。使用 Dounce 均质器，小心地将悬浮液均质化 4-5 次。
- 使用另一个切开的 1 mL 移液器吸头将线粒体悬浮液放入标记的 2 mL 微量离心管中。
3. 线粒体呼吸测量（图3）
- 复合物 I 底物
- 向腔室中加入 945 μL 呼吸缓冲液。确保搅拌器旋转，缓冲温度保持在37°C。 开始记录数据收集。
- 氧气浓度稳定后，加入 20 μL 线粒体并将盖子放在腔室上。在软件中，表示线粒体被添加到腔室中。
- 用单独的注射器向腔室中加入 10 μL 的 1 M 谷氨酸、10 μL 的 200 mM 苹果酸盐和 10 μL 的 200 mM 丙酮酸，等待信号稳定。在软件中，表示已添加基板。
注：这些底物通常用于测量碳水化合物驱动的呼吸。有关用于测量脂肪驱动呼吸的其他底物组合，请参见21。 - 用单独的注射器加入5μLADP，观察快速耗氧量（状态3）。在软件中，表示已添加 ADP。
注意：在添加的 ADP 磷酸化后，耗氧率将稳定到状态 4。 - 状态 4 数据收集 4 分钟后，终止记录。保存数据文件。
- 复合物 II 底物
- 向腔室中加入 963 μL 呼吸缓冲液。确保搅拌器旋转，缓冲温度保持在37°C。 开始记录数据收集。
- 氧气浓度稳定后，加入 20 μL 线粒体并将盖子放在腔室上。在软件中，表示线粒体已添加到溶液中。
- 使用单独的注射器向腔室中加入 2 μL 的 4 μg/μL 鱼藤酮，然后加入 10 μL 的 500 mM 琥珀酸酯，等待信号稳定。在软件中，表示已添加基板。
- 使用单独的注射器加入 5 μL ADP，并观察快速耗氧量（状态 3）。在软件中，表示已添加 ADP。
注意：在添加的 ADP 磷酸化后，耗氧率将稳定到状态 4。 - 状态 4 数据收集 4 分钟后，终止记录。保存数据文件。
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Representative Results
目前的手稿在移动线粒体生理学实验室中研究了野生来源的Mus musculus（n = 7，雄性= 5，雌性= 2;年龄= 1.30±0.2岁）的线粒体呼吸（图1）。为了测量骨骼肌线粒体呼吸，使用整个后肢，即有氧和无氧肌，进行线粒体分离（图2）。原始线粒体呼吸数据的示例如图 3 所示。图3A和图3B表示复杂的I驱动的线粒体呼吸。图3A中观察到的陡峭斜率代表了较高的最大呼吸速率。这是用于进一步数据分析的值。通过急剧转弯和新斜率的稳定来观察线粒体与后肢骨骼肌的成功分离，这决定了状态4（图3B）。
这些数据也可以解释为线粒体由于建立状态 4 的急剧转向而具有高功能。对于复杂的II驱动的线粒体呼吸，可以观察到类似的模式（图3C和图3D）。图 3E，F 显示线粒体功能不佳，可能是由于线粒体生理学或线粒体呼吸不成功。图 3E 显示了线粒体在复杂 I 驱动的线粒体呼吸中的偶联，如状态 4 的转变所示。然而，图 3F 显示了未偶联的复合物 II 线粒体呼吸，如添加 ADP 后的平线所示，并且没有“转向”产生状态 4 数据。这些数据表明线粒体分离过程中可能存在的问题，下面将对此进行讨论。
这些动物的复合物 I 和复合物 II 的状态 3、状态 4 和 RCR 的数值可以在图 4 中找到。这些数据是通过测量添加ADP后最陡斜率的30 s来确定状态3（图3A，C）和测量“转弯”1分钟后的斜率以测量状态4（图3B，D）来确定的。获得这些值后，将数据归一化为蛋白质含量（通过 Bradford 测定22）。使用归一化值，通过将归一化状态 3 值除以归一化状态 4 值来计算 RCR。
图 1：AU MitoMobile，一个移动线粒体生理学实验室。 （A） AU MitoMobile的外部。（B） 车辆内部，看前部，没有做任何改变。（C） 车辆后部显示工作台、储物箱和离心机的安装。（D） 数据收集过程中设备的设置。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：骨骼肌中的线粒体分离和呼吸测量程序。 （1）从动物身上解剖组织并置于缓冲液中，在那里（2）切碎，匀浆，用蛋白酶处理，并进行离心，直到获得线粒体沉淀。（3）复悬线粒体颗粒，获得呼吸数据。（4）耗氧量数据可用于计算状态3、状态4和RCR。缩写：RCR=呼吸控制比。使用 BioRender.com 创建。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：使用复合物 I 和复合物 II 底物进行线粒体呼吸测量。 复合物 I 底物的耗氧量，突出显示状态 3 （A） 和状态 4 （B） 的斜率分析。复合物II底物的耗氧量，突出了状态3（C）和状态4（D）的斜率分析。线粒体呼吸不理想可见于复合 I 驱动的呼吸 （E） 和复杂的 II 驱动的呼吸 （F）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：在 AU MitoMobile 中收集的家鼠 （Mus musculus） 数据。 使用此处描述的程序进行线粒体分离和呼吸。丙酮酸、苹果酸和谷氨酸用于测定复合物 I 呼吸速率。琥珀酸和鱼藤酮用于测量复合物II呼吸速率。（A） 复合物 I 态 3 测量，（B） 复合物 I 态 4 测量，（C） 复合物 I RCR，（D） 复合物 II 态 3 测量，（E） 复合物 II 态 4 测量和 （F） 复合物 II RCR。缩写：RCR=呼吸控制比。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 用于骨骼肌的线粒体分离缓冲液 | ||
| 试剂 | 含 BSA，浓度 （mM） | 不含 BSA，浓度 （mM） |
| 氯化钾 | 100 | 100 |
| Tris-HCl（三盐酸盐） | 40 | 40 |
| Tris-基地 | 10 | 10 |
| 氯化镁2 | 1 | 1 |
| EGTA系列 | 1 | 1 |
| ATP酸加 | 0.2 | 0.2 |
| 不含脂肪酸的牛血清白蛋白 | 0.15% | - |
| 用于骨骼肌的分离线粒体重悬缓冲液 | ||
| 试剂 | 浓度 （mM） | |
| 甘露醇 | 220 | |
| 蔗糖 | 70 | |
| Tris-HCl（三盐酸盐） | 10 | |
| EGTA系列 | 1 | |
表 1：用于骨骼肌的线粒体分离缓冲液（含和不含 BSA）和分离的线粒体重悬缓冲液。
| 呼吸缓冲液 | |
| 试剂 | 浓度 （mM） |
| 氯化钾 | 100 |
| 拖把 | 50 |
| KH2PO4 | 10 |
| 葡萄糖 | 20 |
| 氯化镁2 | 10 |
| EGTA系列 | 1 |
| 不含脂肪酸的牛血清白蛋白 | 0.20% |
| 呼吸底物 | |
| 试剂 | 浓度 （mM） |
| 丙酮 酸 | 200 |
| 苹果酸 | 200 |
| 琥珀酸 | 500 |
| ADP（ADP） | 100 |
| 谷氨酸 | 1000 |
表2：呼吸缓冲液和底物。
| 状态 3 | 状态 4 | RCR系列 | 研究 | 基质 |
| 368,3±80.4 | 68,9±25,0 | 5.8±1.6 | 12 | 2 mM丙酮酸，2 mM苹果酸 |
| 241,8±22.5 | 28.9±3.2 | 8.3±1.9 | 23 | 5 mM丙酮酸，2 mM苹果酸 |
| 285,7±36.5 | 81,9±2,9 | 3.5±1.0 | 23 | 10 mM琥珀酸酯，4μM鱼藤酮 |
| 493.4±105.4 | 61,3±9,6 | 8.2±2.2 | 当前研究 | 2mM丙酮酸，2mM苹果酸，10mM谷氨酸 |
| 559.5±74.9 | 165,2±18.5 | 3.4±0.2 | 当前研究 | 5 mM琥珀酸酯，4μg/μL鱼藤酮 |
表 3：状态 3、状态 4 和 RCR 的比较值。 缩写：RCR=呼吸控制比。状态 3 和状态 4 值以 nmoles O2/mg 蛋白质/min 显示。
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Discussion
移动线粒体生理学实验室使研究人员能够在远程现场收集组织后 2 小时内分离线粒体并测量线粒体呼吸速率。本文提出的结果表明，在AU MitoMobile中进行的线粒体呼吸测量与在大学研究实验室中进行的测量相当。具体来说，这里介绍的野生来源的Mus musculus的状态3，状态4和RCR的值与同一实验室和其他实验室先前发表的结果相当（表3）12,23。然而，应该注意的是，由于使用的小鼠品系和方法不同，无法对这些研究进行直接比较。这些结果证明了在这个移动线粒体生理学实验室中测量线粒体呼吸的概念验证。
线粒体分离和呼吸所需的所有化学品和材料都可以在移动实验室内运输和储存，从而在设置和执行实验时易于访问。此外，在移动线粒体实验室中收集的分离线粒体提供了独特的样品，用于执行其他生化测量，例如活性氧发射。重要的是，冷冻的线粒体可以被运送到固定的实验室进行额外的生化测量（例如，单个电子传递链酶活性）。值得注意的是，通过离心分化分离线粒体并不是测量线粒体呼吸的唯一方法。其他实验室已经成功地用透化纤维测量了线粒体呼吸。虽然目前的手稿没有描述这种方法（有关透化纤维的更多详细信息，请参见24、25、26、27、28），但读者需要注意的是，移动线粒体生理学实验室也可以容纳该过程所需的材料。请参阅其他关于每种方法的优缺点的评论25,29,30。
一些进行线粒体生物能量学研究的实验室已经发布了故障排除建议，读者可能会发现这些建议很有帮助15,17。对于任何单个实验项目，都应制作单批缓冲区来收集所有数据。使用在不同日期制备的缓冲液会为溶液变化创造机会，从而影响线粒体呼吸测量。在分离过程中会发生线粒体外膜的损伤;然而，通过实验室培训正确执行隔离方法可以最大限度地减少该程序自然发生的损害29,31。在分离过程中，无功能或过度受损的线粒体由白色蓬松的线粒体颗粒而不是紧凑的棕色颗粒指示。线粒体无功能或受损可能是由于刀片均质化过程中转速过高、均质时间过长、添加过多蛋白酶或消化时间过长，或在线粒体最终重悬期间使用过多的划水。
此外，选择分离什么肌肉以及使用多少肌肉会影响线粒体产量。例如，在具有较高线粒体密度的动物中，例如鸟类21，与来自大鼠后肢的骨骼肌纤维类型的混合物相比，将沉淀更多的线粒体。这也将改变成功分离所需的组织量。组织中的线粒体密度越大，成功分离所需的组织量就越低。研究人员还应该考虑添加到最终分离的线粒体中的甘露醇-蔗糖溶液的体积。密度较高的线粒体颗粒需要较高的稀释度，而密度较低的线粒体颗粒需要较低的稀释度。稀释的程度将取决于动物、被分离的骨骼肌的氧化性质以及线粒体颗粒的密集程度。
拥有足够的电力来支持移动实验室数据收集所需的所有设备可能具有挑战性。值得注意的是，冷冻离心机在运行过程中（尤其是在冷却的初始阶段）会消耗高电流。因此，应特别考虑确保车辆的电力输出与同时运行所需的设备的电力需求相匹配。可以解决此限制的建议是添加更多电源（例如，额外的电池、额外的发电机）。值得注意的是，用透化纤维测量线粒体呼吸的方法不需要使用冷冻离心机，也可以为有限的电源提供分辨率。在使用移动实验室时，还应考虑环境条件和道路质量。本文讨论的移动线粒体生理学实验室在天气晴朗的州际公路上成功行驶。恶劣天气的土路将给驾驶车辆到感兴趣位置带来更大的困难。虽然线粒体分离不是一种新方法，但它在移动实验室中的使用提供了一种独特的方法来量化自由生活动物的线粒体能量学。这对于阐明实验室动物和野生动物之间的差异至关重要32,33,34。此外，移动线粒体生理学实验室使研究人员能够研究自然界动物中发现的能量约束和能量极端。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
作者感谢奥本大学塞缪尔·吉恩工程学院电气与计算机工程系的 Mark Nelms 和 John Tennant 帮助 AU MitoMobile 的结构和电气装备。此外，作者还感谢为AU MitoMobile提供的资金以及奥本大学跨学科研究总统奖（PAIR）资助的研究。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 2.0 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| Clear 96 well plate | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-284 | Corning |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| Filter paper | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| Free-fatty acid BSA | VWR | 89423-672 | |
| Glucose | VWR | BDH8005-500G | |
| Glutamate | VWR | A12919 | |
| Hamilton Syringes | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 Series Syringes |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | No Catalog Number, but can be found under Products --> Electrode Control Units | |
| KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
| Malate | VWR | 97062-140 | |
| Mannitol | VWR | 97061-052 | |
| Membrane | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| Policeman | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| Protease | VWR | 97062-366 | Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used. |
| Pyruvic acid | VWR | 97061-448 | |
| Sodium Dithionite | VWR | AA33381-22 | |
| Succinate | VWR | 89230-086 | |
| Sucrose | VWR | BDH0308-500G | |
| Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
| Tris-HCl | VWR | 97061-258 |
References
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