Summary
यह प्रोटोकॉल फॉर्मलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक नमूनों की प्रतिशत ट्यूमर सामग्री को बढ़ाने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है।
Abstract
फॉर्मलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) ऊतकों में दूषित गैर-ट्यूमर ऊतकों की उपस्थिति जीनोमिक अध्ययनों को बहुत कमजोर कर सकती है। यहां हम मैक्रोडिसेक्शन का वर्णन करते हैं, एक विधि जिसे डाउनस्ट्रीम न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण करने से पहले अवांछित ऊतक को हटाकर और समाप्त करके ऊतक नमूने की प्रतिशत ट्यूमर सामग्री को बढ़ाने के लिए डिज़ाइन किया गया है। एफएफपीई ऊतक ब्लॉक 4-5 μm स्लाइड-घुड़सवार ऊतक वर्गों का उत्पादन करने के लिए विभाजित थे। हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला होने के लिए एक प्रतिनिधि अनुभाग प्रस्तुत किया गया था और बाद में एक बोर्ड-प्रमाणित रोगविज्ञानी द्वारा समीक्षा की गई थी। समीक्षा के दौरान, रोगविज्ञानी ने एच एंड ई में ट्यूमर ऊतक के क्षेत्रों की पहचान की और चिह्नित किया। एक बार पूरा होने के बाद, चिह्नित एच एंड ई का उपयोग एक ही ऊतक ब्लॉक से धारावाहिक के लकीर को निर्देशित करने के लिए किया गया था। मैक्रोडिसेक्शन के प्रभावों को प्रदर्शित करने के लिए, मिलान किए गए मैक्रोडिसेक्टेड और गैर-विच्छेदित फैलाना बड़े बी-सेल लिंफोमा (डीएलबीसीएल) से निकाले गए आरएनए को डीएलबीसीएल उपप्रकार और बीसीएल 2 अनुवाद स्थिति निर्धारित करने में सक्षम डिजिटल जीन अभिव्यक्ति परख पर चलाया गया था। परिणामों से पता चला है कि मैक्रोडिसेक्शन ने जांच किए गए नमूनों में से 60% में उपप्रकार या बीसीएल 2 अनुवाद स्थिति कॉल को बदल दिया। अंत में, न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण से पहले ट्यूमर संवर्धन करने के लिए मैक्रोडिसेक्शन एक सरल और प्रभावी तरीका है, जिसके उत्पाद को तब डाउनस्ट्रीम जीनोमिक अध्ययनों में आत्मविश्वास से उपयोग किया जा सकता है।
Introduction
फॉर्मलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) ऊतक, सामान्य नैदानिक नैदानिक प्रक्रिया के हिस्से के रूप में एकत्र किए गए और नैदानिक ऊतक भंडारों में बनाए रखा गया, कैंसर अनुसंधान सहित मानव अनुसंधान के लिए एक विशाल संसाधन का प्रतिनिधित्व करते हैं1. जैसे-जैसे मानव रोग की हमारी समझ गहरी होती जा रही है, यह तेजी से स्पष्ट होता जा रहा है कि बीमारियां, जिन्हें पहले रूपात्मक और इम्यूनोफेनोटाइपिकल विशेषताओं के आधार पर एकल संस्थाएं माना जाता था, वास्तव में अलग-अलग आणविक उपप्रकारों में शामिल हैं जिनके लिए आणविक सबटाइपिंग परख की आवश्यकता होती है। नतीजतन, इन उपप्रकारों को समझने में सक्षम उच्च संवेदनशीलता जीनोमिक परख तेजी से महत्वपूर्ण हो गए हैं2. यद्यपि एफएफपीई ऊतक निर्धारण से संबंधित मुद्दों के कारण जीनोमिक तकनीकों के साथ खराब संगत होने के लिए प्रसिद्ध हैं, क्योंकि प्रौद्योगिकी और प्रोटोकॉल विकसित होते हैं, ये तकनीकें इस नैदानिक रूप से सर्वव्यापी ऊतक प्रारूप 3,4,5 के साथ तेजी से संगत हो रही हैं। हालांकि, एफएफपीई ऊतक अक्सर ट्यूमर और गैर-ट्यूमर ऊतक सामग्री के मिश्रण होते हैं, जहां गैर-ट्यूमर सामग्री की उपस्थिति अक्सर अवांछित होती है और यदि उच्च अनुपात में मौजूद होती है, तो जीनोमिक विश्लेषण6 के परिणामों को काफी कमजोर और प्रभावित कर सकती है। दरअसल, 60% की न्यूनतम ट्यूमर सामग्री का उपयोग अक्सर ऐसे विश्लेषणों के लिए किया जाता है, जहां इस सीमा से कम पड़ने वाले ऊतकों को बाहर रखा जा सकता है, अन्यथा अध्ययनमानदंडों को पूरा करने के बावजूद 7. यह दुर्लभ रोग सेटिंग्स में विशेष रूप से समस्याग्रस्त हो सकता है, जहां रोगी के ऊतक कीमती होते हैं और उच्च संख्या में इकट्ठा करना मुश्किल होता है।
मैक्रोडिसेक्शन एक ऐसी विधि है जो सामान्य ऊतक की मात्रा को कम करके कम ट्यूमर सामग्री के प्रभाव को कम करतीहै 3. न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण से पहले इस तरह की भ्रामक गैर-ट्यूमर सामग्री को हटाने से ट्यूमर प्रतिशत सामग्री में काफी वृद्धि हो सकती है और इस प्रकार निकाले गए न्यूक्लिक एसिड की ट्यूमर शुद्धता बढ़ सकती है। ऊतक लकीर गंभीर रूप से विशेषज्ञ रोग समीक्षा पर निर्भर करता है, जिसमें ट्यूमर क्षेत्र की पहचान की जाती है और बोर्ड-प्रमाणित रोगविज्ञानी8 द्वारा ताजा उत्पन्न हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) दाग ऊतक अनुभाग पर परिक्रमा की जाती है। सर्कल किए गए एच एंड ई का उपयोग क्रमशः अवांछित और लक्ष्य ऊतकों को हटाने और संग्रह का मार्गदर्शन करने के लिए किया जाता है। यह प्रोटोकॉल मेयो क्लिनिक में एड्स और कैंसर नमूना संसाधन (एसीएसआर) तकनीकी कोर प्रयोगशाला में किए गए ऊतक कटाई के माध्यम से पैथोलॉजिकल समीक्षा से मैक्रोडिसेक्शन के चरणों का वर्णन करता है।
Protocol
सभी नमूने एकत्र किए गए थे और अनुमोदित मेयो क्लिनिक आईआरबी प्रोटोकॉल (पीआर 16-000507 और पीआर 2207-02) के अनुपालन में उपयोग किए गए थे।
1. नमूना तैयारी
- ऊतक फ्लोटेशन पानी स्नान चालू करें। तापमान को 39 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें और पानी को तापमान पर आने दें। पानी के स्नान में लकड़ी के संग्रह की छड़ें भिगोएँ।
- अनुभागित किए जाने वाले एफएफपीई ऊतक ब्लॉकों को पहचानें और पुनर्प्राप्त करें।
- पूर्व लेबल माइक्रोस्कोप एक हिस्टोलॉजी ग्रेड स्थायी मार्कर का उपयोग करके स्लाइड करता है जो विलायक धोने का सामना कर सकता है।
- एफएफपीई ब्लॉक को अनुभागित करने के लिए एक माइक्रोटोम का उपयोग करें। प्रत्येक ब्लॉक (चित्रा 1 ए) के लिए प्रति अनुभाग 4-5 μm की मोटाई पर कम से कम 2 पूर्ण चेहरे वर्गों में कटौती।
- स्लाइड बढ़ते (चित्रा 1 बी, सी) के लिए पूर्व गर्म ऊतक फ्लोटेशन स्नान करने के लिए ऊतक वर्गों के ताजा कटौती रिबन स्थानांतरण।
नोट: गर्म पानी वर्गों (चित्रा 1 सी) में झुर्रियों को "लोहा" करने में मदद करता है। - अनुक्रमिक रूप से प्रत्येक अनुभाग को संभालना, रिबन (चित्रा 1 डी) से दूर एक एकल अनुभाग को तोड़ने के लिए संदंश का उपयोग करें।
- एक पूर्व लेबल माइक्रोस्कोप स्लाइड पर एकल अनुभाग ले लीजिए।
- अनुभाग के नीचे एक कोण पर माइक्रोस्कोप स्लाइड को डुबोएं, स्लाइड को इस तरह से स्थिति दें कि ऊतक अनुभाग का किनारा स्लाइड (चित्रा 1 ई) को छूता है।
- एक बार ऊतक अनुभाग के संपर्क में आने के बाद, फ्लोटेशन स्नान से स्लाइड को धीरे-धीरे खींचें ताकि ऊतक अनुभाग को स्लाइड के खिलाफ फ्लश को सीधा करने की अनुमति मिल सके क्योंकि यह पानी (चित्रा 1 एफ) से उभरता है।
- माउंट 1 ऊतक अनुभाग प्रति स्लाइड और सभी वर्गों को एकत्र किया गया है जब तक दोहराना।
- स्लाइड-घुड़सवार ऊतक वर्गों को कमरे के तापमान (आरटी) पर अच्छी तरह से सूखने दें।
2. पैथोलॉजिकल समीक्षा
- प्रत्येक ब्लॉक9 के लिए एक प्रतिनिधि ऊतक अनुभाग पर एच एंड ई धुंधला प्रदर्शन करें।
- बोर्ड-प्रमाणित रोगविज्ञानी द्वारा पैथोलॉजिकल समीक्षा के लिए ताजा दाग वाले एच एंड ई को सबमिट करें।
नोट: समीक्षा के दौरान, रोगविज्ञानी निर्धारित करता है और प्रत्येक ऊतक में प्रतिशत ट्यूमर सामग्री रिकॉर्ड करता है और प्रत्येक एच एंड ई स्लाइड पर ट्यूमर क्षेत्र हलकों ( चित्रा 2 और चित्रा 3, पंक्ति 1 देखें)। तालिका 1 नमूनों ए-ई चित्रा 3, पंक्ति 1 में दिखाए गए के लिए एच एंड ई की पैथोलॉजिकल समीक्षा के दौरान निर्धारित सेलुलरिटी द्वारा प्रतिशत ट्यूमर सामग्री को रेखांकित करता है। <60% ट्यूमर सामग्री वाले वर्गों को मैक्रो-विच्छेदन7 की आवश्यकता होती है। न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के लिए आवश्यक वर्गों की संख्या परिक्रमा ट्यूमर क्षेत्र के आकार पर निर्भर करती है। यदि प्रोटोकॉल की धारा 1 में अपर्याप्त वर्गों को काट दिया गया था और आगे की कटौती संभव है, तो अतिरिक्त वर्गों को काटने की आवश्यकता हो सकती है।
3. डिपैराफिनाइजेशन
- एक धूआं हुड में, दो ग्लास धुंधला व्यंजनों को अनियंत्रित हिस्टोलॉजी ग्रेड डी-लिमोनीन या डी-लिमोनीन आधारित विलायक और 1 ग्लास धुंधला पकवान के साथ बिना पतला 200-प्रूफ आणविक ग्रेड इथेनॉल के साथ प्रीफिल करें।
सावधानी: त्वचा और आंखों के साथ डी-लिमोनेन संपर्क से बचें, वाष्प या धुंध के साँस लेने से बचें, और प्रज्वलन के स्रोतों से दूर रहें। इथेनॉल को गर्मी, स्पार्क्स और खुली लपटों से दूर रखें, त्वचा या आंखों के साथ फैलने और संपर्क से बचें, अच्छी तरह हवादार करें और श्वास वाष्प से बचें।
नोट: रैक स्लाइड (चित्रा 4 ए) को डुबोने के लिए व्यंजनों को पर्याप्त रूप से भरें; दिखाए गए 20-स्लाइड धुंधला व्यंजनों को भरने के लिए 250 एमएल की आवश्यकता होती है। प्रत्येक 40 स्लाइड के बाद डी-लिमोनीन और इथेनॉल वॉश को बदलें। डी-लिमोनीन (सी10एच16) जाइलीन के लिए एक वैकल्पिक, समान रूप से प्रभावी और कम विषाक्त डीवैक्सिंग एजेंट है जो हिस्टोलॉजिकल पद्धतियों में अधिक आम हो रहा है और अच्छी गुणवत्ता वाले न्यूक्लिक एसिड पोस्ट निष्कर्षण 10,11,12,13,14 पैदा करता है। यद्यपि इस प्रोटोकॉल को अधिक जैव अनुकूल विकल्प15 का उपयोग करके किया जा सकता है, निकाले गए न्यूक्लिक एसिड की गुणवत्ता पर उनके प्रभाव, यदि कोई हो, तो निर्धारित किया जाना बाकी है। - ग्लास कोप्लिन स्लाइड-रैक (चित्रा 4 ए, इनसेट) में बिना दाग वाले एफएफपीई ऊतक घुड़सवार स्लाइड रैक करें।
- 2 मिनट के लिए डी-लिमोनीन धोने में रैक की गई स्लाइड्स को डुबोएं; पहले 20 एस के लिए धीरे से आंदोलन करें।
नोट: धोने से स्लाइड के रैक को हटाते समय वॉश के बीच कैरीओवर को कम करने के लिए, अतिरिक्त धोने को हटाने के लिए टिशू पेपर पर रैक के निचले हिस्से को धीरे-धीरे डब करने से पहले रैक को संक्षेप में निकालने की अनुमति दें। - 2 मिनट के लिए अनियंत्रित डी-लिमोनीन धोने में रैक की गई स्लाइड्स को डुबोएं; पहले 20 एस के लिए धीरे से आंदोलन करें। निकालें, नाली और रैक को फिर से थपकाएं।
- 2 मिनट के लिए इथेनॉल धोने में रैक स्लाइड डुबोएं; पहले 20 एस के लिए धीरे से आंदोलन करें। रैक निकालें और इसे नाली के लिए एक शोषक ऊतक पर रखें। स्लाइड को कम से कम 10 मिनट के लिए सूखने दें, लेकिन 2 घंटे से अधिक नहीं।
3. मैक्रोडिसेक्शन
- बेंच पर, डीएनएएसई / आरएनएएसई मुक्त पानी में 3% ग्लिसरॉल के 50 मिलीलीटर के साथ एक कोप्लिन ग्लास जार को प्रीफिल करें
नोट: हर 40 स्लाइड के बाद ग्लिसरॉल धोने को बदलें। - प्री-लेबल और प्रीफिल 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब प्रति माइक्रोट्यूब प्रति ऊतक पाचन बफर के 160 μL के साथ।
नोट: मैक्रोडिसेक्शन के बाद किए गए न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण ने डीएनए / आरएनए एफएफपीई निष्कर्षण किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग किया। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले ऊतक पाचन बफर में प्रोटीनेज के 10 μL और पीकेडी बफर के 150 μL शामिल थे। - डीपैराफिनाइज्ड ऊतक स्लाइड के पीछे एच एंड ई पर पैथोलॉजिकल चिह्नों का पता लगाएं।
नोट: गैर-डिपैराफिनाइज्ड ऊतकों (चित्रा 3, पंक्ति 2 और चित्रा 4 बी) की तुलना में, डिपैराफिनाइज्ड ऊतक सफेद और अत्यधिक दृश्यमान हैं (चित्रा 3, पंक्ति 3, और चित्रा 4 सी)। यह बढ़ी हुई दृश्यता और डिपैराफिनाइज्ड ऊतक विशेषताओं की समझदारी है जो मैक्रोडिसेक्शन की अनुमति देती है। बेंच पर एच एंड ई चेहरे को नीचे रखें और मिलान किए गए पैथोलॉजिस्ट की पीठ के खिलाफ डेपाराफिनाइज्ड स्लाइड के सामने एच एंड ई (चित्रा 4 डी) की समीक्षा करें। एच एंड ई ऊतक (चित्रा 4 ई) के साथ डिपोराफिनाइज्ड ऊतक संरेखित करें। पैथोलॉजिस्ट के निशान का पता लगाना मैक्रोडिसेक्शन प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है, और इन चिह्नों को यथासंभव सटीक रूप से पुन: पेश करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। यह नमूने बी, डी, और ई (चित्रा 3, चित्रा 4 ई, और चित्रा 4 ई इनसेट आई) जैसे छोटे और या डिस्कनेक्ट किए गए ऊतकों के लिए विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है। अनुरेखण में सहायता के लिए, किसी को पैथोलॉजिस्ट-खींचे गए चिह्नों का पता लगाने के लिए एक स्याही ठीक या अल्ट्राफाइन निबेड मार्कर (चित्रा 4 ई, इनसेट ii) का उपयोग करना चाहिए। इथेनॉल वाइप्स त्रुटियों को दूर करने और यदि आवश्यक हो तो रिट्रेसिंग की अनुमति देने के लिए उपयोगी हो सकते हैं। - अब चिह्नित डिपैराफिनाइज्ड स्लाइड ऊतक फेस-अप को चालू करें और ट्यूमर क्षेत्र के किनारों को पूर्व-कटौती करने के लिए एक साफ रेजर ब्लेड के कोने के साथ मार्कर की रेखा का पता लगाएं।
- प्रत्येक स्लाइड को क्रमिक रूप से संभालना, 3% ग्लिसरॉल समाधान में डिपैराफिनाइज्ड स्लाइड्स को डुबोएं। सुनिश्चित करें कि धीरे-धीरे स्लाइड को हटाने से पहले ऊतक पूरी तरह से जलमग्न है (चित्रा 4 एफ)।
नोट: ग्लिसरॉल डुबकी का उद्देश्य ऊतक संग्रह की सहायता के लिए ऊतक को गीला करना है, लेकिन स्थिर चार्ज के निर्माण को कम करना है जो ऊतक और प्लास्टिक माइक्रोट्यूब के बीच प्रतिकर्षण का कारण बन सकता है जिसमें एकत्र ऊतक रखा जाना चाहिए। - अतिरिक्त ग्लिसरॉल समाधान को हटाने के लिए धीरे-धीरे एक ऊतक के साथ स्लाइड के पीछे पोंछें, और बेंच पर स्लाइड रखें, साइड फेस को मिटा दें। ऊतकों को 1-2 मिनट के लिए संक्षेप में एयरड्राई करने की अनुमति दें।
नोट: निष्कर्षण प्रक्रिया में अतिरिक्त ग्लिसरॉल के ऊपर ले जाना न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण की उपज और गुणवत्ता को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है। ऊतकों को थोड़ा नम होना चाहिए लेकिन एकत्र होने पर स्पष्ट रूप से गीला नहीं होना चाहिए। - जहां ब्याज के ट्यूमर क्षेत्र स्लाइड पर स्थित है पर निर्भर करता है, रेजर ब्लेड के फ्लैट किनारे का उपयोग या तो (ए) सीधे ट्यूमर ऊतक इकट्ठा करने के लिए, स्लाइड से ब्याज के ऊतक को परिमार्जन /इकट्ठा करने के लिए रेजर का उपयोग करें, या (बी) ब्याज के ट्यूमर ऊतक (चित्रा 3) को इकट्ठा करने से पहले गैर-ट्यूमर ऊतक को हटा दें और त्यागें।
नोट: एकत्रित ऊतक ब्लेड के तल पर इकट्ठा या रोल करने के लिए जाता है (चित्रा 4 जी) - ब्लेड (चित्रा 4 एच और इनसेट) से एकत्रित ऊतक को हटाने के लिए एक लकड़ी की छड़ी का उपयोग करें और इसे उपयुक्त पूर्व-लेबल और प्रीफिल्ड माइक्रोट्यूब (चित्रा 4 आई) में स्थानांतरित करें।
नोट: पाचन बफर तरल में लकड़ी के पिक से ऊतक को "खींचने" का कार्य करता है। - न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के लिए आगे बढ़ें।
नोट: न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण निर्माता के निर्देशों के अनुसार डीएनए / आरएनए एफएफपीई निष्कर्षण किट का उपयोग करके पूरा किया गया था, और परिणामस्वरूप न्यूक्लिक एसिड को यूवी-विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की गई थी। परिणामी आरएनए डिजिटल जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग-आधारित डीएलबीसीएल 90 परख16 पर चलाया गया था।
Representative Results
कुल 5 फैलाना बड़े बी-सेल लिंफोमा (डीएलबीसीएल) एफएफपीई ऊतक ब्लॉक खंडों को खंडित किया गया था, और परिणामस्वरूप वर्गों को या तो मैक्रोडिस्केक्टेड किया गया था या न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण से पहले नहीं था। निकाले गए आरएनए को डीएलबीसीएल 90 परख16 पर चलाया गया था। मैक्रोडिस्केक्टेड नमूनों को दो बार चलाया गया था, एक बार आरएनए स्टॉक एकाग्रता के 5 μL का उपयोग करके लेकिन कुल आरएनए इनपुट के 300 एनजी से अधिक नहीं और एक बार आरएनए स्टॉक के 5 μL का उपयोग करके अपने संबंधित गैर-विच्छेदित समकक्षों के आरएनए इनपुट से मेल खाने के लिए पतला किया गया था। डीएलबीसीएल 90 परिणाम तालिका 2 में उल्लिखित हैं।
डीएलबीसीएल में विभिन्न चिकित्सीय जवाबदेही के साथ 3 अलग-अलग सेल ऑफ ओरिजिन (सीओओ) उपप्रकार शामिल हैं, अर्थात् जीसीबी, एबीसी, और एक मध्यवर्ती समूह जिसे अवर्गीकृत या यूएनसी17,18 के रूप में जाना जाता है। एमवाईसी, बीसीएल 2, और या बीसीएल 6 को अकेले या संयोजन (डबल या ट्रिपल हिट) में शामिल ट्रांसलोकेशन भी अक्सर डीएलबीसीएल में देखे जाते हैं, खासकर जीसीबी उपप्रकार19 में। डीएलबीसीएल 90 परख अपने पूर्ववर्ती, लिम्फ 2 सीएक्स नैदानिक परख का विस्तार है, और इस प्रकार डीएलबीसीएल सीओओ उपप्रकार निर्धारण में सक्षम है, लेकिन मुख्य रूप से प्रतिदीप्ति इन-सीटू संकरण (फिश) 16,20 के विकल्प के रूप में डिजिटल जीन अभिव्यक्ति का उपयोग करके बीसीएल 2 से जुड़े डबल हिट (डीएच) अनुवादों को आश्रय देने वाले नमूनों की पहचान करने के लिए विकसित किया गया था। तालिका 2 के परिणाम बताते हैं कि मैक्रोडिसेक्शन ने या तो सीओओ या डीएचआईटीएसआईजी स्थिति को बदल दिया है, जांच किए गए नमूनों के 60% (3/5) के लिए कॉल करता है।
नमूना ए के मैक्रोडिसेक्शन का सीओओ कॉल पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा, लेकिन डीईटीआईटीआईजी कॉल को एनईजी से यूएनक्लास में बदल दिया, और यह परिवर्तन मैक्रोडिस्केक्टेड नमूना आरएनए इनपुट के बावजूद और समान संभावना स्कोर (0.224, 0.254) के साथ देखा गया। इसके विपरीत, नमूना सी के मैक्रोडिसेक्शन का डीएचआईटीएसआईजी कॉल पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा, लेकिन जीसीबी से यूएनसी में सीओओ कॉल को बदल दिया। फिर से, यह परिवर्तन मैक्रोडिस्केक्टेड नमूना आरएनए इनपुट के बावजूद देखा गया था। हालांकि, 0.117 पर, सीओओ कॉल संभावना कम आरएनए इनपुट के साथ मैक्रोडिस्केक्टेड नमूने के लिए 0.1 की कॉल थ्रेसहोल्ड के करीब थी। नमूना ए के समान, नमूना ई के मैक्रोडिसेक्शन का सीओओ कॉल पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा लेकिन डीएचआईटीएसिग कॉल को बदल दिया। हालांकि, नमूना ई के लिए कॉल अनक्लास से एनईजी में बदल गया और मैक्रोडिस्केक्टेड नमूना आरएनए इनपुट के बावजूद यथोचित समान संभावना कॉल (0.849, 0.833) के साथ ऐसा किया। विशेष रूप से, डीएचआईटीएसआईजी एनईजी में यह कॉल परिवर्तन जैविक समझ में आता है कि नमूना ई एबीसी-डीएलबीसीएल में पाया गया था, और बीसीएल 2 से जुड़े डबल हिट ट्रांसलोकेशन को विशेष रूप से जीसीबी-डीएलबीसीएल19 में देखा गया है।
चित्रा 1: माइक्रोटोम चक द्वारा जगह में आयोजित एफएफपीई ऊतक ब्लॉक और अनुक्रमिक एफएफपीई ऊतक वर्गों के रिबन का उत्पादन करने के लिए कटौती का उपयोग करके स्लाइड-घुड़सवार ऊतक वर्गों को उत्पन्न करना। (बी) पूर्व-लथपथ लकड़ी की छड़ों का उपयोग करके, रिबन को माइक्रोटोम से एकत्र किया जाता है और गर्म पानी के स्नान में स्थानांतरित किया जाता है। (सी) पानी की गर्मी ऊतक रिबन में क्रीज को बाहर निकालने में मदद करती है। (डी) व्यक्तिगत एफएफपीई ऊतक वर्गों को दो वर्गों के जंक्शन पर बंद संदंश रखकर और धीरे-धीरे संदंश खोलकर ऊतक रिबन से हटा दिया जाता है, जो वर्गों को एक दूसरे से दूर तोड़ता है। (ई) अनुभागों को एक कोण पर एक ग्लास स्लाइड को डुबोकर और धीरे-धीरे ऊतक अनुभाग की ओर पक्ष को स्थानांतरित करके पानी से एकत्र किया जाता है जब तक कि अनुभाग का किनारा ग्लास स्लाइड को छू न जाए। (एफ) एक बार स्लाइड और अनुभाग स्पर्श कर रहे हैं, धीरे-धीरे पानी से स्लाइड को हटा दें, जिससे ऊतक अनुभाग स्लाइड के खिलाफ फ्लश गिर सके। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: एक हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) दाग वाले वर्गों की पैथोलॉजी और हिस्टोलॉजिकल समीक्षा( ए, बी) एच एंड ई ऊतक अनुभाग को बोर्ड-प्रमाणित रोगविज्ञानी द्वारा सूक्ष्म समीक्षा के अधीन किया जाता है। (सी, डी) एक बार पैथोलॉजिस्ट ने पूरे ऊतक को देखा और पाया कि यह 100% ट्यूमर ऊतक नहीं है, पैथोलॉजिस्ट ऊतक के ट्यूमर क्षेत्र को घेरने के लिए एक मार्कर का उपयोग करेगा। (ई, एफ) मूल एफएफपीई ऊतक ब्लॉक के खिलाफ चिह्नित एच एंड ई को पकड़ना दिखाता है कि सभी ऊतक ट्यूमर सामग्री नहीं हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: ऊतक के नमूने। यह छवि पैथोलॉजिकल रूप से समीक्षा की गई और ट्यूमर चिह्नित एच एंड ई (पंक्ति 1), असंसाधित स्लाइड-माउंटेड एफएफपीई ऊतक अनुभाग (पंक्ति 2), अपुष्ट स्लाइड-माउंटेड एफएफपीई ऊतक अनुभागों (पंक्ति 3), स्लाइड के पीछे पता लगाए गए पैथोलॉजी चिह्नों के साथ अपैराफिनाइज्ड स्लाइड-माउंटेड एफएफपीई ऊतक वर्गों को प्रदर्शित करती है (पंक्ति 4), डिपैराफिनाइज्ड और मैक्रोडिसेक्टेड स्लाइड-माउंटेड एफएफपीई ऊतक अनुभाग (पंक्ति 5) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: एफएफपीई ऊतक वर्गों के डीपैराफिनाइजेशन और मैक्रो-विच्छेदन: (ए) एक धूआं हुड में, स्लाइड रैक में घुड़सवार एफएफपीई ऊतकों को दो डी-लिमोनीन वॉश और एक इथेनॉल धोने में धोया जाता है। (बी, सी) धोने के बाद, सभी पैराफिन को हटा दिया गया है, और स्लाइड पर केवल ऊतक रहता है, जो अब अपने प्रीवाश किए गए समकक्ष की तुलना में सफेद और अत्यधिक दिखाई देता है। (ई) एच एंड ई पर ट्यूमर क्षेत्र के निशान तब एक ठीक या अल्ट्राफाइन निबेड स्थायी मार्कर (एफ) का उपयोग करके डीपाराफिनाइज्ड स्लाइड के पीछे का पता लगाया जाता है चिह्नित डिपैराफिनाइज्ड स्लाइड-माउंटेड टिशू सेक्शन को संग्रह के लिए ऊतक अनुभाग को गीला करने के लिए ग्लिसरॉल धोने में डुबोया जाता है। स्लाइड को ग्लिसरॉल से धीरे-धीरे हटा दिया जाता है, और स्लाइड ऊतक को बेंच पर फेस-अप बिछाने से पहले अतिरिक्त ग्लिसरॉल को हटाने के लिए स्लाइड के पीछे एक ऊतक के साथ मिटा दिया जाता है। (जी) एक साफ रेजर ब्लेड के सपाट पक्ष का उपयोग करके, ऊतक को मैक्रोडिस्केक्ट किया जाता है, और पैथोलॉजिस्ट चिह्नों के बाहर अवांछित ऊतक को ब्याज के ऊतक को इकट्ठा करने से पहले त्याग दिया जाता है, जो ब्लेड के किनारे इकट्ठा होता है। (एच) ब्लेड के किनारे से एकत्रित ऊतक को हटाने के लिए एक लकड़ी की छड़ी का उपयोग किया जाता है। (मैं) ऊतक तो एक पूर्व लेबल माइक्रोट्यूब प्रीफिल ऊतक पाचन बफर करने के लिए स्थानांतरित कर दिया है और न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के लिए तैयार है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| सैंपल आईडी | पूरे ऊतक (ए) | ऊतक का वृत्ताकार क्षेत्र (ख) | पूरे ऊतक की समग्र ट्यूमर सामग्री (सी) | मैक्रोडिसेक्शन द्वारा ट्यूमर सामग्री में गुना वृद्धि (डी) | मैक्रोडिसेक्टेड नहीं (ई) | मैक्रोडिसेक्टेड (एफ) | ||||
| % व्यवहार्य ट्यूमर | % अन्य | % व्यवहार्य ट्यूमर | % अन्य | # निकाले गए 5 μm स्लाइड्स | आरएनए सांद्र (एनजी / | # निकाले गए 5 μm स्लाइड्स | आरएनए सांद्र (एनजी/μL) |
|||
| नमूना ए | 60 | 40 | 75 | 25 | 45 | 1.7 | 2 | 19.0 | 4 | 58.3 |
| नमूना बी | 60 | 40 | 65 | 35 | 39 | 1.7 | 1 | 34.0 | 2 | 60.0 |
| नमूना सी | 40 | 60 | 65 | 35 | 26 | 2.5 | 1 | 13.7 | 2 | 46.2 |
| नमूना डी | 35 | 65 | 90 | 10 | 32 | 2.9 | 1 | 57.3 | 2 | 60.0 |
| नमूना ई | 20 | 80 | 30 | 70 | 6 | 5.0 | 3 | 25.2 | 3 | 44.6 |
तालिका 1: पैथोलॉजी समीक्षा डेटा। तालिका (ए) क्षेत्र द्वारा पूरे ऊतक अनुभाग में व्यवहार्य ट्यूमर का प्रतिशत दिखाती है, (बी) सेलुलरिटी द्वारा समीक्षा के दौरान रोगविज्ञानी द्वारा परिक्रमा / चिह्नित क्षेत्र में व्यवहार्य ट्यूमर का प्रतिशत, (सी) पूरे ऊतक की अनुमानित समग्र ट्यूमर सेलुलरिटी (ए एक्स बी), (डी) मैक्रोडिसेक्शन के साथ प्राप्त ट्यूमर सेलुलरिटी में अनुमानित गुना वृद्धि, (ई और एफ) निकाले गए 5 μm बिना दाग वाले एफएफपीई स्लाइड-माउंटेड ऊतक वर्गों की संख्या और मिलान किए गए गैर-मैक्रोडिस्केक्टेड और मैक्रोडिस्केक्टेड नमूनों के लिए परिणामी आरएनए सांद्रता। % अन्य किसी दिए गए नमूने में मौजूद अन्य सभी ऊतकों को संदर्भित करता है जो ट्यूमर ऊतक नहीं है और इसमें संयोजी ऊतक, स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट, रक्त वाहिकाओं के साथ-साथ अन्य अंतर्निहित स्ट्रोमल तत्व शामिल हो सकते हैं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
| सैंपल आईडी | आरएनए इनपुट (एनजी) | डीएलबीसीएल 90 सीओओ कॉल | डीएलबीसीएल 90 कॉल संभावना | डीएचआईटीएसआईजी कॉल | डीएचआईटीएसआईजी संभावना का पता लगाता है | डीएचआईटीएसआईजी ने कम संभावना जताई | |
| मैक्रो डिसेक्टेड नहीं | नमूना ए | 95.0 | जीसीबी | 0.000 | एनईजी | 0.135 | 0.865 |
| नमूना बी | 170.0 | जीसीबी | 0.000 | एनईजी | 0.032 | 0.968 | |
| नमूना सी | 68.5 | जीसीबी | 0.028 | एनईजी | 0.033 | 0.967 | |
| नमूना डी | 286.5 | वर्णमाला | 0.998 | एनईजी | 0.002 | 0.998 | |
| नमूना ई | 126.0 | वर्णमाला | 0.989 | अनक्लास | 0.212 | 0.788 | |
| मैक्रो डिसेक्टेड | नमूना A_M | 291.7 | जीसीबी | 0.000 | अनक्लास | 0.224 | 0.776 |
| नमूना B_M | 300.0 | जीसीबी | 0.000 | एनईजी | 0.016 | 0.984 | |
| नमूना C_M | 231.2 | अनक्लास | 0.210 | एनईजी | 0.015 | 0.985 | |
| नमूना D_M | 300.0 | वर्णमाला | 0.999 | एनईजी | 0.002 | 0.998 | |
| नमूना E_M | 223.2 | वर्णमाला | 0.987 | एनईजी | 0.151 | 0.849 | |
| मैक्रोडिसेक्टेड और आरएनए पतला | नमूना A_M | 95.0 | जीसीबी | 0.000 | अनक्लास | 0.254 | 0.746 |
| नमूना B_M | 170.0 | जीसीबी | 0.000 | एनईजी | 0.023 | 0.977 | |
| नमूना C_M | 68.5 | अनक्लास | 0.117 | एनईजी | 0.027 | 0.973 | |
| नमूना D_M | 286.5 | वर्णमाला | 0.999 | एनईजी | 0.002 | 0.998 | |
| नमूना E_M | 126.0 | वर्णमाला | 0.995 | एनईजी | 0.167 | 0.833 | |
तालिका 2: डीएलबीसीएल 90 डिजिटल जीन अभिव्यक्ति परख परिणाम। न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण से पहले पांच नमूने (ए-ई) या तो मैक्रोडिस्केक्टेड या मैक्रोडिसेक्टेड नहीं थे। परिणामी आरएनए डीएलबीसीएल 90 परख पर चलाया गया था, जिसके लिए अधिकतम आरएनए इनपुट वॉल्यूम 5 μL है। गैर-मैक्रोडिस्केक्टेड नमूने स्टॉक आरएनए के 5 μL का उपयोग करके चलाए गए थे। प्रत्येक मैक्रोडिस्केक्टेड नमूने को स्टॉक आरएनए के (ए) 5 μL का उपयोग करके दो बार चलाया गया था जब तक कि 60 एनजी / μL के विभाज्य संभव नहीं थे और (बी) स्टॉक आरएनए के 5 μL को उनके गैर-मैक्रोडिस्केक्टेड समकक्षों की सांद्रता / इनपुट से मेल खाने के लिए पतला किया गया था। प्रत्यय _M दर्शाता है कि वह नमूना मैक्रोडिस्केक्टेड था। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
एफएफपीई ऊतक अक्सर ट्यूमर और गैर-ट्यूमर ऊतकों के विषम मिश्रण होते हैं। उच्च संवेदनशीलता जीनोमिक परीक्षण नैदानिक और अनुसंधान दोनों सेटिंग्स में तेजी से प्रचलित हो रहे हैं, लेकिन दूषित गैर-ट्यूमर ऊतक की उपस्थिति से भ्रमित हो सकते हैं। दरअसल, जीनोमिक अध्ययन के लिए अक्सर 60% की न्यूनतम ट्यूमर सामग्री की सिफारिश की जाती है। प्रतिशत ट्यूमर ट्यूमर सामग्री द्वारा कब्जा कर लिया ऊतक के क्षेत्र या ऊतक के भीतर ट्यूमर कोशिकाओं के अनुपात से निर्धारित किया जा सकता है। यद्यपि क्षेत्र द्वारा ट्यूमर ट्यूमर शुद्धता के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला मीट्रिक है, यह हमेशा ऊतक के सटीक विवरण को चित्रित नहीं करता है। दो ऊतकों पर विचार करें, दोनों 1000 कोशिकाओं के साथ, जिनमें से 500 ट्यूमर कोशिकाएं हैं। ऊतक ए में, 500 गैर-ट्यूमर कोशिकाएं ट्यूमर कोशिका के समान मात्रा के साथ स्ट्रोमल कोशिकाएं होती हैं। इस ऊतक में, ट्यूमर का प्रतिशत कोशिकीयता और क्षेत्र दोनों द्वारा 50% माना जा सकता है। ऊतक बी में, 500 गैर-ट्यूमर कोशिकाएं वसा कोशिकाएं होती हैं जो ट्यूमर कोशिका के 4 गुना होती हैं। इस ऊतक में, प्रतिशत ट्यूमर अभी भी सेलुलरता द्वारा 50% है लेकिन क्षेत्र द्वारा 20% है। एक तीसरा ऊतक, ऊतक सी, 500 ट्यूमर कोशिकाओं और 400 वसा कोशिकाओं और 800 स्ट्रोमल कोशिकाओं से बना होता है जो क्रमशः ट्यूमर कोशिकाओं के 4x और 0.5x होते हैं। यह देखते हुए कि 100 वसा कोशिकाएं 800 स्ट्रोमल कोशिकाओं की मात्रा के बराबर होती हैं, ऊतक सी का प्रतिशत ट्यूमर सेलुलरिटी (500/1700) द्वारा 29% है लेकिन फिर भी क्षेत्र द्वारा 20% है। ऊतक डी में 1x, 4x और 0.1x की मात्रा अनुपात के साथ ट्यूमर, वसा और स्ट्रोमल कोशिकाएं भी शामिल हैं। हालांकि, कोशिकाओं की संख्या क्रमशः 400, 10 और 720 है। इस प्रकार, ऊतक डी का प्रतिशत ट्यूमर सेलुलरिटी (400/1130) द्वारा 35% है लेकिन क्षेत्र द्वारा 78% है। ये उदाहरण अत्यधिक सरलीकृत हैं और वास्तविक दुनिया के ऊतक रचनाओं को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं, लेकिन स्पष्ट रूप से ऊतक संरचना के महत्व और क्षेत्र और सेलुलरता द्वारा ट्यूमर सामग्री के बीच अंतर को व्यक्त करते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि जब डाउनस्ट्रीम न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के लिए ट्यूमर सामग्री को समृद्ध करने की बात आती है, तो ट्यूमर कोशिकाओं की तुलना में अधिक गैर-ट्यूमर कोशिकाओं से जीनोमिक सामग्री निकालने की बढ़ती भ्रामक क्षमता के कारण ट्यूमर सेलुलरिटी अधिक महत्वपूर्ण विशेषता है। यह न केवल प्रतिशत सेलुलरता के संदर्भ में ऊतकों की ट्यूमर सामग्री का आकलन करने की आवश्यकता को रेखांकित करता है, बल्कि गैर-ट्यूमर ऊतक के किसी भी संभावित नकारात्मक प्रभाव को कम करने के लिए अवांछित ऊतक को उत्पादित करने की आवश्यकता को भी रेखांकित करता है। ऊतक संवर्धन के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं, जिनमें मुख्य मैक्रोडिसेक्शन और माइक्रोडिसेक्शन हैं।
मैक्रोडिसेक्शन, इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि, अपेक्षाकृत त्वरित, सरल है, और महंगे या विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है। यद्यपि मैक्रोडिसेक्शन ट्यूमर सामग्री में काफी सुधार कर सकता है, यह समझना महत्वपूर्ण है कि यह गैर-ट्यूमर सामग्री को पूरी तरह से समाप्त नहीं करता है। मैक्रोडिसेक्शन का उद्देश्य अवांछित ऊतक से उपजी "शोर" को कम करने के लिए अवांछित ऊतक के बहिष्कार के माध्यम से ब्याज के ऊतक को पर्याप्त रूप से समृद्ध करना है, जो बदले में ब्याज के ऊतक से ब्याज के संकेत को बढ़ा सकता है। इस प्रकार, मैक्रोडिसेक्शन मध्यस्थता ट्यूमर संवर्धन ब्याज के मार्करों, विशेष रूप से कम बहुतायत या खराब अभिव्यक्ति के साथ ट्यूमर-विशिष्ट आणविक मार्करों का बेहतर पता लगाने के लिए सिग्नल-टू-शोर अनुपात को बढ़ाने का एक तरीका है। हालांकि, रेजर ब्लेड जैसे मोटे उपकरणों द्वारा दी जाने वाली सटीकता की कमी के कारण मैक्रोडिसेक्शन की सीमाएं हैं और पैथोलॉजिस्ट के मार्कर की लाइन मोटाई से उपजी सटीक मुद्दों के साथ-साथ पैथोलॉजिस्ट एच एंड ई सीमांकन का पता लगाते समय संभावित त्रुटियों के लिए अतिसंवेदनशील है। जैसा कि ऊपर बताया गया है, ट्यूमर के भीतर एम्बेडेड अंतर्निहित और ट्यूमर-उत्प्रेरण स्ट्रोमल तत्वों (यानी, संयोजी ऊतक, स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट, रक्त वाहिकाओं, सौम्य प्रतिक्रियाशील लिम्फोसाइट्स, मैक्रोफेज) की उपस्थिति के कारण 100% ट्यूमर शुद्धता प्राप्त करना संभव नहीं है। दरअसल, कई आक्रामक या फैलाने वाली घुसपैठ की दुर्दमताएं एक मजबूत डेस्मोप्लास्टिक स्ट्रोमल प्रतिक्रिया को प्रेरित करती हैं, जिसके परिणामस्वरूप ट्यूमर कोशिकाओं के समूह होते हैं जो स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट और अन्य गैर-नियोप्लास्टिक सेल प्रकारों के साथ घनिष्ठ रूप से मिश्रित होते हैं; जहां इस स्ट्रोमल प्रतिक्रिया पैटर्न से जुड़े ट्यूमर, जैसे कि अग्नाशयी कैंसर के ऊतक21, मैनुअल मैक्रोडिसेक्शन के बजाय डिजिटल रूप से निर्देशित माइक्रोडिसेक्शन से अधिक लाभ उठा सकते हैं।
मैनुअल माइक्रोडिसेक्शन एक माइक्रोस्कोप के तहत सुई या स्केलपेल का उपयोग करके ऊतकों विशिष्ट कोशिकाओं या आबादी की पहचान, विच्छेदन और अलगाव में सहायता के लिए किया जाता है और मैक्रोडिसेक्शन22 पर बढ़ी हुई सटीकता का लाभ होता है। हालांकि, मैनुअल माइक्रोडिसेक्शन एक श्रमसाध्य प्रक्रिया है जिसमें कम ट्यूमर सामग्री या जटिल विशेषताओं वाले जटिल ऊतकों के लिए आवश्यक चालाकी का अभाव होता है जो मैनुअल विच्छेदन के साथ असंगत होते हैं। लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन जैसे उच्च परिशुद्धता स्वचालित तरीकों का उपयोग करके ऐसे ऊतकों को विच्छेदित किया जा सकता है। दरअसल, डिजिटल रूप से निर्देशित माइक्रोडिसेक्शन को अग्नाशय के कैंसर के ऊतकों में मैनुअल मैक्रोडिसेक्शन की तुलना में उच्च प्रतिशत ट्यूमर सामग्री उत्पन्न करने के लिए दिखाया गयाहै 23. हालांकि, इन उच्च परिशुद्धता स्वचालित तरीकों की कमियों, जैसे कि विशेष, महंगे उपकरण और उच्च प्रशिक्षित व्यक्तियों की आवश्यकता ने वर्कफ़्लो में इसके समावेश में बाधा डाली है। जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग पर मैक्रोडिसेक्शन और लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम) के प्रभावों की तुलना में डी ब्रुइन एट अल के एक अध्ययन में पाया गया कि एलसीएम नमूनों में कुल आरएनए पैदावार (30 एनजी औसत) कम थी और सीडीएनए लाइब्रेरी प्रेप इनपुट थ्रेसहोल्ड24 को पूरा करने के लिए एमआरएनए प्रवर्धन के दो दौर की आवश्यकता थी। लेखकों ने पाया कि परिणामस्वरूप एलसीएम जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल एमआरएनए प्रवर्धन के दौर से प्रभावित थे, मैक्रोडिस्केक्टेड प्रोफाइल की तुलना में गैर-ट्यूमर स्ट्रोमल योगदान से प्रभावित थे और निष्कर्ष निकाला कि विश्वसनीय जीन अभिव्यक्ति डेटा24 उत्पन्न करने के लिए मैक्रोडिसेक्शन का पर्याप्त रूप से उपयोग किया जा सकता है।
नैनोस्ट्रिंग डिजिटल जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग का एक महत्वपूर्ण लाभ, खासकर जब अत्यधिक अपमानित एफएफपीई व्युत्पन्न आरएनए के साथ काम करते हैं, तो यह है कि इसे आरएनए प्रवर्धन या सीडीएनए पुस्तकालयों की तैयारी जैसी एंजाइमी निर्भर प्रक्रियाओं की आवश्यकता नहीं होती है। हालांकि, परख आमतौर पर कुल आरएनए25,26 के 50-300 एनजी के बीच इनपुट के लिए अनुकूलित होते हैं, जो डी ब्रुइन एट अल 24 के निष्कर्षों के आधार पर, ऊतक इनपुट को बढ़ाए बिना माइक्रोडिसेक्टेड ऊतकों के साथ संगत नहीं हो सकता है; एक युग में एक प्रतिकूल मांग जहां ऊतक के नमूने सर्जिकल रिसेक्शन के बजाय छोटे बायोप्सी के रूप में तेजी से एकत्र किए जाते हैं। डीएलबीसीएल 90 परख के लिए उपयोग किए जाने वाले आरएनए इनपुट मैक्रोडिसेक्टेड और गैर-विच्छेदित ऊतकों दोनों के लिए 68.5-300 एनजी से लेकर थे। परिणाम बताते हैं कि मैक्रोडिसेक्शन के परिणामस्वरूप जांच किए गए 60% नमूनों में कॉल परिवर्तन हुए और मैक्रोडिसेक्टेड नमूनों के आरएनए इनपुट के बावजूद इन परिवर्तनों को देखा गया। हालांकि, कम आरएनए इनपुट के लिए सीओओ संभावना ने सीओओ जीसीबी / यूएनसी संभावना कॉल थ्रेसहोल्ड का अतिक्रमण किया, जहां थ्रेसहोल्ड जीसीबी के लिए 0 से <0.1, यूएनसी के लिए 0.1-0.9 और एबीसी कॉल20 के लिए >0.9 से 1.0 है। प्रमुख डीएलबीसीएल सीओओ उपप्रकार जीसीबी और एबीसी हैं, जो सभी डीएलबीसीएल मामलों का 41% और 44% बनाते हैं, यूएनसी दोनों के मध्यवर्ती समूह का प्रतिनिधित्व करता है और एबीसी सबसे आक्रामक 20,27 है। इस प्रकार, जबकि नमूना सी के मैक्रोडिसेक्शन पर सीओओ कॉल परिवर्तन ने जीसीबी से एबीसी तक सीओओ उपप्रकार में स्पष्ट परिवर्तन का कारण नहीं बना, जीसीबी से यूएनसी में परिवर्तन अधिक आक्रामक बीमारी की ओर बदलाव का सुझाव दे सकता है। इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से संकेत मिलता है कि यूएनसी उपप्रकार केवल एक मध्यवर्ती उपप्रकार नहीं है और इसमें संभावित रूप से उपप्रकार-विशिष्ट चिकित्सीय रूप से शोषण योग्य विशेषताएं हो सकती हैं28. इसी तरह, नमूनों ए और ई के मैक्रोडिसेक्शन ने डीएच नकारात्मक से डीएच पॉजिटिव, या इसके विपरीत डीएचआईटीएसआईजी कॉल में स्पष्ट परिवर्तन का कारण नहीं बना। तथापि, एनईजी से यूएनक्लास तक जीसीबी नमूना (नमूना ए) और मैक्रोडिसेक्शन पर यूएनक्लास से एनईजी तक एबीसी नमूना (नमूना ई) की गतिविधियां जैविक रूप से उपयुक्त हैं क्योंकि बीसीएल 2 से जुड़े डबल हिट ट्रांसलोकेशन को विशेष रूप से जीसीबी घटना19 बताया गया है। यद्यपि नैदानिक सेटिंग्स में फिश द्वारा पारंपरिक रूप से और सर्वव्यापी रूप से ट्रांसलोकेशन का पता लगाया जाता है, लेकिन उनके पता लगाने के लिए एक वैकल्पिक कम शामिल और समय लेने वाली विधि की पहचान करने के लिए एक बढ़ती गति है। डीएलबीसीएल 90 परख एक महत्वपूर्ण उपकरण है जो इस आवश्यकता को संबोधित करता है, जहां इसके उपयोग के लिए तर्क को इस खोज से मजबूत किया जाता है कि यह परख नैदानिक निदान29 में उपयोग की जाने वाली मछली जांच के लिए गुप्त अनुवाद का पता लगाने में सक्षम है।
ऊपर वर्णित मैक्रोडिसेक्शन प्रोटोकॉल एक सरल विधि की रूपरेखा तैयार करता है जो शोधकर्ताओं को ऊतक के नमूनों की ट्यूमर सामग्री को बढ़ाने में सक्षम बनाता है जो आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले अध्ययन समावेशन मानदंड थ्रेसहोल्ड से नीचे गिर जाएगा। एक अध्ययन वर्कफ़्लो में मैक्रोडिसेक्शन को शामिल करना शोधकर्ताओं को अपने ट्यूमर सामग्री को बढ़ाकर अध्ययन बहिष्करण से खराब ट्यूमर-घने ऊतकों को उबारने में सक्षम बनाता है। बदले में, यह बढ़े हुए आत्मविश्वास की अनुमति देता है कि परिणामस्वरूप आरएनए और डीएनए जीनोमिक जांच के तहत ट्यूमर का प्रतिनिधित्व करते हैं। यद्यपि ऊतक विच्छेदन के लिए अन्य अधिक सटीक तरीके मौजूद हैं, ट्यूमर के लिए जो अधिक विशाल, गैर-घुसपैठ, शीट-जैसे या ठोस फैशन में बढ़ते हैं, मैक्रोडिसेक्शन संभवतः पर्याप्त है। यहां प्रस्तुत परिणाम इसे प्राप्त करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण के रूप में जीनोमिक परख और मैक्रोडिसेक्शन में ट्यूमर शुद्धता के महत्व को उजागर करते हैं।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
यह काम एनआईएच द्वारा वित्त पोषित एड्स और कैंसर नमूना संसाधन (एसीएसआर, यूएम 1 सीए 181255-2) द्वारा अपने जैव-नमूने विज्ञान कार्यक्रम के तहत समर्थित है। वीडियो को फिल्माया गया था और मेयो क्लिनिक मीडिया सर्विसेज द्वारा पोस्ट-प्रोडक्शन संपादन किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200-proof ethanol | Decon | 2701 | |
| AllPrep DNA/RNA FFPE Kit | Qiagen | 80234 | DNA/RNA FFPE extraction kit |
| Coplin pots | Various | x | |
| DLBCL90 probes | NanoString | various | Digital gene expression profiling based DLBCL90 assay |
| d-Limonene | VWR | 89376-092 | |
| Forceps | Various | x | |
| Glass micrscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Glycerol | VWR | 0854-1L | |
| Master kits | NanoString | various | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Microtubes | Ambion | AM12400 | |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONE-W | Spectrophotometer for DNA, RNA and protein qualitation |
| nCounter | NanoString | x | Digital gene expression profiling platform used to run the DLBCL90 assay |
| Permanent marker | Electrib Microscope Sciences | 72109-12 | |
| Razor blade dispenser | Electrib Microscope Sciences | 71985-10 | |
| Razor blades | Electrib Microscope Sciences | 71985-23 | |
| Tissue digestion buffer | Qiagen | 80234 | |
| Ultrapure water | VWR | SH30538.02 | |
| Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
| Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |
References
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