Summary
Denne protokollen presenterer en metode for å øke prosentandelen tumorinnhold i formalin-faste parafin-innebygde vevsprøver.
Abstract
Tilstedeværelsen av forurensende ikke-tumorvev i formalin-fast parafin-innebygd (FFPE) vev kan i stor grad undergrave genomiske studier. Her beskriver vi makrodisseksjon, en metode designet for å øke det prosentvise tumorinnholdet i en vevsprøve ved å fjerne og eliminere uønsket vev før du utfører nedstrøms nukleinsyreekstraksjoner. FFPE vevsblokker ble seksjonert for å produsere 4-5 μm lysbildemonterte vevsseksjoner. En representativ seksjon ble sendt inn for hematoksylin og eosin (H&E) farging og deretter gjennomgått av en styresertifisert patolog. Under gjennomgangen identifiserte og markerte patologen regionene av tumorvev i H&E. Når den er fullført, ble den avmerkede H&E brukt til å lede reseksjon av de serielle unstained seksjonene fra samme vevsblokk. For å demonstrere effekten av makrodisseksjon ble RNA hentet fra samsvarende makro uoppdaget og ikke-dissekert Diffuse Large B-Cell Lymphomas (DLBCL) kjørt på en digital genuttrykksanalyse som kunne bestemme DLBCL-undertype og BCL2-translokasjonsstatus. Resultatene viste at makrodisseksjon endret subtype- eller BCL2-translokasjonsstatuskallene i 60 % av de undersøkte prøvene. Til slutt er makrodisseksjon en enkel og effektiv metode for å utføre tumorberikelse før nukleinsyreutvinninger, hvis produkt deretter trygt kan brukes i nedstrøms genomiske studier.
Introduction
Formalin-fast parafin-innebygd (FFPE) vev, samlet som en del av den normale kliniske diagnostiske prosessen og beholdt i kliniske vev repositorier, representerer en stor ressurs for menneskelig forskning, inkludert kreft forskning1. Etter hvert som vår forståelse av menneskelig sykdom utdypes, blir det stadig tydeligere at sykdommer, tidligere antatt å være enkeltenheter basert på morfologiske og immunofenotypiske egenskaper, faktisk består av distinkte molekylære undertyper som krever molekylære subtypinganalyser. Følgelig har høysensitive genomiske analyser som er i stand til å skjelne disse undertypene blitt stadig viktigere2. Selv om FFPE-vev er kjent for å være dårlig kompatibelt med genomiske teknikker på grunn av fikseringsrelaterte problemer, etter hvert som teknologi og protokoller utvikler seg, blir disse teknikkene stadig mer kompatible med dette klinisk allestedsnærværende vevsformatet 3,4,5. Imidlertid er FFPE-vev ofte blandinger av tumor- og ikke-tumorvevsmaterialer, hvor tilstedeværelsen av ikke-tumormateriale ofte er uønsket og kan, hvis det er tilstede med høy andel, undergrave og påvirke resultatene av genomiske analyser6 betydelig. Faktisk brukes et minimum tumorinnhold på 60% ofte til slike analyser, hvor vev som faller under denne terskelen kan utelukkes, til tross for at de ellers oppfyller studiekriteriene7. Dette kan være spesielt problematisk i sjeldne sykdomsmiljøer, hvor pasientvev er dyrebart og vanskelig å samle i høye tall.
Makrodesisseksjon er en metode som minimerer effekten av lavt tumorinnhold ved å redusere mengden normalt vev3. Fjerningen av slikt forvirrende ikke-tumormateriale før nukleinsyreutvinning kan øke tumorprosentinnholdet betydelig og dermed tumorrenheten til de ekstraherte nukleinsyrene. Vevsreseksjon er kritisk avhengig av ekspert patologisk gjennomgang, hvor svulstregionen identifiseres og sirkles på en nygenerert hematoksylin og eosin (H&E) farget vevsseksjon av en brettsertifisert patolog8. Den sirklede H&E brukes deretter til å lede fjerning og innsamling av henholdsvis uønsket vev og målvev. Denne protokollen beskriver trinnene i makrodisseksjon fra patologisk gjennomgang gjennom vevshøsting som utført ved AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) Technical Core Laboratory ved Mayo Clinic.
Protocol
Alle prøver ble samlet inn og brukt i samsvar med godkjente Mayo Clinic IRB-protokoller (PR16-000507 og PR2207-02).
1. Prøvepreparering
- Slå på vevet flytevannbad. Still temperaturen på 39 °C og la vannet komme til temperatur. Soak tre samling pinner i vannbadet.
- Identifiser og hent FFPE-vevsblokkene som skal seksjoneres.
- Pre-label mikroskop lysbilder ved hjelp av en histologi klasse permanent markør som tåler løsemiddel vasker.
- Bruk en mikrotom til å seksjonere FFPE-blokkene. Klipp minst 2 heldekkende seksjoner med en tykkelse på 4-5 μm per seksjon for hver blokk (figur 1A).
- Overfør det nyskårne båndet av vevsseksjoner til det forvarmede vevsflytbadet for glidemontering (figur 1B, C).
MERK: Det varme vannet bidrar til å "stryke" ut rynkene i avsnittene (figur 1C). - Når du håndterer hver inndeling sekvensielt, bruker du tang til å bryte en enkelt inndeling bort fra båndet (figur 1D).
- Samle den ene delen på et forhåndsmerket mikroskopsklie.
- Senk mikroskopet ned i en vinkel under delen, og plasser lysbildet slik at kanten av vevsdelen berører lysbildet (figur 1E).
- Når du er i kontakt med vevsdelen, trekker du gliden sakte ut av flytebadet slik at vevsdelen kan rettes ut i flukt mot lysbildet når det kommer ut av vannet (figur 1F).
- Monter 1 vevsseksjon per lysbilde og gjenta til alle seksjonene er samlet inn.
- La de glidemonterte vevsdelene tørke grundig ved romtemperatur (RT).
2. Patologisk gjennomgang
- Utfør H&E-farging på en representativ vevsseksjon for hver blokk9.
- Send inn de nyfargede H&Es for patologisk gjennomgang av en styresertifisert patolog.
MERK: Under gjennomgangen bestemmer patologen og registrerer det prosentvise tumorinnholdet i hvert vev og sirkler tumorområdet på hvert H&E-lysbilde (se figur 2 og figur 3, rad 1). Tabell 1 skisserer det prosentvise tumorinnholdet etter cellulæritet som ble bestemt under den patologiske gjennomgangen av H&Es for prøver A-E vist i figur 3, rad 1. Seksjoner med < 60% tumorinnhold krever makro-disseksjon7. Antall seksjoner som trengs for nukleinsyreutvinning avhenger av størrelsen på det sirklede tumorområdet. Hvis utilstrekkelige seksjoner ble kuttet i paragraf 1 i protokollen og ytterligere kutt er mulig, kan det hende at ytterligere seksjoner må kuttes.
3. Deparaffinisering
- I en avtrekkshette, fyll to glassflekker med ufortynnet histologi klasse d-Limonene eller et d-Limonene-basert løsningsmiddel og 1 glassflekker med ufortynnet 200-bevis molekylært etanol.
FORSIKTIG: Unngå d-Limonene kontakt med hud og øyne, unngå innånding av damp eller tåke, og hold deg unna antennelseskilder. Hold etanol borte fra varme, gnister og åpne flammer, unngå søl og kontakt med hud eller øyne, ventiler godt og unngå å puste damper.
MERK: Fyll oppvasken tilstrekkelig til å senke de rackede skliene (figur 4A); 250 ml er nødvendig for å fylle de 20-skyvede fargingsrettene som vises. Bytt ut d-Limonene og etanolvaskene etter hver 40 lysbilder. D-Limonene (C10H16) er et alternativ, tilsvarende effektivt og mindre giftig dewaxingmiddel til xylen som blir mer vanlig i histologiske metoder og gir nukleinsyrepostutvinning av god kvalitet 10,11,12,13,14. Selv om denne protokollen kan utføres ved hjelp av mer biovennlige alternativer15, gjenstår effektene deres, om noen, på ekstrahert nukleinsyrekvalitet. - Rack de uoppdagede FFPE vevsmonterte lysbildene inn i glasset Coplin slide-racks (figur 4A, innfelt).
- Senk de rackede lysbildene ned i d-Limonene vask 1 i 2 min; forsiktig agitate for de første 20 s.
MERK: For å minimere overføringen mellom vaskene, la stativet tømmes kort før du forsiktig dabber bunnen av stativet på vevspapir for å fjerne overflødig vask når du fjerner stativet. - Senk de rackede lysbildene ned i ufortynnet D-Limonene vask 2 i 2 min; forsiktig agitate for de første 20 s. Fjern, tøm og tørk stativet igjen.
- Senk de rackede lysbildene i etanolvasken i 2 min; forsiktig agitate for de første 20 s. Fjern stativet og legg det på et absorberende vev for å drenere. La skliene lufttørke i minst 10 minutter, men ikke mer enn 2 timer.
3. Makrodisseksjon
- På benken, fyll en Coplin glassburk med 50 ml 3% glyserol i DNase / RNase fritt vann
MERK: Skift ut glyserolvasken etter hver 40. - Pre-label og prefill 1,5 ml mikrorør med 160 μL vev fordøyelsesbuffer per mikrotube.
MERK: Nukleinsyreekstraksjoner utført etter makrodeseksjon brukte et DNA/RNA FFPE ekstraksjonssett (Materialfortegnelse). Dermed besto vevsfordøyelsesbufferen som brukes i denne protokollen 10 μL Proteinase K og 150 μL PKD-buffer. - Spor de patologiske markeringene på H&E på baksiden av deparaffinerte vevssklier.
MERK: Sammenlignet med ikke-deparaffinerte vev (figur 3, rad 2 og figur 4B) er deparaffinert vev hvitt og svært synlig (figur 3, rad 3 og figur 4C). Det er denne økte synligheten og dømmekraften til deparaffinerte vevsfunksjoner som tillater makrodisseksjon. Plasser H&E med forsiden ned på benken og plasser forsiden av det deparaffinerte lysbildet mot baksiden av den matchede patologen som er gjennomgått H&E (figur 4D). Juster det deparaffiniserte vevet etter H&E-vevet (figur 4E). Sporing av patologens markeringer er et kritisk skritt i makrodisseksjonsprosessen, og det bør tas hensyn til å reprodusere disse markeringene så nøyaktig som mulig. Dette kan være spesielt utfordrende for små og frakoblede vev som prøver B, D og E (figur 3, figur 4E og figur 4E inset i). For å hjelpe til med sporingen, bør man bruke en inky fin eller ultrafin nibbed markør (figur 4E, innfelling ii) for å spore de patologtegnede markeringene. Etanolservietter kan være nyttige for å fjerne feil og tillate retracing om nødvendig. - Vri det nå merkede deparaffiniserte glidevevet med forsiden opp og spor linjen på markøren med hjørnet av et rent barberblad for å forhåndskutte kantene på svulstområdet.
- Håndtering av hvert lysbilde sekvensielt, dypp de deparaffiniserte lysbildene i 3% glyseroloppløsningen. Sørg for at vevet er helt nedsenket før du fjerner gliden sakte (figur 4F).
MERK: Hensikten med glyseroldippet er å dempe vevet for å hjelpe vevsoppsamling, men også å redusere oppbyggingen av statisk ladning som kan forårsake frastøtelse mellom vevet og plastmikrorøret der det oppsamlede vevet må plasseres. - Tørk forsiktig av baksiden av lysbildet med et vev for å fjerne overflødig glyseroloppløsning, og legg lysbildet på benken, tørket side med forsiden ned. La vevet lufte kort i 1-2 min.
MERK: Overfør overflødig glyserol i ekstraksjonsprosessen kan påvirke utbyttet og kvaliteten på nukleinsyreutvinninger negativt. Vev skal være litt fuktig, men ikke synlig vått når det samles inn. - Avhengig av hvor svulstområdet av interesse ligger på lysbildet, bruk den flate kanten av barberbladet til enten (a) direkte samle tumorvevet, bruk barberhøvelen til å skrape / samle vevet av interesse av lysbildet, eller (b) fjerne og kaste bort ikke-tumorvev først før du samler tumorvevet av interesse (figur 3).
MERK: Innsamlet vev har en tendens til å samle seg eller rulle opp nederst på bladet (figur 4G) - Bruk en trepinne til å fjerne det oppsamlede vevet fra bladet (figur 4H og innfelling) og overfør det til riktig forhåndsmerket og forhåndsfylt mikrorør (figur 4I).
MERK: Fordøyelsesbufferen tjener til å "trekke" vevet fra treplukkingen inn i væsken. - Fortsett til nukleinsyreutvinning.
MERK: Nukleinsyreekstraksjoner ble fullført ved hjelp av DNA/RNA FFPE-ekstraksjonssettet i henhold til produsentens instruksjoner, og de resulterende nukleinsyrene ble kvantifisert ved hjelp av et UV-vis spektrofotometer. Den resulterende RNA ble kjørt på den digitale genuttrykksprofileringsbaserte DLBCL90-analysen16.
Representative Results
Totalt 5 Diffuse Store B-Celle Lymfom (DLBCL) FFPE vev blokker ble seksjonert, og de resulterende seksjonene var enten makrodissected eller ikke før nukleinsyre utvinning. Den ekstraherte RNA ble kjørt på DLBCL90-analysen16. Makrodisserte prøver ble kjørt to ganger, en gang ved hjelp av 5 μL RNA-lagerkonsentrasjon, men ikke mer enn 300 ng total RNA-inngang og en gang ved bruk av 5 μL RNA-lager fortynnet for å matche RNA-inngangene til deres respektive ikke-dissekerte kolleger. Resultatene for DLBCL90 er beskrevet i tabell 2.
DLBCL består av 3 distinkte celle av opprinnelse (COO) undertyper med forskjellig terapeutisk respons, nemlig GCB, ABC, og en mellomgruppe kjent som uklassifisert eller UNC17,18. Translokasjoner som involverer MYC, BCL2 og eller BCL6 alene eller i kombinasjon (dobbelt- eller trippeltreff) observeres også ofte i DLBCL, spesielt i GCB-undertypen19. DLBCL90-analysen er en utvidelse av forgjengeren, Den kliniske lymph2Cx-analysen, og er dermed i stand til DLBCL COO-subtypebestemmelse, men ble hovedsakelig utviklet for å identifisere prøver som inneholder dobbelt hit (DH) translokasjoner som involverer BCL2 ved hjelp av digitalt genuttrykk som et alternativ til fluorescens in-situ hybridisering (FISH)16,20. Resultatene i tabell 2 viser at makrodisseksjon endret enten COO eller DHITsig status krever 60% (3/5) av de undersøkte prøvene.
Makrodisseksjon av utvalg A hadde ingen effekt på COO-utlysningen, men endret DHITsig-kallet fra NEG til UNCLASS, og denne endringen ble observert uavhengig av de makrodisserte utvalgs-RNA-inngangene og med lignende sannsynlighetspoeng (0,224, 0,254). Makrodisseksjon av prøve C hadde derimot ingen effekt på DHITsig-kallet, men endret COO-kallet fra GCB til UNC. Igjen ble denne endringen observert uavhengig av makrodisserte utvalg RNA-innganger. Klokken 0.117 var imidlertid COO-anropssannsynligheten nærmere utlysningsterskelen på 0,1 for det makro uoppdagede utvalget med reduserte RNA-inndata. I likhet med eksempel A hadde makrodisseksjon av prøve E ingen effekt på COO-kallet, men endret DHITsig-kallet. For eksempel E ble imidlertid kallet endret fra UNCLASS til NEG og gjorde det uavhengig av de makrodisserte utvalgs-RNA-inngangene med rimelig like sannsynlighetskall (0,849, 0,833). Denne utlysningsendringen til DHITsig NEG gir biologisk mening gitt at prøve E ble funnet til ABC-DLBCL, og doble trefftranslokasjoner som involverer BCL2 er rapportert å være utelukkende observert i GCB-DLBCL19.
Figur 1: Generere skyvemonterte vevsseksjoner ved hjelp av en mikrotome. (A) FFPE vevsblokk holdt på plass av mikrotomchucken og kuttet for å produsere et bånd av sekvensielle FFPE-vevsseksjoner. (B) Ved hjelp av pre-gjennomvåt trepinner samles båndet fra mikrotomet og overføres til et varmt vannbad. (C) Varmen i vannet bidrar til å stryke ut brettene i vevsbåndet. (D) Individuelle FFPE-vevsseksjoner fjernes fra vevsbåndet ved å plassere lukkede tang i krysset mellom to seksjoner og forsiktig åpne tangene, som bryter seksjoner bort fra hverandre. (E) Seksjoner samles opp fra vannet ved å senke en glasssklie i en vinkel og forsiktig bevege siden mot vevsdelen til kanten av delen berører glasssklie. (F) Når sklien og delen berører, fjerner du langsomt sklien fra vannet, slik at vevsdelen kan falle i flukt mot lysbildet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Patologi og histologisk gjennomgang av en hematoksylin og eosin (H&E) fargede seksjoner. (A,B) H&E-vevsseksjonen blir utsatt for mikroskopisk gjennomgang av en styresertifisert patolog. (C,D) Når patologen har sett hele vevet og funnet ut at det ikke er 100% tumorvev, vil patologen bruke en markør for å omringe svulstområdet i vevet. (E,F) Å holde den merkede H&E mot den opprinnelige FFPE vevsblokken viser at ikke alt vevet er tumormateriale. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Vevsprøver. Dette bildet demonstrerer de patologisk gjennomgåtte og tumormerkede H&Es (rad 1), ubehandlede lysbildemonterte FFPE-vevsseksjoner (rad 2), deparaffinerte lysbildemonterte FFPE-vevsseksjoner (rad 3), deparaffinert lysbildemontert FFPE vev seksjoner med patologi markeringer sporet på baksiden av lysbildet (Rad 4), deparaffinized og makrodissected slide-montert FFPE vev seksjoner (Rad 5) for 5 prøver (A-E) brukes til å demonstrere denne protokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Deparaffinisering og makro-disseksjon av FFPE vevsseksjoner: (A) I en avtrekkshette vaskes FFPE-vev montert i et glidestativ i to d-limonenvasker og en etanolvask. (B,C) Etter vask er all parafin fjernet, og bare vevet forblir på lysbildet, som nå er hvitt og svært synlig sammenlignet med den forhåndsvaskede motparten. (D) Den deparaffiniserte skyvemonterte vevsdelen plasseres med forsiden ned på baksiden av den matchende merkede H&E. (E) Tumorområdemarkeringene på H&E spores deretter på baksiden av den deparaffiniserte sklien ved hjelp av en fin eller ultrafin nibbed permanent markør (F) Den markerte deparaffiniserte lysbildemonterte vevsdelen dyppes deretter i en glyserolvask for å dempe vevsdelen for oppsamling. Lysbildet fjernes sakte fra glyserolen, og baksiden av lysbildet tørkes med et vev for å fjerne overflødig glyserol før du legger glidevevet med forsiden opp på benken. (G) Ved hjelp av den flate siden av et rent barberblad blir vevet makro uoppdaget, og det uønskede vevet utenfor patologmarkeringene kastes før det samler vevet av interesse, som samles langs kanten av bladet. (H) En trepinne brukes til å fjerne det oppsamlede vevet fra kanten av bladet. (I) Vevet overføres deretter til en forhåndsmerket mikrotube forhåndsfylt vevsfordøyelighetsbuffer og er klar for nukleinsyreutvinning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Eksempel-ID | Hele vev (a) | Sirklet område av vev (b) | Generelt tumorinnhold i hele vevet (c) | Fold økning i tumorinnhold ved makrodisseksjon (d) | Ikke makro uoppdaget (e) | Makro uoppdaget (f) | ||||
| % Levedyktig svulst | % annet | % Levedyktig svulst | % annet | Antall 5 μm lysbilder trukket ut | RNA-kons (ng/μL) | Antall 5 μm lysbilder trukket ut | RNA-kons (ng/μL) |
|||
| Eksempel A | 60 | 40 | 75 | 25 | 45 | 1.7 | 2 | 19.0 | 4 | 58.3 |
| Eksempel B | 60 | 40 | 65 | 35 | 39 | 1.7 | 1 | 34.0 | 2 | 60.0 |
| Eksempel C | 40 | 60 | 65 | 35 | 26 | 2.5 | 1 | 13.7 | 2 | 46.2 |
| Eksempel D | 35 | 65 | 90 | 10 | 32 | 2.9 | 1 | 57.3 | 2 | 60.0 |
| Eksempel E | 20 | 80 | 30 | 70 | 6 | 5.0 | 3 | 25.2 | 3 | 44.6 |
Tabell 1: Patologi gjennomgangsdata. Tabellen viser (a) prosentandelen levedyktig svulst i hele vevsseksjonen etter område, (b) prosentandelen levedyktig svulst i området sirklet / merket av patologen under gjennomgangen av cellulæritet, (c) den estimerte generelle tumor cellulæriteten til hele vevet (en x b), (d) den estimerte foldøkningen i tumor cellulæritet oppnådd med makrodissection, (e og f) antall 5 μm unstained FFPE lysbildemonterte vev seksjoner ekstrahert og de resulterende RNA konsentrasjoner for matchede ikke-makrodisserte og makrodisserte prøver. % Andre refererer til alle andre vev som finnes i en gitt prøve som ikke er tumorvev og kan omfatte bindevev, stromale fibroblaster, blodkar samt andre iboende stromale elementer. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
| Eksempel-ID | RNA-inngang (ng) | DLBCL90 COO-kall | Sannsynlighet for DLBCL90-kall | DHITsig-kall | Sannsynlighet for DHITsig-pos | DHITsig neg sannsynlighet | |
| Ikke makro uoppdaget | Eksempel A | 95.0 | GCB | 0.000 | NEG | 0.135 | 0.865 |
| Eksempel B | 170.0 | GCB | 0.000 | NEG | 0.032 | 0.968 | |
| Eksempel C | 68.5 | GCB | 0.028 | NEG | 0.033 | 0.967 | |
| Eksempel D | 286.5 | ABC | 0.998 | NEG | 0.002 | 0.998 | |
| Eksempel E | 126.0 | ABC | 0.989 | UKLASS | 0.212 | 0.788 | |
| Makro uoppdaget | Eksempel på A_M | 291.7 | GCB | 0.000 | UKLASS | 0.224 | 0.776 |
| Eksempel på B_M | 300.0 | GCB | 0.000 | NEG | 0.016 | 0.984 | |
| Eksempel på C_M | 231.2 | UKLASS | 0.210 | NEG | 0.015 | 0.985 | |
| Eksempel på D_M | 300.0 | ABC | 0.999 | NEG | 0.002 | 0.998 | |
| Eksempel på E_M | 223.2 | ABC | 0.987 | NEG | 0.151 | 0.849 | |
| Makro uoppdaget & RNA fortynnet | Eksempel på A_M | 95.0 | GCB | 0.000 | UKLASS | 0.254 | 0.746 |
| Eksempel på B_M | 170.0 | GCB | 0.000 | NEG | 0.023 | 0.977 | |
| Eksempel på C_M | 68.5 | UKLASS | 0.117 | NEG | 0.027 | 0.973 | |
| Eksempel på D_M | 286.5 | ABC | 0.999 | NEG | 0.002 | 0.998 | |
| Eksempel på E_M | 126.0 | ABC | 0.995 | NEG | 0.167 | 0.833 | |
Tabell 2: DLBCL90 digitale genuttrykksanalyseresultater. Fem prøver (A-E) var enten ikke makrodisserte eller makrodisserte før nukleinsyreutvinning ble utført. Den resulterende RNA ble kjørt på DLBCL90-analysen, som det maksimale RNA-inngangsvolumet er 5 μL. Ikke-makrodisserte prøver ble kjørt ved hjelp av 5 μL lager RNA. Hver makrodisserte prøve ble kjørt to ganger ved hjelp av (a) 5 μL lager RNA med mindre aliquots på 60 ng/μL var mulig og (b) 5 μL lager RNA fortynnet for å matche konsentrasjonene/inngangen til deres ikke-makrodisserte kolleger. Suffikset _M angir at eksemplet ble makrodissert. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Discussion
FFPE vev er ofte heterogene blandinger av tumor og ikke-tumor vev. Høysensitive genomiske tester blir stadig mer utbredt i både kliniske og forskningsmiljøer, men kan forvirres av tilstedeværelsen av forurensende ikke-tumorvev. Faktisk anbefales et minimum tumorinnhold på 60% ofte for genomiske studier. Prosent svulst kan bestemmes av vevsområdet okkupert av tumormaterialet eller av andelen tumorceller i vevet. Selv om svulst etter område er en vanlig brukt beregning for tumorrenhet, skildrer den ikke alltid en nøyaktig beskrivelse av vevet. Vurder to vev, begge med 1000 celler, hvorav 500 er tumorceller. I vev A er de 500 ikke-tumorcellene stromale celler med lignende volumer som tumorcellen. I dette vevet kan prosentandelen av svulst betraktes som 50% av både cellulæritet og område. I vev B er de 500 ikke-tumorcellene fettceller med volumer som er 4 ganger svulstcellens. I dette vevet er den prosentvise svulsten fortsatt 50% av cellulæriteten, men 20% etter område. Et tredje vev, vev C, består av 500 tumorceller pluss 400 fettceller og 800 stromale celler med volumer som er henholdsvis 4x og 0,5x av tumorcellene. Gitt 100 fettceller tilsvarer volumet av 800 stromale celler, er den prosentvise svulsten i vev C 29% ved cellulæritet (500/1700), men fortsatt 20% etter areal. Vev D består også av tumor-, fett- og stromalceller med volumforhold på 1x, 4x og 0,1x. Antall celler er imidlertid henholdsvis 400, 10 og 720. Dermed er den prosentvise svulsten i vev D 35% ved cellulæritet (400/1130), men 78% etter areal. Disse eksemplene er altfor forenklede og gjenspeiler ikke virkelige vevssammensetninger, men formidler tydelig viktigheten av vevssammensetning og forskjellen mellom tumorinnhold etter område og cellulæritet. Viktig, når det gjelder berikende tumorinnhold for nedstrøms nukleinsyreutvinning, er tumor cellulæritet den viktigste egenskapen på grunn av det økte forvirrende potensialet for å trekke ut genomisk materiale fra mer ikke-tumorceller enn tumorceller. Dette understreker ikke bare behovet for å vurdere tumorinnholdet i vev når det gjelder prosentandel cellulæritet, men også behovet for å utskille uønsket vev for å minimere potensielle negative effekter av ikke-tumorvevet. Det finnes flere metoder for vevsberikelse, der de viktigste er makrodeseksjon og mikrodesinfeksjon.
Makrodissection, metoden beskrevet i denne protokollen, er relativt rask, enkel og krever ikke kostbart eller spesialisert utstyr. Selv om makrodisseksjon i stor grad kan forbedre tumorinnholdet, er det viktig å forstå at det ikke helt eliminerer ikke-tumormateriale. Formålet med makrodisseksjon er å berike vevet av interesse tilstrekkelig gjennom utelukkelse av uønsket vev for å redusere "støyen" som stammer fra uønsket vev, noe som igjen kan forbedre signalet om interesse fra vevet av interesse. Dermed er makrodisseksjon mediert tumorberikelse en måte å forbedre signal-til-støy-forholdet for bedre å oppdage markører av interesse, spesielt tumorspesifikke molekylære markører med lav overflod eller dårlig uttrykk. Imidlertid har makrodisseksjon begrensninger på grunn av mangel på presisjon som tilbys av grove verktøy som barberblader og er utsatt for presisjonsproblemer som stammer fra banetykkelsens markør, samt potensielle feil når du sporer patologene H&E avgrensninger. Som nevnt ovenfor er det ikke mulig å oppnå 100% tumorrenhet på grunn av tilstedeværelsen av iboende og tumorinduserende stromale elementer (dvs. bindevev, stromale fibroblaster, blodkar, godartede reaktive lymfocytter, makrofager) innebygd i selve svulsten. Faktisk induserer mange invasive eller diffust infiltrative maligniteter en robust desmoplastisk stromal respons, noe som resulterer i klynger av tumorceller som er intimt admixed med stromale fibroblaster og andre ikke-neoplastiske celletyper; der svulster forbundet med dette stromale reaksjonsmønsteret, som kreftvev i bukspyttkjertelen21, kan ha mer nytte av digitalt styrt mikrodeseksjon i stedet for manuell makrodisseksjon.
Manuell mikrodisseksjon utføres under et mikroskop for å hjelpe identifisering, disseksjon og isolering av vev bestemte celler eller populasjoner ved hjelp av en nål eller skalpell og har fordelen av økt presisjon over makrodeseksjon22. Imidlertid er manuell mikrodisseksjon en arbeidskrevende prosess som mangler finesse som trengs for komplekse vev med lavt tumorinnhold eller intrikate egenskaper som er uforenlige med manuell disseksjon. Slike vev kan dissekeres ved hjelp av høypresisjons automatiserte metoder som laserfangstmikrodisseksjon. Faktisk har digitalt styrt mikrodeseksjon vist seg å gi høyere prosentandel tumorinnhold sammenlignet med manuell makrodisseksjon i bukspyttkjertelkreftvev23. Ulempene med disse automatiserte metodene med høy presisjon, for eksempel behovet for spesialisert, dyrt utstyr og høyt utdannede personer, har imidlertid hindret innlemmelsen i arbeidsflyter. En studie av de Bruin et al. som sammenlignet effekten av makrodeseksjon og laserfangstmikrodeseksjon (LCM) på genuttrykksprofilering fant at LCM-prøver hadde lave totale RNA-utbytter (30 ng gjennomsnitt) og krevde to runder med mRNA-forsterkning for å oppfylle cDNA-biblioteket prep input threshold24. Forfatterne fant at de resulterende LCM-genuttrykksprofilene ble påvirket av rundene med mRNA-forsterkning mer enn makrodisserte profiler ble påvirket av ikke-tumorstromale bidrag og konkluderte med at makrodisseksjon kunne brukes tilstrekkelig til å generere pålitelige genuttrykksdata24.
En betydelig fordel med NanoString digital genuttrykksprofilering, spesielt når du arbeider med svært degradert FFPE-avledet RNA, er at det ikke krever enzymatiske avhengige prosesser som RNA-forsterkning eller utarbeidelse av cDNA-biblioteker. Imidlertid er analyser vanligvis optimalisert for innganger mellom 50-300 ng av totalt RNA25,26, som, basert på funnene fra de Bruin et al.24, kanskje ikke er kompatible med mikrodisserte vev uten å øke vevsinngangen; en ugunstig etterspørsel i en tid der vevsprøver i økende grad samles inn som små biopsier i stedet for kirurgiske reseksjoner. RNA-inngangene som ble brukt til DLBCL90-analysen varierte fra 68,5-300 ng for både det makrodisserte og ikke-dissekerte vevet. Resultatene viser at makrodisseksjon resulterte i kallendringer i 60% av de undersøkte prøvene, og at disse endringene ble observert uavhengig av RNA-inndata fra de makrodisserte prøvene. COO-sannsynligheten for de lave RNA-inngangene brøt imidlertid inn COO GCB/UNC-sannsynlighetskallterskelen, der tersklene er 0 til <0,1 for GCB, 0,1-0,9 for UNC og >0,9 til 1,0 for ABC-kall20. De viktigste DLBCL COO-undertypene er GCB og ABC, som utgjør 41% og 44% av alle DLBCL-tilfeller, med UNC som representerer en mellomgruppe av de to og ABC som de mest aggressive20,27. Selv om COO-utlysningen av makrodeseksjon av prøve C ikke forårsaket en åpenbar endring i COO-undertypen fra GCB til ABC, kan endringen fra GCB til UNC antyde et skifte mot en mer aggressiv sykdom. Videre indikerer nyere studier at UNC-subtypen ikke bare er en mellomliggende undertype, og at den potensielt kan ha subtypespesifikke terapeutisk utnyttbare attributter28. På samme måte forårsaket ikke makrodisseksjon av prøver A og E ærlige endringer i DHITsig-kall fra DH-negativ til DH-positiv, eller omvendt. Imidlertid er bevegelsene til en GCB-prøve (prøve A) fra NEG til UNCLASS og en ABC-prøve (prøve E) fra UNCLASS til NEG ved makrodeseksjon biologisk hensiktsmessig ettersom doble trefftranslokasjoner som involverer BCL2 rapporteres å være et utelukkende GCB-fenomen19. Selv om translokasjoner tradisjonelt og allestedsnærværende oppdages av FISH i kliniske omgivelser, er det et økende momentum for å identifisere et alternativ mindre involvert og tidkrevende metode for deteksjon. DLBCL90-analysen er et viktig verktøy som adresserer dette behovet, der begrunnelsen for bruken styrkes av at denne analysen er i stand til å oppdage translokasjoner kryptisk for FISH-sonder som brukes i klinisk diagnostikk29.
Makrodisseksjonsprotokollen beskrevet ovenfor skisserer en enkel metode som gjør det mulig for forskere å øke tumorinnholdet i vevsprøver som vanligvis vil falle under vanlige studieinklusjonskriterier. Inkludert makrodisseksjon i en studiearbeidsflyt gjør det mulig for forskere å redde dårlig tumortett vev fra studieekskludering ved å øke tumorinnholdet. I sin tur tillater dette økt tillit til at de resulterende RNA- og DNA-eluates representerer svulsten under genomisk undersøkelse. Selv om det finnes andre mer presise metoder for vevs disseksjon, for svulster som vokser i en mer ekspansiv, ikke-infiltrativ, arklignende eller solid måte, er makrodisseksjon sannsynligvis tilstrekkelig. Resultatene som presenteres her fremhever betydningen av tumorrenhet i genomiske analyser og makrodisseksjon som et pålitelig verktøy for å oppnå dette.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av NIH-finansiert AIDS og Cancer Specimen Resource (ACSR, UM1 CA181255-2) under sitt biospecimen science program. Videoen ble filmet og etterproduksjonsredigering ble utført av Mayo Clinic Media Services.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200-proof ethanol | Decon | 2701 | |
| AllPrep DNA/RNA FFPE Kit | Qiagen | 80234 | DNA/RNA FFPE extraction kit |
| Coplin pots | Various | x | |
| DLBCL90 probes | NanoString | various | Digital gene expression profiling based DLBCL90 assay |
| d-Limonene | VWR | 89376-092 | |
| Forceps | Various | x | |
| Glass micrscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Glycerol | VWR | 0854-1L | |
| Master kits | NanoString | various | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Microtubes | Ambion | AM12400 | |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONE-W | Spectrophotometer for DNA, RNA and protein qualitation |
| nCounter | NanoString | x | Digital gene expression profiling platform used to run the DLBCL90 assay |
| Permanent marker | Electrib Microscope Sciences | 72109-12 | |
| Razor blade dispenser | Electrib Microscope Sciences | 71985-10 | |
| Razor blades | Electrib Microscope Sciences | 71985-23 | |
| Tissue digestion buffer | Qiagen | 80234 | |
| Ultrapure water | VWR | SH30538.02 | |
| Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
| Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |
References
- Mathieson, W., Thomas, G. A. Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).
- Robetorye, R. S., Maguire, A., Rosenthal, A. C., Rimsza, L. M. Profiling of lymphoma from formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Seminars in Hematology. 56 (1), 46-51 (2019).
- Moorcraft, S. Y., Gonzalez, D., Walker, B. A. Understanding next generation sequencing in oncology: A guide for oncologists. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 96 (3), 463-474 (2015).
- Haile, S., et al. Automated high throughput nucleic acid purification from formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples for next generation sequence analysis. PLoS One. 12 (6), 0178706 (2017).
- Oh, E., et al. Comparison of accuracy of whole-exome sequencing with formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen tissue samples. PLoS One. 10 (12), 0144162 (2015).
- Holley, T., et al. Deep clonal profiling of formalin fixed paraffin embedded clinical samples. PLoS One. 7 (11), 50586 (2012).
- Network T.C.G.A.R. TCGA Tissue sample requirements: High quality requirements yield high quality data. , Available from: https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/structural-genomics/tcga/studied-cancers (2021).
- Javey, M., et al. Innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics. The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 23 (4), 399-406 (2021).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Duan, Q., Zhang, H., Zheng, J., Zhang, L. Turning cold into hot: Firing up the tumor microenvironment. Trends in Cancer. 6 (7), 605-618 (2020).
- Kim, Y. W., et al. Safety evaluation and risk assessment of d-Limonene. Journal of Toxicology and Environmental Health Part B: Critical Reviews. 16 (1), 17-38 (2013).
- Foti, C., et al. Occupational contact dermatitis to a limonene-based solvent in a histopathology technician. Contact Dermatitis. 56 (2), 109-112 (2007).
- Meuse, C. W., Barker, P. E. Quantitative infrared spectroscopy of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue specimens: paraffin wax removal with organic solvents. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 17 (6), 547-552 (2009).
- Schmeller, J., et al. Setting out the frame conditions for feasible use of FFPE derived RNA. Pathology - Research and Practice. 215 (2), 381-386 (2019).
- Prema, V., et al. Biofriendly substitutes for xylene in deparaffinization. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 12, Suppl 1 623-630 (2020).
- Ennishi, D., et al. Double-hit gene expression signature defines a distinct subgroup of germinal center B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma. Journal of Clinical Oncology. 37 (3), 190-201 (2019).
- Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403 (6769), 503-511 (2000).
- Rosenwald, A., et al. The use of molecular profiling to predict survival after chemotherapy for diffuse large-B-cell lymphoma. The New England Journal of Medicine. 346 (25), 1937-1947 (2002).
- Scott, D. W., et al. High-grade B-cell lymphoma with MYC and BCL2 and/or BCL6 rearrangements with diffuse large B-cell lymphoma morphology. Blood. 131 (18), 2060-2064 (2018).
- Scott, D. W., et al. Determining cell-of-origin subtypes of diffuse large B-cell lymphoma using gene expression in formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Blood. 123 (8), 1214-1217 (2014).
- Heinrich, M. A., Mostafa, A., Morton, J. P., Hawinkels, L., Prakash, J. Translating complexity and heterogeneity of pancreatic tumor: 3D in vitro to in vivo models. Advanced Drug Delivery Reviews. 174, 265-293 (2021).
- Erickson, H. S., Gillespie, J. W., Emmert-Buck, M. R.
- Geiersbach, K., et al. Digitally guided microdissection aids somatic mutation detection in difficult to dissect tumors. Cancer Genetics. 209 (1-2), 42-49 (2016).
- de Bruin, E. C., et al. Macrodissection versus microdissection of rectal carcinoma: minor influence of stroma cells to tumor cell gene expression profiles. BMC Genomics. 6, 142 (2005).
- Ramsower, C. A., et al. Clinical laboratory validation of the MCL35 assay for molecular risk stratification of mantle cell lymphoma. Journal of Hematopathology. 13 (4), 231-238 (2020).
- Maguire, A., et al. Enhanced DNA repair and genomic stability identify a novel HIV-related diffuse large B-cell lymphoma signature. International Journal of Cancer. 145 (11), 3078-3088 (2019).
- Rosenwald, A., Staudt, L. M. Gene expression profiling of diffuse large B-cell lymphoma. Leukemia & Lymphoma. 44, Suppl 3 41-47 (2003).
- Wright, G. W., et al. A probabilistic classification tool for genetic subtypes of diffuse large B cell lymphoma with therapeutic implications. Cancer Cell. 37 (4), 551-568 (2020).
- Hilton, L. K., et al. The double-hit signature identifies double-hit diffuse large B-cell lymphoma with genetic events cryptic to FISH. Blood. 134 (18), 1528-1532 (2019).
