Summary
Plaquing是一种用于量化人群中活病毒的常规方法。虽然在各种微生物学课程中经常教授细菌和噬菌体的诱捕，但哺乳动物病毒的幽射更为复杂和耗时。该协议描述了可靠地用于单纯疱疹病毒常规工作的程序。
Abstract
有许多已发表的用于诱捕病毒的方案，包括主要文献中关于方法学的参考文献。然而，Plaquing病毒可能很难执行，需要专注于其规格和改进。对于新生来说，掌握这是一种非常具有挑战性的方法，主要是因为它需要对最微小的细节进行细致的关注。这种诱发单纯疱疹病毒的演示应该可以帮助那些多年来一直在努力可视化该方法的人，尤其是其细微差别。虽然本手稿基于标准绦塑方法的相同原则，但它的不同之处在于它包含以下详细说明：（1）如何最好地处理宿主细胞以避免在此过程中的中断，（2）比琼脂糖更有用的粘性培养基来限制病毒粒子的扩散，以及（3）简单的固定和染色程序，产生可靠的可重复结果。此外，随附的视频有助于展示过程中更精细的区别，在指导他人进行斑块测定时经常会错过这些区别。
Introduction
病毒斑块测定的开始可以追溯到 19 世纪 90 年代首次发现病毒1。首先分离出烟草花叶病毒并传递到烟叶上，其中可以识别和量化单个感染点，其起源于单个活病毒实体2，后来被鉴定为病毒粒子2。后来对细菌和噬菌体的开创性研究完善了用于斑块这些病毒的技术，包括生长中期的细菌，噬菌体样品的连续稀释，以及随后可视化细菌草坪中的字面孔（命名为斑块）的顶部琼脂3。
动物病毒的攀爬滞了对噬菌体进行的激动人心的研究，主要是因为培养哺乳动物细胞所需的方法直到20世纪40年代才得到开发4。然而，在没有整个宿主生物体的情况下，生长中的鼠细胞的出现4催生了培养和计数病毒能力的新时代。这项工作在鸡细胞中传播和定量西马脑脊髓炎病毒和在人细胞中脊髓灰质炎病毒5，6。随着可培养哺乳动物细胞领域的扩大，不同宿主细胞对各种病毒感染的依赖为世界提供了研究各种病毒的可能性7。这包括人类疱疹病毒的传播和定量，特别是单纯疱疹病毒-1（HSV-1）和-2（HSV-2），它们会导致皮肤黏膜病变8。重要的是，所有斑块测定都依赖于活病毒体的存在，其可以在样品中以受体介导的方式进入宿主细胞9。尽管关于执行斑块测定的出版物无处不在和众多5，10，11，12，13，14，15，16，这些用于HSV-1 / -2的方法都是艺术和科学的混合体;如果不适当注意方案中的每个细节，就无法进行测定，也不能在没有对过程中的微妙之处进行严格观察的情况下执行成功的测定。该手稿描述了HSV-1/-2斑块测定最一致的可重复性方法之一，并具有很少讨论的测定技术的精确细节。
目前的方案可靠地获得HSV-1和-2的活斑块形成单元（PFU）计数。使用低传代（低于传代号155）的Vero细胞（转化的非洲绿猴肾上皮细胞）获得最佳结果，并在补充了10 %胎儿小牛血清（FCS），L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和抗生素/抗真菌混合物的α-MEM17中常规生长18。Vero细胞标准地在这种培养基中繁殖，每周两到三次，每次 稀释1/5 。
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Protocol
Vero细胞和活疱疹病毒的所有程序均已获得陶森大学机构生物安全委员会的批准。这些过程的一般化方案如图 1 所示。
1. Vero细胞的接种
- 在开始斑块测定的前一天，胰蛋白酶消化Vero细胞，并按照标准细胞培养方法将其重悬于常规Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）和补充剂中19。将胰蛋白酶消化的细胞重悬于10mL DMEM中，每个汇合Vero细胞（约107个细胞）的T-75 烧瓶。
注意：DMEM用于斑块测定而不是α-MEM，因为它会略微减慢细胞生长速率并有利于更好的斑块测定结果。 - 通过首选方法（例如，具有台盼蓝排除的标准血细胞计数器）计数细胞19。
- 以4×10 6 个细胞/板接种细胞;对于HSV-2，使用6孔板，每孔2.5毫升DMEM（含补充剂）;对于HSV-1，使用12孔板，每孔1.25 mL DMEM（含补充剂）。
注意：无论使用何种板，细胞的数量都应恒定，尽管孔的大小与斑块测定的准确性有关。使细胞均匀分布至关重要，这可以通过来回移动板而不是以圆形方式最有效地实现。 - 让细胞在37°C / 5%CO 2 下在加湿的培养箱中生长过夜。
注意：在培养箱底部用含有杀藻剂的蒸馏水保持湿度。
2. 样品稀释
- 在一次实验室会话中完成样品稀释和将病毒添加到细胞中。
注意：HSV-1和HSV-2对人类具有传染性，必须在适当的生物安全遏制（BSL-2）下处理。将所有与病毒接触的材料分开存放，并在从生物安全柜中取出之前，用季铵盐稀释（见 材料表）、碘磷、漂白剂或强离子洗涤剂（例如SDS）进行消毒。 - 在Vero细胞接种后的第二天，连续稀释每个病毒样品以在1x PBS中斑块;通常使用 10 倍稀释液进行最精确的跟踪。
- 通过10-4 （对于低浓度的病毒）或通过10-9 （对于更高滴度的样品的期望）使这些稀释，每个样品中至少剩下1 mL用于斑块测定本身。
- 将所有病毒稀释液放在冰上（不超过1小时），直到准备好将这些稀释的病毒样品添加到细胞中。
3. 将病毒添加到细胞中
- 通过移液器从一个或两个孔中取出细胞培养基。
注意：不要使用吸气器，因为它会从细胞单层中去除过多的液体并干燥细胞。一个关键的考虑因素是确保细胞单层在整个实验过程中保持水合。如果细胞变干，它们将在最后一步从板中洗掉并产生不可用的数据。因此，一次只处理一个或两个孔，以减少这种可能性。 - 小心地将稀释的病毒样品（分别将100-400μL和50-200μL病毒样品分别用于6孔和12孔板）滴入每个单层，将滴剂添加到每个孔的侧面。每一个或两个孔重复该过程，直到整个板中充满被斑块的病毒样品。
注意：将滴剂添加到孔的中心可能会无意中将细胞从底物上脱落。 - 用手轻轻摇动整个板，以确保含有病毒的PBS覆盖每个孔中的整个单层细胞，然后将板置于37°C的CO2 培养箱中以使病毒吸附。
- 在1小时内每10分钟一次，从培养箱中取出板，再次轻轻摇晃以将病毒更均匀地传播到每个孔中，然后将其放回培养箱中。
注意：每个实验将决定重复的次数和使用哪些稀释液;读者的偏好决定了这个决定。 - 为了减少无意中计数未吸收的接种物的可能性，请用1000μL移液器吸头从孔中取出病毒样品并将其放入废烧杯中。
注意：同样，该过程一次仅使用一个或两个孔进行，以保持细胞单层的水合作用。 - 放置2.5 mL甲基纤维素覆盖层（将5%不含甲基纤维素溶解在100 mL PBS中，在121°C和15 psi的液体循环中高压灭菌15分钟，然后加入375 mL DMEM和25 mL FBS）。
- 一旦整个板含有覆盖物，将板放回培养箱中以允许生长两天。
注意：如果允许病毒和细胞生长三天，即使在DMEM加补充剂中，也可能导致单层细胞的大量损失，从而损害最终数据。 - 对废烧杯进行消毒，通常添加漂白剂，碘伏或类似的杀病毒剂，然后将其从生物安全柜中取出。
4. 斑块染色
- 在两天的孵育后，用移液器除去甲基纤维素覆盖物，一次一个或两个孔，然后将其放入废烧杯中。
- 向每个孔中加入约2mL的1%结晶紫（见 材料表）和50%乙醇，以染色斑块。
注意：不必删除叠加层的每一滴。 - 在37°C下孵育板，所有孔都充满污渍30分钟。 此时，如上步骤3.8中的废烧杯进行消毒。
- 用自来水大力清洗板，直到径流清除。
注意：温和的水流不够有力;实验室水槽夹具需要全压。 - 此时，请确保每个稀释系列中的斑块数量存在大约10倍的差异。
- 让板倒置干燥过夜，之后可以计数单个斑块。
5. 计数斑块和确定病毒滴度
- 无论采用何种方法（见下文注），将斑块数量乘以稀释因子（例如，如果在10-4 孔中计数斑块，则斑块数量将乘以104）。
注意：虽然在 10-100 个斑块范围内计数是有用的5，但计数具有 30-300 个斑块的孔更可靠，并且要考虑大约 1/2 对数稀释度，而不是全对数稀释度。 - 将此数字除以接种量（如上所述步骤3.2），并平均所有在规定范围内具有斑块的孔，以获得原始样品中HSV的最准确滴度。
- 在步骤 5.3.1 至 5.3.5 中执行计算，考虑使用 表 1 中的模拟数据。
- 只考虑有30-300个斑块的孔（步骤5.1）。因此，在 表 1 中，仅将 10-5 列用于重复项 1、2 和 3。
- 取给定稀释液下的斑块数量，乘以稀释因子的倒数。因此，样品1的10-5 柱从10-5 稀释的81个斑块到81个斑块乘以105。
- 然后将该数字除以添加到该孔中细胞中的病毒稀释液的体积（以mL为单位）。假设 表 1中HSV-1的数据来自12孔板，0.2 mL将是最合适的测量。因此，步骤5.3.2的计算变为81 x 105 除以0.2 mL，或HSV-1的4.0 x 107 PFU / mL。
- 对所有有用的数据和平均值重复此过程。因此，在5.3.2-5.3.3中对10-5柱中的所有样品进行计算，假设它们来自同一病毒样品，并进行生物重复以获得最准确的滴度测量。在表1的情况下，该样品的平均4.0 x 107，2.1 x 107和2.6 x 107 PFU / mL以获得2.9 x 107±0.98 x 107 PFU / mL的最终平均滴度。
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Representative Results
表1显示了具有最佳结果的实验。所有10倍稀释后，斑块计数减少约10倍。这些类型的数据也可以在图2中看到，这是一种实际的斑块测定，其中所有三个重复的可计数斑块数量都在10-4范围内。在图3的顶行中可以看到相同的情况，其中可计数的斑块数在10-3稀释液中。
然而， 底行图3显示了当斑块测定不顺利时完全不同的结果。首先，从任何稀释中可以看到很少的斑块;因此，数据不可用。其次，在顶部周围有可见的区域，Vero细胞已经完全从底物中抬起，有证据表明细胞在此过程中干燥或在孔的该区域移液过猛。
表2 还显示了斑块计数中的一组潜在异常结果，并且在此过程中需要谨慎。值得注意的是，无论是顶行还是底行的重复，当一个从一个稀释液移动到下一个稀释液时，斑块计数的常规差异为10倍;这些数据表明病毒稀释过程中的用户错误。此外，用户不太可能准确地计算超过15，000个斑块，因此必须对这些数据提出质疑。最后，人们可能会注意到，在重复1，10-6 稀释中，斑块计数在30-300范围内;尽管如此，鉴于此复制中其余数据的不良性质，42个斑块计数不太可能是一个准确的数字。因此， 表 2 中唯一可信的数据位于副本 2 中。
图4 显示了在斑块测定过程中细胞干燥或处理不当的相同问题。然而， 图4 严重显示Vero细胞接种不良;每孔都显示出较深的紫色斑点，表明细胞没有很好地分布在整个孔中，并且成簇地堆叠在一起。
图1：整体斑块测定方案。 改编自Biorender模板，“病毒斑块测定方案”，由 BioRender.com。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：12孔板中HSV-1的斑块测定。 如 图1 所示，对HSV-1的一个样本进行了生物复制。将HSV-1样品的连续10倍稀释液（从10-2 稀释液开始）加入Vero细胞中，孵育，然后用结晶紫染色。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：六孔板中HSV-2的斑块测定。 如图 1 所示，对HSV-2的一个样本进行了生物重复。将HSV-2样品的连续10倍稀释液（从10-2 稀释液开始）加入Vero细胞中，孵育，然后用结晶紫染色。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：12孔板中HSV-1的斑块测定。 如 图1 所示，对HSV-1的一个样本进行了生物复制。将HSV-1样品的连续10倍稀释液（从10-2 稀释液开始）加入Vero细胞中，孵育，然后用结晶紫染色。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 稀释因子 | ||||
| 复制 | 10-2 | 10-3 | 10~5 | 10-7 |
| 1 | 5721 | 635 | 81 | 5 |
| 2 | 4592 | 365 | 42 | 0 |
| 3 | 5,519 | 521 | 53 | 1 |
表1：一次成功测定的代表性斑块计数。对每个生物重复进行连续稀释;每次稀释显示代表性斑块计数（从10-3 稀释开始）。
| 稀释因子 | ||||
| 复制 | 10-2 | 10-3 | 10~5 | 10-7 |
| 1 | 15225 | 635 | 450 | 42 |
| 2 | 4592 | 365 | 42 | 0 |
| 3 | 5519 | 5400 | 53 | 1 |
表2：一次不成功测定的代表性斑块计数。对每个生物重复进行连续稀释;每次稀释显示代表性斑块计数（从10-3 稀释开始）。
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Discussion
虽然斑块测定几乎与哺乳动物细胞培养物本身一样古老，但似乎每个实验室都有自己的一套方案来执行这种基本测定5，6，10，11，12，13，14，15，16，20.尽管每个已发表的斑块测定版本中的说明略有不同，但这些手稿中很少有人阐明获得一致结果所涉及的关键细微差别。
因此，该协议的某些部分更像是艺术而不是科学。当Vero细胞接种在孔中进行测定时，它们必须均匀地分布在整个孔中（图4）。所有涉及液体转移的步骤（例如，步骤3.1，3.2，3.5，3.6，4.1和4.2）必须小心地完成，以保持Vero细胞单层水合（图3 和 图4）。同样重要的是，不要用任何移液器接触孔的底部，否则细胞可能会刮掉，进一步损害最终数据（图4）。
虽然甲基纤维素作为覆盖材料是有利的，可以防止病毒粒子在整个孔中扩散，但可以使用替代品。例如，可以使用微晶纤维素21，22 或羧甲基纤维素21。无论如何，甲基纤维素是最容易和最便宜的液体覆盖介质之一。也可以使用不同的染料21 或固色溶液（例如，多聚甲醛）21 作为方案的染色部分（步骤4），但是在50%乙醇中的结晶紫是最简单和最便宜的选择。
虽然进行这些测定可能过于简单，但它们确实需要培训和实践。使用并非不可替代的样本来学习这种方法是非常值得的，这样人们就可以在最重要的时候掌握该技术。
但是，斑块测定本身应该只在需要计数真正的活病毒体时使用。与荧光显微镜23，ELISA24，酶活性25，26或qPCR27等较新的定量方法相比，Plaquing是一种更古老的方法来测量病毒颗粒5，10。然而，后一种方法会产生替代数据，表明存在整个病毒粒子，但可能导致对可行颗粒的严重高估，因为用户将量化感染指标，而不是真正的病毒粒子。荧光显微镜通过有多少细胞表现出病毒表达的蛋白质来测量感染性病毒粒子，但不一定检测到完整的，具有复制能力的病毒粒子。ELISA同样检测可能存在的病毒蛋白的存在，这些病毒蛋白可能没有完全传染性的病毒粒子。酶促活性测定虽然提示完整的病毒粒子，但仅显示存在单个活性酶，并不反映整个病毒粒子的真正传染性。qPCR只是量化病毒基因组的拷贝，无论该基因组是否有缺陷。与斑块测定可比的唯一可量化活病毒的方法是终点稀释测定28，这仍然需要通过Reed-Muench或Spearman-Kärber方法进行统计估计29，30，31以确定病毒粒子浓度。
虽然斑块测定是整个病毒学中使用的常规方法，但在特定情况下，它们不是首选的定量测定。例如，斑块测定要求宿主细胞附着在底物上;如果感染的最佳宿主细胞是非粘附的，斑块将永远不会形成32。一些病毒的生长速度比宿主的典型细胞周期慢，因此任何萌芽的斑块都会被宿主细胞本身过度生长21。斑块有时可能形成不好，只是由于细胞病变效应的性质，使得真正斑块的确定成为一个限制21。
这里介绍的疱疹病毒的扁平化方法不一定是独一无二的。然而，这种对与成功的HSV斑块测定相关的小警告的深入描述可能会减少许多用户，特别是新手所经历的困难。无论如何，所描述的方法也广泛适用于许多其他病毒的斑块测定，包括但不限于微核病毒33，正粘病毒34，黄病毒35，冠状病毒36以及许多其他需要可量化的传染性动物病毒的系统。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢我们实验室（PJD和BJM）的无数学生，他们多年来一直与我们一起改进这些方法。特别感谢Stan Person，在他的指导下，这种方法首先得到了发展。这项工作得到了陶森大学费舍尔科学与数学学院本科生研究支持基金和NIGMS Bridges的部分支持，获得了学士学位补助金5R25GM058264。此内容完全是作者的责任，并不一定代表美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所的官方观点。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Corning | 3512 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
| Antibiotic/antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| Crystal violet | Alfa Aesar | B2193214 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++) | Gibco | 14190144 | |
| Fetal calf serum | Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Gibco | GS07F161BA | |
| Hemacytometer | Thermo Fisher | 02-671-54 | |
| Methylcellulose | Millipore-Sigma | 27-441-0 | |
| Quaternary agent (Lysol I.C.) | Thermo Fisher | NC9645698 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 |
References
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