Summary
Plaquing er en rutinemæssig metode, der bruges til at kvantificere levende vira i en befolkning. Selvom plaquing ofte undervises i forskellige mikrobiologiske læseplaner med bakterier og bakteriofager, er plaquing af pattedyrvirus mere kompleks og tidskrævende. Denne protokol beskriver de procedurer, der fungerer pålideligt til regelmæssigt arbejde med herpes simplex-vira.
Abstract
Der er adskillige offentliggjorte protokoller til plaquing af vira, herunder referencer inden for primær litteratur til metodologi. Imidlertid kan plaquing vira være vanskelige at udføre, hvilket kræver fokus på dets specifikationer og forfining. Det er en utrolig udfordrende metode for nye studerende at mestre, hovedsageligt fordi det kræver omhyggelig opmærksomhed på de mest minutiøse detaljer. Denne demonstration af plaquing herpes simplex vira bør hjælpe dem, der har kæmpet med at visualisere metoden, især dens nuancer, gennem årene. Selv om dette manuskript er baseret på de samme principper for standardplaquing-metoden, adskiller det sig ved, at det indeholder en detaljeret beskrivelse af (1) hvordan man bedst håndterer værtsceller for at undgå forstyrrelser under processen, (2) et mere nyttigt viskøst medium end agarose for at begrænse diffusionen af virioner og (3) en simpel fikserings- og farvningsprocedure, der giver pålideligt reproducerbare resultater. Desuden hjælper den ledsagende video med at demonstrere de finere sondringer i processen, som ofte savnes, når man instruerer andre om at udføre plaque-assays.
Introduction
Begyndelsen på virusplaque-assays går tilbage til de første opdagelser af vira i 1890'erne1. Tobaksmosaikvirus blev først isoleret og videregivet tobaksblade, hvor individuelle infektionspletter kunne genkendes og kvantificeres som hidrørende fra en enkelt, levende virusenhed2, der senere blev identificeret som en virion2. Senere skelsættende undersøgelser med bakterier og bakteriofager perfektionerede de teknikker, der blev brugt til at plaque disse vira, herunder bakterier i midten af vækstfasen, seriel fortynding af bakteriofagprøver og topagar med efterfølgende visualisering af bogstavelige huller (navngivne plaques) i bakterieplænen3.
Plaquing af dyrevirus forsinkede den spændende forskning, der blev udført med bakteriofager, hovedsageligt fordi de metoder, der kræves til dyrkning af pattedyrceller i kultur, først blev udviklet i 1940'erne4. Fremkomsten af voksende murineceller i fravær af hele værtsorganismen4 skabte imidlertid en ny æra i evnen til at dyrke og tælle vira. Et sådant arbejde blev udvidet til formering og kvantation af Western Equine Encephalomyelitis virus i kyllingeceller og poliovirus i humane celler5,6. Efterhånden som området for dyrkelige pattedyrceller udvidede sig, gav de forskellige værtscellers væld af forskellige virusinfektioner verden et overflødighedshorn af muligheder for at studere alle mulige vira7. Dette omfattede udbredelse og kvantificering af humane herpesvirus, især herpes simplex virus-1 (HSV-1) og -2 (HSV-2), som forårsager mucokutane læsioner8. Det er vigtigt, at alle plaque-assays er afhængige af eksistensen af levende virioner, som kan komme ind i værtsceller på en receptormedieret måde i en prøve9. Uanset den allestedsnærværende og mangfoldighed af publikationer om udførelse af plaque assays5,10,11,12,13,14,15,16 er disse metoder til HSV-1/-2 en blanding af både kunst og videnskab; man kan ikke udføre analysen uden behørig opmærksomhed på alle detaljer i protokollen, og man kan heller ikke udføre et vellykket assay uden et krtitisk øje for subtilitet i processen. Dette manuskript skildrer en af de mest konsekvent reproducerbare metoder til HSV-1/-2 plaque assays, med præcise detaljer mod assayets kunst, der sjældent diskuteres.
Denne nuværende protokol opnår levende plakdannende enheder (PFU) tæller pålideligt for HSV-1 og -2. De bedste resultater opnås ved anvendelse af Vero-celler (transformerede afrikanske grønne abenyrepitelceller) ved lav passage (under passage nummer 155) og rutinemæssigt dyrket i alfa-MEM17 suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS), L-alanyl-L-glutamin og en antibiotikum/antimykotisk blanding18. Vero-celler formeres normalt i dette medium to til tre gange om ugen ved en 1/5 fortynding hver gang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer med Vero-cellerne og levende herpesvirus er blevet godkendt af Towson University Institutional Biosafety Committee. En generaliseret ordning for disse procedurer er repræsenteret i figur 1.
1. Såning af Vero-cellerne
- Dagen før påbegyndelse af plaque-analysen trypsiniseres Vero-celler og resuspend dem i almindelig Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) og supplerer i henhold til standard cellekulturmetodologi19. Resuspend de trypsiniserede celler i 10 ml DMEM pr. T-75 kolbe af de sammenflydende Vero-celler (~ 107 celler).
BEMÆRK: DMEM bruges til plaque assays i stedet for alfa-MEM, fordi det lidt bremser cellevæksthastigheden og favoriserer bedre plaque assay resultater. - Tæl cellerne efter ens foretrukne metode (f.eks. et standard hæmocytometer med Trypan Blue-udelukkelse)19.
- Frø cellerne ved 4 x 106 celler / plade; til HSV-2 skal du bruge 6-brøndsplader med 2,5 ml DMEM (med kosttilskud) pr. Brønd; og for HSV-1 skal du bruge 12-brøndsplader med 1,25 ml DMEM (med kosttilskud) pr. Brønd.
BEMÆRK: Antallet af celler skal være konstant uanset hvilken plade der anvendes, selvom brøndenes størrelse betyder noget for nøjagtigheden i plakanalysen. Det er vigtigt at få cellerne jævnt fordelt, hvilket mest effektivt kan opnås ved at flytte pladen frem og tilbage, ikke på en cirkulær måde. - Lad cellerne vokse natten over ved 37 °C/5 % CO2 i en befugtet inkubator.
BEMÆRK: Fugtigheden opretholdes med en gryde med destilleret vand indeholdende et algicid i bunden af inkubatoren.
2. Prøvefortynding
- Fuldfør prøvefortyndingen og tilsætningen af virus til celler i en laboratoriesession.
FORSIGTIG: HSV-1 og -2 er infektiøse for mennesker og skal håndteres under korrekt biosikkerhedsindeslutning (BSL-2). Hold alle materialer, der kommer i kontakt med virussen, adskilt og desinficer med et kvaternært middel ved 1/256 fortynding (se tabel over materialer), iodfor, blegemiddel eller stærkt ionisk vaskemiddel (f.eks. SDS), før du fjerner dem fra biosikkerhedsskabet. - Dagen efter såning af Vero-cellerne fortyndes serielt hver virusprøve, der skal plaques i 1x PBS; brug typisk 10 gange fortyndinger til mest præcis sporing.
- Foretag disse fortyndinger gennem 10-4 (for lave koncentrationer af vira) eller gennem 10-9 (for forventninger om højere titerprøver) med mindst 1 ml af hver prøve tilbage til selve plakanalysen.
- Opbevar alle virale fortyndinger på is (ikke længere end 1 time), indtil de er klar til at tilføje disse fortyndede virusprøver til cellerne.
3. Tilsætning af virus til cellerne
- Fjern cellekulturmediet fra en eller to brønde med pipette.
BEMÆRK: Brug ikke en aspirator, fordi den fjerner for meget væske fra cellemonolaget og tørrer cellerne ud. En afgørende overvejelse er at sikre, at cellemonolaget forbliver hydreret gennem hele eksperimentets forløb. Hvis cellerne tørrer ud, vasker de pladen af i det sidste trin og genererer ubrugelige data. Behandl derfor kun en eller to brønde ad gangen for at reducere denne mulighed. - Tilsæt forsigtigt den fortyndede virusprøve (100-400 μL og 50-200 μL virusprøve anvendes til henholdsvis 6-brønds og 12-brønds plader) dråbevis til hvert monolag, tilsæt dråberne ned ad siden af hver brønd. Gentag processen for hver eller to brønde, indtil hele pladen er fyldt med virusprøverne, der plaques.
BEMÆRK: Tilsætning af dråberne til midten af brønden kan utilsigtet slough celler fra substratet. - Rock forsigtigt hele pladen i hånden for at sikre, at PBS, der indeholder virussen, dækker hele monolaget af celler i hver brønd, og læg derefter pladen i en CO2-inkubator ved 37 ° C for at lade virussen adsorbere.
- Hvert 10. minut inden for 1 time skal du fjerne pladen fra inkubatoren, forsigtigt rocke den igen for at sprede viruset mere jævnt over hver brønd og derefter placere den tilbage i inkubatoren.
BEMÆRK: Hvert eksperiment vil diktere antallet af replikater, og hvilke fortyndinger der anvendes; læserens præference dikterer denne beslutning. - For at mindske muligheden for utilsigtet at tælle uabsorberet inokulum skal du fjerne virusprøven fra brøndene med 1000 μL pipettespidser og placere den i et affaldsbægerglas.
BEMÆRK: Igen udføres denne procedure med kun en eller to brønde ad gangen for at opretholde hydrering af cellemonolaget. - Der anbringes 2,5 ml methylcelluloseoverlejring (opløses 5 % methylcellulose m/w i 100 ml PBS, autoklave i 15 minutter ved 121 °C og 15 psi i en flydende cyklus, hvorefter der tilsættes 375 ml DMEM plus 25 ml FBS).
- Når en hel plade indeholder overlejring, skal du placere pladen tilbage i inkubatoren for at tillade vækst i to dage.
BEMÆRK: Hvis virussen og cellerne får lov til at vokse i tre dage, selv i DMEM plus kosttilskud, kan der opstå et betydeligt tab af celler i monolaget og derved kompromittere de endelige data. - Desinficere affaldsbægerglasset, typisk med tilsætning af blegemiddel, en iodphor eller et lignende virucid, inden det fjernes fra biosikkerhedsskabet.
4. Farvning til plaques
- Efter to-dages inkubation fjernes methylcelluloseoverlejringen med en pipette, igen en eller to brønde ad gangen, og anbringes i et affaldsbægerglas.
- Tilsæt ~ 2 ml 1% krystalviolet (se materialetabel) i 50% ethanol til hver brønd for at plette plaques.
BEMÆRK: Det er ikke vigtigt at fjerne hver eneste dråbe af overlejringen. - Inkuber pladen med alle brønde fyldt med pletten i 30 minutter ved 37 °C. På dette tidspunkt desinficeres affaldsnæberen som ovenfor i trin 3.8.
- Vask pladerne kraftigt med ledningsvand, indtil afstrømningen er klar.
BEMÆRK: En blid vandstrøm er ikke kraftig nok; fuldt tryk fra en laboratorievaskarmatur er påkrævet. - På dette tidspunkt skal du sikre dig, at der er ca. 10 gange forskelle i antallet af plaques på tværs af hver fortyndingsserie.
- Lad pladerne tørre natten over på hovedet, hvorefter de enkelte plaketter kan tælles.
5. Tælling af plaques og bestemmelse af virustiter
- Uanset fremgangsmåden (se NOTE nedenfor) multipliceres antallet af plaques med fortyndingsfaktoren (f.eks. Hvis plaques blev talt i 10-4-brønden , ville antallet af plaques blive ganget med 104).
BEMÆRK: Selvom det er nyttigt at tælle inden for et interval på 10-100 plaques5, er det noget mere pålideligt at tælle brønde med 30-300 plaques og tager højde for ca. 1/2-log fortyndinger i stedet for fuld-log fortyndinger. - Divider dette tal med volumenet af inokulum (som ovenfor i trin 3.2), og gennemsnit alle brønde, der har plaques inden for det angivne område for at få den mest nøjagtige titer af HSV i den oprindelige prøve.
- Udfør beregningerne i trin 5.3.1 til 5.3.5 under hensyntagen til brugen af mock-data i tabel 1.
- Overvej kun brønde med 30-300 plaques (trin 5.1). Brug derfor i tabel 1 kun kolonnen 10-5 til replikat 1, 2 og 3.
- Tag antallet af plaques ved den givne fortynding og multiplicer med den gensidige af fortyndingsfaktoren. Derfor går 10-5 kolonnen i prøve 1 fra 81 plaques ved 10-5 fortynding til 81 plaques gange 105.
- Divider derefter dette tal med volumenet (i ml) af virusfortyndingen tilsat cellerne i den brønd. Hvis man antager, at dataene om HSV-1 i tabel 1 er fra en plade med 12 brønde, ville 0,2 ml være den mest hensigtsmæssige måling. Derfor bliver beregningen fra trin 5.3.2 81 x 105 divideret med 0,2 ml eller 4,0 x 107 PFU/ml HSV-1.
- Gentag denne proces for alle nyttige data og gennemsnit. Foretag derfor beregningen i 5.3.2-5.3.3 på alle prøver i kolonnen 10-5, forudsat at de stammer fra den samme virusprøve, og at de biologiske replikater blev udført for at opnå den mest nøjagtige titermåling. For så vidt angår tabel 1, gennemsnit 4,0 x 107, 2,1 x 107 og 2,6 x 107 PFU/ml for at opnå en endelig gennemsnitlig titer på 2,9 x 107 ± 0,98 x 107 PFU/ml for denne prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabel 1 viser et eksperiment, der har optimale resultater. Alle 10 gange fortyndinger følger et ca. 10 gange fald i antallet af plak. Denne slags data kan også ses i figur 2, et egentligt plaque assay, hvor det tællelige antal plaques faldt i intervallet 10-4 for alle tre replikater. Det samme kan ses i figur 3, den øverste række, hvor det tællelige antal plaketter var i 10-3 fortyndingen.
Figur 3, nederste række, viser imidlertid et helt andet resultat, når et plakassay ikke udføres godt. For det første er der meget få plaques synlige fra enhver fortynding; derfor er dataene ubrugelige. For det andet er der synlige områder omkring toppen, hvor Vero-cellerne helt er løftet fra substratet, hvilket enten er tegn på at lade cellerne tørre ud i processen eller at pipettere for kraftigt i det område af brønden.
Tabel 2 viser også et sæt potentielt afvigende resultater i plaktællinger og kræver advarsler undervejs. Bemærk, at hverken den øverste række eller den nederste række af replikater følger en regelmæssig 10 gange forskel i plaktællinger, når man bevæger sig fra en fortynding til den næste; disse data indikerer brugerfejl under virusfortyndingsprocessen. Desuden er det ikke sandsynligt, at en bruger nøjagtigt ville tælle over 15.000 plaques, så man må sætte spørgsmålstegn ved disse data. Endelig kan man bemærke, at der i replikat 1, 10-6 fortynding er et plakantal i området 30-300; I betragtning af den dårlige karakter af resten af dataene i denne replikat er det ikke desto mindre usandsynligt, at antallet af 42 plak er et nøjagtigt tal. Derfor er de eneste troværdige data i tabel 2 i replikat 2.
Figur 4 viser de samme problemer med celler, der tørrer ud eller bliver mishandlet under plaque-analysen. Figur 4 viser imidlertid kritisk dårlig Vero-cellesåning; hver brønd viser mørkere lilla pletter, hvilket indikerer, at celler ikke spredes godt over brønden og stables oven på hinanden i klynger.
Figur 1: Samlet plaque assay skema. Tilpasset fra Biorender-skabelonen, "Viral Plaque Assay Protocol", af BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Plaque assay for HSV-1 i tolv brøndplader. Biologiske replikater blev udført som beskrevet i figur 1 på en prøve af HSV-1. Serielle 10-foldige fortyndinger af en HSV-1-prøve (startende ved 10-2 fortyndingen ) blev tilsat til Vero-cellerne, inkuberet og derefter farvet med krystalviolet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Plaque assay for HSV-2 i seks-brønds plader. Biologiske replikater blev udført som beskrevet i figur 1 på en prøve af HSV-2. Serielle 10-foldige fortyndinger af en HSV-2-prøve (startende ved 10-2 fortynding) blev tilsat til Vero-celler , inkuberet og derefter farvet med krystalviolet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Plaque assay for HSV-1 i tolv brøndplader. Biologiske replikater blev udført som beskrevet i figur 1 på en prøve af HSV-1. Serielle 10-foldige fortyndinger af en HSV-1-prøve (startende ved 10-2 fortynding) blev tilsat til Vero-celler , inkuberet og derefter farvet med krystalviolet. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Fortyndingsfaktor | ||||
| Kopiere | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 |
| 1 | 5721 | 635 | 81 | 5 |
| 2 | 4592 | 365 | 42 | 0 |
| 3 | 5,519 | 521 | 53 | 1 |
Tabel 1: Repræsentativ plak tæller fra et vellykket assay. Serielle fortyndinger fra hver biologisk replikat blev udført; repræsentative plaktællinger (startende ved 10-3 fortynding) vises for hver fortynding.
| Fortyndingsfaktor | ||||
| Kopiere | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 |
| 1 | 15225 | 635 | 450 | 42 |
| 2 | 4592 | 365 | 42 | 0 |
| 3 | 5519 | 5400 | 53 | 1 |
Tabel 2: Repræsentativ plak tæller fra et mislykket assay. Serielle fortyndinger fra hver biologisk replikat blev udført; repræsentative plaktællinger (startende ved 10-3 fortynding) vises for hver fortynding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens plaque-assays er næsten lige så gamle som selve pattedyrcellekulturen, ser det ud til, at hvert laboratorium har sit eget sæt protokoller til at udføre dette grundlæggende assay5,6,10,11,12,13,14,15,16,20 . Selvom instruktionerne i hver offentliggjort version af et plakassay adskiller sig så lidt, er der få af disse manuskripter, der belyser de kritiske nuancer, der er involveret i at opnå konsistente resultater.
Derfor er der nogle dele af denne protokol, der er mere kunst end videnskab. Når Vero-celler podes i brønde til analysen, skal de fordeles jævnt i hele brønden (figur 4). Alle trin, der involverer en væskeoverførsel (f.eks. Trin 3.1, 3.2, 3.5, 3.6, 4.1 og 4.2), skal udføres omhyggeligt for at holde Vero-cellemonolaget hydreret (figur 3 og figur 4). Det er også afgørende ikke at røre bunden af brønden med nogen pipette, ellers kan cellerne skrabe af, hvilket yderligere kompromitterer de endelige data (figur 4).
Mens methylcellulose er fordelagtigt som et overlejringsmateriale for at forhindre diffusion af virioner over hele brønden, kan der anvendes alternativer. For eksempel kan man anvende mikrokrystallinsk cellulose21,22 eller carboxymethylcellulose21. Uanset hvad er methylcellulose dog et af de nemmeste og billigste flydende overlejringsmedier at bruge. Man kan også bruge et andet farvestof21 eller en anden fikseringsopløsning (f.eks. paraformaldehyd)21 til farvningsdelen af protokollen (trin 4), men krystalviolet i 50% ethanol er den nemmeste og billigste blandt mulighederne.
Selvom det kan være åbenlyst ligetil at udføre disse assays, kræver de træning og praksis. Det er værd at bruge prøver, der ikke er uerstattelige til at lære denne metode, så man har mestret teknikken, når det betyder mest.
Plaque assays selv bør dog kun bruges, når man skal tælle bona fide levende virioner. Plaquing er en meget ældre metode til måling af viruspartikler5,10 sammenlignet med nyere kvantitative metoder som fluorescensmikroskopi23, ELISA24, enzymatisk aktivitet25,26 eller qPCR27. Disse sidstnævnte metoder genererer imidlertid surrogatdata, der tyder på tilstedeværelsen af hele virioner, men kan alligevel føre til en grov overvurdering i levedygtige partikler, fordi brugeren ville kvantificere en indikator for infektion, ikke reelle virioner. Fluorescensmikroskopi måler infektiøse virioner ved, hvor mange celler der udviser tilstedeværelsen af et protein udtrykt af virussen, men detekterer ikke nødvendigvis komplette, replikationskompetente virioner. ELISA registrerer ligeledes tilstedeværelsen af virusproteiner, der kan eksistere uden en fuldstændig infektiøs virion. Assaying af enzymatisk aktivitet, selvom den antyder en intakt virion, viser kun, at et enkelt aktivt enzym er til stede og ikke afspejler den sande smitsomme natur af en hel virion. Og qPCR kvantificerer blot kopier af en virus' genom, uanset om genomet er defekt eller ej. Den eneste metode, der kan sammenlignes med et plaque-assay til kvantificering af levende vira, er et endpointfortyndingsassay28, som stadig kræver et statistisk skøn via Reed-Muench- eller Spearman-Kärber-metoderne29,30,31 for at bestemme virionkoncentrationen.
Mens plaque assays er en rutinemæssig metode, der anvendes i hele virologien, er der særlige tilfælde, hvor de ikke er det kvantitative assay, der vælges. For eksempel kræver plaque-assays, at værtsceller fastgøres til et substrat; hvis den bedste værtscelle for infektion ikke er klæbende, vil plaques aldrig danne32. Nogle vira vokser langsommere end deres værters typiske cellecyklus, og derfor vil eventuelle spirende plaques blive overgroet af værtscellerne selv21. Plaques kan undertiden ikke danne sig godt, bare på kraft af arten af den cytopatiske virkning, hvilket gør bestemmelsen af bona fide plaques til en begrænsning21.
Tilgangen til plaquing herpesvirus præsenteret her er ikke nødvendigvis unik. Denne dybdegående beskrivelse af de mindre forbehold, der er forbundet med et vellykket HSV-plaqueassay, kan dog mindske de vanskeligheder, som mange brugere, især nybegyndere, har oplevet. Uanset hvad er den beskrevne metode også bredt anvendelig på plaque-assays med mange andre vira, herunder, men ikke begrænset til, picornavirus33, orthomyxovirus34, flavirus35, coronavirus36 og mange andre systemer, hvor der kræves en kvantificerbar mængde infektiøse dyrevira.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker utallige studerende i vores laboratorier (PJD og BJM), der har arbejdet sammen med os gennem årene med at forfine disse metoder. En særlig tak til Stan Person, under hvis vejledning denne metode først blev udviklet. Dette arbejde blev delvist støttet af Towson University Fisher College of Science and Math Undergraduate Research Support Fund og NIGMS Bridges til Baccalaureate grant 5R25GM058264. Dette indhold er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health's National Institute of General Medical Sciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Corning | 3512 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
| Antibiotic/antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| Crystal violet | Alfa Aesar | B2193214 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++) | Gibco | 14190144 | |
| Fetal calf serum | Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Gibco | GS07F161BA | |
| Hemacytometer | Thermo Fisher | 02-671-54 | |
| Methylcellulose | Millipore-Sigma | 27-441-0 | |
| Quaternary agent (Lysol I.C.) | Thermo Fisher | NC9645698 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 |
References
- Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. Introduction to Moden Virology. 6th end. , Wiley-Blackwell. (2007).
- Mahy, B., Collier, L. Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, Arnold. (1998).
- Anderson, B., et al. Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays. Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).
- Earle, W. R., et al. Production of malignancy in vitro; IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. Journal of the National Cancer Institute. 4 (2), 165-212 (1943).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).
- Enders, J. F., Weller, T. H., Robbins, F. C. Cultivation of the lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues. Science. 109 (2822), 85-87 (1949).
- Enders, J. F. Cytopathology of virus infections: particular reference to tissue culture studies. Annual Review of Microbiology. 8, 473-502 (1954).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J. Fields Virology. Knipe, D. M., et al. 1, Wolters Kluwer-Lippincott Williams & Wilkins. 1823-1897 (2013).
- Madavaraju, K., Koganti, R., Volety, I., Yadavalli, T., Shukla, D. Herpes simplex virus cell entry mechanisms: An update. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 617578 (2020).
- Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Advances in Virus Research. 8, 319-378 (1961).
- Farnham, A. E. The formation of microscopic plaques by herpes simplex virus in HeLa cells. Virology. 6 (2), 317-327 (1958).
- Garabedian, G. A., Scott, L. V. Plaque assay for herpes simplex virus in L-929 (Earle) mouse fibroblasts. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 126 (2), 568-571 (1967).
- Lancz, G. J. Herpes simplex viruses types 1 and 2. Type and strain specific characteristics affecting virus plaque formation. Arch Gesamte Virusforsch. 46 (1-2), 36-43 (1974).
- Muratore, O., Tonoli, E. L., Pesce Schito, A. A short-term plaque assay for antiviral drug research on herpes simplex virus type 2. New Microbiologica. 19 (3), 257-261 (1996).
- Sato, S., Kaneki, H., Shirai, J., Takahashi, K., Kawana, R. Differentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by plaque appearances on semicontinuous rabbit lens epithelial cells in the clinical laboratory. Kansenshogaku Zasshi. 67 (6), 561-573 (1993).
- Yazaki, S., Taniguchi, S., Yoshino, K. Improvement of the plaque assay of herpes simplex virus in HeLa cells. Japanese Jouranl of Microbiology. 10 (3), 133-139 (1966).
- Stanners, C. P., Eliceiri, G. L., Green, H. Two types of ribosome in mouse-hamster hybrid cells. Nature New Biology. 230 (10), 52-54 (1971).
- Giannasca, N. J., Suon, J. S., Evans, A. C., Margulies, B. J. Matrix-based controlled release delivery of acyclovir from poly-(ethylene co-vinyl acetate) rings. Journal of Drug Delivery Science and Technology. 55, 101391 (2020).
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 7th edn. , John Wiley & Sons, Inc. (2016).
- Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 38 (8), 747-752 (1952).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 3, 63 (2006).
- Culley, S., Towers, G. J., Selwood, D. L., Henriques, R., Grove, J. Infection counter: Automated quantification of in vitro virus replication by fluorescence microscopy. Viruses. 8 (7), 201 (2016).
- Hudu, S. A., et al. Quantitative Hepatitis B e antigen: A better predictor of Hepatitis B virus DNA than quantitative Hepatitis B surface antigen. Clinical Laboratory. 64 (4), 443-449 (2018).
- Baltimore, D. RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature. 226 (5252), 1209-1211 (1970).
- Scolnick, E. M., Aaronson, S. A., Todaro, G. J., Parks, W. P. RNA dependent DNA polymerase activity in mammalian cells. Nature. 229 (5283), 318-321 (1971).
- Strick, L. B., Wald, A. Diagnostics for herpes simplex virus: is PCR the new gold standard. Molecular Diagnosis and Therapy. 10 (1), 17-28 (2006).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Jouranl of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Kärber, G. Beitrag zue kollektiven Behandlung pharmakologischer pharmakologischer Reihenversuche. Archiv for Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 162 (4), 480-487 (1931).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).
- Spearman, C. The Method of 'Right and Wrong Cases' (Constant Stimuli) without Gauss's formula. British Journal of Psychology. 2 (3), 227-242 (1908).
- Ryu, W. -S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. 1st edn. , Academic Press. (2017).
- Burrill, C. P., Strings, V. R., Andino, R. Poliovirus: generation, quantification, propagation, purification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 15 Unit 15H 11 (2013).
- Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yanguez, E. Propagation and titration of influenza viruses. Methods in Molecular Biology. 1836, 59-88 (2018).
- Baz, M. Zika virus isolation, purification, and titration. Methods in Molecular Biology. 2142, 9-22 (2020).
- Coleman, C. M., Frieman, M. B. Growth and quantification of MERS-CoV infection. Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).
