Summary
Plaquing is een routinemethode die wordt gebruikt om levende virussen in een populatie te kwantificeren. Hoewel plaquing vaak wordt onderwezen in verschillende microbiologische curricula met bacteriën en bacteriofagen, is het plaquenten van zoogdiervirussen complexer en tijdrovender. Dit protocol beschrijft de procedures die betrouwbaar functioneren voor regelmatig werk met herpes simplex-virussen.
Abstract
Er zijn tal van gepubliceerde protocollen voor het plaquen van virussen, inclusief verwijzingen in de primaire literatuur voor methodologie. Het paaien van virussen kan echter moeilijk uit te voeren zijn, waardoor de nadruk moet worden gelegd op de specificaties en verfijning ervan. Het is een ongelooflijk uitdagende methode voor nieuwe studenten om onder de knie te krijgen, vooral omdat het nauwgezette aandacht vereist voor de meest minuscule details. Deze demonstratie van het plaquen van herpes simplex-virussen zou degenen moeten helpen die in de loop der jaren hebben geworsteld met het visualiseren van de methode, vooral de nuances ervan. Hoewel dit manuscript is gebaseerd op dezelfde principes van de standaard plaquing-methodologie, verschilt het in die zin dat het een gedetailleerde beschrijving bevat van (1) hoe gastheercellen het beste kunnen worden behandeld om verstoring tijdens het proces te voorkomen, (2) een nuttiger viskeus medium dan agarose om de diffusie van virionen te beperken, en (3) een eenvoudige fixatie- en kleuringsprocedure die betrouwbaar reproduceerbare resultaten oplevert. Bovendien helpt de bijbehorende video de fijnere onderscheidingen in het proces te demonstreren, die vaak worden gemist bij het instrueren van anderen over het uitvoeren van plaque-assays.
Introduction
Het begin van virus plaque assays gaan terug tot de eerste ontdekkingen van virussen in de jaren 18901. Tabaksmozaïekvirus werd voor het eerst geïsoleerd en doorgegeven op tabaksbladeren, waar individuele infectieplekken konden worden herkend en gekwantificeerd als afkomstig van een enkele, levende virusentiteit2, later geïdentificeerd als een virion2. Latere baanbrekende studies met bacteriën en bacteriofagen perfectioneerden de technieken die werden gebruikt om deze virussen te plaqueren, waaronder bacteriën in de mid-log fase van groei, seriële verdunning van bacteriofaagmonsters en top agar met daaropvolgende visualisatie van letterlijke gaten (plaques genoemd) in het bacteriële gazon3.
Plaquing van dierlijke virussen bleef achter bij het opwindende onderzoek dat werd uitgevoerd met bacteriofagen, vooral omdat de methoden die nodig zijn voor het kweken van zoogdiercellen in cultuur pas in de jaren 19404 werden ontwikkeld. De komst van groeiende muizencellen in afwezigheid van het hele gastheerorganisme4 bracht echter een nieuw tijdperk voort in het vermogen om virussen te kweken en te tellen. Dergelijk werk werd uitgebreid voor de verspreiding en kwantificering van western equine encefalomyelitisvirus in kippencellen en poliovirus in menselijke cellen5,6. Naarmate het rijk van kweekbare zoogdiercellen zich uitbreidde, gaf de schare van verschillende gastheercellen voor verschillende virale infecties de wereld een overvloed aan mogelijkheden om allerlei soorten virussen te bestuderen7. Dit omvatte de verspreiding en kwantificering van menselijke herpesvirussen, met name herpes simplex virus-1 (HSV-1) en -2 (HSV-2), die mucocutane laesies veroorzaken8. Belangrijk is dat alle plaque-assays afhankelijk zijn van het bestaan van levende virionen, die gastheercellen op een receptorgemedieerde manier in een monster kunnen binnendringen9. Ongeacht de alomtegenwoordigheid en veelheid aan publicaties over de uitvoering van plaque-assays5,10,11,12,13,14,15,16, zijn deze methoden voor HSV-1/-2 een mix van zowel kunst als wetenschap; men kan de test niet uitvoeren zonder de juiste aandacht voor elk detail in het protocol, noch kan men een succesvolle test uitvoeren zonder een kritisch oog voor subtiliteit in het proces. Dit manuscript toont een van de meest consistent reproduceerbare methoden voor HSV-1 /-2 plaque-assays, met nauwkeurige details over de kunst van de assay die zelden worden besproken.
Dit huidige protocol verkrijgt op betrouwbare wijze live plaquevormende eenheden (PFU) tellingen voor HSV-1 en -2. De beste resultaten worden verkregen met behulp van Vero-cellen (getransformeerde Afrikaanse groene apennierepitheelcellen) bij lage passage (onder passagenummer 155) en routinematig gekweekt in alfa-MEM17 aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS), L-alanyl-L-glutamine en een antibioticum / antimycotisch mengsel18. Vero-cellen worden standaard twee tot drie keer per week in dit medium vermeerderd bij een verdunning van 1/5 telkens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures met de Vero-cellen en levende herpesvirussen zijn goedgekeurd door het Towson University Institutional Biosafety Committee. Een algemeen schema van deze procedures is weergegeven in figuur 1.
1. Zaaien van de Vero-cellen
- De dag voordat de plaquetest wordt gestart, trypsiniseren Vero-cellen en resuspenderen ze in reguliere Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) en supplement volgens de standaard celkweekmethodologie19. Resuspend de trypsinized cellen in 10 ml DMEM per T-75 kolf van de confluent Vero-cellen (~ 107 cellen).
OPMERKING: DMEM wordt gebruikt voor plaque-assays in plaats van alfa-MEM omdat het de celgroeisnelheid enigszins vertraagt en betere plaque-assayresultaten bevordert. - Tel de cellen volgens de voorkeursmethode (bijvoorbeeld een standaard hemocytometer met Trypan Blue-uitsluiting)19.
- Zaai de cellen op 4 x 106 cellen/plaat; gebruik voor HSV-2 6-putplaten met 2,5 ml DMEM (met supplementen) per put; en gebruik voor HSV-1 12-putplaten met 1,25 ml DMEM (met supplementen) per put.
OPMERKING: Het aantal cellen moet constant zijn, ongeacht de gebruikte plaat, hoewel de grootte van de putten van belang is voor de nauwkeurigheid in de plaquetest. Het is essentieel om cellen gelijkmatig te verdelen, wat het meest effectief kan worden bereikt door de plaat heen en weer te bewegen, niet op een cirkelvormige manier. - Laat de cellen een nacht groeien bij 37 °C/5% CO2 in een bevochtigde incubator.
OPMERKING: Vochtigheid wordt gehandhaafd met een pan gedestilleerd water met een algicide in de bodem van de incubator.
2. Monsterverdunning
- Voltooi de monsterverdunning en de toevoeging van virus aan cellen in één laboratoriumsessie.
LET OP: HSV-1 en -2 zijn besmettelijk voor de mens en moeten worden behandeld onder de juiste bioveiligheidsinsluiting (BSL-2). Houd alle materialen die in contact komen met het virus gescheiden en desinfecteer met een quaternair middel bij 1/256 verdunning (zie Materialentabel), jodofor, bleekmiddel of sterk ionisch reinigingsmiddel (bijv. SDS) voordat u ze uit de bioveiligheidskast verwijdert. - De dag na het zaaien van de Vero-cellen, verdun elk virusmonster serieel om te worden geplakt in 1x PBS; gebruik meestal 10-voudige verdunningen voor de meest nauwkeurige tracking.
- Voer deze verdunningen uit via 10-4 (voor lage concentraties virussen) of via 10-9 (voor de verwachting van hogere titermonsters) waarbij ten minste 1 ml van elk monster overblijft voor de plaquetest zelf.
- Bewaar alle virale verdunningen op ijs (niet langer dan 1 uur) totdat ze klaar zijn om deze verdunde virusmonsters aan de cellen toe te voegen.
3. Toevoeging van virus aan de cellen
- Verwijder het celkweekmedium uit een of twee putjes met een pipet.
OPMERKING: Gebruik geen aspirator omdat deze te veel vloeistof uit de celmonolaag verwijdert en de cellen uitdroogt. Een cruciale overweging is ervoor te zorgen dat de celmonolaag gedurende de hele duur van het experiment gehydrateerd blijft. Als de cellen uitdrogen, spoelen ze in de laatste stap de plaat af en genereren ze onbruikbare gegevens. Verwerk daarom slechts één of twee putten tegelijk om deze mogelijkheid te verminderen. - Voeg voorzichtig het verdunde virusmonster toe (100-400 μL en 50-200 μL virusmonster worden gebruikt voor respectievelijk 6-well en 12-well platen) druppelsgewijs aan elke monolaag, waarbij de druppels langs de zijkant van elke put worden toegevoegd. Herhaal het proces voor elke één of twee putten totdat de hele plaat is gevuld met de virusmonsters die worden geplakt.
OPMERKING: Het toevoegen van de druppels aan het midden van de put kan per ongeluk cellen van het substraat verwijderen. - Wieg de hele plaat voorzichtig met de hand om ervoor te zorgen dat de PBS die het virus bevat de hele monolaag van cellen in elke put bedekt en plaats de plaat vervolgens in een CO2-incubator bij 37 ° C om het virus te laten adsorberen.
- Verwijder elke 10 minuten binnen 1 uur de plaat uit de couveuse, schommel hem voorzichtig opnieuw om het virus gelijkmatiger over elke put te verspreiden en plaats hem vervolgens terug in de couveuse.
OPMERKING: Elk experiment bepaalt het aantal replicaties en welke verdunningen worden gebruikt; de voorkeur van de lezer dicteert die beslissing. - Om de mogelijkheid te verkleinen om per ongeluk niet-geabsorbeerd entmateriaal te tellen, verwijdert u het virusmonster uit de putten met 1000 μL pipetpunten en plaatst u het in een afvalbeker.
OPMERKING: Nogmaals, deze procedure wordt uitgevoerd met slechts één of twee putten tegelijk om de hydratatie van de celmonolaag te behouden. - Plaats 2,5 ml van een methylcellulose-overlay (los 5% methylcellulose w/w op in 100 ml PBS, autoclaaf gedurende 15 minuten bij 121 °C en 15 psi in een vloeibare cyclus en voeg vervolgens 375 ml DMEM plus 25 ml FBS toe).
- Zodra een hele plaat overlay bevat, plaatst u de plaat terug in de incubator om twee dagen groei mogelijk te maken.
OPMERKING: Als het virus en de cellen drie dagen mogen groeien, zelfs in DMEM plus supplementen, kan een aanzienlijk verlies van cellen in de monolaag het gevolg zijn, waardoor de uiteindelijke gegevens in gevaar komen. - Desinfecteer het afvalbeker, meestal met de toevoeging van bleekmiddel, een jodofor of een vergelijkbaar virucide, voordat u het uit de bioveiligheidskast verwijdert.
4. Kleuring voor plaques
- Verwijder na de incubatietijd van twee dagen de methylcellulose-overlay met een pipet, opnieuw één of twee putten tegelijk, en plaats deze in een afvalbeker.
- Voeg ~ 2 ml 1% kristalviolet (zie tabel met materialen) in 50% ethanol toe aan elke put om de plaques te kleuren.
OPMERKING: Het is niet essentieel om elke laatste druppel van de overlay te verwijderen. - Incubeer de plaat met alle putjes gevuld met de vlek gedurende 30 min bij 37 °C. Desinfecteer op dit punt het bekerglas zoals hierboven beschreven in stap 3.8.
- Was de borden krachtig met kraanwater totdat de afvoer helder is.
OPMERKING: Een zachte stroom water is niet krachtig genoeg; volledige druk van een laboratorium gootsteen armatuur is vereist. - Zorg er op dit punt voor dat er ongeveer 10-voudige verschillen zijn in het aantal plaques in elke verdunningsreeks.
- Laat de platen een nacht ondersteboven drogen, waarna de afzonderlijke plaques kunnen worden geteld.
5. Plaques tellen en virustiter bepalen
- Ongeacht de benadering (zie OPMERKING hieronder), vermenigvuldig het aantal plaques met de verdunningsfactor (bijvoorbeeld als de plaques werden geteld in de put van 10-4 , zou het aantal plaques worden vermenigvuldigd met 104).
OPMERKING: Hoewel tellen binnen een bereik van 10-100 plaques nuttig is5, is het tellen van putten met 30-300 plaques iets betrouwbaarder en houdt rekening met ongeveer 1/2-log verdunningen in plaats van full-log verdunningen. - Deel dit aantal door het volume entmateriaal (zoals hierboven in stap 3.2) en gemiddelde alle putten met plaques binnen het aangegeven bereik om de meest nauwkeurige titer van HSV in het oorspronkelijke monster te krijgen.
- Voer de berekeningen uit in stap 5.3.1 tot en met 5.3.5, rekening houdend met het gebruik van mock-gegevens in tabel 1.
- Overweeg alleen putten met 30-300 plaques (stap 5.1). Gebruik daarom in tabel 1 alleen de kolom 10-5 voor replicaties 1, 2 en 3.
- Neem het aantal plaques bij de gegeven verdunning en vermenigvuldig met de reciproke van de verdunningsfactor. Vandaar dat de 10-5 kolom van monster 1 van 81 plaques bij de 10-5 verdunning naar 81 plaques maal 105 gaat.
- Deel dat getal vervolgens door het volume (in ml) van de virusverdunning die aan de cellen in die put is toegevoegd. Ervan uitgaande dat de gegevens over HSV-1 in tabel 1 afkomstig zijn van een plaat met 12 putten, zou 0,2 ml de meest geschikte meting zijn. Vandaar dat de berekening van stap 5.3.2 81 x 105 gedeeld door 0,2 ml, of 4,0 x 107 PFU / ml HSV-1 wordt.
- Herhaal dit proces voor alle nuttige gegevens en het gemiddelde. Voer daarom de berekening in 5.3.2-5.3.3 uit op alle monsters in de kolom 10-5 , ervan uitgaande dat ze afkomstig zijn van hetzelfde virusmonster en de biologische replicaties zijn uitgevoerd om de meest nauwkeurige titermeting te verkrijgen. In het geval van tabel 1, gemiddeld 4,0 x 107, 2,1 x 107 en 2,6 x 107 PFU/ml om een uiteindelijke gemiddelde titer van 2,9 x 107 ± 0,98 x 107 PFU/ml voor dit monster te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabel 1 toont een experiment dat optimale resultaten heeft. Alle 10-voudige verdunningen volgen op een ongeveer 10-voudige afname van het aantal plaques. Dit soort gegevens zijn ook te zien in figuur 2, een werkelijke plaquetest waarbij het telbare aantal plaques in het bereik van 10-4 viel voor alle drie de replicaties. Hetzelfde is te zien in figuur 3, de bovenste rij, waar het telbare aantal plaques zich in de 10-3 verdunning bevond.
Figuur 3, onderste rij, toont echter een heel ander resultaat wanneer een plaquetest niet goed wordt uitgevoerd. Ten eerste zijn er zeer weinig plaques zichtbaar van enige verdunning; daarom zijn de gegevens onbruikbaar. Ten tweede zijn er zichtbare gebieden rond de bovenkant waar de Vero-cellen volledig uit het substraat zijn opgetild, bewijs van het laten uitdrogen van de cellen tijdens het proces of van te krachtig pipetteren in dat deel van de put.
Tabel 2 toont ook een reeks potentieel afwijkende uitkomsten in plaquetellingen en vereist waarschuwingen onderweg. Van belang is dat noch de bovenste rij, noch de onderste rij replicaties een regelmatig 10-voudig verschil in plaque telt als men van de ene verdunning naar de volgende gaat; deze gegevens wijzen op een gebruikersfout tijdens het virusverdunningsproces. Bovendien is het niet waarschijnlijk dat een gebruiker nauwkeurig meer dan 15.000 plaques zou tellen, dus men moet die gegevens in twijfel trekken. Ten slotte kan men opmerken dat bij replicatie 1, 10-6 verdunning, er een plaquetelling is in het bereik van 30-300; niettemin, gezien de slechte aard van de rest van de gegevens in deze replica, is het onwaarschijnlijk dat het aantal plaques van 42 een nauwkeurig aantal is. Daarom zijn de enige geloofwaardige gegevens in tabel 2 in replicatie 2.
Figuur 4 toont dezelfde problemen met cellen die uitdrogen of verkeerd worden behandeld tijdens de plaquetest. Figuur 4 toont echter kritisch slechte Vero-celzaaiing; elke put vertoont donkerdere paarse vlekken, wat wijst op cellen die zich niet goed over de put verspreiden en in clusters op elkaar zijn gestapeld.
Figuur 1: Totaal plaque-assayschema. Aangepast van Biorender sjabloon, "Viral Plaque Assay Protocol", door BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Plaquetest voor HSV-1 in twaalf-putplaten. Biologische replicaties werden uitgevoerd zoals beschreven in figuur 1 op één monster van HSV-1. Seriële 10-voudige verdunningen van een HSV-1-monster (beginnend bij de 10-2 verdunning) werden toegevoegd aan de Vero-cellen , geïncubeerd en vervolgens gekleurd met kristalviolet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Plaquetest voor HSV-2 in platen met zes putten. Biologische replicaties werden uitgevoerd zoals beschreven in figuur 1 op één monster van HSV-2. Seriële 10-voudige verdunningen van een HSV-2-monster (beginnend bij de 10-2 verdunning) werden toegevoegd aan Vero-cellen , geïncubeerd en vervolgens gekleurd met kristalviolet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Plaquetest voor HSV-1 in twaalf-putplaten. Biologische replicaties werden uitgevoerd zoals beschreven in figuur 1 op één monster van HSV-1. Seriële 10-voudige verdunningen van een HSV-1-monster (beginnend bij de 10-2 verdunning) werden toegevoegd aan Vero-cellen , geïncubeerd en vervolgens gekleurd met kristalviolet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Verdunningsfactor | ||||
| Nabootsen | 10-3 zoekertjes | 10-4 zoekertjes | 10-5 | 10-6 |
| 1 | 5721 | 635 | 81 | 5 |
| 2 | 4592 | 365 | 42 | 0 |
| 3 | 5,519 | 521 | 53 | 1 |
Tabel 1: Representatieve plaquetellingen van één succesvolle test. Seriële verdunningen van elke biologische replicaat werden uitgevoerd; representatieve plaquetellingen (beginnend bij de 10-3 verdunning) worden weergegeven voor elke verdunning.
| Verdunningsfactor | ||||
| Nabootsen | 10-3 zoekertjes | 10-4 zoekertjes | 10-5 | 10-6 |
| 1 | 15225 | 635 | 450 | 42 |
| 2 | 4592 | 365 | 42 | 0 |
| 3 | 5519 | 5400 | 53 | 1 |
Tabel 2: Representatieve plaquetellingen van één mislukte test. Seriële verdunningen van elke biologische replicaat werden uitgevoerd; representatieve plaquetellingen (beginnend bij de 10-3 verdunning) worden weergegeven voor elke verdunning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel plaque-assays bijna net zo oud zijn als zoogdiercelkweek zelf, lijkt het erop dat elk laboratorium zijn eigen set protocollen heeft om deze basistest uit te voeren5,6,10,11,12,13,14,15,16,20 . Hoewel de instructies in elke gepubliceerde versie van een plaque-assay enigszins verschillen, verduidelijken maar weinig van deze manuscripten de kritische nuances die betrokken zijn bij het verkrijgen van consistente resultaten.
Vandaar dat er sommige delen van dit protocol zijn die meer kunst dan wetenschap zijn. Wanneer Vero-cellen voor de test in putten worden gezaaid, moeten ze gelijkmatig over de put worden verdeeld (figuur 4). Alle stappen met een vloeistofoverdracht (bijv. stap 3.1, 3.2, 3.5, 3.6, 4.1 en 4.2) moeten zorgvuldig worden uitgevoerd om de Vero-celmonolaag gehydrateerd te houden (figuur 3 en figuur 4). Het is ook van cruciaal belang om de bodem van de put niet aan te raken met een pipet, anders kunnen de cellen eraf schrapen, waardoor de uiteindelijke gegevens verder in gevaar komen (figuur 4).
Hoewel methylcellulose voordelig is als overlaymateriaal om diffusie van virionen over de hele put te voorkomen, kunnen alternatieven worden gebruikt. Men kan bijvoorbeeld microkristallijne cellulose21,22 of carboxymethylcellulose21 gebruiken. Hoe dan ook, methylcellulose is echter een van de gemakkelijkste en goedkoopste vloeibare overlaymedia om te gebruiken. Men kan ook een andere kleurstof21 of fixatieoplossing (bijv. Paraformaldehyde)21 gebruiken voor het kleuringsgedeelte van het protocol (stap 4), maar kristalviolet in 50% ethanol is het gemakkelijkst en het minst duur van de opties.
Hoewel het misschien openlijk eenvoudig is om deze testen uit te voeren, vereisen ze training en oefening. Het is de moeite waard om monsters te gebruiken die niet onvervangbaar zijn voor het leren van deze methode, zodat men de techniek onder de knie heeft wanneer deze er het meest toe doet.
Plaque-assays zelf mogen echter alleen worden gebruikt wanneer men bonafide levende virionen moet tellen. Plaquing is een veel oudere methode om virusdeeltjes5,10 te meten in vergelijking met nieuwere kwantitatieve methoden zoals fluorescentiemicroscopie23, ELISA24, enzymatische activiteit25,26 of qPCR27. Deze laatste methoden genereren echter surrogaatgegevens die de aanwezigheid van hele virionen suggereren, maar kunnen leiden tot een grove overschatting van levensvatbare deeltjes omdat de gebruiker een indicator van infectie zou kwantificeren, geen echte virionen. Fluorescentiemicroscopie meet infectieuze virionen door hoeveel cellen de aanwezigheid vertonen van een eiwit dat door het virus wordt uitgedrukt, maar detecteert niet noodzakelijkerwijs volledige, replicatie-competente virionen. ELISA detecteert op dezelfde manier de aanwezigheid van viruseiwitten die kunnen bestaan zonder een volkomen infectieus virion. Het testen van enzymatische activiteit, hoewel suggestief voor een intact virion, toont alleen aan dat een enkel actief enzym aanwezig is en weerspiegelt niet de ware besmettelijke aard van een heel virion. En qPCR kwantificeert alleen kopieën van het genoom van een virus, of dat genoom defect is of niet. De enige methode die vergelijkbaar is met een plaquetest om levende virussen te kwantificeren is een eindpuntverdunningstest28, die nog steeds een statistische schatting vereist via de Reed-Muench- of Spearman-Kärber-methoden29,30,31 om de virionconcentratie te bepalen.
Hoewel plaque-assays een routinemethode zijn die in de virologie wordt gebruikt, zijn er specifieke gevallen waarin ze niet de kwantitatieve assay van keuze zijn. Plaque-assays vereisen bijvoorbeeld dat gastheercellen zich hechten aan een substraat; als de beste gastheercel voor infectie niet-hechtend is, zullen plaques zich nooit vormen32. Sommige virussen groeien langzamer dan de typische celcyclus van hun gastheren, en daarom zouden eventuele ontluikende plaques door de gastheercellen zelf worden overwoekerd21. Plaques kunnen zich soms niet goed vormen, alleen al door de aard van het cytopathische effect, waardoor de bepaling van bonafide plaques een beperking is21.
De hier gepresenteerde benadering van het plaquenten van herpesvirussen is niet noodzakelijkerwijs uniek. Deze diepgaande beschrijving van de kleine kanttekeningen bij een succesvolle HSV-plaquetest kan echter de problemen verminderen die veel gebruikers, vooral beginners, ervaren. Hoe dan ook, de beschreven methodologie is ook breed toepasbaar op plaque-assays met vele andere virussen, waaronder maar niet beperkt tot picornavirussen33, orthomyxovirussen34, flavirussen35, coronavirussen36 en vele andere systemen waarin een kwantificeerbare hoeveelheid infectieuze dierlijke virussen vereist is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
We bedanken talloze studenten in onze laboratoria (PJD en BJM) die in de loop der jaren met ons hebben samengewerkt om deze methoden te verfijnen. Een speciale dank aan Stan Person, onder wiens voogdij deze methodologie voor het eerst werd ontwikkeld. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het Towson University Fisher College of Science and Math Undergraduate Research Support fund en NIGMS Bridges to the Baccalaureate grant 5R25GM058264. Deze inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Corning | 3512 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
| Antibiotic/antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| Crystal violet | Alfa Aesar | B2193214 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++) | Gibco | 14190144 | |
| Fetal calf serum | Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Gibco | GS07F161BA | |
| Hemacytometer | Thermo Fisher | 02-671-54 | |
| Methylcellulose | Millipore-Sigma | 27-441-0 | |
| Quaternary agent (Lysol I.C.) | Thermo Fisher | NC9645698 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 |
References
- Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. Introduction to Moden Virology. 6th end. , Wiley-Blackwell. (2007).
- Mahy, B., Collier, L. Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, Arnold. (1998).
- Anderson, B., et al. Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays. Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).
- Earle, W. R., et al. Production of malignancy in vitro; IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. Journal of the National Cancer Institute. 4 (2), 165-212 (1943).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).
- Enders, J. F., Weller, T. H., Robbins, F. C. Cultivation of the lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues. Science. 109 (2822), 85-87 (1949).
- Enders, J. F. Cytopathology of virus infections: particular reference to tissue culture studies. Annual Review of Microbiology. 8, 473-502 (1954).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J. Fields Virology. Knipe, D. M., et al. 1, Wolters Kluwer-Lippincott Williams & Wilkins. 1823-1897 (2013).
- Madavaraju, K., Koganti, R., Volety, I., Yadavalli, T., Shukla, D. Herpes simplex virus cell entry mechanisms: An update. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 617578 (2020).
- Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Advances in Virus Research. 8, 319-378 (1961).
- Farnham, A. E. The formation of microscopic plaques by herpes simplex virus in HeLa cells. Virology. 6 (2), 317-327 (1958).
- Garabedian, G. A., Scott, L. V. Plaque assay for herpes simplex virus in L-929 (Earle) mouse fibroblasts. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 126 (2), 568-571 (1967).
- Lancz, G. J. Herpes simplex viruses types 1 and 2. Type and strain specific characteristics affecting virus plaque formation. Arch Gesamte Virusforsch. 46 (1-2), 36-43 (1974).
- Muratore, O., Tonoli, E. L., Pesce Schito, A. A short-term plaque assay for antiviral drug research on herpes simplex virus type 2. New Microbiologica. 19 (3), 257-261 (1996).
- Sato, S., Kaneki, H., Shirai, J., Takahashi, K., Kawana, R. Differentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by plaque appearances on semicontinuous rabbit lens epithelial cells in the clinical laboratory. Kansenshogaku Zasshi. 67 (6), 561-573 (1993).
- Yazaki, S., Taniguchi, S., Yoshino, K. Improvement of the plaque assay of herpes simplex virus in HeLa cells. Japanese Jouranl of Microbiology. 10 (3), 133-139 (1966).
- Stanners, C. P., Eliceiri, G. L., Green, H. Two types of ribosome in mouse-hamster hybrid cells. Nature New Biology. 230 (10), 52-54 (1971).
- Giannasca, N. J., Suon, J. S., Evans, A. C., Margulies, B. J. Matrix-based controlled release delivery of acyclovir from poly-(ethylene co-vinyl acetate) rings. Journal of Drug Delivery Science and Technology. 55, 101391 (2020).
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 7th edn. , John Wiley & Sons, Inc. (2016).
- Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 38 (8), 747-752 (1952).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 3, 63 (2006).
- Culley, S., Towers, G. J., Selwood, D. L., Henriques, R., Grove, J. Infection counter: Automated quantification of in vitro virus replication by fluorescence microscopy. Viruses. 8 (7), 201 (2016).
- Hudu, S. A., et al. Quantitative Hepatitis B e antigen: A better predictor of Hepatitis B virus DNA than quantitative Hepatitis B surface antigen. Clinical Laboratory. 64 (4), 443-449 (2018).
- Baltimore, D. RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature. 226 (5252), 1209-1211 (1970).
- Scolnick, E. M., Aaronson, S. A., Todaro, G. J., Parks, W. P. RNA dependent DNA polymerase activity in mammalian cells. Nature. 229 (5283), 318-321 (1971).
- Strick, L. B., Wald, A. Diagnostics for herpes simplex virus: is PCR the new gold standard. Molecular Diagnosis and Therapy. 10 (1), 17-28 (2006).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Jouranl of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Kärber, G. Beitrag zue kollektiven Behandlung pharmakologischer pharmakologischer Reihenversuche. Archiv for Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 162 (4), 480-487 (1931).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).
- Spearman, C. The Method of 'Right and Wrong Cases' (Constant Stimuli) without Gauss's formula. British Journal of Psychology. 2 (3), 227-242 (1908).
- Ryu, W. -S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. 1st edn. , Academic Press. (2017).
- Burrill, C. P., Strings, V. R., Andino, R. Poliovirus: generation, quantification, propagation, purification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 15 Unit 15H 11 (2013).
- Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yanguez, E. Propagation and titration of influenza viruses. Methods in Molecular Biology. 1836, 59-88 (2018).
- Baz, M. Zika virus isolation, purification, and titration. Methods in Molecular Biology. 2142, 9-22 (2020).
- Coleman, C. M., Frieman, M. B. Growth and quantification of MERS-CoV infection. Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).
