Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

הפלקה של וירוסי הרפס סימפלקס

Published: November 5, 2021 doi: 10.3791/62962
Automatic Translation
*1, *1, *1, *1,2, 3, 1,4
1Towson University Herpes Virus Lab, Department of Biological Sciences, Towson University, 2Towson University Department of Chemistry, Towson University, 3Department of Oncology, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Molecular Biology, Biochemistry, and Bioinformatics Program, Towson University
* These authors contributed equally

Summary

הפלקה היא שיטה שגרתית המשמשת לכימות וירוסים חיים באוכלוסייה. למרות שהפלקה נלמדת לעתים קרובות בתוכניות לימודים מיקרוביולוגיות שונות עם חיידקים ובקטריופאג'ים, הפלקה של וירוסים יונקים מורכבת יותר וגוזלת זמן רב יותר. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים המתפקדים באופן אמין לעבודה רגילה עם וירוסי הרפס סימפלקס.

Abstract

ישנם פרוטוקולים רבים שפורסמו עבור וירוסים plaquing, כולל הפניות בתוך הספרות הראשית למתודולוגיה. עם זאת, וירוסים plaquing יכול להיות קשה לביצוע, הדורשים התמקדות מפרטים שלה עידון. זוהי שיטה מאתגרת להפליא עבור תלמידים חדשים לשלוט, בעיקר משום שהיא דורשת תשומת לב קפדנית לפרטים הקטנים ביותר. הדגמה זו של וירוסים הרפס סימפלקס plaquing צריך לעזור לאלה שנאבקו עם לדמיין את השיטה, במיוחד הניואנסים שלה, לאורך השנים. בעוד שכתב יד זה מבוסס על אותם עקרונות של מתודולוגיית הפלקה הסטנדרטית, הוא שונה בכך שהוא מכיל תיאור מפורט של (1) כיצד לטפל בצורה הטובה ביותר בתאים מארחים כדי למנוע הפרעה במהלך התהליך, (2) מדיום צמיג שימושי יותר מאשר אגרוז כדי להגביל את פיזור הוויריונים, ו - (3) הליך קיבעון והכתמה פשוט המייצר תוצאות ניתנות לשחזור אמינות. יתר על כן, הסרטון המצורף מסייע להדגים את ההבחנות העדינות בתהליך, אשר לעתים קרובות חסרים כאשר מנחים אחרים על ביצוע בדיקות פלאק.

Introduction

ראשיתם של בדיקות פלאק וירוס לחזור לתגליות הראשונות של וירוסים בשנות ה -18901. נגיף פסיפס הטבק היה מבודד לראשונה והועבר על עלי טבק, שם ניתן לזהות ולכמת כתמי זיהום בודדים שמקורם בישות וירוס חיה אחת2, שזוהתה מאוחר יותר כ- virion2. מחקרים ראשוניים מאוחרים יותר עם חיידקים ובקטריופאג'ים שיכללו את הטכניקות המשמשות לפלייק של וירוסים אלה, כולל חיידקים בשלב אמצע היומן של הצמיחה, דילול סדרתי של דגימות בקטריופאג ', ואגר העליון עם הדמיה מאוחרת יותר של חורים מילוליים (הנקראים פלאקים) במדשאה החיידקית3.

הפלקה של וירוסים מן החי פיגרה במחקר המרגש שנערך עם בקטריופאג'ים, בעיקר משום שהשיטות הנדרשות לגידול תאי יונקים בתרבית לא פותחו עד שנות ה-40 של המאה ה-20. עם זאת, הופעתם של תאי מורין גדלים בהיעדר האורגניזם המארח כולו4 הולידה עידן חדש ביכולת לתרבות ולספור וירוסים. עבודה זו הורחבה עבור התפשטות וכמות של וירוס אנצפלומליטיס סוס מערבי בתאי עוף ופוליו וירוס בתאים אנושיים5,6. ככל שתחום תאי היונקים הפולחניים התרחב, החבורה של תאים מארחים שונים לזיהומים ויראליים שונים העניקה לעולם שפע של אפשרויות לחקור כל מיני וירוסים7. זה כלל את ההתפשטות והכימות של הרפס-וירוסים אנושיים, במיוחד וירוס הרפס סימפלקס-1 (HSV-1) ו -2 (HSV-2), הגורמים נגעים mucocutaneous8. חשוב לציין, כל בדיקות הפלאק תלויות בקיומם של נגיפים חיים, שיכולים להיכנס לתאים מארחים באופן בתיווך קולטן במדגם9. ללא קשר בכל מקום ושפע של פרסומים על ביצוע בדיקות פלאק5,10,11,11,12,13,14,15,16, שיטות אלה עבור HSV-1/-2 הן תערובת של אמנות ומדע; אי אפשר לנהל את הבדיקה ללא תשומת לב ראויה לכל פרט בפרוטוקול, וגם לא ניתן לבצע בדיקה מוצלחת ללא עין קרטית לעידון בתהליך. כתב יד זה מתאר את אחת השיטות הניתנות לשחזור באופן עקבי ביותר עבור בדיקות פלאק HSV-1/-2, עם פרטים מדויקים כלפי אמנות הבדיקה שנדונים לעתים רחוקות.

פרוטוקול נוכחי זה מקבל ספירות יחידות יוצרות פלאק חי (PFU) עבור HSV-1 ו- -2 באופן אמין. התוצאות הטובות ביותר מתקבלות באמצעות תאי Vero (תאי אפיתל כליות קוף ירוק אפריקאי שעברו טרנספורמציה) במעבר נמוך (מתחת למעבר מספר 155) וגדלים באופן שגרתי באלפא-MEM17 בתוספת סרום עגל עוברי 10% (FCS), L-אלניל-L-גלוטמין, ותערובת אנטיביוטית/אנטי-מיקרוטית18. תאי Vero מופצים באופן סטנדרטי במדיום זה פעמיים עד שלוש פעמים בשבוע בדילול של 1/5 בכל פעם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים עם תאי Vero והרפסוירוסים חיים אושרו על ידי ועדת הביו-בטיחות המוסדית של אוניברסיטת טוסון. ערכה כללית של הליכים אלה מיוצגת באיור 1.

1. זריעת תאי Vero

  1. יום לפני תחילת בדיקת הפלאק, טריפסינציה תאי Vero resuspened אותם רגילים של Dulbecco שונה נשרים בינוני (DMEM) ולהשלים לפי מתודולוגיית תרבית התא הסטנדרטית19. הגדילו מחדש את התאים הטריפסיניים ב-10 מ"ל של DMEM לכל בקבוק T-75 של תאי Vero המתנגשים (כ-107 תאים).
    הערה: DMEM משמש לבדיקות פלאק במקום אלפא-MEM מכיוון שהוא מאט מעט את קצב צמיחת התא ומעדיף תוצאות בדיקת פלאק טובות יותר.
  2. ספור את התאים לפי השיטה המועדפת על האדם (לדוגמה, המוציטומטר סטנדרטי עם אי-הכללה של טריפאן בלו)19.
  3. זרע את התאים ב 4 x 106 תאים / צלחת; עבור HSV-2, להשתמש 6-well צלחות עם 2.5 מ"ל של DMEM (עם תוספי מזון) לבאר; ועבור HSV-1, השתמש צלחות 12-well עם 1.25 מ"ל של DMEM (עם תוספי מזון) לבאר.
    הערה: מספר התאים צריך להיות קבוע ללא קשר ללוח המשמש, אם כי גודל הבארות חשוב לגבי דיוק בבדיקת הפלאק. זה חיוני כדי לקבל תאים מופצים באופן שווה, אשר ניתן להשיג בצורה היעילה ביותר על ידי הזזת הצלחת קדימה ואחורה, לא בצורה מעגלית.
  4. אפשר לתאים לגדול בן לילה בטמפרטורה של 37 °C /5% CO2 באינקובטור לח.
    הערה: הלחות נשמרת עם מחבת של מים מזוקקים המכילים קוטל בתחתית האינקובטור.

2. דילול מדגם

  1. להשלים את דילול המדגם ואת התוספת של וירוס לתאים במושב מעבדה אחד.
    זהירות: HSV-1 ו-2 מדבקים לבני אדם ויש לטפל בהם תחת בלימה בטיחות ביולוגית נאותה (BSL-2). יש להפריד את כל החומרים שבאים במגע עם הנגיף ולחטא עם סוכן רבעוני בדילול של 1/256 (ראו טבלת חומרים), יודופר, אקונומיקה או חומר ניקוי יוני חזק (למשל, SDS) לפני הסרתם מארון הבטיחות הביולוגית.
  2. יום לאחר זריעת תאי Vero, לדלל באופן סדרתי כל דגימת וירוס להיות פלאק ב 1x PBS; בדרך כלל משתמשים בדילולים של פי 10 למעקב המדויק ביותר.
  3. הפוך את הדילולים האלה דרך 10-4 (לריכוזים נמוכים של וירוסים) או דרך 10-9 (לציפיות של דגימות טיטר גבוהות יותר) עם לפחות 1 מ"ל של כל מדגם שנותר לבדיקת הפלאק עצמה.
  4. שמור את כל הדילול הנגיפי על הקרח (לא יותר מ 1 שעות) עד מוכן להוסיף דגימות וירוס מדולל אלה לתאים.

3. תוספת של וירוס לתאים

  1. הסר את מדיום תרבית התאים מבאר אחת או שתיים על ידי פיפטה.
    הערה: אין להשתמש בשאיפה מכיוון שהיא מסירה יותר מדי נוזלים ממונולייר התאים ומייבשת את התאים. שיקול מכריע אחד הוא להבטיח כי monolayer התא נשאר hydrated לאורך כל מהלך הניסוי. אם התאים יתייבשו, הם ישטפו את הצלחת בשלב האחרון וייצרו נתונים שאינם שמישים. לכן, לעבד רק באר אחת או שתיים בכל פעם כדי להפחית את האפשרות הזאת.
  2. בזהירות להוסיף את מדגם וירוס מדולל (100-400 μL ו 50-200 μL של מדגם וירוס משמשים עבור 6-well ו 12-well צלחות, בהתאמה) dropwise לכל monolayer, הוספת הטיפות בצד של כל באר. חזור על התהליך עבור כל באר אחת או שתיים עד הצלחת כולה מתמלאת עם דגימות וירוס להיות פלאק.
    הערה: הוספת הטיפות למרכז הבאר עלולה לשחוק בטעות תאים מהמצע.
  3. בעדינות לטלטל את הצלחת כולה ביד כדי להבטיח PBS המכיל את הנגיף מכסה את כל monolayer של תאים בכל באר, ולאחר מכן למקם את הצלחת בחממה CO2 ב 37 °C (50 °F) כדי לאפשר את הנגיף לספוח.
  4. כל 10 דקות בתוך 1 שעה, להסיר את הצלחת מן האינקובטור, בעדינות לטלטל אותו שוב כדי להפיץ את הנגיף באופן שווה יותר על פני כל באר, ולאחר מכן למקם אותו בחזרה באינקובטור.
    הערה: כל ניסוי יכתיב את מספר השכפולים ואילו דילולים משמשים; העדפת הקורא מכתיבה החלטה זו.
  5. כדי להפחית את האפשרות של ספירה בשוגג inoculum unabsorbed, להסיר את דגימת הנגיף מן הבארות עם טיפים 1000 μL פיפטה ומניחים אותו בכוס פסולת.
    הערה: שוב, הליך זה מתנהל עם באר אחת או שתיים בלבד בכל פעם כדי לשמור על הידרציה של monolayer התא.
  6. מניחים 2.5 מ"ל של שכבת-על מתיל צלולוז (ממיסים 5% מתיל צלולוז w/w ב-100 מ"ל של PBS, אוטולבה אוטומטית למשך 15 דקות ב-121 °C ו-15 פסאיי על מחזור נוזלי, ולאחר מכן מוסיפים 375 מ"ל של DMEM בתוספת 25 מ"ל של FBS).
  7. לאחר צלחת שלמה מכילה כיסוי, מניחים את הצלחת בחזרה באינקובטור כדי לאפשר צמיחה במשך יומיים.
    הערה: אם הנגיף והתאים מורשים לגדול במשך שלושה ימים, אפילו ב- DMEM בתוספת תוספי מזון, אובדן משמעותי של תאים במונולייר עלול לגרום, ובכך להתפשר על הנתונים הסופיים.
  8. לחטא את הפסולת, בדרך כלל עם תוספת של אקונומיקה, יודופר, או וירוקסיד דומה, לפני הסרתו מארון הבטיחות הביולוגית.

4. כתמים ללוחות

  1. לאחר הדגירה בת היומיים, הסר את שכבת היתר של מתילצלולוז על ידי פיפטה, שוב באר אחת או שתיים בכל פעם, והניח אותו בכוס פסולת.
  2. מוסיפים ~ 2 מ"ל של 1% סגול קריסטל (ראה טבלת חומרים) ב 50% אתנול לכל באר כדי להכתים את הלוחות.
    הערה: אין זה חיוני כדי להסיר כל טיפה אחרונה של הכיסוי.
  3. לדגור על הצלחת עם כל הבארות מלאות בכתם במשך 30 דקות ב 37 °C (50 °F). בשלב זה, לחטא את הפסולת כנל בשלב 3.8.
  4. לשטוף את הצלחות במרץ עם מי ברז עד נגר ברור.
    הערה: זרם עדין של מים אינו נמרץ מספיק; לחץ מלא ממתקן כיור מעבדה נדרש.
  5. בשלב זה, ודא שיש הבדלים של פי 10 במספר הלוחות בכל סדרת דילול.
  6. אפשר ללוחות להתייבש בן לילה הפוך, ולאחר מכן ניתן לספור את הלוחות הבודדים.

5. ספירת לוחות וקביעת טיטר וירוסים

  1. ללא קשר לגישה (ראה הערה להלן), הכפל את מספר הלוחות על ידי גורם הדילול (למשל, אם הלוחות נספרו בבאר 10-4 , אז מספר הלוחות יוכפל ב -104).
    הערה: למרות ספירה בתוך טווח של 10-100 לוחות הוא שימושי5, ספירת בארות עם 30-300 לוחות הוא קצת יותר אמין לוקח בחשבון כ 1/2-log דילול במקום דילול מלא.
  2. חלק מספר זה בנפח של inoculum (כמו לעיל בשלב 3.2), וממוצע כל הבארות שיש להם לוחות בתוך הטווח שצוין כדי לקבל את הטיטר המדויק ביותר של HSV במדגם המקורי.
  3. בצע את החישובים בשלבים 5.3.1 עד 5.3.5, בהתחשב בשימוש בנתונים מדומים בטבלה 1.
    1. שקול רק בארות עם 30-300 לוחות (שלב 5.1). לפיכך, בטבלה 1, השתמש רק בעמודה 10-5 עבור שכפולים 1, 2 ו- 3.
    2. קח את מספר הלוחות בדילול הנתון והכפל בהדדיות של גורם הדילול. לפיכך, 10-5 עמודה של מדגם 1 הולך מ 81 לוחות בדילול 10-5 ל 81 לוחות כפול 105.
    3. לאחר מכן חלק את המספר הזה בנפח (ב- mL) של דילול הנגיף שנוסף לתאים בבאר זו. בהנחה שהנתונים על HSV-1 בטבלה 1 הם מלוח של 12 בארות, 0.2 מ"ל תהיה המדידה המתאימה ביותר. מכאן החישוב משלב 5.3.2 הופך 81 x 105 חלקי 0.2 מ"ל, או 4.0 x 107 PFU / מ"ל של HSV-1.
    4. חזור על תהליך זה עבור כל הנתונים והממוצעים השימושיים. לפיכך, בצע את החישוב ב 5.3.2-5.3.3 על כל הדגימות בעמודה 10-5, בהנחה שמקורם באותה דגימת וירוס ואת המשכפלים הביולוגיים נערכו כדי לקבל את מדידת titer המדויקת ביותר. במקרה של טבלה 1, ממוצע 4.0 x 107, 2.1 x 107, ו 2.6 x 107 PFU / mL כדי לקבל טיטר ממוצע סופי של 2.9 x 107 ± 0.98 x 107 PFU / mL עבור מדגם זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

טבלה 1 מציגה ניסוי בעל תוצאות מיטביות. כל הדילולים פי 10 באים בעקבות ירידה של פי 10 בספירת הפלאק. נתונים מסוג זה ניתן לראות גם באיור 2, בדיקת פלאק בפועל שבה מספר הלוחות הניתן לספירה נפל בטווח של 10-4 עבור כל שלושת המשכפלים. אותו הדבר ניתן לראות באיור 3, השורה העליונה, שבה מספר הלוחות הניתן לספירה היה בדילול של 10-3 .

עם זאת, איור 3, השורה התחתונה, מציג תוצאה שונה לחלוטין כאשר בדיקת פלאק אינה מתנהלת היטב. ראשית, יש מעט מאוד לוחות הנראים מכל דילול; לפיכך, הנתונים אינם שמישים. שנית, ישנם אזורים גלויים סביב החלק העליון שבו תאי Vero הוסרו לחלוטין מן המצע, ראיות או של מתן התאים להתייבש בתהליך או של צינורות נמרצים מדי באזור זה של הבאר.

טבלה 2 מציגה גם קבוצה של תוצאות שעלולות להיות חריגות בספירת פלאק ודורשת אזהרות לאורך הדרך. שים לב, לא השורה העליונה ולא השורה התחתונה של שכפולים עוקבת אחר הפרש קבוע של פי 10 בספירות פלאק כאשר אחד עובר מדילול אחד למשנהו; נתונים אלה מציינים שגיאת משתמש במהלך תהליך דילול הווירוסים. יתר על כן, לא סביר שמשתמש יספור במדויק מעל 15,000 לוחות, ולכן יש להטיל ספק בנתונים אלה. לבסוף, ניתן לציין כי בדילול 1, 10-6 , יש ספירת פלאק בטווח 30-300; עם זאת, בהתחשב באופי העגום של שאר הנתונים בשכפול זה, לא סביר שספירת הלוחות 42 היא מספר מדויק. לפיכך, הנתונים האמינים היחידים בטבלה 2 נמצאים בשכפול 2.

איור 4 מראה את אותן בעיות עם תאים שמתייבשים או מטופלים בצורה לא נכונה במהלך בדיקת הפלאק. עם זאת, איור 4 מראה באופן קריטי זריעת תאי Vero ירו עניים; כל באר מראה כתמים סגולים כהים יותר, המעידים על תאים שאינם מתפשטים היטב על פני הבאר ונערמו זה על גבי זה באשכולות.

Figure 1
איור 1: ערכת בדיקת פלאק כוללת. עובד מתוך תבנית Biorender, "פרוטוקול בדיקת פלאק ויראלי", על ידי BioRender.com. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: בדיקת פלאק עבור HSV-1 בצלחות של 12 בארות. העתקים ביולוגיים נערכו כמתואר באיור 1 במדגם אחד של HSV-1. דילול סדרתי של פי 10 של דגימת HSV-1 (החל מהדילול של 10-2 ) נוספו לתאי Vero, דגירה, ואז הוכתמו בסגול קריסטל. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: בדיקת פלאק עבור HSV-2 בלוחות של שש בארות. העתקים ביולוגיים נערכו כמתואר באיור 1 במדגם אחד של HSV-2. דילול סדרתי של פי 10 של דגימת HSV-2 (החל מדילול 10-2 ) נוספו לתאי Vero, דגירה, ואז מוכתמת בסגול קריסטל. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: בדיקת פלאק עבור HSV-1 בצלחות של 12 בארות. העתקים ביולוגיים נערכו כמתואר באיור 1 במדגם אחד של HSV-1. דילול סדרתי של פי 10 מדגם HSV-1 (החל מהדילול של 10-2 ) נוספו לתאי Vero, דגירה, ואז הוכתמו בסגול קריסטל. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

גורם דילול
לשכפל 10-3 10-4 10-5 10-6
1 5721 635 81 5
2 4592 365 42 0
3 5,519 521 53 1

טבלה 1: לוחית ייצוגית נחשבת מבדיקה מוצלחת אחת. נערכו דילולים סדרתיים מכל שכפול ביולוגי; ספירת פלאק ייצוגית (החל מדילול 10-3 ) מוצגת עבור כל דילול.

גורם דילול
לשכפל 10-3 10-4 10-5 10-6
1 15225 635 450 42
2 4592 365 42 0
3 5519 5400 53 1

לוח 2: לוחית ייצוגית נחשבת מבדיקה אחת לא מוצלחת. נערכו דילולים סדרתיים מכל שכפול ביולוגי; ספירת פלאק ייצוגית (החל מדילול 10-3 ) מוצגת עבור כל דילול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעוד שבדיקות פלאק ישנות כמעט כמו תרבות התאים של היונקים עצמה, נראה שלכל מעבדה יש מערכת פרוטוקולים משלה לביצוע בדיקה בסיסית זו5,6,10,11,12,13,14,15,16,20 . אף על פי שההוראות בכל גרסה שפורסמה של בדיקת פלאק שונות זו מזו, מעטים מכתבי היד הללו מבהירים את הניואנסים הקריטיים הכרוכים בהשגת תוצאות עקביות.

לפיכך, ישנם חלקים מסוימים של פרוטוקול זה כי הם יותר אמנות מאשר מדע. כאשר תאי Vero נזרעים בבארות לצורך הבדיקה, יש להפיץ אותם באופן שווה בכל הבאר (איור 4). כל השלבים הכרוכים בהעברה נוזלית (לדוגמה, שלבים 3.1, 3.2, 3.2, 3.5, 3.6, 4.1 ו-4.2) חייבים להיעשות בקפידה כדי לשמור על לחות של תאי Vero (איור 3 ואיור 4). חשוב גם לא לגעת בתחתית הבאר עם פיפטה כלשהי, אחרת התאים עלולים לגרד, מה שעלול לסכן עוד יותר את הנתונים הסופיים (איור 4).

בעוד methylcellulose הוא יתרון כחומר כיסוי כדי למנוע דיפוזיה של virions על פני הבאר כולה, חלופות עשוי לשמש. לדוגמה, ניתן להשתמש תאית microcrystalline21,22 או תאית carboxymethyl21. בכל מקרה, מתיל צלולוז הוא אחד אמצעי כיסוי נוזלי הקל והפחות יקר לשימוש, אם כי. אפשר גם להשתמש בצבע אחר 21 או פתרון תיקון (למשל, paraformaldehyde)21 עבור החלק הכתים של הפרוטוקול (שלב 4), אבל סגול קריסטל ב 50% אתנול הוא הקל ביותר והפחות יקר בין האפשרויות.

אמנם זה עשוי להיות פשוט באופן גלוי לנהל בדיקות אלה, הם דורשים הכשרה ותרגול. כדאי להשתמש בדגימות שאינן ניתנות להחלפה ללימוד שיטה זו, כך שאדם שולט בטכניקה כאשר זה הכי חשוב.

עם זאת, יש להשתמש בפלאק בעצמם רק כאשר צריך לספור ויריונים חיים בתום לב. Plaquing היא מתודולוגיה ישנה בהרבה למדידת חלקיקי וירוס5,10 בהשוואה לשיטות כמותיות חדשות יותר כמו מיקרוסקופיה פלואורסצנטית23, ELISA24, פעילות אנזימטית25,26, או qPCR27. עם זאת, שיטות אלה האחרונות לייצר נתונים חלופיים המציעים נוכחות של virions שלם, עדיין עלול להוביל הערכת יתר ברוטו חלקיקים קיימא כי המשתמש יהיה כימות אינדיקטור של זיהום, לא וירוסים אמיתיים. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מודדת ווירוסים זיהומיים על ידי מספר התאים המציגים נוכחות של חלבון המבוטא על ידי הנגיף, אך אינה מזהה בהכרח נגיפים שלמים ומוכשרים לשכפול. ELISA מזהה באופן דומה את נוכחותם של חלבוני וירוסים שעשויים להתקיים ללא נגיף זיהומי לחלוטין. בדיקת פעילות אנזימטית, תוך רמיזה של וריון שלם, רק מראה כי אנזים פעיל אחד קיים ואינו משקף את הטבע המדבק האמיתי של נגיף שלם. ו-qPCR רק מכמת עותקים של הגנום של וירוס, בין אם הגנום הזה פגום או לא. השיטה היחידה הדומה לבדיקת פלאק לכימות וירוסים חיים היא בדיקת דילול נקודת קצה28, שעדיין דורשת הערכה סטטיסטית באמצעות שיטות ריד-מונץ ' או ספירמן-קרבר29,30,31 כדי לקבוע את ריכוז הנגיף.

בעוד בדיקות פלאק הן שיטה שגרתית המשמשת לאורך וירולוגיה, ישנם מקרים מסוימים שבהם הם אינם הבדיקה הכמותית של בחירה. לדוגמה, בדיקות פלאק דורשות שתאים מארחים יתחברו למצע; אם התא המארח הטוב ביותר לזיהום הוא לא דבק, לוחות לעולם לא ייווצרו 32. וירוסים מסוימים גדלים לאט יותר ממחזור התאים הטיפוסי של המארחים שלהם, ולכן כל לוחות מתפתחים היו מגודלים על ידי התאים המארחים עצמם21. לוחות עשויים לפעמים לא להיווצר היטב, רק על ידי הטבע של האפקט הציטופתי, מה שהופך את הקביעה של לוחות בתום לב מגבלה21.

הגישה כדי plaquing herpesviruses המוצגים כאן אינו בהכרח ייחודי. עם זאת, תיאור מעמיק זה של האזהרות הקטנות הקשורות לבדיקת פלאק HSV מוצלחת עשוי להפחית את הקשיים שחווים משתמשים רבים, במיוחד טירונים. ללא קשר, המתודולוגיה המתוארת חלה גם באופן נרחב על בדיקות פלאק עם וירוסים רבים אחרים, כולל אך לא מוגבל ל picornaviruses33, orthomyxoviruses34, flaviruses35, coronaviruses36, ומערכות רבות אחרות שבהן נדרשת כמות ניתנת לכימות של וירוסים בעלי חיים זיהומיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

Acknowledgments

אנו מודים לאינספור סטודנטים במעבדות שלנו (PJD ו- BJM) שעבדו איתנו לאורך השנים בשיפור שיטות אלה. תודה מיוחדת לסטן פרסון, שתחת חסותו פותחה לראשונה מתודולוגיה זו. עבודה זו נתמכה חלקית על ידי אוניברסיטת טוסון פישר המכללה למדע ומתמטיקה תואר ראשון מחקר תמיכה קרן וגשרים NIGMS למענק Baccalaureate 5R25GM058264. תוכן זה הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plates Corning 3512
6-well plates Corning 3516
Alpha-MEM Lonza 12169F
Antibiotic/antimycotic Gibco 15240096
Crystal violet Alfa Aesar B2193214
DMEM Gibco 11965092
Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++) Gibco 14190144
Fetal calf serum Millipore-Sigma TMS-013-B
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) Gibco GS07F161BA
Hemacytometer Thermo Fisher 02-671-54
Methylcellulose Millipore-Sigma 27-441-0
Quaternary agent (Lysol I.C.) Thermo Fisher NC9645698
Trypan Blue Corning 25900CI
Trypsin Cytiva SH30042.01
Vero cells ATCC CCL-81

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. Introduction to Moden Virology. 6th end. , Wiley-Blackwell. (2007).
  2. Mahy, B., Collier, L. Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, Arnold. (1998).
  3. Anderson, B., et al. Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays. Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).
  4. Earle, W. R., et al. Production of malignancy in vitro; IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. Journal of the National Cancer Institute. 4 (2), 165-212 (1943).
  5. Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).
  6. Enders, J. F., Weller, T. H., Robbins, F. C. Cultivation of the lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues. Science. 109 (2822), 85-87 (1949).
  7. Enders, J. F. Cytopathology of virus infections: particular reference to tissue culture studies. Annual Review of Microbiology. 8, 473-502 (1954).
  8. Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J. Fields Virology. Knipe, D. M., et al. 1, Wolters Kluwer-Lippincott Williams & Wilkins. 1823-1897 (2013).
  9. Madavaraju, K., Koganti, R., Volety, I., Yadavalli, T., Shukla, D. Herpes simplex virus cell entry mechanisms: An update. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 617578 (2020).
  10. Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Advances in Virus Research. 8, 319-378 (1961).
  11. Farnham, A. E. The formation of microscopic plaques by herpes simplex virus in HeLa cells. Virology. 6 (2), 317-327 (1958).
  12. Garabedian, G. A., Scott, L. V. Plaque assay for herpes simplex virus in L-929 (Earle) mouse fibroblasts. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 126 (2), 568-571 (1967).
  13. Lancz, G. J. Herpes simplex viruses types 1 and 2. Type and strain specific characteristics affecting virus plaque formation. Arch Gesamte Virusforsch. 46 (1-2), 36-43 (1974).
  14. Muratore, O., Tonoli, E. L., Pesce Schito, A. A short-term plaque assay for antiviral drug research on herpes simplex virus type 2. New Microbiologica. 19 (3), 257-261 (1996).
  15. Sato, S., Kaneki, H., Shirai, J., Takahashi, K., Kawana, R. Differentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by plaque appearances on semicontinuous rabbit lens epithelial cells in the clinical laboratory. Kansenshogaku Zasshi. 67 (6), 561-573 (1993).
  16. Yazaki, S., Taniguchi, S., Yoshino, K. Improvement of the plaque assay of herpes simplex virus in HeLa cells. Japanese Jouranl of Microbiology. 10 (3), 133-139 (1966).
  17. Stanners, C. P., Eliceiri, G. L., Green, H. Two types of ribosome in mouse-hamster hybrid cells. Nature New Biology. 230 (10), 52-54 (1971).
  18. Giannasca, N. J., Suon, J. S., Evans, A. C., Margulies, B. J. Matrix-based controlled release delivery of acyclovir from poly-(ethylene co-vinyl acetate) rings. Journal of Drug Delivery Science and Technology. 55, 101391 (2020).
  19. Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 7th edn. , John Wiley & Sons, Inc. (2016).
  20. Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 38 (8), 747-752 (1952).
  21. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
  22. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 3, 63 (2006).
  23. Culley, S., Towers, G. J., Selwood, D. L., Henriques, R., Grove, J. Infection counter: Automated quantification of in vitro virus replication by fluorescence microscopy. Viruses. 8 (7), 201 (2016).
  24. Hudu, S. A., et al. Quantitative Hepatitis B e antigen: A better predictor of Hepatitis B virus DNA than quantitative Hepatitis B surface antigen. Clinical Laboratory. 64 (4), 443-449 (2018).
  25. Baltimore, D. RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature. 226 (5252), 1209-1211 (1970).
  26. Scolnick, E. M., Aaronson, S. A., Todaro, G. J., Parks, W. P. RNA dependent DNA polymerase activity in mammalian cells. Nature. 229 (5283), 318-321 (1971).
  27. Strick, L. B., Wald, A. Diagnostics for herpes simplex virus: is PCR the new gold standard. Molecular Diagnosis and Therapy. 10 (1), 17-28 (2006).
  28. Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Jouranl of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
  29. Kärber, G. Beitrag zue kollektiven Behandlung pharmakologischer pharmakologischer Reihenversuche. Archiv for Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 162 (4), 480-487 (1931).
  30. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).
  31. Spearman, C. The Method of 'Right and Wrong Cases' (Constant Stimuli) without Gauss's formula. British Journal of Psychology. 2 (3), 227-242 (1908).
  32. Ryu, W. -S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. 1st edn. , Academic Press. (2017).
  33. Burrill, C. P., Strings, V. R., Andino, R. Poliovirus: generation, quantification, propagation, purification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 15 Unit 15H 11 (2013).
  34. Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yanguez, E. Propagation and titration of influenza viruses. Methods in Molecular Biology. 1836, 59-88 (2018).
  35. Baz, M. Zika virus isolation, purification, and titration. Methods in Molecular Biology. 2142, 9-22 (2020).
  36. Coleman, C. M., Frieman, M. B. Growth and quantification of MERS-CoV infection. Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 177
הפלקה של וירוסי הרפס סימפלקס
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sadowski, L. A., Lesko, G. M.,… More

Sadowski, L. A., Lesko, G. M., Suissa, C., Upadhyay, R., Desai, P. J., Margulies, B. J. Plaquing of Herpes Simplex Viruses. J. Vis. Exp. (177), e62962, doi:10.3791/62962 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter