Summary
Plaquing é um método de rotina usado para quantificar vírus vivos em uma população. Embora o plaquing seja frequentemente ensinado em vários currículos de microbiologia com bactérias e bacteriófagos, o plaquamento de vírus mamíferos é mais complexo e demorado. Este protocolo descreve os procedimentos que funcionam de forma confiável para o trabalho regular com vírus herpes simplex.
Abstract
Existem inúmeros protocolos publicados para plaquamento de vírus, incluindo referências dentro da literatura primária para metodologia. No entanto, plaquing vírus pode ser difícil de executar, exigindo foco em suas especificações e refinamento. É um método incrivelmente desafiador para novos alunos dominarem, principalmente porque requer uma atenção meticulosa aos detalhes mais minuciosos. Essa demonstração de plaquamento de vírus herpes simplex deve ajudar aqueles que têm lutado para visualizar o método, especialmente suas nuances, ao longo dos anos. Embora este manuscrito se baseie nos mesmos princípios da metodologia de plaquing padrão, ele difere na sua descrição detalhada de (1) a melhor forma de lidar com células hospedeiras para evitar interrupções durante o processo, (2) um meio viscoso mais útil do que surgiu para limitar a difusão de virions, e (3) um simples procedimento de fixação e coloração que produz resultados relisivelmente reprodutíveis. Além disso, o vídeo que acompanha ajuda a demonstrar as distinções mais finas no processo, que são frequentemente perdidas ao instruir outros sobre a realização de ensaios de placa.
Introduction
Os primórdios dos ensaios da placa do vírus remontam às primeiras descobertas de vírus na década de 18901. O vírus do mosaico do tabaco foi primeiro isolado e transmitido sobre as folhas de tabaco, onde as manchas individuais de infecção poderiam ser reconhecidas e quantificadas como originárias de uma única entidade de vírus vivo2, posteriormente identificada como virion2. Estudos seminais posteriores com bactérias e bacteriófagos aperfeiçoaram as técnicas usadas para aplacar esses vírus, incluindo bactérias na fase de crescimento de tronco médio, diluição serial de amostras de bacteriófago, e ágar superior com visualização subsequente de buracos literais (placas nomeadas) no gramado bacteriano3.
O plaquamento de vírus animais atrasou a emocionante pesquisa que está sendo conduzida com bacteriófagos, principalmente porque os métodos necessários para o cultivo de células de mamíferos na cultura não foram desenvolvidos até a década de 19404. No entanto, o advento do crescimento das células murinas na ausência de todo o organismo hospedeiro4 gerou uma nova era na capacidade de cultura e contagem de vírus. Tal trabalho foi estendido para a propagação e quantitação do vírus da Encefalomielite Equina Ocidental em células de frango e poliovírus em células humanas5,6. À medida que o reino das células mamíferas culturable se expandiu, o bando de diferentes células hospedeiras para várias infecções virais deu ao mundo uma cornucópia de possibilidades de estudar todos os tipos de vírus7. Isso incluiu a propagação e quantificação de herpesvírus humanos, particularmente herpes simplex vírus-1 (HSV-1) e -2 (HSV-2), que causam lesões mucocutâneas8. É importante ressaltar que todos os ensaios de placa dependem da existência de virions vivos, que podem entrar em células hospedeiras de forma mediada por receptores em uma amostra9. Independentemente da onipresença e da multiplicidade de publicações sobre a execução de ensaios de placa5,10,11,12,13,14,15,16, esses métodos para O HSV-1/2 são uma mistura de arte e ciência; não se pode conduzir o ensaio sem a devida atenção a cada detalhe no protocolo, nem se pode executar um ensaio bem sucedido sem um olhar crticial para a sutileza no processo. Este manuscrito retrata um dos métodos mais consistentemente reprodutíveis para ensaios de placas HSV-1/2, com detalhes precisos para a arte do ensaio que raramente são discutidos.
Este protocolo atual obtém as contagens de unidades de formação de placas vivas (PFU) para HSV-1 e -2 de forma confiável. Os melhores resultados são obtidos utilizando células Vero (células epiteliais de macaco verde africano transformado) em baixa passagem (abaixo da passagem número 155) e cultivados rotineiramente em alfa-MEM17 suplementados com soro de bezerro fetal 10% (FCS), L-alanyl-L-glutamina, e uma mistura antibiótico/antimíctico18. As células vero são padronizadas neste meio de duas a três vezes por semana a uma diluição de 1/5 cada vez.
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Protocol
Todos os procedimentos com as células Vero e herpesvírus vivos foram aprovados pelo Comitê de Biossegurança Institucional da Universidade de Towson. Um esquema generalizado desses procedimentos está representado na Figura 1.
1. Semeadura das células Vero
- Um dia antes de iniciar o ensaio da placa, trippsinize células Vero e resuspensá-las no Médio de Águias Modificadas (DMEM) de Dulbecco regular e suplemento conforme metodologia de cultura celular padrão19. Resuspenque as células experimentpsinizadas em 10 mL de DMEM por frasco T-75 das células Vero confluentes (~107 células).
NOTA: O DMEM é usado para ensaios de placa em vez de alfa-MEM porque retarda ligeiramente a taxa de crescimento celular e favorece melhores resultados de ensaios de placa. - Conte as células pelo método preferido (por exemplo, um hemócito padrão com exclusão trypan blue)19.
- Sementes as células em 4 x 106 células/placa; para HSV-2, utilize placas de 6 poços com 2,5 mL de DMEM (com suplementos) por poço; e para HSV-1, utilize placas de 12 poços com 1,25 mL de DMEM (com suplementos) por poço.
NOTA: O número de células deve ser constante independentemente da placa utilizada, embora o tamanho dos poços importe a precisão no ensaio da placa. É essencial obter células uniformemente distribuídas, o que pode ser mais eficazmente realizado movendo a placa para frente e para trás, não de forma circular. - Permita que as células cresçam durante a noite a 37 °C/5% de CO2 em uma incubadora umidificada.
NOTA: A umidade é mantida com uma panela de água destilada contendo um algicida no fundo da incubadora.
2. Diluição amostral
- Complete a diluição da amostra e a adição de vírus às células em uma sessão de laboratório.
ATENÇÃO: O HSV-1 e -2 são infecciosos para humanos e devem ser manuseados sob a adequada contenção de biossegurança (BSL-2). Mantenha todos os materiais que entram em contato com o vírus separados e desinfetam com um agente quaternário a 1/256 diluição (ver Tabela de Materiais), iodophor, alvejante ou detergente iônico forte (por exemplo, SDS) antes de removê-los do armário de biossegurança. - No dia seguinte à semeadura das células Vero, diluir seriamente cada amostra de vírus a ser emplacar em 1x PBS; normalmente usam diluições de 10 vezes para o rastreamento mais preciso.
- Faça essas diluições através de 10-4 (para baixas concentrações de vírus) ou através de 10-9 (para expectativas de amostras mais altas de titer) com pelo menos 1 mL de cada amostra restante para o ensaio da placa em si.
- Mantenha todas as diluições virais no gelo (não mais que 1h) até que estejam prontas para adicionar essas amostras de vírus diluídas às células.
3. Adição de vírus às células
- Remova o meio de cultura celular de um ou dois poços por pipeta.
NOTA: Não use um aspirador porque ele remove muito líquido da monocamada celular e seca as células. Uma consideração crucial é garantir que a monocamada celular permaneça hidratada durante todo o curso do experimento. Se as células secarem, elas lavarão a placa na etapa final e gerarão dados inutilizáveis. Portanto, processe apenas um ou dois poços por vez para reduzir essa possibilidade. - Adicione cuidadosamente a amostra de vírus diluída (100-400 μL e 50-200 μL de amostra de vírus são usadas para placas de 6 poços e 12 poços, respectivamente) dropwise a cada monocamada, adicionando as gotas ao lado de cada poço. Repita o processo para cada um ou dois poços até que toda a placa esteja preenchida com as amostras do vírus sendo emplacados.
NOTA: Adicionar as gotas ao centro do poço pode inadvertidamente tirar as células do substrato. - Balance suavemente a placa inteira à mão para garantir que o PBS que contém o vírus cubra toda a monocamada de células em cada poço, em seguida, coloque a placa em uma incubadora de CO2 a 37 °C para permitir que o vírus adsorb.
- A cada 10 minutos dentro de 1h, remova a placa da incubadora, balance-a suavemente novamente para espalhar o vírus mais uniformemente em cada poço, e depois coloque-o de volta na incubadora.
NOTA: Cada experimento ditará o número de réplicas e quais diluições são utilizadas; a preferência do leitor dita essa decisão. - Para diminuir a possibilidade de contar inadvertidamente o inóculo não absorvido, remova a amostra de vírus dos poços com pontas de pipeta de 1000 μL e coloque-a em um béquer de resíduo.
NOTA: Mais uma vez, este procedimento é realizado com apenas um ou dois poços de cada vez para manter a hidratação da monocamada celular. - Coloque 2,5 mL de sobreposição de metilcelulose (dissolva 5% de metilcelulose w/w em 100 mL de PBS, autoclave por 15 min a 121 °C e 15 psi em um ciclo líquido, depois adicione 375 mL de DMEM mais 25 mL de FBS).
- Uma vez que uma placa inteira contenha sobreposição, coloque a placa de volta na incubadora para permitir o crescimento por dois dias.
NOTA: Se o vírus e as células podem crescer por três dias, mesmo em DMEM mais suplementos, uma perda substancial de células na monocamada pode resultar, comprometendo assim os dados finais. - Desinfete o béquer de resíduos, tipicamente com a adição de alvejante, um iodophor, ou um virucida semelhante, antes de removê-lo do armário de biossegurança.
4. Coloração para placas
- Após a incubação de dois dias, remova a sobreposição de metilcelulose por uma pipeta, novamente um ou dois poços de cada vez, e coloque-o em um béquer de resíduo.
- Adicione ~2 mL de 1% de violeta cristalina (ver Tabela de Materiais) em 50% de etanol a cada poço para manchar as placas.
NOTA: Não é essencial remover até a última gota da sobreposição. - Incubar a placa com todos os poços preenchidos com a mancha por 30 min a 37 °C. Neste ponto, desinfete o béquer de resíduos como acima na etapa 3.8.
- Lave as placas vigorosamente com água da torneira até que o escoamento esteja limpo.
NOTA: Um fluxo suave de água não é vigoroso o suficiente; é necessária pressão total de uma instalação de pia de laboratório. - Neste ponto, certifique-se de que há aproximadamente 10 vezes diferenças no número de placas em cada série de diluição.
- Deixe as placas secarem durante a noite de cabeça para baixo, após as quais as placas individuais podem ser contadas.
5. Contagem de placas e determinação de titulação de vírus
- Independentemente da abordagem (veja NOTA abaixo), multiplique o número de placas pelo fator de diluição (por exemplo, se as placas fossem contadas no poço 10-4 , então o número de placas seria multiplicado por 104).
NOTA: Embora contar dentro de uma faixa de 10-100 placas seja útil5, contar poços com 30-300 placas é um pouco mais confiável e leva em conta aproximadamente 1/2-log diluições em vez de diluições de log completo. - Divida esse número pelo volume de inóculo (acima na etapa 3.2), e média de todos os poços que possuem placas dentro da faixa indicada para obter o título mais preciso de HSV na amostra original.
- Realizar os cálculos nas etapas 5.3.1 a 5.3.5, considerando o uso de dados falsos na Tabela 1.
- Considere apenas poços com placas 30-300 (passo 5.1). Assim, na Tabela 1, utilize apenas a coluna 10-5 para réplicas 1, 2 e 3.
- Pegue o número de placas na diluição dada e multiplique pelo recíproco do fator de diluição. Assim, a coluna 10-5 da amostra 1 vai de 81 placas na diluição de 10-5 para 81 placas vezes 105.
- Em seguida, divida esse número pelo volume (em mL) da diluição do vírus adicionada às células naquele poço. Supondo que os dados sobre o HSV-1 na Tabela 1 sejam de uma placa de 12 poços, 0,2 mL seria a medida mais apropriada. Assim, o cálculo da etapa 5.3.2 passa a ser 81 x 105 dividido por 0,2 mL, ou 4,0 x 107 PFU/mL de HSV-1.
- Repita este processo para todos os dados úteis e médios. Assim, realize o cálculo em 5.3.2-5.3.3 em todas as amostras da coluna 10-5, assumindo que elas se originaram da mesma amostra de vírus e as réplicas biológicas foram realizadas para obter a medição mais precisa do título. No caso da Tabela 1, média de 4,0 x 107, 2,1 x 107 e 2,6 x 107 PFU/mL para obter uma média final de 2,9 x 107 ± 0,98 x 107 PFU/mL para esta amostra.
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Representative Results
A Tabela 1 mostra um experimento que tem resultados ótimos. Todas as diluições de 10 vezes seguem uma redução de aproximadamente 10 vezes na contagem de placas. Esses tipos de dados também podem ser vistos na Figura 2, um ensaio de placa real onde o número contável de placas caiu na faixa 10-4 para todas as três réplicas. O mesmo pode ser visto na Figura 3, a linha superior, onde o número contável de placas estava na diluição 10-3.
No entanto, a Figura 3, linha inferior, mostra um resultado totalmente diferente quando um ensaio de placa não é bem conduzido. Primeiro, há muito poucas placas visíveis de qualquer diluição; portanto, os dados são inutilizáveis. Em segundo lugar, há áreas visíveis ao redor do topo onde as células Vero foram totalmente levantadas do substrato, evidência de permitir que as células sequem no processo ou de pipetar muito vigorosamente naquela região do poço.
A Tabela 2 também mostra um conjunto de resultados potencialmente aberrantes na contagem de placas e requer cautelas ao longo do caminho. Note-se que nem a linha superior nem a linha inferior de réplicas seguem uma diferença regular de 10 vezes na contagem de placas, pois uma se move de uma diluição para a próxima; esses dados indicam erro do usuário durante o processo de diluição do vírus. Além disso, não é provável que um usuário conte com precisão mais de 15.000 placas, por isso é preciso colocar esses dados em questão. Finalmente, pode-se notar que na replicação 1, 10-6 diluição, há uma contagem de placas na faixa 30-300; no entanto, dada a natureza pobre do resto dos dados nesta réplica, é improvável que a contagem de 42 placas seja um número preciso. Assim, os únicos dados críveis na Tabela 2 estão na replicação 2.
A Figura 4 mostra os mesmos problemas com as células secando ou sendo mal tratadas durante o ensaio da placa. No entanto, a Figura 4 mostra criticamente a pobre semeadura celular Vero; cada poço mostra manchas roxas mais escuras, indicativas de células não se espalham bem pelo poço e empilhadas umas sobre as outras em aglomerados.
Figura 1: Esquema geral de ensaio de placa. Adaptado do modelo Biorender, "Protocolo de Ensaio de Placa Viral", por BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Ensaio de placa para HSV-1 em placas de doze poços. As réplicas biológicas foram conduzidas conforme descrito na Figura 1 em uma amostra do HSV-1. Diluições de 10 vezes de uma amostra de HSV-1 (a partir da diluição de 10-2 ) foram adicionadas às células Vero, incubadas, depois manchadas com violeta cristalina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Ensaio de placa para HSV-2 em placas de seis poços. As réplicas biológicas foram realizadas conforme descrito na Figura 1 em uma amostra do HSV-2. Diluições de 10 vezes de uma amostra de HSV-2 (a partir da diluição de 10-2 ) foram adicionadas às células Vero, incubadas, depois manchadas com violeta cristalina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Ensaio de placa para HSV-1 em placas de doze poços. As réplicas biológicas foram conduzidas conforme descrito na Figura 1 em uma amostra do HSV-1. Diluições de 10 vezes de uma amostra de HSV-1 (a partir da diluição de 10-2 ) foram adicionadas às células Vero, incubadas, depois manchadas com violeta cristalina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Fator de diluição | ||||
| Replicar | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 |
| 1 | 5721 | 635 | 81 | 5 |
| 2 | 4592 | 365 | 42 | 0 |
| 3 | 5,519 | 521 | 53 | 1 |
Tabela 1: A placa representativa conta a partir de um ensaio bem sucedido. Diluições seriais de cada réplica biológica foram realizadas; contagem de placas representativas (a partir da diluição de 10-3 ) são mostradas para cada diluição.
| Fator de diluição | ||||
| Replicar | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 |
| 1 | 15225 | 635 | 450 | 42 |
| 2 | 4592 | 365 | 42 | 0 |
| 3 | 5519 | 5400 | 53 | 1 |
Tabela 2: A placa representativa conta a partir de um ensaio mal sucedido. Diluições seriais de cada réplica biológica foram realizadas; contagem de placas representativas (a partir da diluição de 10-3 ) são mostradas para cada diluição.
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Discussion
Embora os ensaios de placa sejam quase tão antigos quanto a própria cultura celular de mamíferos, parece que cada laboratório tem seu próprio conjunto de protocolos para executar este ensaio básico5,6,10,11,12,13,14,15,16,20 . Embora as instruções em cada versão publicada de um ensaio de placa diferem sempre tão ligeiramente, poucos desses manuscritos elucidam as nuances críticas envolvidas na obtenção de resultados consistentes.
Portanto, há algumas partes deste protocolo que são mais arte do que ciência. Quando as células Vero são semeadas em poços para o ensaio, elas devem ser espalhadas uniformemente por todo o poço (Figura 4). Todas as etapas que envolvam uma transferência líquida (por exemplo, etapas 3.1, 3.2, 3.5, 3.6, 4.1 e 4.2) devem ser feitas cuidadosamente para manter a monocamada de célula Vero hidratada (Figura 3 e Figura 4). Também é crucial não tocar na parte inferior do poço com qualquer pipeta, ou as células podem raspar, comprometendo ainda mais os dados finais (Figura 4).
Embora a metilcelulose seja vantajosa como material de sobreposição para evitar a difusão de virions em todo o poço, alternativas podem ser usadas. Por exemplo, pode-se usar celulose microcristalino21,22 ou celulose carboximetil21. Independentemente disso, a metilcelulose é uma das mais fáceis e menos caras mídia de sobreposição líquida para usar. Pode-se também usar uma solução de corante diferente21 ou fixação (por exemplo, paraformaldeído)21 para a parte de coloração do protocolo (etapa 4), mas o cristal violeta em 50% de etanol é o mais fácil e menos caro entre as opções.
Embora possa ser extremamente simples conduzir esses ensaios, eles requerem treinamento e prática. Vale a pena usar amostras que não são insubstituíveis para aprender esse método para que se tenha dominado a técnica quando mais importa.
Os ensaios de placa em si só devem ser usados, no entanto, quando é preciso contar virions vivos de boa fé. Plaquing é uma metodologia muito mais antiga para medir partículas de vírus5,10 em comparação com métodos quantitativos mais novos como microscopia de fluorescência23, ELISA24, atividade enzimática25,26 ou qPCR27. No entanto, esses últimos métodos geram dados substitutos que sugerem a presença de virions inteiros, mas podem levar a uma superestimação grosseira em partículas viáveis porque o usuário estaria quantificando um indicador de infecção, não virions reais. A microscopia de fluorescência mede virões infecciosos pela quantidade de células que exibem a presença de uma proteína expressa pelo vírus, mas não necessariamente detecta virions completos e competentes para replicação. ELISA também detecta a presença de proteínas de vírus que podem existir sem uma virion totalmente infecciosa. Ensaios de atividade enzimática, embora sugestivo de uma virion intacta, só mostra que uma única enzima ativa está presente e não reflete a verdadeira natureza contagiosa de toda uma virion. E qPCR apenas quantifica cópias do genoma de um vírus, quer esse genoma esteja defeituoso ou não. O único método comparável a um ensaio de placa para quantificar vírus vivos é um ensaio de diluição de ponto final28, que ainda requer uma estimativa estatística através dos métodos Reed-Muench ou Spearman-Kärber29,30,31 para determinar a concentração de virion.
Embora os ensaios de placa sejam um método de rotina utilizado ao longo da virologia, há casos particulares em que eles não são o ensaio quantitativo de escolha. Por exemplo, os ensaios de placa exigem que as células hospedeiras se conectem a um substrato; se a melhor célula hospedeira para infecção não for aderente, as placas nunca formarão32. Alguns vírus crescem mais lentamente do que o ciclo celular típico de seus hospedeiros, e, portanto, quaisquer placas em expansão seriam supercrescidas pelas próprias células hospedeiras21. As placas podem às vezes não se formar bem, apenas pela natureza do efeito citopático, tornando a determinação de placas de boa fé uma limitação21.
A abordagem para plaquamento de herpesvírus aqui apresentados não é necessariamente única. No entanto, essa descrição aprofundada das pequenas ressalvas associadas a um ensaio de placa HSV bem sucedido pode diminuir as dificuldades vivenciadas por muitos usuários, especialmente os novatos. Independentemente disso, a metodologia descrita também é amplamente aplicável a ensaios de placas com muitos outros vírus, incluindo, mas não se limitando a picornavírus33, ortomyxovírus34, flavírus35, coronavírus36, e muitos outros sistemas nos quais uma quantidade quantificável de vírus infecciosos de animais são necessários.
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Disclosures
Os autores não declaram conflito de interesses.
Acknowledgments
Agradecemos a inúmeros alunos de nossos laboratórios (PJD e BJM) que trabalharam conosco ao longo dos anos refinando esses métodos. Um agradecimento especial a Stan Person, sob cuja tutela esta metodologia foi desenvolvida pela primeira vez. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo fundo de apoio à pesquisa da Towson University Fisher College of Science and Math E nigms Bridges para a bolsa baccalaureate 5R25GM058264. Este conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Corning | 3512 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
| Antibiotic/antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| Crystal violet | Alfa Aesar | B2193214 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++) | Gibco | 14190144 | |
| Fetal calf serum | Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Gibco | GS07F161BA | |
| Hemacytometer | Thermo Fisher | 02-671-54 | |
| Methylcellulose | Millipore-Sigma | 27-441-0 | |
| Quaternary agent (Lysol I.C.) | Thermo Fisher | NC9645698 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 |
References
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