Summary
Plaquing es un método de rutina utilizado para cuantificar virus vivos en una población. Aunque el plaquing se enseña con frecuencia en varios currículos de microbiología con bacterias y bacteriófagos, el plaquing de virus de mamíferos es más complejo y requiere más tiempo. Este protocolo describe los procedimientos que funcionan de manera confiable para el trabajo regular con virus del herpes simple.
Abstract
Existen numerosos protocolos publicados para detectar virus, incluidas referencias dentro de la literatura primaria para la metodología. Sin embargo, la detección de virus puede ser difícil de realizar, lo que requiere centrarse en sus especificaciones y refinamiento. Es un método increíblemente desafiante para que los nuevos estudiantes lo dominen, principalmente porque requiere una atención meticulosa a los detalles más minuciosos. Esta demostración de plagar los virus del herpes simple debería ayudar a aquellos que han luchado con la visualización del método, especialmente sus matices, a lo largo de los años. Si bien este manuscrito se basa en los mismos principios de la metodología estándar de plaquing, difiere en que contiene una descripción detallada de (1) la mejor manera de manejar las células huésped para evitar interrupciones durante el proceso, (2) un medio viscoso más útil que la agarosa para limitar la difusión de viriones, y (3) un procedimiento simple de fijación y tinción que produce resultados reproducibles de manera confiable. Además, el video que lo acompaña ayuda a demostrar las distinciones más finas en el proceso, que con frecuencia se pasan por alto cuando se instruye a otros sobre la realización de ensayos de placa.
Introduction
Los inicios de los ensayos de placa viral se remontan a los primeros descubrimientos de virus en la década de 18901. El virus del mosaico del tabaco se aisló por primera vez y se transmitió a las hojas de tabaco, donde las manchas individuales de infección pudieron reconocerse y cuantificarse como originarias de una sola entidad de virus viva2, más tarde identificada como un virión2. Estudios seminales posteriores con bacterias y bacteriófagos perfeccionaron las técnicas utilizadas para placar estos virus, incluidas las bacterias en la fase media del crecimiento, la dilución en serie de muestras de bacteriófagos y el agar superior con la posterior visualización de agujeros literales (llamadas placas) en el césped bacteriano3.
La detección de virus animales retrasó la emocionante investigación que se estaba llevando a cabo con bacteriófagos, principalmente porque los métodos requeridos para cultivar células de mamíferos en cultivo no se desarrollaron hasta la década de 19404. Sin embargo, el advenimiento del crecimiento de células murinas en ausencia de todo el organismo huésped4 generó una nueva era en la capacidad de cultivar y contar virus. Dicho trabajo se amplió para la propagación y cuantificación del virus de la encefalomielitis equina occidental en células de pollo y poliovirus en células humanas5,6. A medida que el reino de las células de mamíferos cultivables se expandió, el grupo de diferentes células huésped para diversas infecciones virales le dio al mundo una cornucopia de posibilidades para estudiar todo tipo de virus7. Esto incluyó la propagación y cuantificación de herpesvirus humanos, particularmente virus del herpes simple-1 (HSV-1) y -2 (HSV-2), que causan lesiones mucocutáneas8. Es importante destacar que todos los ensayos de placa dependen de la existencia de viriones vivos, que pueden ingresar a las células huésped de manera mediada por receptores en una muestra9. Independientemente de la ubicuidad y la multitud de publicaciones sobre la ejecución de ensayos de placa5,10,11,12,13,14,15,16, estos métodos para HSV-1/-2 son una mezcla de arte y ciencia; no se puede llevar a cabo el ensayo sin la debida atención a cada detalle en el protocolo, ni se puede ejecutar un ensayo exitoso sin un ojo crticial para la sutileza en el proceso. Este manuscrito describe uno de los métodos reproducibles más consistentemente para los ensayos de placa HSV-1/-2, con detalles precisos hacia el arte del ensayo que rara vez se discuten.
Este protocolo actual obtiene recuentos de unidades formadoras de placa viva (PFU) para HSV-1 y -2 de manera confiable. Los mejores resultados se obtienen utilizando células Vero (células epiteliales de riñón de mono verde africano transformadas) a paso bajo (por debajo del número de paso 155) y cultivadas rutinariamente en alfa-MEM17 suplementadas con 10% de suero fetal de ternero (FCS), L-alanil-L-glutamina y una mezcla antibiótica/antimicótica18. Las células Vero se propagan estándarmente en este medio dos o tres veces por semana a una dilución de 1/5 cada vez.
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Protocol
Todos los procedimientos con las células Vero y los herpesvirus vivos han sido aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad de la Universidad de Towson. En la Figura 1 se representa un esquema generalizado de estos procedimientos.
1. Siembra de las células Vero
- El día antes de iniciar el ensayo de placa, tripsinize las células Vero y resuspóndelas en el Medio Modified Eagles (DMEM) de Dulbecco regular y complemente según la metodología estándar de cultivo celular19. Resuspend las células tripsinizadas en 10 mL de DMEM por matraz T-75 de las células Vero confluentes (~107 células).
NOTA: DMEM se utiliza para ensayos de placa en lugar de alfa-MEM porque ralentiza ligeramente la tasa de crecimiento celular y favorece mejores resultados de ensayo de placa. - Cuente las células por el método preferido (por ejemplo, un hemocitómetro estándar con exclusión de Trypan Blue)19.
- Sembrar las células a 4 x 106 células/placa; para HSV-2, use placas de 6 pocillos con 2.5 ml de DMEM (con suplementos) por pozo; y para HSV-1, use placas de 12 pocillos con 1.25 ml de DMEM (con suplementos) por pozo.
NOTA: El número de células debe ser constante independientemente de la placa utilizada, aunque el tamaño de los pocillos es importante en cuanto a la precisión en el ensayo de placa. Es esencial lograr que las células se distribuyan uniformemente, lo que se puede lograr de manera más efectiva moviendo la placa hacia adelante y hacia atrás, no de manera circular. - Permita que las células crezcan durante la noche a 37 ° C / 5% de CO2 en una incubadora humidificada.
NOTA: La humedad se mantiene con una sartén de agua destilada que contiene un algicida en el fondo de la incubadora.
2. Dilución de la muestra
- Complete la dilución de la muestra y la adición de virus a las células en una sesión de laboratorio.
PRECAUCIÓN: HSV-1 y -2 son infecciosos para los seres humanos y deben manejarse bajo la contención adecuada de bioseguridad (BSL-2). Mantenga todos los materiales que entran en contacto con el virus separados y desinfecte con un agente cuaternario a una dilución de 1/256 (consulte la Tabla de materiales), yodóforo, lejía o detergente iónico fuerte (por ejemplo, SDS) antes de retirarlos del gabinete de bioseguridad. - El día después de la siembra de las células Vero, diluya en serie cada muestra de virus para ser placada en 1x PBS; por lo general, utiliza diluciones de 10 veces para un seguimiento más preciso.
- Haga estas diluciones a través de 10-4 (para bajas concentraciones de virus) o a través de 10-9 (para expectativas de muestras de título más alto) con al menos 1 ml de cada muestra restante para el ensayo de placa en sí.
- Mantenga todas las diluciones virales en hielo (no más de 1 h) hasta que esté listo para agregar estas muestras de virus diluidas a las células.
3. Adición de virus a las células
- Retire el medio de cultivo celular de uno o dos pocillos por pipeta.
NOTA: No use un aspirador porque elimina demasiado líquido de la monocapa celular y seca las células. Una consideración crucial es garantizar que la monocapa celular permanezca hidratada durante todo el curso del experimento. Si las células se secan, lavarán la placa en el paso final y generarán datos inutilizables. Por lo tanto, procese solo uno o dos pozos a la vez para reducir esta posibilidad. - Agregue cuidadosamente la muestra de virus diluida (100-400 μL y 50-200 μL de muestra de virus se utilizan para placas de 6 y 12 pocillos, respectivamente) gota a gota a cada monocapa, agregando las gotas por el lado de cada pozo. Repita el proceso por cada uno o dos pocillos hasta que toda la placa se llene con las muestras de virus que se están placando.
NOTA: Agregar las gotas al centro del pozo puede desprender inadvertidamente las células del sustrato. - Balancee suavemente toda la placa a mano para asegurarse de que el PBS que contiene el virus cubra toda la monocapa de células en cada pozo, luego coloque la placa en una incubadora de CO2 a 37 ° C para permitir que el virus se adsorba.
- Cada 10 minutos dentro de 1 h, retire la placa de la incubadora, vuelva a mecerla suavemente para propagar el virus de manera más uniforme a través de cada pozo y luego colóquela nuevamente en la incubadora.
NOTA: Cada experimento dictará el número de réplicas y qué diluciones se utilizan; la preferencia del lector dicta esa decisión. - Para disminuir la posibilidad de contar inadvertidamente el inóculo no absorbido, retire la muestra de virus de los pozos con puntas de pipeta de 1000 μL y colóquela en un vaso de precipitados de desecho.
NOTA: Nuevamente, este procedimiento se lleva a cabo con solo uno o dos pocillos a la vez para mantener la hidratación de la monocapa celular. - Coloque 2,5 ml de una superposición de metilcelulosa (disuelva el 5% de metilcelulosa p/p en 100 ml de PBS, en autoclave durante 15 min a 121 °C y 15 psi en un ciclo líquido, luego agregue 375 ml de DMEM más 25 ml de FBS).
- Una vez que una placa entera contenga superposición, coloque la placa de nuevo en la incubadora para permitir el crecimiento durante dos días.
NOTA: Si se permite que el virus y las células crezcan durante tres días, incluso en DMEM más suplementos, puede producirse una pérdida sustancial de células en la monocapa, comprometiendo así los datos finales. - Desinfecte el vaso de precipitados residual, generalmente con la adición de lejía, un yodóforo o un virucida similar, antes de retirarlo del gabinete de bioseguridad.
4. Tinción para placas
- Después de la incubación de dos días, retire la capa de metilcelulosa con una pipeta, nuevamente uno o dos pozos a la vez, y colóquela en un vaso de precipitados de desecho.
- Agregue ~ 2 ml de violeta de cristal al 1% (consulte la Tabla de materiales) en etanol al 50% a cada pozo para manchar las placas.
NOTA: No es esencial eliminar hasta la última gota de la superposición. - Incubar la placa con todos los pocillos llenos de la mancha durante 30 min a 37 °C. En este punto, desinfecte el vaso de precipitados de residuos como se indica anteriormente en el paso 3.8.
- Lave las placas vigorosamente con agua del grifo hasta que la escorrentía esté clara.
NOTA: Una corriente suave de agua no es lo suficientemente vigorosa; se requiere la presión completa de un accesorio de fregadero de laboratorio. - En este punto, asegúrese de que haya diferencias de aproximadamente 10 veces en el número de placas en cada serie de dilución.
- Deje que las placas se sequen durante la noche boca abajo, después de lo cual se pueden contar las placas individuales.
5. Contar las placas y determinar el título del virus
- Independientemente del enfoque (ver NOTA a continuación), multiplique el número de placas por el factor de dilución (por ejemplo, si las placas se contaron en el pozo 10-4 , entonces el número de placas se multiplicaría por 104).
NOTA: Aunque contar dentro de un rango de 10-100 placas es útil5, contar pocillos con 30-300 placas es algo más confiable y tiene en cuenta aproximadamente 1/2-log diluciones en lugar de diluciones full-log. - Divida este número por el volumen de inóculo (como se mencionó anteriormente en el paso 3.2) y promedie todos los pozos que tienen placas dentro del rango indicado para obtener el título más preciso de HSV en la muestra original.
- Realice los cálculos en los pasos 5.3.1 a 5.3.5, considerando el uso de datos simulados en la Tabla 1.
- Considere solo los pozos con 30-300 placas (paso 5.1). Por lo tanto, en la Tabla 1, use solo la columna 10-5 para las réplicas 1, 2 y 3.
- Tome el número de placas en la dilución dada y multiplique por el recíproco del factor de dilución. Por lo tanto, la columna 10-5 de la muestra 1 pasa de 81 placas en la dilución 10-5 a 81 placas por 105.
- Luego divida ese número por el volumen (en ml) de la dilución del virus agregada a las células en ese pozo. Suponiendo que los datos sobre HSV-1 en la Tabla 1 son de una placa de 12 pocillos, 0.2 mL sería la medida más apropiada. Por lo tanto, el cálculo del paso 5.3.2 se convierte en 81 x 105 dividido por 0.2 mL, o 4.0 x 107 PFU / mL de HSV-1.
- Repita este proceso para todos los datos útiles y el promedio. Por lo tanto, realice el cálculo en 5.3.2-5.3.3 en todas las muestras de la columna 10-5, suponiendo que se originaron a partir de la misma muestra de virus y las réplicas biológicas se realizaron para obtener la medición de título más precisa. En el caso de la Tabla 1, promedio de 4.0 x 107, 2.1 x 107 y 2.6 x 107 PFU/mL para obtener un título promedio final de 2.9 x 107 ± 0.98 x 107 PFU/mL para esta muestra.
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Representative Results
La Tabla 1 muestra un experimento que tiene resultados óptimos. Todas las diluciones de 10 veces siguen a una disminución de aproximadamente 10 veces en los recuentos de placa. Este tipo de datos también se pueden ver en la Figura 2, un ensayo de placa real donde el número contable de placas cayó en el rango de 10-4 para las tres réplicas. Lo mismo se puede ver en la Figura 3, la fila superior, donde el número contable de placas estaba en la dilución 10-3.
Sin embargo, la Figura 3, fila inferior, muestra un resultado completamente diferente cuando un ensayo de placa no se realiza bien. En primer lugar, hay muy pocas placas visibles de cualquier dilución; por lo tanto, los datos son inutilizables. En segundo lugar, hay áreas visibles alrededor de la parte superior donde las células Vero se han levantado por completo del sustrato, evidencia de permitir que las células se sequen en el proceso o de pipetear demasiado vigorosamente en esa región del pozo.
La Tabla 2 también muestra un conjunto de resultados potencialmente aberrantes en los recuentos de placa y requiere precauciones en el camino. Cabe destacar que ni la fila superior ni la fila inferior de réplicas siguen una diferencia regular de 10 veces en los recuentos de placa a medida que uno se mueve de una dilución a la siguiente; estos datos indican un error del usuario durante el proceso de dilución del virus. Además, no es probable que un usuario cuente con precisión más de 15,000 placas, por lo que uno debe cuestionar esos datos. Finalmente, se puede observar que en la dilución replicada 1, 10-6 , hay un recuento de placas en el rango de 30-300; sin embargo, dada la naturaleza pobre del resto de los datos en esta réplica, es poco probable que el recuento de 42 placas sea un número preciso. Por lo tanto, los únicos datos creíbles en la Tabla 2 están en la réplica 2.
La Figura 4 muestra los mismos problemas con las células que se secan o se manejan mal durante el ensayo de placa. Sin embargo, la Figura 4 muestra críticamente una siembra deficiente de células Vero; cada pozo muestra manchas púrpuras más oscuras, indicativas de células que no se extienden bien por el pozo y se apilan una encima de la otra en grupos.
Figura 1: Esquema general de ensayo de placa. Adaptado de la plantilla Biorender, "Protocolo de ensayo de placa viral", por BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ensayo de placa para HSV-1 en placas de doce pocillos. Se realizaron réplicas biológicas como se describe en la Figura 1 en una muestra de HSV-1. Las diluciones seriadas de 10 veces de una muestra de HSV-1 (a partir de la dilución de 10-2 ) se agregaron a las células Vero, se incubaron y luego se tiñeron con violeta cristalino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ensayo de placa para HSV-2 en placas de seis pocillos. Se realizaron réplicas biológicas como se describe en la Figura 1 en una muestra de HSV-2. Las diluciones seriadas de 10 veces de una muestra de HSV-2 (a partir de la dilución de 10-2 ) se agregaron a las células Vero, se incubaron y luego se tiñeron con violeta cristalino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ensayo de placa para HSV-1 en placas de doce pocillos. Se realizaron réplicas biológicas como se describe en la Figura 1 en una muestra de HSV-1. Las diluciones seriadas de 10 veces de una muestra de HSV-1 (a partir de la dilución de 10-2 ) se agregaron a las células Vero, se incubaron y luego se tiñeron con violeta cristalino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Factor de dilución | ||||
| Replicar | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 |
| 1 | 5721 | 635 | 81 | 5 |
| 2 | 4592 | 365 | 42 | 0 |
| 3 | 5,519 | 521 | 53 | 1 |
Tabla 1: Recuentos de placas representativas de un ensayo exitoso. Se realizaron diluciones seriadas de cada réplica biológica; se muestran recuentos representativos de placa (a partir de la dilución 10-3 ) para cada dilución.
| Factor de dilución | ||||
| Replicar | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 |
| 1 | 15225 | 635 | 450 | 42 |
| 2 | 4592 | 365 | 42 | 0 |
| 3 | 5519 | 5400 | 53 | 1 |
Tabla 2: Recuentos representativos de placas de un ensayo fallido. Se realizaron diluciones seriadas de cada réplica biológica; se muestran recuentos representativos de placa (a partir de la dilución 10-3 ) para cada dilución.
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Discussion
Si bien los ensayos de placa son casi tan antiguos como el propio cultivo celular de mamíferos, parece que cada laboratorio tiene su propio conjunto de protocolos para ejecutar este ensayo básico5,6,10,11,12,13,14,15,16,20 . Aunque las instrucciones en cada versión publicada de un ensayo de placa difieren ligeramente, pocos de estos manuscritos dilucidan los matices críticos involucrados en la obtención de resultados consistentes.
Por lo tanto, hay algunas partes de este protocolo que son más arte que ciencia. Cuando las células Vero se siembran en pozos para el ensayo, deben extenderse uniformemente por todo el pozo (Figura 4). Todos los pasos que impliquen una transferencia de líquido (por ejemplo, los pasos 3.1, 3.2, 3.5, 3.6, 4.1 y 4.2) deben realizarse con cuidado para mantener hidratada la monocapa de células Vero (Figura 3 y Figura 4). También es crucial no tocar el fondo del pozo con ninguna pipeta, o las células pueden rasparse, comprometiendo aún más los datos finales (Figura 4).
Si bien la metilcelulosa es ventajosa como material superpuesto para evitar la difusión de viriones en todo el pozo, se pueden usar alternativas. Por ejemplo, se puede utilizar celulosa microcristalina21,22 o carboximetilcelulosa21. Sin embargo, la metilcelulosa es uno de los medios de superposición líquida más fáciles y menos costosos de usar. También se puede usar un colorante diferente21 o una solución fijadora (por ejemplo, paraformaldehído)21 para la parte de tinción del protocolo (paso 4), pero el violeta cristal en etanol al 50% es la más fácil y menos costosa entre las opciones.
Si bien puede ser abiertamente sencillo realizar estos ensayos, requieren capacitación y práctica. Vale la pena usar muestras que no sean insustituibles para aprender este método para que uno haya dominado la técnica cuando más importa.
Sin embargo, los ensayos de placa en sí solo deben usarse cuando se necesitan contar viriones vivos de buena fe. Plaquing es una metodología mucho más antigua para medir partículas de virus5,10 en comparación con métodos cuantitativos más nuevos como la microscopía de fluorescencia23, ELISA24, actividad enzimática25,26 o qPCR27. Sin embargo, estos últimos métodos generan datos sustitutos que sugieren la presencia de viriones enteros, pero pueden conducir a una sobreestimación bruta en partículas viables porque el usuario estaría cuantificando un indicador de infección, no viriones reales. La microscopía de fluorescencia mide los viriones infecciosos por la cantidad de células que exhiben la presencia de una proteína expresada por el virus, pero no necesariamente detecta viriones completos y competentes para la replicación. ELISA detecta de manera similar la presencia de proteínas virales que pueden existir sin un virión completamente infeccioso. El ensayo de la actividad enzimática, aunque sugiere un virión intacto, solo muestra que una sola enzima activa está presente y no refleja la verdadera naturaleza contagiosa de un virión completo. Y la qPCR simplemente cuantifica las copias del genoma de un virus, ya sea que ese genoma sea defectuoso o no. El único método comparable a un ensayo de placa para cuantificar virus vivos es un ensayo de dilución de endpoint28, que aún requiere una estimación estadística a través de los métodos Reed-Muench o Spearman-Kärber29,30,31 para determinar la concentración de viriones.
Si bien los ensayos de placa son un método de rutina utilizado en toda la virología, hay casos particulares en los que no son el ensayo cuantitativo de elección. Por ejemplo, los ensayos de placa requieren que las células huésped se adhieran a un sustrato; si la mejor célula huésped para la infección es no adherente, las placas nunca se formarán32. Algunos virus crecen más lentamente que el ciclo celular típico de sus huéspedes y, por lo tanto, cualquier placa floreciente sería crecida en exceso por las propias células huésped21. Las placas a veces pueden no formarse bien, solo por la naturaleza del efecto citopático, lo que hace que la determinación de placas de buena fe sea una limitación21.
El enfoque para plagar los herpesvirus presentado aquí no es necesariamente único. Sin embargo, esta descripción en profundidad de las advertencias menores asociadas con un ensayo exitoso de placa de VHS puede disminuir las dificultades experimentadas por muchos usuarios, especialmente los novatos. En cualquier caso, la metodología descrita también es ampliamente aplicable a los ensayos de placa con muchos otros virus, incluidos, entre otros, picornavirus33, ortomixovirus34, flavirus35, coronavirus36 y muchos otros sistemas en los que se requiere una cantidad cuantificable de virus animales infecciosos.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflicto de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a innumerables estudiantes en nuestros laboratorios (PJD y BJM) que han trabajado con nosotros a lo largo de los años refinando estos métodos. Un agradecimiento especial a Stan Person, bajo cuya tutela se desarrolló por primera vez esta metodología. Este trabajo fue parcialmente apoyado por el fondo de apoyo a la investigación de pregrado fisher College of Science and Math de la Universidad de Towson y la subvención NIGMS Bridges to the Baccalaureate 5R25GM058264. Este contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Corning | 3512 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
| Antibiotic/antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| Crystal violet | Alfa Aesar | B2193214 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++) | Gibco | 14190144 | |
| Fetal calf serum | Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Gibco | GS07F161BA | |
| Hemacytometer | Thermo Fisher | 02-671-54 | |
| Methylcellulose | Millipore-Sigma | 27-441-0 | |
| Quaternary agent (Lysol I.C.) | Thermo Fisher | NC9645698 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 |
References
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