Summary
В настоящем исследовании показано создание трех различных моделей донорства легких (донорство после смерти мозга, донорство после смерти от кровообращения и донорство после геморрагического шока). Сравниваются воспалительные процессы и патологические нарушения, связанные с этими событиями.
Abstract
Экспериментальные модели являются важными инструментами для понимания этиологических явлений, участвующих в различных патофизиологических событиях. В этом контексте различные животные модели используются для изучения элементов, запускающих патофизиологию первичной дисфункции трансплантата после трансплантации, для оценки потенциальных методов лечения. В настоящее время экспериментальные модели донорства можно разделить на две большие группы: донорство после смерти мозга и донорство после остановки кровообращения. Кроме того, вредные последствия, связанные с геморрагическим шоком, следует учитывать при рассмотрении моделей донорства органов на животных. В этой статье мы опишем создание трех различных моделей донорства легких (донорство после смерти мозга, донорство после смерти от кровообращения и донорство после геморрагического шока) и сравним воспалительные процессы и патологические расстройства, связанные с этими событиями. Цель – предоставить научному сообществу надежные животные модели донорства легких для изучения ассоциированных патологических механизмов и поиска новых терапевтических мишеней для оптимизации количества жизнеспособных трансплантатов для трансплантации.
Introduction
Клиническая значимость
Трансплантация органов является хорошо зарекомендовавшим себя терапевтическим вариантом при нескольких серьезных патологиях. В последние годы было достигнуто много успехов в клинической и экспериментальной областях трансплантации органов, таких как углубление знаний о патофизиологии первичной дисфункции трансплантата (ПГД) и достижения в области интенсивной терапии, иммунологии и фармакологии 1,2,3. Несмотря на достижения и улучшения качества соответствующих хирургических и фармакологических процедур, соотношение между количеством доступных органов и числом реципиентов в листе ожидания остается одной из основных проблем 2,4. В связи с этим в научной литературе предложены животные модели для изучения методов лечения, которые могут быть применены к донорам органов для лечения и/или сохранения органов до момента трансплантации 5,6,7,8.
Имитируя различные события, наблюдаемые в клинической практике, животные модели позволяют изучать связанные с ними патологические механизмы и соответствующие терапевтические подходы. Экспериментальная индукция этих явлений в большинстве единичных случаев привела к созданию экспериментальных моделей донорства органов и тканей, которые широко исследованы в научной литературе по трансплантации органов 6,7,8,9. В этих исследованиях используются различные методологические стратегии, такие как индуцирование смерти мозга (ББ), геморрагического шока (ГС) и циркуляторной смерти (БК), поскольку эти события связаны с различными вредными процессами, которые ставят под угрозу функциональность донорских органов и тканей.
Смерть мозга (BD)
БД связан с рядом событий, которые приводят к прогрессирующему износу различных систем. Обычно это происходит, когда происходит острое или постепенное повышение внутричерепного давления (ВЧД) из-за травмы головного мозга или кровоизлияния. Это повышение ВЧД способствует повышению артериального давления в попытке поддерживать стабильный мозговой кровоток в процессе, известном как рефлекс Кушинга10,11. Эти острые изменения могут привести к сердечно-сосудистым, эндокринным и неврологическим дисфункциям, которые ставят под угрозу количество и качество донорских органов, а также влияют на заболеваемость и смертность после трансплантации 10,11,12,13.
Геморрагический шок (ГГ)
ГГ, в свою очередь, часто ассоциируется с донорами органов, так как большинство из них являются жертвами травм со значительной потерей объема крови. Некоторые органы, такие как легкие и сердце, особенно уязвимы к ГГ из-за гиповолемии и последующей гипоперфузии тканей14. ГГ вызывает повреждение легких через повышенную проницаемость капилляров, отек и инфильтрацию воспалительных клеток, механизмы, которые вместе нарушают газообмен и приводят к прогрессирующему разрушению органов, что приводит к срыву процесса донорства 6,14.
Циркуляторная смерть (БК)
Использование пост-CD донорства растет в геометрической прогрессии в крупных мировых центрах, что способствует увеличению количества собранных органов. Органы, извлеченные от доноров после БК, уязвимы к эффектам теплой ишемии, которая возникает после интервала низкого (агоническая фаза) или отсутствия кровоснабжения (асистолическая фаза)8,15. Гипоперфузия или отсутствие кровотока приводит к тканевой гипоксии, связанной с резкой потерей АТФ и накоплением метаболических токсинов в тканях15. Несмотря на то, что в настоящее время они используются для трансплантации в клинической практике, остается много сомнений относительно влияния использования этих органов на качество посттрансплантационного трансплантата и на выживаемостьпациентов. Таким образом, использование экспериментальных моделей для лучшего понимания этиологических факторов, ассоциированных с БК, также растет 8,15,16,17.
Экспериментальные модели
Существуют различные экспериментальные модели донорства органов (BD, HS и CD). Тем не менее, исследования часто фокусируются только на одной стратегии за раз. Заметен пробел в исследованиях, которые объединяют или сравнивают две или более стратегий. Эти модели очень полезны при разработке методов лечения, направленных на увеличение числа донаций и, следовательно, сокращение списка потенциальных получателей помощи. Виды животных, используемые для этой цели, варьируются от исследования к исследованию, при этом модели свиней чаще выбираются, когда целью является более прямая трансляция морфофизиологии человека и меньшая техническая сложность хирургической процедуры из-за размера животного. Несмотря на преимущества, с моделью свиньи связаны логистические трудности и высокие затраты. С другой стороны, низкая стоимость и возможность биологических манипуляций благоприятствуют использованию моделей грызунов, позволяя исследователю отталкиваться от достоверной модели для воспроизведения и лечения поражений, а также интегрировать знания, полученные в области трансплантации органов.
Здесь мы представляем на грызунах модель смерти мозга, циркуляторной смерти и геморрагического шока. Описаны воспалительные процессы и патологические состояния, связанные с каждой из этих моделей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты на животных проводились в соответствии с требованиями Комитета по этике использования и ухода за экспериментальными животными медицинского факультета Университета Сан-Паулу (протокол No 112/16).
1. Группировка животных
- Случайным образом распределите двенадцать крыс-самцов Sprague Dawley (250-300 г) в одну из трех экспериментальных групп (n=4) для анализа и сравнения эффектов, связанных с животными моделями.
- Распределить животных в группу геморрагического шока (ГС, n=4): животные, подвергнутые катетеризации сосудов с индукцией геморрагического шока + поддержание в течение 360 мин + экстракция сердечно-легочной блокады + подготовка проб для анализа.
- Отнесите животных к группе смерти головного мозга (BD, n=4): животные, подвергшиеся смерти мозга + поддержание в течение 360 мин + экстракция сердечно-легочной блокады + подготовка проб для анализа.
- Отнесите животных к группе циркуляторной смерти (CD, n=4): животные, подвергнутые катетеризации сосудов + индукция циркуляторной смерти + приостановка вентиляции легких + ишемия при комнатной температуре в течение 180 мин + пробоподготовка к анализу.
2. Анестезия и предоперационная подготовка
- Поместите крысу в закрытую камеру с 5% изофлураном на 1 - 4 мин. Убедитесь в правильности анестезии, проверив рефлекс защемления пальцев ног. При отсутствии рефлекторных реакций (нет втягивания лапы) проводят оротрахеальную интубацию (ангиокат 14-G) с помощью детского ларингоскопа.
- С помощью предварительно настроенного аппарата искусственной вентиляции легких (FiO2 100%, дыхательный объем 10 мл/кг, 90 циклов/мин и PEEP 3,0 смH2O) подключите катетер трахеи к аппарату искусственной вентиляции легких и отрегулируйте концентрацию анестетика до 2%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, связанные с животными моделями, следовали одному и тому же протоколу анестезии, описанному в этом разделе. - Удалите шерсть с интересующих областей (голова, шея, грудь и живот). Затем с помощью марли продезинфицируют операционное поле и хвост животного. Дезинфекцию проводят тремя чередующимися циклами спиртового раствора хлоргексидина диглюконата скраба.
- Отрежьте кончик хвоста животного, положите большой и указательный пальцы на основание хвоста, а затем нажмите и отодвиньте их от основания. Соберите образец периферической крови (20 мкл) через хвост для общего количества лейкоцитов8.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура должна быть выполнена до начала трахеостомии и сразу в конце каждого протокола (BD и HS - через 360 мин). - С помощью прецизионной пипетки разведите собранную кровь в 380 мкл (1:20) раствора Турка (ледяная уксусная кислота 99%). После разбавления пипеткой поместите образец крови в камеру Нойбауэра и поместите его под микроскоп (40x). Выполните общий подсчет лейкоцитов в четырех боковых квадрантах камеры.
3. Трахеостомия
- С помощью соответствующих ножниц и щипцов выполняют продольное рассечение шейной трахеи, начиная от средней трети шеи до надгрудинной выемки (
разрез 1,5 см). После разреза кожи и подкожной клетчатки рассекают шейные мышцы до обнажения трахеи. - Поместите одну шелковую лигатуру 2-0 под трахею.
- С помощью микроножниц трахеостомируют верхнюю треть трахеи, чтобы добиться равномерной вентиляции. Горизонтально разрежьте трахею между двумя хрящевыми кольцами, чтобы вместить диаметр металлической канюли (3,5 см).
- Вставьте вентиляционную трубку и зафиксируйте ее подготовленными лигатурами.
- Подсоедините вентиляционную трубку к системе вентиляции мелких животных.
- Вентиляция легких крысы с дыхательным объемом 10 мл/кг, скоростью 70 циклов/мин и PEEP 3 смH2O.
разрез 1,5 см). После разреза кожи и подкожной клетчатки рассекают шейные мышцы до обнажения трахеи.4. Катетеризация бедренной артерии и вены
- Обнажают бедренный треугольник через небольшой разрез (1,5 см) в паховой области. Идентификация и изоляция бедренных сосудов. Для этой процедуры используют стереомикроскоп (3,2-кратное увеличение).
- Поместите две шелковые лигатуры 4-0 под кровеносные сосуды (вену или артерию), одну дистально, а другую проксимально. Закройте самую дистальную лигатуру, затем поместите предварительно отрегулированный узел в проксимальную лигатуру и потяните.
- Введите катетер через небольшой, предварительно сформированный разрез в сосудах. Зафиксируйте канюлю, чтобы избежать вывиха.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изготовьте катетеры из 20-сантиметрового неонатального экстендера, приваренного путем нагревания, к периферическому внутривенному катетеру в соответствии с калибром венозной сети животного, тем самым предотвращая срыгивание содержимого крови. Смажьте канюлю гепарином, избегая образования тромбов и осложнений при измерении среднего артериального давления (MAP). - Подключите артериальный катетер к датчику давления и системе мониторинга жизненно важных показателей для регистрации среднего артериального давления (MAP). Датчик должен располагаться на уровне сердца животного. Записывайте MAP каждые 10 минут.
- Поместите шприцевой катетер (3 мл) в вену, стремясь при необходимости к гидратации и обескровливанию.
5. Индукция геморрагического шока
- Через венозный доступ и с помощью гепаринизированного шприца удаляют небольшие объемы крови до достижения значений MAP 50 мм рт.ст., устанавливая таким образом геморрагический шок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Собирайте 2 мл аликвоты крови каждые 10 минут в первый час эксперимента и каждые 30 минут в последующие часы. - Поддерживайте стабильное давление на уровне около 50 мм рт.ст. в течение 360 минут. Для этого удаляют или добавляют аликвоты крови, если давление повышается или снижается соответственно.
- Поставьте рядом источник тепла, чтобы избежать переохлаждения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используется тепловая лампа. - В конце протокола соберите легочную блокаду при общей емкости легких (TLC) и либо мгновенно заморозьте ее в жидком азоте, либо поместите в фиксирующий раствор для дальнейших исследований.
ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью аппарата искусственной вентиляции легких для мелких животных можно получить доступ к параметрам вентиляции во время протокола. В настоящем исследовании эти параметры оценивали непосредственно перед индукцией ГГ (исходный уровень) и через 360 мин (заключительный).
6. Индукция смерти в кровообращении
- Чтобы вызвать смерть кровообращения, вводят тиопентал натрия в дозе 150 мг/кг через венозный катетер. Затем отключите систему вентиляции.
- Обратите внимание на прогрессирующее снижение MAP до тех пор, пока он не достигнет 0 мм рт.ст. С этого момента рассмотрим начало периода теплой ишемии и начнем отсчет времени. Животное должно оставаться при комнатной температуре (примерно 22 °C) в течение 180 минут.
- По окончании протокола повторно подключите легкие к аппарату искусственной вентиляции легких и соберите легочную блокаду в TLC для сбора. Либо мгновенно замораживают с использованием жидкого азота, либо помещают в фиксирующий раствор для дальнейших исследований.
7. Индукция смерти мозга
- Поместите крысу в положение лежа.
- Снимите кожу с черепа с помощью хирургических ножниц. Пробурите скважину калибром 1 мм 2,80 мм спереди и 10,0 мм вентрально до брегмы и 1,5 мм латеральнее сагиттального шва.
- Введите весь баллонный катетер в полость черепа и убедитесь, что баллон предварительно заполнен физиологическим раствором (500 мкл).
- С помощью шприца быстро надуйте катетер.
- Подтвердите смерть мозга, наблюдая резкое повышение MAP (рефлекс Кушинга), отсутствие рефлексов, двусторонний мидриаз и апноэ. После подтверждения прекратить анестезию и держать животное на искусственной вентиляции легких в течение 360 мин.
- Поставьте рядом источник тепла, чтобы избежать переохлаждения.
- В конце протокола соберите легочную блокаду в ТСХ для сбора и либо мгновенно заморозьте в жидком азоте, либо поместите ее в фиксирующий раствор для дальнейших исследований.
ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью аппарата искусственной вентиляции легких для мелких животных можно получить доступ к параметрам вентиляции во время протокола. В настоящем исследовании мы оценивали эти параметры непосредственно перед индукцией БД (исходный уровень) и через 360 минут (заключительный).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Среднее артериальное давление (MAP)
Для определения гемодинамических последствий ББ и ГГ MAP оценивали в течение 360 минут протокола. Исходное измерение проводилось после удаления кожи и сверления черепа, а также перед забором аликвот крови у животных, подвергшихся ББ или ГС, соответственно. До индукции БД и ГГ исходный уровень MAP в обеих группах был одинаковым (БД: 110,5 ± 6,1 против ГГ: 105,8 ± 2,3 мм рт.ст.; p=0,5; двусторонняя ANOVA). После катетерной инсуффляции в группе БД наблюдалось резкое повышение уровня артериального давления (138,7 ± 10,1 мм рт. ст.). Гипертонический пик является своеобразным событием, связанным с повышением внутричерепного давления и может рассматриваться как первое свидетельство установления ББ. Кроме того, мы наблюдали отсутствие рефлексов, двусторонний мидриаз и постинфляционное апноэ у всех животных. Этот пик давления сопровождался быстрым снижением MAP (10 мин - 81,2 ± 10 мм рт.ст.). Гипотензия сохранялась в течение примерно 50 мин, после чего уровни MAP возвращались к значениям, близким к исходным (120 мин - 120,7 ± 7,5 мм рт. ст.) (рис. 1).
В отличие от группы БД, снижение MAP в группе ГС связано с выводом аликвот крови в первые 10 мин эксперимента. Гиповолемический шок сохранялся в течение 360 мин (среднее изменение по протоколу 52,3 ± 1,2 мм рт.ст.). После окончания протокола в группе БД наблюдалась достоверно отличающаяся картина MAP по сравнению с 6-часовым периодом наблюдения из группы ГГ (ББ: 93,7 ± 4,5 против ГГ: 52,3 ± 0,5 мм рт.ст.; p<0,0001; t-тест Стьюдента).
Механика легких
Для оценки эластических и резистивных параметров дыхательной системы был проведен анализ механики легких животных, подвергшихся БД и ГС. Через 360 мин после начала заболевания и после поддержания гипотензии в группе ГГ отмечалось повышение резистентности легочной ткани (G) (HS: исходный уровень - 0,26 ± 0,02 против конечного - 0,51 ± 0,05 смH2O).мл-1; р=0,03; двусторонний ANOVA), за которым последовало снижение податливости дыхательной системы (Crs) (HS: исходный уровень - 0,64 ± 0,05 против конечного - 0,23 ± 0,004 смН2O/мл; p=0,001; двусторонний ANOVA) (рис. 2A,B).
Отек легких
В конце протокола была собрана средняя доля правого легкого для всех групп, и ее вес был измерен для анализа соотношения влажной и сухой массы, которое использовалось в качестве индекса отека легких. Влажный вес оценивали сразу после извлечения органа, а сухой вес измеряли через 24 ч в печи с температурой 80 °C. Согласно этому соотношению в группе БД (2,32 ± 0,1) отек был больше, чем в группах ГС (1,97 ± 0,03) и БК (2,04 ± 0,02) (рис. 3).
Системные и тканевые воспалительные параметры
В конце протокола отмечено достоверное увеличение общего количества системных лейкоцитов в группе, перенесшей ГГ (исходный уровень - 13888 ± 887,3 против конечного - 35263 ± 4076мм3; p=0,0189); двусторонний ANOVA) (рис. 4). В группе ГС также наблюдалось увеличение количества лейкоцитов как по сравнению с исходными значениями, так и по отношению к группе БД (р = 0,0132).
Воспаление тканей оценивали путем количественного определения маркеров воспаления в легочной ткани. Для этого образцы биопсии легочной ткани гомогенизировали в фосфатном буфере, а затем отправляли на анализ на экспрессию фактора некроза опухоли альфа (ФНО-α) и интерлейкина 1 бета (IL1-β). Уровни экспрессии IL1-β были выше в группе БД (304,4 ± 91 пг/мг) и ГС (327,5 ± 25,2 пг/мг), чем в группе БК (8 ± 2,3 пг/мг; p=0,004; односторонний ANOVA) (рис. 5Б). В группе ГС также выявлены более высокие уровни ФНО-α (4,7 ± 0,3 пг/мг; р<0,0001; односторонний ANOVA), чем в группе BD (1,3 ± 0,3 пг/мг) и группе CD (0,4 ± 0,2 пг/мг) (рис. 5B).
Рисунок 1: Динамика среднего артериального давления (MAP) в группах смерти головного мозга (BD) и геморрагического шока (HS). Значения для всех измерений выражаются в виде средних значений ± стандартных ошибок средних значений (SEM). MAP, среднее артериальное давление; BD, смерть мозга; ГГ, геморрагический шок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Механика легких. Механика легких, определяемая по (А) податливости дыхательной системы и (Б) тканевой резистентности в группе смерти головного мозга (БД) и группе геморрагического шока (ГС). * указывает на достоверные различия между исходным и конечным значениями в группе ГС (<0,05). Значения для всех измерений выражены в виде средних ± стандартных ошибок средних (SEM), а для сравнений использовалась двусторонняя ANOVA. Crs, податливость дыхательной системы; G, сопротивление тканей; BD, смерть мозга; ГГ, геморрагический шок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Отек легких, определяемый соотношением массы легких к сухому весу в группе смерти головного мозга (БД) и группе геморрагического шока (ГС). Значения для всех измерений выражены в виде средних ± стандартных ошибок средних (SEM), а сравнения проводились с односторонней ANOVA. BD, смерть мозга; ГГ, геморрагический шок; БК, циркуляторная смерть. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Лейкограмма группы геморрагического шока (ГГ) и группы смерти головного мозга (ББ). * указывает на достоверные различия между исходными и конечными значениями в группе ГС (стр<0,05). Значения для всех измерений выражены в виде средних ± стандартных ошибок среднего значения (SEM), а сравнения проводились с помощью двусторонней ANOVA. BD, смерть мозга; ГГ, геморрагический шок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Местные воспалительные реакции были менее выражены в группе циркуляторной смертности (БК). (A) экспрессия IL-1β в легочной ткани; (B) Экспрессия TNF-α в легочной ткани. Значения для всех измерений выражены в виде средних ± стандартных ошибок среднего значения (SEM), а сравнения проводились с помощью одностороннего ANOVA. BD, смерть мозга; ГГ, геморрагический шок; БК, циркуляторная смерть. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В последние годы растущее число диагнозов смерти мозга привело к тому, что он стал крупнейшим поставщиком органов и тканей, предназначенных для трансплантации. Этот рост, однако, сопровождался невероятным увеличением числа доноров после смерти от кровообращения. Несмотря на многофакторный характер, большинство пусковых механизмов причин смерти начинаются после травмы или сопровождают ее обширной потерей содержания крови 4,18.
В этом контексте экспериментальные модели смерти головного мозга, остановки кровообращения и геморрагического шока являются важными инструментами для проспективного изучения осложнений, связанных с причиной смерти донора и их влияния на жизнеспособность потенциальных органов, предназначенных для трансплантации 6,8,10. Для создания модели было предложено несколько линий животных, таких как свиньи, кролики, крысы и мыши. Модели на крысах и мышах более распространены в литературе, поскольку они не очень дороги и не требуют больших логистических сложностей, в то же время удовлетворительно воспроизводя патофизиологические события, описанные в исследовании 8,13,14,15.
Мы хотели бы подчеркнуть, что недавние рекомендации и исследования одобрили использование преднаркозной анальгезии в качестве неотъемлемой части хирургических протоколов, даже в острых ситуациях, с целью более комплексного лечения периоперационной боли и благополучия животных. Мы рекомендуем исследователям оценить такой подход в будущих исследованиях.
Смерть мозга (BD)
Установлено, что модель BD воспроизводима за счет резкого увеличения ВЧД. Использование соответствующих инструментов и обученного персонала позволяет добиться успеха хирургического вмешательства и воспроизвести технику за несколько недель обучения. Во время освоения техники BD трепанацию следует выполнять соответствующей моторизованной дрелью, чтобы не было слабины в катетере, тем самым предотвращая проекцию мозговой ткани из отверстия. Кроме того, во время сверления поступательное движение сверла должно быть остановлено, как только будет преодолено первоначальное сопротивление черепа.
Исследователи должны сохранять бдительность и обеспечить быстрое надувание катетера, поскольку постепенное надувание способствует отчетливым воспалительным и гемодинамическим реакциям21. Изменения артериального давления, в свою очередь, должны контролироваться постоянно на протяжении всего протокола, особенно во время катетерной инсуффляции, которая должна сопровождаться резким повышением MAP и в течение первого часа после установления БД (период постинфляционной гипотензии). Эти результаты согласуются с литературными данными, которые показывают установление гипертензивного пика сразу после катетерной инсуффляции с последующим снижением уровня давления, что является вероятной реакцией на преходящее повышение уровня циркулирующих катехоламинов22.
Содержание животного в БД в течение длительного периода времени может привести к гипотензии с последующей циркуляторной смертью, что делает эксперимент неосуществимым. Соответственно, большинство протоколов, используемых в литературе, устанавливают период наблюдения, который варьируется от 4 до 6 часов, после чего необходимо ввести вазоактивные препараты 12,13,21,22,23.
Помимо гемодинамических изменений, инфаркт и ишемия мозга способствуют усилению системной циркуляции провоспалительных факторов, которые, достигая легких, способствуют повреждению паренхимы легких 24,25,26.
В нашем исследовании ББ сопровождалась достоверным увеличением экспрессии тканевого IL-1β (по сравнению с CD) и соотношения влажной/сухой массы, индекса отека легких. Предыдущие исследования показали увеличение циркулирующих уровней провоспалительных цитокинов после ББ, что в конечном итоге может способствовать модуляции экспрессии молекул адгезии, увеличению проницаемости сосудов и последующей миграции лейкоцитов 27,28,29,30.
Геморрагический шок (ГГ)
Установленная путем отмены или рефузии аликвот крови с целью длительного поддержания гипотензии (≤ 50 мм рт. ст.), модель ГГ с фиксированным давлением направлена на имитацию уменьшения объема крови, вызванного геморрагическим процессом, и, следовательно, ослабления системного давления наполнения. Эти явления приводят к снижению MAP, сопровождающемуся снижением перфузионного давления в легких31,32.
Среди преимуществ данной модели ГС – возможность контроля степени и продолжительности гипотензии, а также большая воспроизводимость методики по сравнению с моделями, основанными на префиксном объеме крови. Соответственно, большинство протоколов, используемых в литературе, устанавливают протокольный период, который варьируется от 15 мин до более чем 180 мин, со средним уровнем артериального давления в пределах 20-55 мм рт.ст., в зависимости от анализа, выбранного в исследовании 6,32. В настоящем исследовании гипотензия сохранялась в течение 3 часов, что приводило к повышению тканевой резистентности с последующей податливостью легких у животных, подвергшихся ГГ. Подтверждая это, различные исследования в литературе указывают на пропорциональную зависимость между временем, проведенным в ГГ, и влиянием гиповолемии на сопротивление дыхательных путей и податливость легких 6,33,34.
Кроме того, в настоящем исследовании ГГ сопровождался выраженным лейкоцитозом и повышенной тканевой экспрессией IL-1β (по отношению к CD) и TNF-α. Повреждение эндотелия легочного микроциркуляторного русла, индуцированное высвобождением активных форм кислорода из первичного процесса гипоксии и установившейся ишемии, повысит проницаемость сосудов, что вместе с повышением давления в легочной артерии будет выступать хемотаксическим фактором для лейкоцитов и последующим высвобождением медиаторов воспаления 6,20,31,35,36, С. 37,38.
Циркуляторная смерть (БК)
Основным различием между маргинальными трансплантатами, происходящими из процессов БД и КД, является время теплой ишемии (ВИТ), которому будет подвергнут трансплантат, определяемое некоторыми исследователями как время между отсутствием периферических импульсов и прерыванием кровотока из-за удаления средств жизнеобеспечения до холодной или регионарной перфузии органа17, 39,40.
В настоящем исследовании органы и ткани животных, полученных из модели CD, подвергались периоду WIT продолжительностью 180 минут. Несколько исследований в литературе выявили пропорциональную связь между ВИТ и посттрансплантационной дисфункцией, предполагая, что время ишемии должно варьироваться в зависимости от особенностей и целостности каждого органа. В этом контексте было показано, что трансплантаты легких крыс переносят до 3-часовых периодов теплой ишемии41,42.
При наличии признаков повреждения тканей, вызванного преобладающей симпатической фазой, гемодинамической нестабильности и системного воспаления, возникающего в результате процесса ББ, донорство после остановки кровообращения было пересмотрено как потенциальная стратегия снижения осложнений, связанных с трансплантацией 41,42,43. В этом смысле наши данные свидетельствуют о резком снижении уровней IL-1β и TNF-α в модели CD по сравнению с двумя другими изученными моделями. Подтверждая это, Iskender et al.4 отметили низкие уровни тканевых цитокинов в модели реперфузии легких у крыс с тканями, донорскими после WIT с помощью механизмов, которые до сих пор плохо изучены.
Исходя из вышеизложенного, выбор методологии и ее адаптации должны зависеть от задач, разработанных исследователем. После того, как эти цели определены, они должны определять тип модели донорства, время протокола и анализы, которые необходимо выполнить. Также можно соотнести тип донорства с животными моделями восстановления легких и реперфузии.
Выводы
В заключение, описанные здесь модели донорских органов являются потенциальными инструментами в изучении изменений, связанных с различными методологиями забора трансплантатов, и могут предоставить средства, с помощью которых можно получить полное понимание влияния качества этих органов на результаты после трансплантации, учитывая воспроизводимость и надежность представленных здесь методологий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Мы хотели бы подтвердить, что в связи с данной публикацией отсутствуют какие-либо известные конфликты интересов и что эта работа не получила существенной финансовой поддержки, которая могла бы повлиять на ее результат.
Acknowledgments
Мы благодарим FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) за предоставленную финансовую поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14-gauge angiocath | DB | 38186714 | Orotracheal intubation |
| 2.0-silk | Brasuture | AA553 | Tracheal tube fixation |
| 24-gauge angiocath | DB | 38181214 | Arterial and venous access |
| 4.0-silk | Brasuture | AA551 | Fixation of arterial and venous cannulas |
| Alcoholic chlorhexidine digluconate solution (2%). | Vic Pharma | Y/N | Asepsis |
| Trichotomy apparatus | Oster | Y/N | Clipping device |
| Precision balance | Shimadzu | D314800051 | Analysis of the wet/dry weight ratio |
| Barbiturate (Thiopental) | Cristália | 18080003 | DC induction |
| Balloon catheter (Fogarty-4F) | Edwards Life Since | 120804 | BD induction |
| Neonatal extender | Embramed | 497267 | Used as catheters with the aid of the 24 G angiocath |
| FlexiVent | Scireq | 1142254 | Analysis of ventilatory parameters |
| Heparin | Blau Farmaceutica SA | 7000982-06 | Anticoagulant |
| Isoflurane | Cristália | 10,29,80,130 | Inhalation anesthesia |
| Micropipette (1000 µL) | Eppendorf | 347765Z | Handling of small- volume liquids |
| Micropipette (20 µL) | Eppendorf | H19385F | Handling of small- volume liquids |
| Microscope | Zeiss | 1601004545 | Assistance in the visualization of structures for the surgical procedure |
| Multiparameter monitor | Dixtal | 101503775 | MAP registration |
| Motorized drill | Midetronic | MCA0439 | Used to drill a 1 mm caliber borehole |
| Neubauer chamber | Kasvi | D15-BL | Cell count |
| Pediatric laryngoscope | Oxygel | Y/N | Assistance during tracheal intubation |
| Syringe (3 mL) | SR | 3330N4 | Hydration and exsanguination during HS protocol |
| Pressure transducer | Edwards Life Since | P23XL | MAP registration |
| Metallic tracheal tube | Biomedical | 006316/12 | Rigid cannula for analysis with the FlexiVent ventilator |
| Isoflurane vaporizer | Harvard Bioscience | 1,02,698 | Anesthesia system |
| Mechanical ventilator for small animals (683) | Harvard Apparatus | MA1 55-0000 | Mechanical ventilation |
| xMap methodology | Millipore | RECYTMAG-65K-04 | Analysis of inflammatory markers |
References
- Paterno, F., et al. Clinical implications of donor warm and cold ischemia time in donor after circulatory death liver transplantation. Liver Transplantation. 25 (9), 1342-1352 (2019).
- Yusen, R. D., et al. The registry of the International Society for heart and lung transplantation: thirty-third adult lung and heart-lung transplant report-2016; focus theme: primary diagnostic indications for transplant. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (10), 1170-1184 (2016).
- Jung, H. Y., et al. Comparison of transplant outcomes for low-level and standard-level tacrolimus at different time points after kidney transplantation. Journal of Korean Medical Science. 34 (12), e103 (2019).
- Cypel, M., et al. The International Society for heart and lung transplantation donation after circulatory death registry report. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 34 (10), 1278-1282 (2015).
- Drake, M., Bernard, A., Hessel, E.
- Nepomuceno, N. A., et al. Effect of hypertonic saline in the pretreatment of lung donors with hemorrhagic shock. Journal of Surgical Research. 225, 181-188 (2018).
- Menegat, L., et al. Evidence of bone marrow downregulation in brain-dead rats. International Journal of Experimental Pathology. (3), 158-165 (2017).
- Iskender, I., et al. Effects of warm versus cold ischemic donor lung preservation on the underlying mechanisms of injuries during ischemia and reperfusion. Transplantation. (5), 760-768 (2018).
- Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo perfusion prevents lung injury compared to extended cold preservation for transplantation. American Journal of Transplantation. 9 (10), 2262-2269 (2009).
- Wauters, S., et al. Evaluating lung injury at increasing time intervals in a murine brain death model. Journal of Surgical Research. 183 (1), 419-426 (2013).
- Smith, M. Physiologic changes during brain stem death--lessons for management of the organ donor. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 23 (9), S217-S222 (2004).
- Belhaj, A., et al. Mechanical versus humoral determinants of brain death-induced lung injury. PLoS One. 12 (7), e0181899 (2017).
- Kolkert, J. L., et al. The gradual onset brain death model: a relevant model to study organ donation and its consequences on the outcome after transplantation. Laboratory Animals. 41 (3), 363-371 (2007).
- Rocha-E-Silva, M. Cardiovascular effects of shock and trauma in experimental models: A review. Revista Brasileira de Cirurgia Cardiovascular. 31 (1), 45-51 (2016).
- Manara, A. R., Murphy, P. G., O'Callaghan, G.
- Dhital, K. K., et al. Adult heart transplantation with distant procurement and ex-vivo preservation of donor hearts after circulatory death: a case series. The Lancet. 385 (9987), 2585-2591 (2015).
- Boucek, M. M., et al. Pediatric heart transplantation after declaration of cardiocirculatory death. The New England Journal of Medicine. 359 (7), 709-714 (2008).
- Kramer, A. H., Baht, R., Doig, C. J. Time trends in organ donation after neurologic determination of death: a cohort study. CMAJ Open. 5 (1), E19-E27 (2017).
- Reino, D. C., et al. Trauma hemorrhagic shock-induced lung injury involves a gut-lymph-induced TLR4 pathway in mice. PLoS One. 6 (8), e14829 (2011).
- Pascual, J. L., et al. Hypertonic saline resuscitation of hemorrhagic shock diminishes neutrophil rolling and adherence to endothelium and reduces in vivo vascular leakage. Annals of Surgery. 236 (5), 634-642 (2002).
- Van Zanden, J. E., et al. Rat donor lung quality deteriorates more after fast than slow brain death induction. PLoS One. 15 (11), e0242827 (2020).
- Shivalkar, B., et al. Variable effects of explosive or gradual increase of intracranial pressure on myocardial structure and function. Circulation. 87 (1), 230-239 (1993).
- López-Aguilar, J., et al. Massive brain injury enhances lung damage in an isolated lung model of ventilator-induced lung injury. Critical Care Medicine. 33 (5), 1077-1083 (2005).
- Catania, A., Lonati, C., Sordi, A., Gatti, S. Detrimental consequences of brain injury on peripheral cells. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (7), 877-884 (2009).
- McKeating, E. G., Andrews, P. J., Mascia, L. Leukocyte adhesion molecule profiles and outcome after traumatic brain injury. Acta Neurochirurgica Supplement. 71, 200-202 (1998).
- Ott, L., McClain, C. J., Gillespie, M., Young, B. Cytokines and metabolic dysfunction after severe head injury. Journal of Neurotrauma. 11 (5), 447-472 (1994).
- Avlonitis, V. S., Wigfield, C. H., Kirby, J. A., Dark, J. H. The hemodynamic mechanisms of lung injury and systemic inflammatory response following brain death in the transplant donor. American Journal of Transplantation. 5 (4), 684-693 (2005).
- De Jesus Correia, C., et al. Hypertonic saline reduces cell infiltration into the lungs after brain death in rats. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 61, 101901 (2020).
- Kalsotra, A., Zhao, J., Anakk, S., Dash, P. K., Strobel, H. W. Brain trauma leads to enhanced lung inflammation and injury: evidence for role of P4504Fs in resolution. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 27 (5), 963-974 (2007).
- Simas, R., Zanoni, F. L., Silva, R., Moreira, L. F. P. Brain death effects on lung microvasculature in an experimental model of lung donor. Journal Brasileiro de Pneumologia. 46 (2), e20180299 (2020).
- Moore, K. The physiological response to hemorrhagic shock. Journal of Emergency Nursing. 40 (6), 629-631 (2014).
- Fülöp, A., Turóczi, Z., Garbaisz, D., Harsányi, L., Szijártó, A. Experimental models of hemorrhagic shock: a review. European Surgical Research. 50 (2), 57-70 (2013).
- Hillen, G. P., Gaisford, W. D., Jensen, C. G. Pulmonary changes in treated and untreated hemorrhagic shock. I. Early functional and ultrastructural alterations after moderate shock. The American Journal of Surgery. 122 (5), 639-649 (1971).
- Sprung, J., Mackenzie, C. F., Green, M. D., O'Dwyer, J., Barnas, G. M. Chest wall and lung mechanics during acute hemorrhage in anesthetized dogs. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 11 (5), 608-612 (1997).
- Liu, X., et al. Inhibition of BTK protects lungs from trauma-hemorrhagic shock-induced injury in rats. Molecular Medicine Reports. 16 (1), 192-200 (2017).
- Maeshima, K., et al. Prevention of hemorrhagic shock-induced lung injury by heme arginate treatment in rats. Biochemical Pharmacology. 69 (11), 1667-1680 (2005).
- Gao, J., et al. Effects of different resuscitation fluids on acute lung injury in a rat model of uncontrolled hemorrhagic shock and infection. The Journal of Trauma. 67 (6), 1213-1219 (2009).
- Wohlauer, M., et al. Nebulized hypertonic saline attenuates acute lung injury following trauma and hemorrhagic shock via inhibition of matrix metalloproteinase-13. Critical Care Medicine. 40 (9), 2647-2653 (2012).
- Morrissey, P. E., Monaco, A. P. Donation after circulatory death: current practices, ongoing challenges, and potential improvements. Transplantation. 97 (3), 258-264 (2014).
- Snell, G. I., Levvey, B. J., Levin, K., Paraskeva, M., Westall, G. Donation after brain death versus donation after circulatory death: lung donor management issues. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 39 (2), 138-147 (2018).
- Iskender, I., et al. Effects of warm versus cold ischemic donor lung preservation on the underlying mechanisms of injuries during ischemia and reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
- Yamamoto, S., et al. Activations of mitogen-activated protein kinases and regulation of their downstream molecules after rat lung transplantation from donors after cardiac death. Transplantation Proceedings. 43 (10), 3628-3633 (2011).
- Kang, C. H., et al. Transcriptional signatures in donor lungs from donation after cardiac death vs after brain death: a functional pathway analysis. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 30 (3), 289-298 (2011).
