Overvågning i realtid af mitokondriel respiration i cytokindifferentierede humane primære T-celler
Summary
Metabolisk tilpasning er grundlæggende for T-celler, da det dikterer differentiering, persistens og cytotoksicitet. Her præsenteres en optimeret protokol til overvågning af mitokondriel respiration i ex vivo cytokindifferentierede humane primære T-celler.
Abstract
Under aktivering tilpasser metabolismen af T-celler sig til ændringer, der påvirker deres skæbne. En stigning i mitokondriel oxidativ phosphorylering er uundværlig for T-celleaktivering, og overlevelsen af hukommelse T-celler er afhængig af mitokondriel ombygning. Dette påvirker derfor det langsigtede kliniske resultat af kræftimmunterapier. Ændringer i T-cellekvalitet studeres ofte ved flowcytometri ved hjælp af velkendte overflademarkører og ikke direkte ved deres metaboliske tilstand. Dette er en optimeret protokol til måling af mitokondriel respiration i realtid af primære humane T-celler ved hjælp af en ekstracellulær fluxanalysator og cytokinerne IL-2 og IL-15, som forskelligt påvirker T-cellemetabolismen. Det er vist, at T-cellernes metaboliske tilstand klart kan skelnes ved at måle iltforbruget, når de hæmmer nøglekomplekser i den metaboliske vej, og at nøjagtigheden af disse målinger er meget afhængig af optimal inhibitorkoncentration og inhibitorinjektionsstrategi. Denne standardiserede protokol vil hjælpe med at implementere mitokondriel respiration som en standard for T-celle fitness i overvågning og undersøgelse af kræftimmunterapier.
Introduction
Korrekt T-celleudvikling og -funktion er afgørende for immunsystemets evne til at genkende og reagere på antigener. Mitokondriel oxidativ phosphorylering (OxPhos) ændres i henhold til T-cellens tilstand. Naive T-celler bruger overvejende OxPhos til at producere ATP, mens aktiverede T-celler gennemgår en metabolisk overgang, hvor glykolyse bliver dominerende1. Efter effektorfasen vender den lille resterende delmængde af hukommelseS-T-celler tilbage til en metabolisk tilstand domineret af OxPhos2,3. Ændringerne af OxPhos følger differentieringen af T-celler i en sådan grad, at selv delmængder af T-celler kan differentieres ved deres specifikke er OxPhos egenskaber1. Omvendt er OxPhos vigtig for T-cellernes funktion, og hæmning af OxPhos har vist sig at blokere for spredning og cytokinproduktion af T-celler4. Derfor er evnen til at kvantificere egenskaberne af T-celle OxPhos på en præcis og reproducerbar måde et kraftfuldt værktøj for alle, der arbejder med T-celler.
I denne protokol måles egenskaberne af T-celle OxPhos ved hjælp af en ekstracellulær fluxanalysator. Kernefunktionen i denne analysator er kontinuerligt at måle iltindholdet i vækstmediet i de celler, der skal analyseres. Ilt fjernet fra vækstmediet antages at blive optaget af cellerne. Ved at behandle cellerne med en række OxPhos-hæmmere eller modifikatorer er et fald i iltoptagelsen forbundet med den hæmmede eller modulerede funktion. For eksempel vil hæmning af ATP-syntasen føre til en reduceret cellulær optagelse af ilt, som ellers ville blive brugt til at producere ATP ved oxidativ phosphorylering. Andet udstyr, herunder Clark-elektroden og Oroboros-instrumentet, tilbyder lignende funktionalitet, og hvert instrument har forskellige fordele og mangler. En bred vifte af celletyper kan bruges til undersøgelser i disse enheder, men en særlig udfordrende celletype er humane primære T-lymfocytter5. På grund af deres lille størrelse, dårlig overlevelse ex vivo og ikke-klæbende egenskaber kan humane primære T-celler være udfordrende at studere.
Dette er en protokol til undersøgelse af mitokondriel respiration af humane primære T-celler af en ekstracellulær analysator. Protokollen er opdelt i et optimeringsløb, hvor optimale koncentrationer af celletal pr. brønd samt den optimale koncentration af oligomycin og FCCP bestemmes. Desuden et Assay-løb, hvor de optimerede betingelser anvendes.
Ved hjælp af blodafledte humane PBMC’er og ex vivo primære T-cellekulturer demonstrerer denne protokol vigtigheden af optimal inhibitorkoncentration og relevansen af at anvende separat i stedet for en sekventiel injektion af mitokondrielle hæmmere, når man arbejder med følsomme celletyper. Endelig er det påvist, at dette assay robust kan detektere subtile forskelle i mitokondriel respiration ved polarisering med cytokiner IL-2 og IL-15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detaljeret og korrekt kvantificering af oxidativ phosphorylering er et uundværligt værktøj til beskrivelse af T-cellers energitilstande. Tilstanden af mitokondriel kondition kan være direkte relateret til T-celleaktiveringspotentiale, overlevelse og differentiering1,5. Med denne protokol er det muligt at bestemme de forskellige egenskaber ved oxidativ phosphorylering (se tabel 4 for en detaljeret forklaring). Præcis kvantificering af disse e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kasper Mølgaard og Anne Rahbech modtog legater fra Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat. Kasper Mølgaard modtog også en bevilling fra Børnecancerfonden.
Materials
| 24-well tissue culture plate | Nunc | 142485 | |
| Anti-CD3xCD28 beads | Gibco | 11161D | |
| Antimycin A | Merck | A8674 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | For coating |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D9170 | |
| Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| IL-15 | Peprotech | 200-02 | |
| IL-2 | Peprotech | 200-15 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 07801 | |
| Oligomycin | Merck | O4876 | |
| PBS | Thermo Fisher | 10010023 | |
| RPMI 1640 | Gibco-Thermo Fisher | 61870036 | |
| Seahorse Calibrant | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose solution | Agilent Technologies | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pytuvate solution | Agilent Technologies | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine solution | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Seahorse XF RPMI medium, pH7.4 | Agilent Technologies | 103576-100 | XF RPMI media |
| Seahorse XFe96 Analyser | Agilent Technologies | Flux analyzer | |
| Seahorse XFe96 cell culture microplates | Agilent Technologies | 102416-100 | XF cell culture plate |
| Seahorse XFe96 sensor cartridge | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3) | Sigma Aldrich | 36486 | |
| Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH) | Sigma Aldrich | S2770-100ML | |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | |
| T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| Seahorse wave | Flux analyzer software |
References
- vander Windt, G. J. W., et al. Mitochondrial respiratory capacity is a critical regulator of CD8+ T cell memory development. Immunity. 36 (1), 68-78 (2012).
- Krauss, S., Brand, M. D., Buttgereit, F. Signaling takes a breath–new quantitative perspectives on bioenergetics and signal transduction. Immunity. 15 (4), 497-502 (2001).
- vander Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336-14341 (2013).
- Chang, C. -. H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
- vander Windt, G. J. W., Chang, C. -. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Current Protocols in Immunology. 113, 1-14 (2016).
- Buck, M. D., O’Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Rivadeneira, D. B., Delgoffe, G. M. Antitumor T-cell reconditioning: Improving metabolic fitness for optimal cancer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2473-2481 (2018).
- Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
- Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).
- Alizadeh, D., et al. IL15 enhances CAR-T cell antitumor activity by reducing mTORC1 activity and preserving their stem cell memory phenotype. Cancer Immunology Research. 7 (5), 759-772 (2019).
