Summary
该协议提出了放射性标记的氨基酸摄取测定，这对于评估原代细胞或分离骨骼中的氨基酸消耗是有用的。
Abstract
骨发育和稳态取决于骨形成成骨细胞的分化和活性。成骨细胞分化依次表现为增殖，然后是蛋白质合成，最终是骨基质分泌。增殖和蛋白质合成需要持续供应氨基酸。尽管如此，对成骨细胞中氨基酸的消耗知之甚少。在这里，我们描述了一种非常敏感的方案，旨在使用放射性标记的氨基酸测量氨基酸消耗。该方法经过优化，可量化与成骨细胞增殖或分化、药物或生长因子治疗或各种遗传操作相关的氨基酸摄取变化。重要的是，该方法可以互换用于量化体外培养细胞系或原代细胞或体外分离骨干中的氨基酸消耗。最后，我们的方法可以很容易地适应测量任何氨基酸以及葡萄糖和其他放射性标记营养素的转运。
Introduction
氨基酸是含有氨基（-NH2）和羧基（-COOH）官能团的有机化合物，具有特定于每个氨基酸的可变侧链。一般来说，氨基酸是众所周知的蛋白质的基本成分。最近，氨基酸的新用途和功能已被阐明。例如，单个氨基酸可以被代谢以产生中间代谢物，这些代谢物有助于生物能量学，作为酶促辅因子，调节活性氧或用于合成其他氨基酸1，2，3，4，5，6，7，8，9，10.许多研究表明，氨基酸代谢对于各种情况下的细胞多能性、增殖和分化至关重要3，6，11，12，13，14，15，16，17。
成骨细胞是产生和分泌富含1型胶原蛋白的细胞外骨基质的分泌细胞。为了在骨形成过程中维持高速率的蛋白质合成，成骨细胞需要持续的氨基酸供应。为了满足这一需求，成骨细胞必须积极获取氨基酸。与此一致，最近的研究揭示了氨基酸摄取和代谢在成骨细胞活性和骨形成中的重要性15，16，17，18，19，20。
成骨细胞从三个主要来源获取细胞氨基酸：细胞外环境、细胞内蛋白质降解和新生氨基酸生物合成。该协议将侧重于评估来自细胞外环境的氨基酸摄取。测量氨基酸摄取的最常见方法依赖于放射性标记（例如，3H或14C）或重同位素标记（例如，13C）氨基酸。重同位素体测定可以更彻底、更安全地分析氨基酸的摄取和代谢，但更耗时，需要数天才能完成，因为制备和衍生化样品需要一天的时间，在质谱仪上分析需要多天，具体取决于样品的数量 21，22。相比之下，放射性标记的氨基酸摄取测定不能提供有关下游代谢的信息，但价格便宜且相对较快，能够在实验开始后2-3小时内完成23，24。在这里，我们描述了一种易于修改的基本方案，旨在评估体外培养的原代细胞或细胞系或体外单个骨干中的放射性标记氨基酸摄取。这两种方案的应用可以扩展到其他放射性标记的氨基酸和其他骨相关细胞类型和组织。
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Protocol
本文描述的所有小鼠程序均已获得达拉斯德克萨斯大学西南医学中心的动物研究委员会的批准。辐射协议得到了达拉斯德克萨斯大学西南医学中心的辐射安全咨询委员会的批准。
1. 细胞中氨基酸摄取（方案 I）
- 在12孔组织培养板的每个孔中板5 x 104 个ST2细胞。在含有 10% FBS、100 U/mL 青霉素和 0.1 μg/mL 链霉素（笔/链球菌）的 α-MEM 中平板细胞。板额外的细胞孔以量化步骤1.12中归一化的每个条件的细胞数。在37°C的加湿细胞培养箱中用5%CO2孵育细胞。
- 培养细胞2-3天直至汇合。
- 在实验当天，准备以下溶液：1x磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4和克雷布斯林格斯HEPES（KRH）缓冲液，pH 8.0：（120mM NaCl，5mM KCl，2mM CaCl 2，1mM MgCl2，NaHCO 3，5mM HEPES，1mM D-葡萄糖）。预热至37°C。
- 吸出培养基并用 1 mL 1x PBS（pH 7.4）洗涤细胞两次。
注意：此协议也适用于快速分裂非融合细胞。在这种情况下，重要的是将放射性标准化为绝对细胞数或DNA含量。此外，考虑增加培养板或烧瓶的尺寸，以增加总细胞数和cpm值。这对于根据个人经验确定这一点很重要。 - 吸出 1x PBS 并用 1 mL KRH 洗涤细胞一次。
- 每 1 mL KRH 稀释 4 μL [1 μCi μL-1] L-[3，4-3 H]-谷氨酰胺原液，制成 4 μCi/mL L-[3，4-3H]-谷氨酰胺工作培养基。
注意：在使用放射性材料之前，请联系您所在机构的辐射安全办公室以获得批准。所有与辐射有关的程序都必须在有机玻璃屏蔽后面进行。 - 将细胞与含有 4 μCi/mL L-[3，4-3H]-谷氨酰胺工作培养基的 0.5 mL KRH 孵育 5 分钟。
- 收集放射性介质并分配到液体废物容器中。用冰冷的KRH短暂洗涤细胞三次以终止反应。收集并丢弃放射性液体废物容器中的所有洗涤液。
- 向每个孔中加入 1 mL 的 1% SDS，并研磨 10 倍以裂解和匀浆细胞。将细胞裂解物转移到 1.5 mL 管中。将细胞培养板、血清移液器和移液器吸头丢弃在固体放射性废物容器中。
- 以 >10，000 x g 离心 10 分钟。将上清液转移到含有8mL闪烁溶液的闪烁瓶中。通过剧烈摇动闪烁瓶进行混合。将试管和移液器吸头丢弃在固体放射性废物容器中。
- 使用闪烁计数器读取每分钟计数 （cpm） 的放射性。将闪烁小瓶丢弃在闪烁小瓶废物容器中。
- 胰蛋白酶消化，重悬和计数剩余非放射性细胞板中的细胞（参见步骤1.1），以估计裂解的放射性培养物中的细胞数量。使用血细胞计数器，计算每个实验条件下每个非放射性孔的细胞数。将步骤 1.11 中的 cpm 归一化为非放射性板的估计细胞数。
- 实验完成后，用放射性去污喷雾剂对细胞培养罩、工作台和所有仪器进行净化。最后，进行擦拭测试以确保工作区域无辐射。
2. 新鲜分离的骨组织中氨基酸摄取（方案 II）
- 将KRH预热至37°C。
- 对 3 天大的老鼠实施安乐死并去除手臂上的皮肤。用剪刀从肩膀上解开肱骨，解剖出两个肱骨。使用手术刀和镊子取出所有临时组织。从骨头上去除骨骺。
注意：除肱骨外，该协议还可以适用于从2个月和4个月大的小鼠中分离的新生儿股骨，胫骨和颅骨以及肱骨，股骨和胫骨（未发表的数据）。 - 从骨头中冲洗出骨髓，并在步骤2.14中称量骨干以使其正常化。
- 在100°C的1x PBS中煮一个肱骨10分钟以使骨骼脱细胞。脱细胞煮沸的骨用作阴性对照。
注意：作为质量控制，石蜡将煮沸的和非煮沸的骨头嵌入组织学染色，以目视确认煮沸对骨头脱细胞有效。 - 在37°C的细胞培养箱中平衡1mL KRH中的两个肱骨30分钟。
- 每 1 mL KRH 稀释 4 μL 1μCi/μL L-[2，3，4-3H]-精氨酸原液，制成 4 μCi/mL L-[2，3，4-3H]-精氨酸在 KRH 中的工作溶液。
注意：该协议适用于评估选择的任何放射性标记营养素的摄取。L-[2，3，4-3H]-谷氨酰胺、L-[14CU]-丙氨酸和 L-[2，3-3H]-脯氨酸已经过类似的测试结果。显示精氨酸数据以突出该协议的效用。
注意：所有使用辐射的程序必须在有机玻璃防护罩后面进行，同时使用适当的个人防护设备（PPE）。 - 将实验骨和煮沸的对照骨分别在含有4μCi / mL L-[2，3，4-3H]-精氨酸的KRH中在37°C下孵育长达90分钟。
注意：重要的是通过执行时间过程从经验上确定不同条件下的孵育时间，包括小鼠的年龄，不同的骨骼元素和放射性标记氨基酸的类型。饱和主要发生在大约3-4小时后。应在摄取的线性愤怒的时间点评估摄取。 - 取出放射性介质并丢弃在液体放射性废物容器中。使用冰冷的 1 mL KRH 洗涤肱骨 3 次以终止反应。将所有洗涤液丢弃在液体放射性废物容器中。
- 将每块骨转移到 1.5 mL 管中。加入 500 μL RIPA 缓冲液 [150 mM NaCl;5 mM EDTA;50 mM Tris （pH 8.0;0.5% NP40 （v/v）; 0.5% DOX （w/v）; 0.1% SDS （w/v）]。将培养板、血清移液器和移液器吸头丢弃在放射性固体废物容器中。
- 通过在RIPA缓冲液中用剪刀切碎100次来均质化肱骨。
- 超声处理（振幅：35%，脉冲1秒）所得均质骨10秒。
注意：超声处理也已知会产生气溶胶。超声处理步骤可以在生物安全柜中进行。为了减少气溶胶的形成，重要的是不要过度填充管子。小体积样品的超声处理会导致超声处理不完全或因起泡而导致样品损失。如果发生起泡，将样品离心5分钟以沉降。 - 通过在室温下以>10，000× g 离心10分钟来澄清裂解物。将 200 μL 上清液转移到含有 8 mL 闪烁溶液的闪烁瓶中。通过剧烈摇动闪烁瓶进行混合。将所有固体放射性废物（例如，用过的试管、移液器吸头、板等）丢弃在固体放射性废物容器中。
- 使用闪烁计数器读取放射性 （cpm）。将用过的闪烁瓶丢弃在指定用于闪烁瓶的放射性废物容器中。
- 从实验骨的 cpm 中减去煮骨的 cpm（基础值）。用步骤2.3中的骨重使放射性标准化。
- 在细胞培养罩、仪器和工作台上喷洒放射性净化剂。进行擦拭测试以确认工作区域无辐射。
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Representative Results
氨基酸转运由许多膜结合氨基酸转运蛋白调节，这些转运蛋白根据许多特性（包括底物特异性、动力学以及离子和 pH 依赖性25）被分类为不同的转运系统。例如，谷氨酰胺摄取可由Na+依赖性转运系统A，ASC，γ+L和N或Na+非依赖性系统L介导。Na+依赖性系统的特点是能够用Li+替代Na+（系统N）或对氨基酸类似物2-（甲基氨基）异丁酸（MeAIB）（系统A）的敏感性。该实验的目的是确定可归因于每个运输系统的谷氨酰胺消耗量。在含有 120 mM NaCl、含有 120 mM 氯化胆碱的 Na+ 游离 KRH、含有 5 mM MeAIB 的正常 KRH 或含有 120 mM LiCl 的 Na+ 游离 KRH 中的汇合 ST2 细胞中测量 L-[3，4-3H] 谷氨酰胺摄取。总放射性（每分钟计数）归一化为细胞数。Na+去除导致谷氨酰胺摄取减少90%。这表明系统L占谷氨酰胺摄取的10%，而90%的谷氨酰胺摄取在ST2细胞中依赖于Na+（图2）。与无Na +条件相比，Li+的存在仅使谷氨酰胺摄取增加了2%，而5 mM MEAIB不影响谷氨酰胺的摄取。这些数据表明，大部分谷氨酰胺摄取是由系统ASC和γ + L介导的，而系统N和系统A分别负责大约2%和0%的Na +依赖性谷氨酰胺摄取。
我们修改了方案I以表征离 体骨干中的氨基酸摄取。在这个实验中，我们遵循方案II来表征3天龄（p3）小鼠分离的长骨中的精氨酸摄取动力学。为此，我们首先从p3小鼠中解剖了两个肱骨。切除骨骺，旋转骨髓，称量每个肱骨以使其正常化。对侧肱骨被指定为阴性对照，并被煮沸以杀死细胞活动。然后将实验和煮沸的肱骨与放射性标记的4μCi / mL L-[2，3，4-3H]-精氨酸一起孵育长达2小时。精氨酸摄取在该实验过程中以线性方式增加（图3A）。相比之下，煮沸的肱骨在该实验中没有表现出精氨酸摄取的动态增加，而是具有基础放射性，这归因于探针在骨基质中的吸附。标准化和校正的精氨酸摄取如图 3B所示。
图1：放射性标记氨基酸摄取测定的工作流程。 体 外 （方案I）和骨离 体 （方案II）氨基酸摄取测定的示意图概述。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：L-[3，4-3H]-谷氨酰胺在体外 ST2 中摄取的动力学特性。 （A） L-[3，4-3H]-谷氨酰胺摄取测定在 ST2 细胞中存在 （+） 或不存在 （-） 钠 （Na+）、MeAIB 或锂 （Li+） 的情况下进行。（B）系统A，N，L或ASC和γ+L对谷氨酰胺吸收的估计贡献的百分比。请点击此处查看此图的大图。
图3：新生儿肱骨离体L-[2，3，4-3 H]-精氨酸摄取。 （A） L-[2，3，4-3 H]-精氨酸摄取 在从 3 天大的 C57BL/6 小鼠分离的活肱骨和煮沸的肱骨中在 2 小时的时间过程中进行。（B）标准化的L-[2，3，4-3H]-精氨酸吸收与煮沸的肱骨。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
本文描述的方案提供了一种快速而灵敏的方法来评估响应体外或离体的各种实验排列的氨基酸摄取。与市售试剂盒（例如谷氨酰胺和谷氨酸测定试剂盒）相比，该方法更灵敏、更快且劳动强度更低16，17，25。在我们的协议中，我们评估克雷布斯林格斯HEPES缓冲液的摄取。我们利用这种培养基，因为它是一种基础配方，可以快速轻松地进行修改，以测试各种条件来表征氨基酸的摄取。例如，为了测试运输系统是否依赖于Na+，我们可以简单地用氯化胆碱代替NaCl，使Na+游离KRH。这种灵活性有利于询问介导单个氨基酸摄取的各种运输系统。基础生长培养基如α-MEM也适用于该测定。在这种情况下，我们通常会购买缺乏相关单个氨基酸的α-MEM，将其替换为放射性标记的氨基酸进行实验。例如，为了评估谷氨酰胺的摄取，我们在原代骨髓基质细胞中使用不含谷氨酰胺的α-MEM。由于其成分简单，KRH 确实有一些局限性。如果目标是研究辅助主动运输系统，例如符号转运体和反转运体，则 KRH 不是一个理想的选择。例如，通过Slc7a5 / Slc3a2摄取亮氨酸以换取谷氨酰胺。在这种情况下，由于 KRH 中缺乏谷氨酰胺，亮氨酸的摄取可能被低估;相反，在这种情况下，最好使用不含亮氨酸的α-MEM培养基。同样重要的是要注意，在使用同位素3H时，使用盖革计数器不是强制性的。但是，建议保持盖革计数器作为礼貌，以提醒人们您正在与辐射一起工作。
第二种方案的关键和强制性控制是对侧骨的沸腾。这是必要的，因为骨基质可以吸收放射性氨基酸，而不受骨细胞的促进运输。通过对骨骼进行去细胞化，我们可以估计骨基质捕获的辐射量，并将其用作基线放射性以使摄取正常化。另一个重要的控制是在切除骨骺和骨髓后称量骨骼。骨骼的重量用于使相对于骨干大小的摄取正常化。这很重要，因为骨骼的大小可能由于许多因素而变化，从骨骺切除过程中的变异性到影响生长的基因突变。另一种方法是量化骨干的DNA含量以进行标准化。根据我们的经验，标准化DNA含量与骨重相当，但增加了处理放射性物质的更多步骤。因此，我们更愿意恢复到骨量。
这些方案可以适应细胞系，包括ATDC5，MC3T3，293或其他原代细胞，如颅骨母细胞，软骨细胞，骨髓基质细胞，骨髓巨噬细胞和破骨细胞。此外，该方案很容易适应评估其他放射性同位素（例如， 14C和 35S）以及不同的营养素，包括氨基酸，葡萄糖和脂肪酸。此外，方案II还可以适应成体骨骼和沉淀培养物，并考虑调整孵育时间。尽管该协议具有高度适应性，但在进行实验之前表征新同位素标记分子或新细胞系的动力学非常重要。不同分子、不同同位素或不同细胞类型之间的转运动力学可能有很大差异。
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Disclosures
作者没有披露。
Acknowledgments
Karner实验室得到了美国国立卫生研究院R01拨款（AR076325和AR071967）对C.M.K的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 1 mL syringe | BD precision | 309628 | |
| 30G Needle | BD precision | 305106 | |
| Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | |||
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Choline chloride | Sigma | C7077 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissection Tool | Forceps, scissors, scapels | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-Glutamine | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Liquid scintilation vials | Sigma | Z190535 | |
| Lithium chloride solution, 8M | Sigma | L7026 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| MEMα | Gibco | 12561 | |
| Microcentrifuge tube, 15mL | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Sigma | 492016 | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic&Materials | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (Scintillation solution) | PerkinElmer | 6013329 | |
| α-(Methylamino)isobutyric acid | Sigma | M2383 |
References
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