Summary
Mikrofluidisk-baserede lipid nanopartikel (LNP) produktionsmetoder har tiltrukket sig opmærksomhed i lægemiddelleveringssystemer (DDS'er), herunder RNA-levering. Denne protokol beskriver fremstillingen, LNP(siRNA-belastet LNP) produktion og LNP-evalueringsprocesser ved hjælp af vores originale mikrofluidiske enhed ved navn iLiNP.
Abstract
Udviklingen af funktionelle lipidnanopartikler (LNP'er) er en af de største udfordringer inden for lægemiddelleveringssystemer (DDS). For nylig har LNP-baserede RNA-leveringssystemer, nemlig RNA-belastede LNP'er, tiltrukket opmærksomhed for RNA-terapi. Især blev mRNA-belastede LNP-vacciner godkendt til at forhindre COVID-19, hvilket førte til paradigmeskiftet mod udvikling af næste generations nanolægemidler. For de LNP-baserede nanolægemidler er LNP-størrelsen en væsentlig faktor i styringen af LNP-biodistributionen og LNP-ydeevnen. Derfor er en præcis LNP-størrelseskontrolteknik uundværlig for LNP-produktionsprocessen. Her rapporterer vi en protokol til størrelsesstyret LNP-produktion ved hjælp af en mikrofluidisk enhed ved navn iLiNP. siRNA-belastede LNP'er produceres også ved hjælp af iLiNP-enheden og evalueres ved in vitro-eksperiment . Repræsentative resultater er vist for LNP-størrelsen, herunder siRNA-belastede LNP'er, Z-potentiale, siRNA-indkapslingseffektivitet, cytotoksicitet og målgenhæmningsaktivitet.
Introduction
Lipid nanopartikel (LNP) er en af de mest anvendte nanobærere til RNA-leveringssystemer. For nylig er mRNA-belastede LNP'er blevet godkendt som vacciner til forebyggelse af COVID-191,2,3. Generelt spiller størrelsen af LNP en afgørende rolle i biodistributions- og lægemiddelleveringssystemernes (DDS) ydeevne, herunder genhæmning eller proteinekspression4,5,6. Derfor kræves en præcis LNP-størrelseskontrolmetode til LNP-produktionsprocessen.
Til produktion af størrelseskontrollerede LNP'er har mikrofluidiske enheder tiltrukket sig opmærksomhed gennem årene7. I 2018 blev de første Food and Drug Administration (FDA)-godkendte siRNA-belastede LNP'er (f.eks. Onpattro) udviklet ved hjælp af den mikrofluidiske enhed8,9. I den mikrofluidisk-baserede LNP-produktionsmetode indføres en lipidopløsning og en vandig opløsning separat i den mikrofluidiske enhed og blandes derefter i mikrokanalen. For at forbedre blandingseffektiviteten er den kaotiske blandeenhed blevet brugt til LNP-produktionen10,11,12. Den kaotiske mixerenhed gør det muligt at producere LNP'er i specifik størrelse.
En simpel mikrofluidisk enhed, der hedder invasiv lipid nanopartikelproduktion (iLiNP), udstyret med baffelstrukturer, er udviklet til at kontrollere LNP-størrelsen præcist13,14. I sammenligning med den kaotiske mixerenhed var iLiNP-enheden i stand til at styre LNP-størrelsen varierede fra 20 til 100 nm med 10 nm intervaller. Derudover producerede iLiNP-enheden siRNA-belastede LNP'er6, mRNA-belastede LNP'er15, ribonukleoproteinbelastede LNP'er16 og exosomlignende LNP'er17. Formålet med dette papir er at introducere fremstillings- ogsiRNA-indlæst LNP-produktionsproces for iLiNP-enheden og beskrive LNP-evalueringsprocessen produceret af iLiNP-enheden.
Protocol
1. Fremstilling af iLiNP-enheden
BEMÆRK: iLiNP-enheden er fremstillet ved hjælp af standardmetoden til blød litografi18. Den detaljerede fabrikationsprotokol blev rapporteret tidligere10,13.
- SU-8 form fabrikation
- Hæld SU-8 3050 på en 3-tommer siliciumskive. Spin coat siliciumskiven for at opnå et 100 μm tykt SU-8 lag.
- Bag siliciumskiven ved at placere den på en kogeplade ved 65 °C i 5 min og 95 °C i 45 min.
- Efter bagning skal du placere siliciumskiven på scenen i et stationært maskeløst litografisystem.
- Udsæt siliciumskiven for UV-lys ved 365 nm i 1,5 s pr. Position.
BEMÆRK: Et desktop maskeløst litografisystem blev brugt i dette eksperiment. Systemet udsætter automatisk UV-lys ved et opdelt bestrålingsområde (en position) af mikrokanalen. - Efter UV-bestråling bages siliciumskiven på kogepladen ved 65 °C i 1 min og 95 °C i 5 min.
- Afkøl siliciumskiven, og blød derefter i en SU-8-udvikler i 15 minutter for at fjerne ueksponeret SU-8.
- Behandl SU-8-formen med damp af Trichlor(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silan ved hjælp af en tørremaskine og vakuumpumpe.
- Fremstilling af iLiNP-enheden
- Bland silikonebasen og polydimethylsiloxan (PDMS) hærdningsmidlet i forholdet 10:1 (w/w).
- Afgas blandingen ved hjælp af en vakuumpumpe og en tørremaskine.
BEMÆRK: PDMS blev afgasset ved hjælp af en vakuumpumpe i 10 minutter ved stuetemperatur. - Hæld den afgassede PDMS på SU-8-formen i en 100 mm petriskål op til 0,5 til 1 cm tykkelse, efterfulgt af bagning i en ovn ved 80 °C i 1 time.
- Afkøl formen, og skræl derefter PDMS-substratet fra SU-8-formen ved hjælp af en pincet.
- Stans tre huller (0,5 mm) i PDMS-substratet. Lim PDMS-substratet og et glasglas ved hjælp af en iltplasmarenser for at opbygge en iLiNP-enhed (se figur 1)13.
- Tilslut tre PEEK-kapillærer (I.D. 0,3 mm, O.D. 0,5 mm) til iLiNP-enhedens indløb og udløb, og hærd med en superlim.
BEMÆRK: Længden af PEEK-kapillærerne er justerbar og afhænger af eksperimentet.
2. Fremstilling af lipidopløsninger
- Forbered lipid/ethanolopløsninger: 13,4 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC), 10 mM 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DSPC), 20 mM 1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammoniumpropan (DOTAP), 5 mM 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylenglycol-2000 (DMG-PEG2k) og 20 mM kolesterol. Lageropløsningerne opbevares ved -20 °C inden forsøget.
- For at producere de siRNA-belastede LNP'er blandes DOTAP-, DSPC-, kolesterol- og DMG-PEG2k-opløsninger i et molært forhold på 50/10/38,5/1,5. Den samlede lipidkoncentration justeres til 8 mM.
3. Fremstilling af vandige opløsninger
- Vandige opløsninger fremstilles: 154 mM NaCl (saltvand), 25 mM acetatbuffer ved pH 4,0 ved hjælp af DNase/RNase-frit destilleret vand.
- Filtrer opløsningerne gennem membranfiltre på 0,2 μm eller sprøjtefiltre.
4. Fremstilling af siRNA/bufferopløsningen
- 70 μg siGL4 opløses i 1 ml 25 mM acetatbuffer (pH 4,0).
BEMÆRK: siGL4 bruges til knockdown af luciferase gen.
5. Opsætning af iLiNP-enheden og produktion af LNP'er
BEMÆRK: Se figur 1 for skemaerne.
- Fyld 1 ml glassprøjter med lipid- og vandige opløsninger (fra henholdsvis trin 3.1 og 4.1 i individuelle sprøjter).
BEMÆRK: Juster lipid- og vandig opløsningsvolumen afhængigt af den mængde, der kræves til LNP-evalueringseksperimentet. - Tilslut glassprøjterne til PEEK-kapillærerne ved hjælp af sprøjtestik.
- Indstil strømningshastigheden for lipid- og vandige opløsninger.
BEMÆRK: Strømningshastighedsforholdet (FRR) for den vandige fase og lipidfasen varierer fra 3: 1 til 9: 1. - Indfør lipid- og vandige opløsninger separat i iLiNP-enheden ved hjælp af sprøjtepumper.
- Saml LNP-suspensioner i et mikrorør fra udløbet af iLiNP-enheden (figur 1).
6. Dialyse af LNP-suspensionen og LNP-størrelsesmåling
- Dialysere LNP-suspensionen ved hjælp af en dialysemembran (12-14 kDa MW-afskæringer) ved 4 °C natten over mod saltvand eller D-PBS for henholdsvis POPC LNP'er og siRNA-belastede LNP'er.
BEMÆRK: POPC opløses ikke i saltvand (se 2.1). POPC/ethanolopløsning fortyndes med saltvand i iLiNP-enheden. - Saml de dialyserede LNP-suspensioner i mikrorør.
- Pipette 20-30 μL af LNP-suspensionen til en mikrokvartscelle.
- Mål LNP-størrelsen, LNP-størrelsesfordelingen og polydispersitetsindekset ved hjælp af dynamisk lysspredning (DLS).
7. Måling af LNP's Z-potentiale
BEMÆRK: Til måling af Z-potentiale blev der anvendt en partikelanalysator (se tabel over materialer) efter producentens instruktion.
- Fortynd LNP-suspensionen opnået fra trin 6.1, 35 gange med 10 mM HEPES-buffer (pH 7.4).
- Pipette 700 til 1000 μL af den fortyndede LNP-suspension til en kapillærcelle.
- Mål Z-potentialet i henhold til producentens instruktion.
8. siRNA-indkapslingseffektivitet ved RiboGreen-assay
BEMÆRK: Ribogreen-assay udføres for at evaluere siRNA-indkapslingen i LNP'er19. Ribogreen-assay kan måle mængden af RNA'er i og uden for LNP'er med/uden overfladeaktivt stof (f.eks. TritonX-100).
- Fortynd 2 mg/ml siGL4 med 10 mM HEPES-buffer (pH 7,4) til 500 ng/ml siGL4-opløsning.
- Fortyndingsserien (0, 12,5, 25, 50, 100, 200 ng/ml) af siGL4-opløsning forberedes til at lave en kalibreringskurve for Triton (+) og Triton (-) prøver.
- Fortynd LNP-suspensionen 100 gange med 10 mM HEPES-buffer (pH 7,4).
- Følgende blandes for Triton (+) opløsning: 980 μL 10 mM HEPES (pH 7,4), 20 μL 10% w/v TritonX-100 og 1,25 μL RiboGreen til 10 brønde af en 96-brønds mikroplade.
- Følgende blandes i Triton (-) opløsning: 1000 μL 10 mM HEPES (pH 7,4) og 1,25 μL RiboGreen til 10 brønde i en mikroplade med 96 brønde.
- Pipette 100 μL af fortyndingsserien af siGL4-opløsning og fortyndede LNP-suspensioner i brøndene på en sort 96-brønds mikroplade.
BEMÆRK: Fortyndingsserien af siGL4-opløsning og fortyndede LNP-suspensioner blev dispenseret i fire mikrobrønde pr. Tilstand. - Pipette 100 μL af detektionsopløsningen (TritonX-100 (+) eller Triton (-)) i brøndene.
BEMÆRK: Detektionsopløsningen (TritonX-100 (+)) blev udleveret i to brønde pr. prøve pr. tilstand, og TritonX-100 (-) opløsningen blev udleveret i de resterende to brønde pr. Prøvetilstand. - Inkuber mikropladen i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Mål fluorescensintensiteten ved hjælp af en mikropladelæser med en bølgelængde på 475 nm.
- Beregn siRNA-indkapslingseffektiviteten ud fra følgende ligning19.
9. Cellekultur
- Forbered et vækstmedium indeholdende DMEM, varmeinaktiveret 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin og 400 μg / ml G418.
- Kultur HeLa-celler, der stabilt udtrykker ildflue og Renilla luciferase (HeLa-dluc) i en 100 mm TC-behandlet cellekulturskål indeholdende vækstmediet ved 37 °C i en 5 % CO2-inkubator.
10. Celle levedygtighed assay
- Frø 100 μL af en suspension af HeLa-celler i vækstmediet (6 x 103 celler/brønd) i en mikroplade med 96 brønde.
BEMÆRK: Celler blev talt ved hjælp af en celletællerplade og et mikroskop. - Inkubere mikropladen i 24 timer ved 37 °C i en 5 % CO2-inkubator .
- Fortynd de siRNA-belastede LNP'er med DMEM (FBS (-)) i koncentrationerne 10 og 100 nM siRNA'er.
- Dispenser 100 μL af den fortyndede siRNA-belastede LNP-suspension pr. Brønd.
- Inkubere mikropladen i 4 timer ved 37 °C i en 5 % CO2-inkubator .
- Fjern LNP-suspensionen, og tilsæt 100 μL DMEM (FBS (+)).
- Inkuber mikropladen i 20 timer ved 37 °C i en 5 % CO2-inkubator .
- Mål cellens levedygtighed ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt sæt i henhold til producentens protokol.
BEMÆRK: D-PBS (-) blev brugt som den negative kontrol.
11. Luciferase gen knockdown assay
- Frø 75 μL af en suspension af HeLa-celler i vækstmediet (4,5 x 103 celler/brønd) i en mikroplade med 96 brønde.
- Inkubere mikropladen i 24 timer ved 37 °C i en 5 % CO2-inkubator .
- Fortynd de siRNA-belastede LNP'er med DMEM (FBS (-)) i koncentrationerne 10 og 100 nM siRNA'er.
- Dispenser 75 μL af den fortyndede siRNA-belastede LNP-suspension pr. En brønd.
- Inkubere mikropladen i 4 timer ved 37 °C i en 5 % CO2-inkubator .
- Fjern LNP-suspensionen, og tilsæt 75 μL DMEM (FBS (+)).
- Inkuber mikropladen i 20 timer ved 37 °C i en 5 % CO2-inkubator .
- Mål luciferase-udtrykket ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt sæt i henhold til producentens protokol.
BEMÆRK: Vi brugte D-PBS (-) som den negative kontrol.
Representative Results
Figur 2A,B viser POPC LNP-størrelsesfordelingen produceret under forskellige strømningsforhold. Den mikrofluidisk-baserede LNP-forberedelsesmetode kan styre størrelsen af LNP'er ved hjælp af strømningsbetingelserne såsom den samlede strømningshastighed (TFR) og FRR. Sammenlignet med de typiske mikrofluidiske enheder, herunder den kaotiske mixerenhed og den flowfokuserende mikrofluidiske enhed, muliggjorde iLiNP-enheden præcis LNP-størrelseskontrol fra 20 til 100 nm (figur 2). Små LNP'er dannet ved høje samlede strømningshastighedsforhold. Derudover var LNP-størrelserne dannet ved FRR på 5 mindre end FRR på 3, uanset den samlede strømningshastighed13.
siRNA-belastede LNP'er blev også fremstillet ved anvendelse af iLiNP-enheden (figur 3A). Til det siRNA-belastede LNP-præparat blev DOTAP, et kationisk lipid, anvendt til effektivt at indkapsle siRNA'et i LNP'erne. iLiNP-enheden producerede 90 nm størrelse siRNA-belastede kationiske LNP'er med smal fordeling (figur 3A,B). SiRNA-indkapslingseffektiviteten var 95% på grund af den elektrostatiske interaktion mellem det kationiske lipid og negativt ladede siRNA'er (figur 3C).
Cytotoksicitet og genhæmningsaktiviteten af 90 nm størrelse siRNA-belastede LNP'er blev evalueret som vist i figur 4 og figur 5. siRNA-belastede LNP'er viste cytotoksicitet i en dosis på 10 og 100 nM siRNA. Vi bekræftede også, at ekspressionsniveauet af luciferase blev reduceret afhængigt af siRNA-koncentrationen. De siRNA-belastede LNP'er undertrykte 80% luciferaseekspression i en dosis på 100 nM siRNA. Effekten af LNP-størrelse på genhæmningsaktiviteten blev rapporteret tidligere6,13,17.
Figur 1: (A) Skematisk illustration og (B) fotografi af iLiNP-enheden. iLiNP-enheden består af PDMS og glassubstrater. iLiNP-enheden er forbundet til PEEK-kapillærer med en superlim. Lipid- og siRNA/bufferopløsningerne indføres separat i iLiNP-enheden ved hjælp af sprøjtepumper. LNP-suspensionen opsamles i et mikrorør. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: POPC LNP-størrelsesfordelinger produceret af iLiNP-enheden ved de forskellige strømningshastighedsforhold (FRR). POPC LNP-størrelsen måles ved dynamisk lysspredning (DLS). POPC LNP'erne udarbejdes ved at ændre den samlede strømningshastighed og FRR: (A) 3 FRR og (B) 5 FRR. Små LNP'er dannes ved høje samlede strømningshastighedsforhold. Derudover var LNP-størrelserne dannet ved FRR på 5 mindre end dem ved FRR på 3. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Karakterisering af de siRNA-belastede LNP'er. (A) Størrelsesfordeling af siRNA-belastede LNP'er. siRNA'er (siGL4) indkapsles i LNP'erne ved elektrostatisk interaktion mellem det kationiske lipid (DOTAP) og negativt ladede siRNA'er. B) Z-potentialet for de siRNA-belastede LNP'er. LNP-suspensionen blev fortyndet med 10 mM HEPES-buffer (pH 7,4) før målingen. Data er repræsenteret som gennemsnitlig ± SD (Standard Deviation). n = 3. (C) siRNA-indkapslingseffektivitet af de DOTAP-baserede LNP'er. Indkapslingseffektiviteten blev bestemt af RiboGreen-assay. Data er repræsenteret som middelværdi ± SD. n = 3. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Cytotoksicitet af de siRNA-belastede LNP'er. siRNA-belastede LNP'er blev fortyndet med DMEM (FBS (-)) for at opnå siGL4-koncentrationerne på 10 og 100 nM. LNP-suspensionerne tilsættes heLa-dLuc-celler og inkuberes i 4 timer ved 37 °C i en 5 % CO2-inkubator . N.T.: Ikke-behandlet (D-PBS(-)). Data er repræsenteret som middelværdien ± SD. n = 3. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Luciferase gen knockdown aktivitet behandlet med siRNA-belastede LNP'er. siRNA-belastede LNP'er fremstilles på samme måde som cellelevedygtighedsassay. Luciferase-ekspressionsniveauet måles ved hjælp af Dual-Glo Luciferase Assay System. N.T.: Ikke-behandlet (D-PBS(-)). Data er repræsenteret som middelværdi ± SD. n = 3. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
LNP-størrelsen påvirker LNP-biodistributionen, antitumoreffekten og genhæmningsevnen. Derfor er LNP-størrelseskontrolmetoden en væsentlig teknik til fremstilling af DDS-nanomedicin, herunder RNA-leveringssystemer. Formålet med dette papir er at introducere iLiNP-enheden til præcis størrelsesindstilling af LNP'er og dens anvendelse på den siRNA-belastede LNP-produktion. iLiNP-enheden var i stand til at styre LNP-størrelsen varierede fra 20 til 100 nm (figur 2) 13. Når strømningsbetingelserne, såsom den samlede strømningshastighed og FRR, ændres for at kontrollere LNP-størrelsen, skal LNP-suspensionen opsamles efter ca. 5 til 10 s for at stabilisere opløsningsstrømmen. LNP-suspensionen, der blev indsamlet fra udløbet af iLiNP-enheden, blev dialyseret straks mod bufferopløsningen for at fjerne ethanol og forhindre LNP-aggregering.
LNP-størrelseskontrollen er en af de store udfordringer inden for DDS. Generelt har den konventionelle LNP-produktionsproces, såsom lipidfilmhydreringsmetoden, brug for en størrelsesindstillingsproces efter LNP-produktionen20. På den anden side kan den mikrofluidisk-baserede LNP'er produktionsmetode producere de størrelsesstyrede LNP'er ved at indføre lipid- og vandige opløsninger i den mikrofluidiske enhed6,11,13. Selvom dialyseprocessen er nødvendig for at fjerne ethanol fra LNP-suspensionen, lover en kontinuerlig proces med den mikrofluidiske enhed kombineret med det tangentielle flowsystem automatisering af LNP-produktionsprocessen14. Ifølge litteraturen var POPC LNP-størrelserne 50-60 nm og 30-60 nm for henholdsvis den flowfokuserende mikrofluidiske enhed21 og den kaotiske mixerenhed10. Sammenlignet med andre mikrofluidiske enheder muliggør iLiNP-enheden POPC LNP-størrelseskontrol i en bred vifte fra 20 til 100 nm.
Fremstillingsprocessen for den anvendte iLiNP-enhed var standard blød litografi. Således kan iLiNP-enheden masseproduceres ved hjælp af hurtig prototypeteknik og forhindre krydskontaminering af opløsninger ved hjælp af en engangsanordning. iLiNP-enheden kan producere siRNA-belastede LNP'er på samme måde som POPC LNP-produktionsmetoden. For LNP-produktionsmetoden ved hjælp af iLiNP-enheden kræver brugeren ingen komplicerede procedurer. Af disse grunde forventes den mikrofluidisk baserede LNP-produktionsmetode, herunder iLiNP-enheden, at blive anvendt som standard LNP-produktionsmetode. Protokollen for dette papir kan tilpasses andre mikrofluidiske enheder til LNP-produktion. Derudover muliggøres produktionen af mRNA-belastede LNP'er også ved at ændre siRNA/bufferopløsningen til en bufferopløsning indeholdende mRNA'er.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af JST, CREST Grant Number JPMJCR17H1, Japan, JST, PRESTO Grant Number JPMJPR19K8, Japan, JST, SCORE, Japan, Special Education and Research Expenses fra Ministeriet for Uddannelse, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi, JSPS KAKENHI Grant Number JP19KK0140 og Iketani Science and Technology Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | NOF Corp. | MC-6081 | |
| 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (DMG-PEG2K) | NOF Corp. | GM-020 | |
| 1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propane (DOTAP) | NOF Corp. | CL-8181TA | |
| 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholinev (DSPC) | NOF Corp. | MC-8080 | |
| 10 x D-PBS (-) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 048-29805 | |
| Acetic acid | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 017-00251 | |
| CellTiter-Blue Cell Viability Assay | Promega | G8081 | |
| cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667-5G | |
| Desktop maskless lithography system | NEOARK CORPORATION | DDB-701-DL4 | |
| Dialysis membrane | Repligen | 132697 | |
| Dual-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2940 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | Lot: 42G6587K | |
| G418 | Nacalai Tesque | 08973-14 | |
| Glass substrate | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S1111 | |
| Glass syringe | Hamilton | GASSTIGHT 1002 | |
| HeLa cell | HeLa-dluc cells were provided from Dr. Yusuke Sato at Hokkaido University | ||
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 342-01375 | |
| Low-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D6046-500ML | |
| Oxygen plasma cleaner | Femto Science | CUTE-1MP/R | |
| Penicillin–streptomycin, trypsin (2.5%) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Quant-iT RiboGreen RNA Reagent | Thermo Fisher Scientific | R11491 | |
| siGL4 | Hokkaido System Science Co., Ltd | The sense and antisense strand sequences of siGL4 are 5'-CCGUCGUAUUCGUGAGCAATsT -3' and 5'-UUGCUCACGAAUACGACGGTsT -3', respectively. |
|
| Silicon wafer | GTC | ||
| SILPOT 184 W/C (PDMS) | Dow Corning Toray Co., Ltd. | silicone base and curing agent are included | |
| Sodium acetate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 192-01075 | |
| Sodium chloride | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 191-01665 | |
| SU-8 3050 | Nippon Kyaku Co., Ltd. | ||
| Syringe connector | Institute of microchemical Technology Co., Ltd. | ISC-011 | |
| Syringe pump | Chemyx | CX07200 | |
| trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| TritonX-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Instruments | ZEN3600 |
References
- Schoenmaker, L., et al. mRNA-lipid nanoparticle COVID-19 vaccines: Structure and stability. International Journal of Pharmaceutics. 601, 120586 (2021).
- Chung, Y. H., Beiss, V., Fiering, S. N., Steinmetz, N. F. COVID-19 Vaccine frontrunners and their nanotechnology design. ACS Nano. 14 (10), 12522-12537 (2020).
- Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).
- Cabral, H., et al. Accumulation of sub-100 nm polymeric micelles in poorly permeable tumours depends on size. Nature Nanotechnology. 6 (12), 815-823 (2011).
- Sato, Y., et al. Elucidation of the physicochemical properties and potency of siRNA-loaded small-sized lipid nanoparticles for siRNA delivery. Journal of Controlled Release. 229, 48-57 (2016).
- Kimura, N., et al. Three-dimensional, symmetrically assembled microfluidic device for lipid nanoparticle production. RSC Advances. 11 (3), 1430-1439 (2021).
- Maeki, M., Kimura, N., Sato, Y., Harashima, H., Tokeshi, M. Advances in microfluidics for lipid nanoparticles and extracellular vesicles and applications in drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 128, 84-100 (2018).
- Akinc, A., et al. The Onpattro story and the clinical translation of nanomedicines containing nucleic acid-based drugs. Nature Nanotechnology. 14 (12), 1084-1087 (2019).
- Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Chen, S., Cullis, P. R., vander Meel, R. Lipid nanoparticle technology for clinical translation of siRNA therapeutics. Accounts of Chemical Research. 52 (9), 2435-2444 (2019).
- Maeki, M., et al. Understanding the formation mechanism of lipid nanoparticles in microfluidic devices with chaotic micromixers. PLoS One. 12 (11), 0187962 (2017).
- Maeki, M., et al. A strategy for synthesis of lipid nanoparticles using microfluidic devices with a mixer structure. RSC Advances. 5 (57), 46181-46185 (2015).
- Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, 37 (2012).
- Kimura, N., et al. Development of the iLiNP Device: Fine Tuning the Lipid Nanoparticle Size within 10 nm for Drug Delivery. ACS Omega. 3 (5), 5044-5051 (2018).
- Kimura, N., et al. Development of a microfluidic-based post-treatment process for size-controlled lipid nanoparticles and application to siRNA delivery. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (30), 34011-34020 (2020).
- Hashiba, A., et al. The use of design of experiments with multiple responses to determine optimal formulations for in vivo hepatic mRNA delivery. Journal of Controlled Release. 327, 467-476 (2020).
- Suzuki, Y., et al. Lipid nanoparticles loaded with ribonucleoprotein-oligonucleotide complexes synthesized using a microfluidic device exhibit robust genome editing and hepatitis B virus inhibition. Journal of Controlled Release. 330, 61-71 (2020).
- Kimura, N., Maeki, M., Ishida, A., Tani, H., Tokeshi, M. One-step production using a microfluidic device of highly biocompatible size-controlled noncationic exosome-like nanoparticles for RNA delivery. ACS Applied Bio Materials. 4 (2), 1783-1793 (2021).
- Deng, T., Wu, H., Brittain, S. T., Whitesides, G. M. Prototyping of masks, masters, and stamps/molds for soft lithography using an office printer and photographic reduction. Analytical Chemistry. 72 (14), 3176-3180 (2000).
- Sato, Y., et al. A pH-sensitive cationic lipid facilitates the delivery of liposomal siRNA and gene silencing activity in vitro and in vivo. Journal of Controlled Release. 163 (3), 267-276 (2012).
- Ong, S. G., Chitneni, M., Lee, K. S., Ming, L. C., Yuen, K. H. Evaluation of extrusion technique for nanosizing liposomes. Pharmaceutics. 8 (4), (2016).
- Mijajlovic, M., Wright, D., Zivkovic, V., Bi, J. X., Biggs, M. J. Microfluidic hydrodynamic focusing based synthesis of POPC liposomes for model biological systems. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 104, 276-281 (2013).
