Summary
A pinça da cabeça basal da planta de pimenta preta é um método breve e de economia de tempo para danificá-la. Aqui, fornecemos passos detalhados com um vídeo para infectar plantas de pimenta preta.
Abstract
Piper nigrum L. (pimenta preta) é uma típica videira amadeirada que é uma cultura de especiarias economicamente importante em todo o mundo. A produção de pimenta preta é significativamente impactada pela doença da podridão radicular causada pelo Phytophthora capsici, que influenciou seriamente o desenvolvimento da indústria como um problema de "ponto de estrangulamento". No entanto, o mecanismo genético molecular de resistência na pimenta preta não é claro, levando a um lento progresso no desenvolvimento de novas variedades de pimenta preta. Um sistema eficaz de inoculação e amostragem precisa para Phytophthora capsici em plantas de pimenta preta é essencial para estudar esta interação planta-patógeno. O principal objetivo deste estudo é demonstrar uma metodologia detalhada onde a cabeça basal de pimenta preta é inoculada com Phytophthora capsici, ao mesmo tempo em que fornece referência para a inoculação de plantas de videiras amadeiradas. A cabeça basal da planta de pimenta preta foi picada para danificá-la, e as pelotas mycelial cobriram os três orifícios para reter a umidade para que o patógeno pudesse infectar bem a planta. Este método fornece uma melhor maneira de resolver a instabilidade causada pelos métodos tradicionais de inoculação, incluindo o encharcado de solo ou o mergulho de raízes. Também fornece um meio promissor para estudar o modo de ação entre plantas e outros patógenos vegetais transportados pelo solo na reprodução de precisão agrícola.
Introduction
A pimenta-do-reino (Piper nigrum L.) é uma alpinista amadeirada e uma das culturas de especiarias mais importantes. É conhecido como o "Rei das Especiarias"1 e é cultivado em mais de 40 países e regiões da Ásia, África e América Latina. A podridão da raiz de Phytophthora é a doença mais devastadora da pimenta preta, e é causada pelo oomycete Phytophthora capsici. Este patógeno também infecta cucurbits, berinjelas, pimentão e tomate 2,3. Com pimenta-do-reino, uma cultura inteira às vezes pode ser dizimada por esta doença. A expansão das áreas de plantio de pimenta é restrita como resultado da indisponibilidade de variedades resistentes, o que tem dificultado significativamente o desenvolvimento da indústria chinesa de pimenta-do-reino. Uma inoculação eficaz e um sistema de amostragem preciso para Phytophthora capsici em plantas de pimenta preta são essenciais para estudar esta interação planta-patógeno.
A identificação e triagem da resistência nos recursos do germoplasma é o requisito básico para pesquisar a patogenicidade do patógeno e a criação e utilização de variedades resistentes. Uma abordagem amplamente utilizada é usar uma variedade de métodos de identificação baseados em espécies vegetais e grupos de patógenos. Os métodos atuais de identificação incluem identificação populacional, identificação individual, identificação de órgãos, identificação de tecidos, identificação celular, identificação bioquímica e identificação molecular, que foram desenvolvidos nos últimos anos 4,5. Houve sucesso nessas áreas, mas também há muitos problemas. Não importa qual método seja escolhido, os requisitos básicos de identificação de resistência à planta são consistentes, incluindo objetivos claros, resultados confiáveis e métodos simples, rápidos e fáceis de padronizar. Este princípio também deve ser seguido na identificação da resistência à pimenta-do-reino.
Em condições naturais de campo, a identificação da resistência à doença pode ser influenciada por muitos fatores ambientais. Assim, foi proposto que folhas separadas e raízes irrigadas sejam utilizadas em laboratório para identificar a resistência à doença. As folhas jovens de plantas saudáveis foram inoculadas in vitro em laboratório, e a área de folhas doentes foi medida pela inoculação do patógeno, a fim de identificar a resistência à doença das plantas6. No entanto, a inoculação de folhas in vitro só pode ser usada para identificação geral de resistência e não para estudos de interação molecular. Apesar disso, o status resistente à doença frequentemente se apresenta na inoculação radicular irrigada, causando incerteza no estudo de acompanhamento da reprodução molecular para resistência à doença. Portanto, métodos rápidos e simples de detecção interna são essenciais. Este estudo tem como objetivo fornecer um método de identificação de resistência em laboratório.
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Protocol
1. Preparação de plantas de corte de pimenta preta para infecção
- Tome um corte de cinco nódulos, aproximadamente 40 cm de comprimento com um diâmetro de 0,5 cm, de um ramo ortotrópico saudável e vigorosamente crescente de pimenta preta usando uma faca de poda desinfetada ou secateurs. Podar os três nódulos inferiores dos ramos plagiotrópicos, com os dois nódulos superiores deixados com aproximadamente 10 folhas intactas.
- Prepare o substrato de raiz contendo solo e estrume animal (esterco de vaca ou esterco de ovelha) a uma proporção de 1:1. Autoclave o substrato de raiz a 121 °C por 20 min.
- Insira as estacas no substrato de raiz em um ângulo de aproximadamente 50°, com o terceiro nó apenas tocando a superfície do substrato e o broto axilar neste nó acima do substrato.
NOTA: A bolsa utilizada aqui tem as seguintes dimensões: altura de 40-60 cm, diâmetro de 25-30 cm. - Despeje 10-20 L de água sobre as raízes da planta. Coloque as estacas em uma estufa com 90% de sombra a uma temperatura de 25-30 °C para enraizar e crescer.
2. Propagação de Fitohthora capsici (P. capsici)
NOTA: Um estoque da cultura Phytophthora capsici é mantido no laboratório de proteção vegetal do Spice and Beverage Research Institute, Academia Chinesa de Ciências Agrícolas Tropicais7.
- Escove e limpe os tubérculos de batata sob água da torneira e, em seguida, corte 200 g de batatas em cubos de 1 cm3. Coloque alguns dos cubos em um béquer contendo 800 mL de água dupla destilada (ddH2O) e ferva por 20 minutos.
- Filtre o caldo através de gaze dupla usando filtragem de gravidade. Prepare o ágar de dextrose de batata (PDA) adicionando 20 g de dextrose e 15 g de ágar ao filtrado e superando o volume até 1 L com ddH2O. Autoclave a mistura a 121 °C por 20 min8.
- Despeje 20 mL do PDA esterilizado em forma líquida em uma placa de Petri redonda de 9 cm de diâmetro dentro de uma capa de fluxo de ar laminar. Deixe as placas PDA abertas dentro do capô de fluxo de ar laminar durante a noite como forma de evitar a condensação.
- Use um laço de inoculação para pegar mycelia de Phytophthora capsici estoque dentro de um tubo de ensaio. Coloque o inóculo com o lado mycelial em contato com o PDA em uma placa de Petri.
3. Infecção por pimenta preta
- Incubação
- Identifique uma área 5 cm acima da superfície do substrato e perto das raízes na haste para a inoculação.
- Core out um disco de mycelia 0,5 cm de diâmetro na borda crescente da cultura Phytophthora capsici em PDA em uma placa de Petri usando um borer de rolha.
- Danifique a haste usando uma agulha de seringa e faça três furos em um padrão triangular na área de inoculação selecionada. Cubra cada orifício com um disco mycelial. Posicione os orifícios próximos um do outro para garantir que a área ferida esteja totalmente coberta com os discos mycelial.
- Cubra os discos micelial com almofadas de algodão umedecido esterilizadas como forma de evitar a secagem. Amarre a almofada na haste com uma tira de polietileno para manter a posição dos discos inoculantes.
NOTA: Às 8h após a inoculação, os orifícios inoculados ficaram pretos e a lesão se estendeu com o passar do tempo. As folhas ficaram amarelas e caíram, e a planta inoculada morreu 7-10 dias após a inoculação. Não foram desenvolvidas lesões nas plantas de controle. A maioria dos genes expressou-se de forma diferente após a inoculação com Phytophthora capsici em comparação com o grupo controle. A análise histopatológica dos tecidos infectados demonstrou que Phytophthora capsici colonizou no xilema.
- Prove os materiais vegetais de interesse e armazene a -80 °C em nitrogênio líquido para uso em estudos subsequentes.
NOTA: Nitrogênio líquido, sacos plásticos, canetas marcadoras, tesouras de galhos e outros materiais foram preparados antes dos experimentos. - Após a amostra de materiais vegetais específicos para uso, autoclave todos os materiais vegetais restantes, a cultura e o meio de cultura Phytophthora capsici , e todos os instrumentos e labware utilizados neste trabalho de inoculação.
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Representative Results
A Figura 1 apresenta os sintomas das folhas de pimenta preta após a inoculação de P. capsici . A Figura 2 apresenta os sintomas das hastes de pimenta-do-reino após a inoculação de P. capsici . O patógeno infectou a pimenta-do-reino na haste basal; sintomas incluindo amarelamento de folhas, murchas aparecendo, browning xilema e o envelhecimento do vaso gradualmente aparecendo. A Figura 3 mostra a maioria dos genes expressos de forma diferente após a inoculação com Phytophthora capsici em comparação com o grupo controle. A Figura 4 demonstrou que Phytophthora capsici colonizada no xilema pela análise histopatológica dos tecidos infectados.
Figura 1: Os sintomas da pimenta-do-reino saem após a inoculação de P. capsici 7. CK: grupo de controle; Inoculado: após a inoculação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O sintoma da pimenta-do-reino segue a inoculação de P. capsici 7. Inoculado: após a inoculação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Perfis de expressão detalhados dos genes nas raízes da pimenta negra. As barras de erro nas figuras denotam o erro padrão dos níveis de expressão de três replicações biológicas. CK-8, CK-12, CK-24, CK-48, 8, 12, 24 e 48 no eixo x referem-se a 8, 12, 24 e 48 h no controle e 8, 12, 24 e 48 h, respectivamente, seguindo a inoculação com P. capsici. O eixo y representa o nível de expressão relativa em comparação com a ubiquitina. Cada coluna representa o valor médio mais SD (desvio padrão) de três réplicas biológicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise histopatológica dos tecidos infectados. A comparação entre toluidina azul O manchando sozinho (coluna esquerda) e algodão azul e safranin O dupla mancha (coluna direita) (20X). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste estudo, a cabeça basal foi picada para danificar e fornecer um sistema de inoculação eficaz na planta de pimenta preta. As pelotas mycelial então cobriram os três orifícios para reter a umidade e permitir que o patógeno infectasse bem a planta. Após a inoculação, as folhas ficaram amarelas e caíram e as plantas inoculadas morreram. Não foram desenvolvidas lesões nas plantas de controle. A maioria dos genes expressou-se de forma diferente após a inoculação com Phytophthora capsici em comparação com o grupo controle. As doenças fúngicas são responsáveis por distúrbios estruturais e fisiológicos em um número significativo de culturas, levando à diminuição da produtividade e perdas econômicas para seus produtores. Estudos estruturais que empregam técnicas histológicas no modo de penetração e colonização de tecidos vegetais por fungos fornecem uma indicação detalhada das interações entre o patógeno e o tecido vegetal. Esses estudos revelaram aspectos importantes para ajudar a entender o monociclo das doenças. A análise histopatológica dos tecidos infectados demonstrou Phytophthora capsici colonizada no xilema. Este método fornece um melhor meio para resolver a instabilidade causada pelos métodos tradicionais de inoculação, incluindo o encharcado de solo ou o mergulho de raízes. Um sistema eficaz de inoculação e amostragem precisa para Phytophthora capsici em plantas de pimenta preta são essenciais para estudar esta interação planta-patógeno. Também fornece um meio promissor para estudar o modo de ação entre plantas e outros patógenos vegetais transportados pelo solo na reprodução de precisão agrícola.
Ao mesmo tempo, este protocolo representa uma forma mais eficiente de fornecer referência para a incubação de videiras lenhosas. Em estudos anteriores, os patógenos foram inoculados por mergulho de raízes com suspensões de esporos cultivadas em V8 médio9. Leva 7 dias para a suspensão do esporo ficar pronta, enquanto o uso do PDA para cultivar Phytophthora capsici leva apenas 5 dias. A placa PDA foi selada usando fita cirúrgica permeável como forma de evitar a contaminação de outras bactérias e fungos. As culturas foram mantidas em temperatura ambiente. O método utilizado neste estudo pode economizar mais tempo e ser realizado mais rapidamente. A pimenta-do-reino é uma vinha amadeirada com muitos açúcares e fenóis10, e os zoosporos produzidos por Phytophthora capsici geralmente ocorrem em solos, dificultando a infecção de videiras de pimenta preta e causando instabilidade de infecção na raiz11. Este protocolo proporciona melhores resultados, permitindo uma forte interação entre plantas videiras e patógenos transportados pelo solo. A detecção do processo dinâmico entre plantas e patógenos é visível e conveniente.
O método radicular irrigante é rápido e de economia de tempo, mas um problema permanece sem solução para a pimenta-do-reino. Phytophthora capsici é um patógeno transmitido pelo solo que geralmente infecta raízes vegetais através de espánguas e zoosporos12. Na natureza, a espúria é capaz de se espalhar através da chuva e irrigação. Uma vez que os zoospores se apegam à superfície da planta, os tubos de germe podem desenvolver e penetrar rapidamente no tecido vegetal, o que resulta em infecção13,14. Isso pode causar incerteza de que escolher a hifa como fonte de infecção será semelhante à suspensão dos esporos. O método utilizado neste estudo começa com a fixação da cabeça basal da planta de pimenta-preta para danificá-la. A área danificada é então coberta com Phytophthora capsici e a umidade é retida, garantindo que o patógeno possa infectar bem a planta. Este método é melhor para resolver a instabilidade causada pelos métodos tradicionais de inoculação, incluindo o encharcado de solo ou o mergulho de raízes. É também um método promissor para estudar o modo de ação entre plantas e outros patógenos vegetais transportados pelo solo na reprodução de precisão agrícola.
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Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo Programa Nacional de P&D da China (2020YFD1001200), o Sistema de Pesquisa agrícola da China (CARS-11), o fundo de pesquisa específico da Plataforma de Inovação para Acadêmicos da Província de Hainan (YSPTZX202154), a Fundação de Ciência Natural da Província de Hainan da China (321RC652) e a Natural Science Foundation of China (No. 31601626).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar powder | Solarbio | A8190 | |
| Clean bench | Haier | ||
| Dextrose | Xilong Scientific | 15700501 | |
| High temperature sterilizing oven | Zaelway | ||
| Petri dish plates | Biosharp | BS-90-D |
References
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