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Immunology and Infection

वैक्सीन विकास के लिए क्लैमाइडिया मुरिडेरम से एक पुनः संयोजक प्रमुख बाहरी झिल्ली प्रोटीन के लिए सेल-फ्री स्केल्ड उत्पादन और सहायक जोड़

Published: March 16, 2022 doi: 10.3791/63028
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1,3
1Physical and Life Sciences Directorate, Lawrence Livermore National Laboratory, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of California, 3School of Medicine, Radiation Oncology, University of California Davis
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल नैनोडिस्क में समर्थित झिल्ली प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए वाणिज्यिक, सेल-मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति किट का उपयोग करने का वर्णन करता है जिसे सबयूनिट टीकों में एंटीजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

Abstract

सबयूनिट टीके सुरक्षा, स्थिरता और मानक विनिर्माण में अधिक पारंपरिक निष्क्रिय या क्षीण होल-सेल-व्युत्पन्न टीकों पर लाभ प्रदान करते हैं। एक प्रभावी प्रोटीन-आधारित सबयूनिट वैक्सीन प्राप्त करने के लिए, प्रोटीन एंटीजन को अक्सर देशी जैसी रचना को अपनाने की आवश्यकता होती है। यह रोगज़नक़-सतह एंटीजन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जो झिल्ली-बाध्य प्रोटीन हैं। नैनोलिपोप्रोटीन कणों (एनएलपी) के सह-अनुवाद के माध्यम से सही ढंग से मुड़े हुए कार्यात्मक झिल्ली प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए सेल-मुक्त विधियों का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है, जिसे आमतौर पर नैनोडिस्क के रूप में जाना जाता है।

इस रणनीति का उपयोग लिपिड-बाध्य वातावरण में झिल्ली प्रोटीन से युक्त सबयूनिट टीकों का उत्पादन करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, सेल-मुक्त प्रोटीन उत्पादन अक्सर छोटे पैमाने (<1 एमएल) तक सीमित होता है। छोटे पैमाने पर उत्पादन में उत्पादित प्रोटीन की मात्रा आमतौर पर जैव रासायनिक और बायोफिज़िकल अध्ययन के लिए पर्याप्त होती है। हालांकि, पशु मॉडल में वैक्सीन अध्ययन के लिए पर्याप्त प्रोटीन प्राप्त करने के लिए सेल-मुक्त प्रक्रिया को स्केल, अनुकूलित और सावधानीपूर्वक परीक्षण करने की आवश्यकता है। वैक्सीन उत्पादन में शामिल अन्य प्रक्रियाओं, जैसे शुद्धिकरण, सहायक जोड़, और लियोफिलाइजेशन, को समानांतर में अनुकूलित करने की आवश्यकता है। यह पेपर एक झिल्ली-बाध्य प्रोटीन सबयूनिट वैक्सीन को व्यक्त, शुद्ध और तैयार करने के लिए स्केल-अप प्रोटोकॉल के विकास की रिपोर्ट करता है।

स्केल-अप सेल-मुक्त प्रतिक्रियाओं को तैयार नैनोलिपोप्रोटीन कणों के उच्च-स्तरीय उत्पादन के लिए कई प्लास्मिड अभिव्यक्ति वैक्टर, लिपिड चयन और सहायक जोड़ का उपयोग करते समय प्लास्मिड सांद्रता और अनुपात के अनुकूलन की आवश्यकता होती है। विधि को यहां क्लैमाइडिया प्रमुख बाहरी झिल्ली प्रोटीन (एमओएमपी) की अभिव्यक्ति के साथ प्रदर्शित किया गया है, लेकिन अन्य झिल्ली प्रोटीन एंटीजन पर व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है। एंटीबॉडी उत्पादन को मापने के लिए टीकाकरण अध्ययन के माध्यम से विवो में एंटीजन प्रभावशीलता का मूल्यांकन किया जा सकता है, जैसा कि यहां दिखाया गया है।

Introduction

प्रोटीन की कोशिका-मुक्त अभिव्यक्ति के लिए प्रोकैरियोटिक या यूकेरियोटिक लाइसेट रुचि के प्रोटीन को संश्लेषित करने के लिए वाणिज्यिक उत्पादों के रूप में आसानी से उपलब्ध हैं (पूर्ण समीक्षा के लिए, देखें 1)। ये अभिव्यक्ति प्रणालियां विभिन्न पैमानों पर उपलब्ध हैं और ई कोलाई, तंबाकू पौधों और स्तनधारी संस्कृतियों सहित विभिन्न जीवों से लाइसेट का उपयोग करती हैं। सेल-मुक्त लाइसेट पारंपरिक पुनः संयोजक प्रोटीन उत्पादन दृष्टिकोण पर कई लाभ प्रदान करते हैं, जिसमें उपयोग में आसानी और मजबूत, तेजी से प्रोटीन उत्पादन शामिल है। जबकि इन दृष्टिकोणों का उपयोग मुख्य रूप से घुलनशील प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए किया जाता है, इस समूह ने झिल्ली प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए उनके उपयोग के लिए एक दृष्टिकोण का बीड़ा उठाया है।

यह नया दृष्टिकोण अभिव्यक्ति के लिए दो प्रोटीन उत्पादों, एक एपोलिपोप्रोटीन और रुचि के झिल्ली प्रोटीन को डीएनए एन्कोडिंग को शामिल करके मौजूदा सेल-मुक्त अभिव्यक्ति प्रणालियों में मामूली संशोधन करता है। व्यक्त एपोलिपोप्रोटीन (या तो एपोए 1 या एपोई 4 के डेरिवेटिव) सेल-फ्री लाइसेट में जोड़े गए लिपिड के साथ सहज रूप से (~ 20 एनएम) एनएलपी को इकट्ठा करने के लिए बातचीत करता है। जब रुचि के झिल्ली प्रोटीन के साथ सह-अनुवाद किया जाता है, तो एनएलपी और झिल्ली प्रोटीन एक घुलनशील नैनोपार्टिकल कॉम्प्लेक्स बनाते हैं जिसमें झिल्ली प्रोटीन एनएलपी लिपिड बाइलेयर के भीतर एम्बेडेड होता है। इस प्रकार, झिल्ली प्रोटीन डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए अधिक सुलभ है, क्योंकि यह घुलनशील, असतत कणों के भीतर निहित है। यह दृष्टिकोण एनएलपी बाइलेयर2 के भीतर कार्यात्मक ओलिगोमेरिक प्रोटीन कॉम्प्लेक्स का उत्पादन कर सकता है और एक सबयूनिट वैक्सीन के एंटीजन घटक का उत्पादन कर सकता है, जिसे बाद में लिपोफिलिक एडजुवेंट के साथ मिलाकर एक नैनोपार्टिकल वैक्सीन बनाई जाती है जिसमें सह-स्थानीयकृत एंटीजन और विवो मूल्यांकन के लिए उपयुक्त सहायक होता है।

यह वर्तमान विधि पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल3 से संशोधित किया गया है। प्रमुख संशोधन सेल-मुक्त प्रतिक्रिया के स्केल-अप और प्रोटीन-एनएलपी कॉम्प्लेक्स के बाद के शुद्धिकरण पर केंद्रित हैं। एक और संशोधन में टेलोडेंड्रिमर के रूप में जाना जाने वाला एक एम्फीफिलिक बहुलक शामिल है, जिसे पहले सेल-मुक्त प्रतिक्रिया के अलावा लिपिड के साथ मिलाया जाता है। टेलोडेंड्रिमर और लिपिड की उपस्थिति में प्लास्मिड का सह-अनुवाद एक टेलोडेंड्रिमर एनएलपी (टीएनएलपी) का उत्पादन करता है। टेलोडेंड्रिमर के अलावा परिणामी टीएनएलपीनैनोकणों के आकार और मोनोडिस्प्रेरेबिलिटी को संशोधित करने में भी मदद करता है। यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से एक झिल्ली-बाध्य सबयूनिट एंटीजन प्रोटीन, क्लैमाइडिया एमओएमपी 5,6 का उत्पादन करने के लिए बड़े पैमाने पर वैक्सीन अध्ययन के लिए अनुकूलित है। विधि टीएनएलपी से जुड़े पुनः संयोजक एमओएमपी का उत्पादन करती है ताकि एक अत्यधिक घुलनशील एमओएमपी-टीएनएलपी कॉम्प्लेक्स बनाया जा सके जो एमओएमपी ऑलिगोमेराइजेशन को बरकरार रखता है। एक विशिष्ट 3 एमएल स्केल-अप उत्पादन > 1.5 मिलीग्राम शुद्ध एमओएमपी का उत्पादन करता है। सेल-मुक्त उत्पादित एमओएमपी-टीएनएलपी विवो इम्युनोजेनेसिटी परीक्षण में तेजी से सहायक जोड़ने के लिए उत्तरदायी है।

Protocol

सभी जानवरों के अध्ययन कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, इरविन में सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा (पीएचएस) -आश्वासन सुविधाओं में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा निर्धारित दिशानिर्देशों के अनुसार किए गए थे।

1. ग्लासवेयर की तैयारी

नोट: जानवरों के लिए वैक्सीन-ग्रेड फॉर्मूलेशन के उत्पादन में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्री एंडोटॉक्सिन-मुक्त हैं।

  1. दूषित एंडोटॉक्सिन को नष्ट करने के लिए, साफ किए गए ग्लासवेयर को बेक करें जो 4 घंटे के लिए 180 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में बफर रखेंगे।

2. बफर तैयारी

  1. तालिका 1 में सूचीबद्ध नी आत्मीयता शुद्धि बफर के 250 एमएल तैयार करें। उन्हें 6 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. प्रतिक्रिया की तैयारी

  1. 1,2-डिमिरिस्टोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (डीएमपीसी) के 20 मिलीग्राम को एंडोटॉक्सिन-मुक्त, 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में वजन करें। इसे एंडोटॉक्सिन-मुक्त पानी के 1 मिलीलीटर में घोलें, 1 मिनट के लिए 6 ए पर कम से कम चार बार जांच-सोनिकेट करें, बीच में 1 मिनट के विराम के साथ, स्पष्ट होने तक। 22 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 13,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा जांच से किसी भी दूषित धातु को हटा दें और फिर घुलनशील लिपिड को एक नए 1.5 एमएल एंडोटॉक्सिन-मुक्त ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. 1 मिलीग्राम पीईजी 5 के-सीए 8 टेलोडेंड्रिमर को 1.5 एमएल एंडोटॉक्सिन-मुक्त ट्यूब में वजन करें। एंडोटॉक्सिन मुक्त पानी में 20 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता में घुल ें। भंवर पूरी तरह से घुलने तक और 2 मिलीग्राम / एमएल तक पतला होने तक।
  3. एक नई एंडोटॉक्सिन-मुक्त ट्यूब में, 210 μL 20 mg / mL DMPC समाधान को 210 μL 2 mg / mL टेलोडेंड्रिमर समाधान के साथ मिलाएं।

4. सबयूनिट वैक्सीन फॉर्मूलेशन के लिए एमओएमपी-टीएनएलपी का सेल-फ्री उत्पादन

  1. पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल5 से संशोधित सेल-मुक्त विधियों का उपयोग करके एमओएमपी-टीएनएलपी तैयार करें।
    1. सेल-मुक्त प्रतिक्रिया स्थापित करने से दो घंटे पहले, प्रोकैरियोटिक सेल-मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति किट खोलें और पुनर्गठन बफर में से एक को पिघलाएं। एक बार पिघलने के बाद, ईडीटीए-मुक्त प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल की एक गोली जोड़ें और इसे पूरी तरह से घुलने दें।
  2. 5 x 1 एमएल प्रतिक्रियाओं को चलाने के लिए डिज़ाइन किए गए किट का उपयोग करके इस प्रोटोकॉल का पालन करें।
    नोट: एक विशिष्ट स्केल-अप उत्पादन 3 x 1 एमएल है।
    1. प्रत्येक 1 एमएल प्रतिक्रिया के लिए, ई कोलाई लाइसेट बोतल में 525 μL पुनर्गठन बफर जोड़ें और धीरे से घुलने के लिए रोल करें। प्रतिक्रिया योजक (जैसे, एटीपी, जीटीपी) युक्त बोतल में 250 μL पुनर्गठन बफर जोड़ें और धीरे से घुलने के लिए रोल करें।
    2. प्रतिक्रिया फ़ीड बोतल में 8.1 एमएल पुनर्गठन बफर जोड़ें, रबर स्टॉपर के साथ रीकैप करें (ध्यान रखें कि रबर स्टॉपर के अंदर को न छुएं), और घुलने के लिए धीरे से इनवर्ट / रोल करें।
    3. अमीनो एसिड मिश्रण की बोतल में 3 एमएल पुनर्गठन बफर जोड़ें, रबर स्टॉपर के साथ रीकैप करें, और घुलने के लिए धीरे से इनवर्ट / रोल करें।
      नोट: ध्यान रखें कि रबर स्टॉपर के अंदर को न छुएं क्योंकि इससे संदूषण हो सकता है।
    4. मेथिओनिन की बोतल में 1.8 एमएल पुनर्गठन बफर जोड़ें, घुलने के लिए धीरे से रोल करें, और फिर उपयोग तक बर्फ पर स्टोर करें।
  3. प्रतिक्रिया समाधान तैयार करें।
    1. ई कोलाई लाइसेट बोतल में, पुनर्गठित प्रतिक्रिया मिश्रण के 225 μL, मेथिओनिन के बिना पुनर्गठित अमीनो एसिड मिश्रण के 270 μL, और पुनर्गठित मेथिओनिन के 30 μL जोड़ें। इसके अतिरिक्त, डीएमपीसी / टेलोडेंड्रिमर मिश्रण के 400 μL, MOMP प्लास्मिड के 15 μg और त्रिभुज49ApoA1 प्लास्मिड के 0.6 μg जोड़ें। मिश्रण करने के लिए धीरे से हिलाएं।
      नोट: सुनिश्चित करें कि दोनों प्लास्मिड एक ही प्लास्मिड रीढ़ से निर्मित हैं। भंवर मत करो।
    2. कुल समाधान का 20 μL लें और इसे जीएफपी-व्यक्त नियंत्रण प्रतिक्रिया के लिए 1.5 एमएल ट्यूब में अलग रखें (नीचे देखें)।
  4. फ़ीड घोल तैयार करें। फ़ीड मिश्रण बोतल में, मेथिओनिन के बिना पुनर्गठित अमीनो एसिड मिश्रण के 2.65 एमएल और पुनर्गठित मेथिओनिन के 300 μL जोड़ें। घुलने के लिए धीरे से हिलाएं।
    नोट: इस समय, अप्रयुक्त पुनर्गठन बफर और मेथिओनिन को भंडारण के लिए फ्रीजर में वापस किया जा सकता है।
  5. सेल-मुक्त प्रतिक्रिया किट में प्रदान किए गए आंतरिक प्रतिक्रिया कक्ष में प्रतिक्रिया समाधान के 1 एमएल को स्थानांतरित करें और भरने पर सील करें। प्रतिक्रिया पोत और सील के बाहरी कक्ष में फ़ीड समाधान के 10 एमएल स्थानांतरित करें।
    नोट: कक्षों को ओवरफिल न करें! आंतरिक प्रतिक्रिया कक्ष और आंतरिक फ़ीड कक्ष दोनों के शीर्ष पर हवा के बुलबुले की उपस्थिति प्रतिक्रिया पर प्रतिकूल प्रभाव डालेगी। किसी भी शेष प्रतिक्रिया समाधान को 1.5 एमएल ट्यूब में रखा जा सकता है और मुख्य पोत के साथ मिश्रण करने की अनुमति दी जा सकती है।
  6. जीएफपी नियंत्रण प्लास्मिड (0.5 मिलीग्राम / एमएल) के 0.5 μL को पहले से अलीकोट किए गए 20 μL प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ें।
    नोट: गुणवत्ता-नियंत्रण उद्देश्यों के लिए कई किट ों को एक नियंत्रण प्लास्मिड के साथ आपूर्ति की जाती है। टी 7 प्रमोटर और ई.कोलाई राइबोसोम बाइंडिंग साइट (आरबीएस) के साथ प्लास्मिड व्यक्त करने वाले अधिकांश जीएफपी को नियंत्रण प्लास्मिड के रूप में भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
  7. प्रतिक्रिया को 300 आरपीएम पर एक शेकर में रखें, 30 डिग्री सेल्सियस 18 घंटे तक। यह सत्यापित करने के लिए कि प्रतिक्रिया सफल थी, 15 मिनट के इनक्यूबेशन के बाद नियंत्रण जीएफपी (चित्रा 1 ए) के संश्लेषण के कारण प्रतिदीप्ति की जांच करने के लिए यूवी प्रकाश स्रोत का उपयोग करें।
    नोट: इन स्थितियों, विशेष रूप से तापमान, को अन्य झिल्ली प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।

5. एमओएमपी-टीएनएलपी शुद्धिकरण

  1. कोशिका-मुक्त प्रतिक्रिया मिश्रण से एमओएमपी-टीएनएलपी नैनोपार्टिकल कॉम्प्लेक्स को शुद्ध करने के लिए स्थिर निकल आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करें।
    1. हिस-टैग शुद्धिकरण राल के 50% घोल के 1 एमएल को डिस्पोजेबल 10 एमएल क्रोमैटोग्राफी कॉलम में स्थानांतरित करें और इसे 3 एमएल बाइंडिंग बफर के साथ समतुल्य करें।
    2. बफर को सूखने दें, आउटलेट को कैप करें, और राल में बाइंडिंग बफर के 250 μL जोड़ें।
    3. स्तंभ में सेल-मुक्त प्रतिक्रिया जोड़ने से पहले, SDS-PAGE द्वारा बाद के विश्लेषण के लिए 20 μL सहेजें। सेल-मुक्त प्रतिक्रिया को समतुल्य राल के साथ मिलाएं और इसे 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रयोगशाला रॉकर पर इनक्यूबेट करें।
  2. कॉलम अनकैप करें, अतिरिक्त बाइंडिंग बफर के 500 μL के साथ कैप धो लें, और इस तरल को शेष कॉलम में जोड़ें।
  3. SDS-PAGE द्वारा बाद में विश्लेषण के लिए स्तंभ से तरल प्रवाह एकत्र करें।
  4. कॉलम को 20 एमएम इमिडाज़ोल युक्त 1 एमएल वॉश बफर के साथ छह बार धोएं और अंशों को इकट्ठा करें। ध्यान रखें कि राल को धोने के बीच सूखने न दें। दूसरे धोने पर, 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके ऊपर और नीचे पाइप करके राल को सख्ती से उत्तेजित करें।
  5. एमओएमपी-टीएनएलपी को क्षालन बफर 1 (जिसमें 250 एमएम इमिडाज़ोल होता है) के छह 300 μL अंशों में विभाजित किया जाता है, इसके बाद 300 μL क्षालन बफर 2 (500 mM इमिडाज़ोल युक्त) के साथ एक अंतिम क्षालन होता है। दूसरे क्षालन पर, 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके ऊपर और नीचे पाइप करके राल को सख्ती से उत्तेजित करें।

6. एसडीएस-पेज द्वारा विश्लेषण

नोट: रुचि के प्रोटीन की मात्रा और शुद्धता की जांच के लिए एसडीएस-पेज द्वारा सभी क्षालन अंशों का विश्लेषण किया जाना चाहिए।

  1. कुल लाइसेट और फ्लो-थ्रू में से प्रत्येक 1 μL लोड करें और फिर सभी एकत्रित वॉश और क्षालन अंशों के लिए 5 μL लोड करें।
    1. 4x SDS-PAGE नमूना लोडिंग बफर के साथ ELUTED MOMP-tNLP, वॉश, फ्लो-थ्रू और कुल लाइसेट के एलिकोट मिलाएं। जब तक अन्यथा संकेत न दिया गया हो, तब तक 10x नमूना कम करने वाले एजेंट के साथ नमूनों को मिलाएं और गर्मी से अलग करें।
    2. 1.0 मिमी, 4 से 12% का उपयोग करके जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा अंशों का विश्लेषण करें, एक उपयुक्त आणविक भार मानक के साथ 1x एमईएस-एसडीएस रनिंग बफर के साथ बीआईएस-ट्रिस एसडीएस-पेज जैल। जैल को 200 वोल्ट पर 35 मिनट के लिए चलाएं।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार जैल को दाग दें।
    1. कैसेट से जेल निकालें और इसे 60 एमएल जेल दाग में रखें। जेल को 30 सेकंड के लिए जेल दाग में माइक्रोवेव करें, और गर्मी को समान रूप से वितरित करने के लिए कंटेनर को धीरे से 30 सेकंड के लिए हिलाएं। दाग में जेल को एक और 30 सेकंड के लिए 80-85 डिग्री सेल्सियस तक माइक्रोवेव करें, और जेल को 5 मिनट के लिए रॉक करने के लिए ऑर्बिटल शेकर पर रखें।
    2. जेल को 30 सेकंड के लिए तीसरी बार माइक्रोवेव करें, और फिर 23 मिनट के लिए रॉक करने के लिए ऑर्बिटल शेकर पर वापस आ जाएं।
    3. जेल को एक साफ कंटेनर में स्थानांतरित करें और 30 मिनट के लिए 100 मिलीलीटर वॉश सॉल्यूशन (10% मेथनॉल, 7% एसिटिक एसिड) में धो लें।
      नोट: यह एक महत्वपूर्ण कदम है क्योंकि धोने के घोल को गर्म करने से बचने के लिए यह आवश्यक है। ऐसा करने में विफलता के परिणामस्वरूप पृष्ठभूमि धुंधला हो सकती है और अंतिम जेल छवि में अनियमितताएं हो सकती हैं।
    4. धोने के बाद, जेल को अल्ट्राप्योर पानी में 5 मिनट के लिए दो बार धो लें।
    5. 600 एनएम पर जेल इमेजर का उपयोग करके जैल की छवि बनाएं (चित्रा 2)। नैनोपार्टिकल समाधान में व्यक्तिगत प्रोटीन की मात्रा को निर्धारित करने के लिए एसडीएस-पेज का उपयोग करें यदि तुलना के लिए प्रोटीन मानक है।
      नोट: इस उदाहरण में, पुनः संयोजक रूप से व्यक्त एमओएमपी के सीरियल कमजोर पड़ने को एसडीएस-पेज द्वारा हल किया जाता है और बैंड के घनत्व को उपकरण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है।
    6. एमओएमपी बैंड की घनत्व का उपयोग करके एक मानक वक्र उत्पन्न करें। एक ही एसडीएस-पेज जेल पर एमओएमपी-टीएनएलपी नमूने हल करें और एमओएमपी मानक वक्र (चित्रा 3) का उपयोग करके कणों के एमओएमपी घटक की गणना करें।

7. पश्चिमी और डॉट ब्लॉट और भंडारण

  1. पश्चिमी सोख्ता के लिए, एसडीएस-पेज द्वारा नमूनों को हल करें और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार मानक सेटिंग्स के साथ वाणिज्यिक शुष्क सोख्ता प्रणाली का उपयोग करके जैल को स्थानांतरित करें।
    1. स्थानांतरण पूरा होने के बाद स्टैक से धब्बे हटा दें, और प्रत्येक धब्बे को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक उपयुक्त ब्लॉकिंग बफर में इनक्यूबेट करें, जिसमें 0.2% ट्वीन 20 और या तो 0.5 मिलीग्राम / एमएल एमएबी 40 या 0.2 मिलीग्राम / एमएल एमएबीएचआईएस एंटी-हिस-टैग एंटीबॉडी शामिल हैं।
      नोट: ब्लोटिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी कमजोर पड़ने से एमएबी 40 के लिए 1: 1,000 और एमएबीएचआईएस एंटीबॉडी के लिए 1: 500-1,000 हैं।
    2. पीबीएस-टी (1x PBS, 0.2% ट्वीन 20, pH 7.4) के साथ 5 मिनट के लिए प्रत्येक धब्बा को 3 बार धोएं।
    3. 1: 10,000 कमजोर पड़ने पर फ्लोरोफोरे (जैसे, आईआरडाई) से संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी युक्त बफर को अवरुद्ध करने में 1 घंटे के लिए धब्बों को इनक्यूबेट करें।
    4. पीबीएस-टी के साथ 5 मिनट के लिए धब्बों को 3 बार धोएं। अंतिम धोने के बाद धब्बों की छवि बनाने के लिए एक प्रतिदीप्ति इमेजर का उपयोग करें।
  2. डॉट ब्लॉट्स के लिए, शुद्ध एमओएमपी-टीएनएलपी के ब्लॉट 3 μg और डॉट ब्लॉट उपकरण का उपयोग करके खाली टीएनएलपी। पश्चिमी सोख्ता के लिए ऊपर वर्णित समान तरीकों का उपयोग करके धब्बों को ब्लॉक और विकसित करें।

8. एंडोटॉक्सिन मूल्यांकन

  1. लिम्यूलस एमेबोसाइट लाइसेट (एलएएल) परख के आधार पर एंडोटॉक्सिन परीक्षण प्रणाली का उपयोग करके एंडोटॉक्सिन के स्तर को निर्धारित करें। एंडोटॉक्सिन-मुक्त 25 एमएम ट्रिस, पीएच 7.4, 1 एम ट्रिस हाइड्रोक्लोराइड समाधान और एंडोटॉक्सिन-मुक्त पानी का उपयोग करके नमूना बफर तैयार करें।
    नोट: आमतौर पर, नमूनों को इस नमूना बफर का उपयोग करके पतला करने की आवश्यकता होती है, और अलग-अलग नमूनों के लिए उपयुक्त सीमा खोजने के लिए कमजोर पड़ने को समायोजित किया जाता है। यहां, एमओएमपी-टीएनएलपी नमूने नमूना बफर में 500 गुना पतला होते हैं और 25 μL को 0.05 EU / mL संवेदनशीलता के साथ डिवाइस कारतूस के प्रत्येक कुएं में लोड किया जाता है। नीचे वर्णित माउस अध्ययनों में उपयोग किए जाने वाले एमओएमपी-टीएनएलपी और खाली टीएनएलपी के एंडोटॉक्सिन स्तर नमूने के आधार पर 0.4 से 12 ईयू /

9. लियोफिलाइजेशन।

  1. -20 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक (वर्षों तक) उपयोग के लिए एमओएमपी-टीएनएलपी नैनोकणों को लियोफिलाइज और स्टोर करें। लियोफिलाइजेशन के लिए टीएनएलपी और एमओएमपी-टीएनएलपी निलंबन तैयार करने के लिए, ठंड और लियोफिलाइजेशन प्रक्रिया के दौरान एक रक्षक के रूप में ट्रेहलोस जोड़ें।
    नोट: इस प्रक्रिया को विभिन्न प्रकार के टीएनएलपी फॉर्मूलेशन 7,8 के लिए बड़े पैमाने पर मान्य किया गया है।
  2. 0.1 एम ट्रेहलोस की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए आवश्यक बाँझ, एंडोटॉक्सिन-मुक्त, विआयनीकृत पानी में 1 एम ट्रेहलोस की मात्रा प्राप्त करने के लिए एमओएमपी-टीएनएलपी समाधान की वर्तमान मात्रा को 9 से विभाजित करें। अंतिम मात्रा पर ध्यान दें और इच्छानुसार एंडोटॉक्सिन-मुक्त 15 एमएल या 50 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में एलिकोट करें।
  3. सूखी बर्फ पर मिश्रित घोल को फ्रीज करें और लियोफिलाइज़र का उपयोग करके इसे रात भर लियोफिलाइज़ करें। सूखे फॉर्मूलेशन को -20 डिग्री सेल्सियस पर जरूरत पड़ने तक स्टोर करें।
  4. एंडोटॉक्सिन-मुक्त पानी का उपयोग करके लियोफिलाइज्ड टीएनएलपी का पुनर्गठन करें। धीरे-धीरे रोल करें जब तक कि लियोफिलाइज्ड केक पूरी तरह से घुल न जाए और पुनर्जलित न हो जाए। ट्रेहलोज को हटाने के लिए, 3.5 केडीए कटऑफ डायलिसिस झिल्ली का उपयोग करके पीबीएस के खिलाफ समाधान को डायलाइज करें।

10. सहायक जोड़

नोट: ये और इसी तरह के अन्य एनएलपी-आधारित उप-इकाई वैक्सीन फॉर्मूलेशन आसानी से सीपीजी -ODN1826 और एफएसएल -1 जैसे लिपोफिलिक सहायक को शामिल कर सकते हैं। सीपीजी-ODN1826 एक संशोधित क्लास बी सीपीजी ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड (5'-tccatgacgttcctgacgtt-3') है, जिसमें एक पूर्ण फॉस्फोरोथियोएट रीढ़ होती है जिसमें 5'कोलेस्ट्रॉल मोइटी (5'-चोल-सी 6) होता है। टीएनएलपी के लिए सीपीजी -ODN1826 के संयुग्मन को टीएनएलपी के कोलेस्ट्रॉल मोइटी और फॉस्फोलिपिड बाइलेयर के बीच हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन द्वारा मध्यस्थ किया जाता है और इसे प्रदर्शित और अच्छी तरह से चित्रित किया गया है, जैसा कि पहले 9,10 बताया गया था।

  1. इन योगों में शामिल करने से पहले, दूषित एंडोटॉक्सिन के साथ-साथ किसी भी असंशोधित सीपीजी अणुओं को हटाने के लिए रिवर्स-फेज क्रोमैटोग्राफी द्वारा कोलेस्ट्रॉल-संशोधित सीपीजी को शुद्ध करें।
    1. विक्रेता से प्राप्त होने पर, एंडोटॉक्सिन-मुक्त पानी में लियोफिलाइज्ड सीपीजी सामग्री को फिर से हाइड्रेट करें और इसे 10 एमएम ट्राइथाइलअमोनियम एसीटेट (टीईएए) (मोबाइल चरण ए) और एसिटोनिट्राइल (मोबाइल चरण बी) से युक्त पृथक्करण ढाल का उपयोग करके एक प्रारंभिक सी 4 आरपी-एचपीएलसी कॉलम पर शुद्ध करें।
      नोट: अतिरिक्त विवरण तालिका 2 में उपलब्ध हैं।
    2. कोलेस्ट्रॉल-संशोधित सीपीजी युक्त अंशों को पूल और लियोफिलाइज करें। अवशिष्ट टीईएए के पूर्ण निष्कासन को सुनिश्चित करने के लिए, सीपीजी को 15 एमएल एंडोटॉक्सिन-मुक्त पानी के साथ पुनर्गठित करें और इसे तीन बार फिर से लियोफिलाइज करें।
    3. अंतिम लियोफिलाइजेशन के बाद, एंडोटॉक्सिन-मुक्त पानी (>20 मिलीग्राम / एमएल अंतिम सीपीजी एकाग्रता), एलिकोट में सीपीजी का पुनर्गठन करें, और इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर आवश्यक होने तक स्टोर करें। फॉर्मूलेशन के अलावा, सीपीजी को 1-2.5 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता तक पतला करें।
      नोट: एफएसएल -1 एक वैक्सीन-ग्रेड, लियोफिलाइज्ड पाउडर के रूप में उपलब्ध है। यह 1 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर बाँझ और एंडोटॉक्सिन मुक्त पानी का उपयोग करके पुनर्गठित किया जाता है। वैक्सीन को इंट्रामस्क्युलर रूप से (यानी) प्रशासित किया जाता है, जिसमें प्रत्येक खुराक में 50 μL की कुल मात्रा में 10 μg MOMP होता है।
  2. वांछित फॉर्मूलेशन खुराक प्राप्त करने के लिए, नैनोकणों को पीबीएस में डायलाइज करें और सहायक जोड़ से पहले केन्द्रापसारक वैक्यूम कंसंट्रेटर का उपयोग करके उन्हें केंद्रित करें। नमूने के पूर्ण सूखने को रोकने के लिए ऐसा करते समय ध्यान रखें- सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान हर 20-30 मिनट में नमूना मात्रा की जांच करें।
  3. जैव सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ परिस्थितियों के तहत सहायक जोड़ें। सफल निगमन का आकलन करने के लिए, विश्लेषणात्मक आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) द्वारा अंतिम योगों और उनके घटकों का विश्लेषण करें।
    नोट: इन तैयारियों के लिए, पीबीएस बफर (प्रवाह दर में 0.5 एमएल / मीटर) में एक एसईसी कॉलम का उपयोग किया गया था, और यूवी-विस डायोड सरणी डिटेक्टर का उपयोग करके क्षालन का पता लगाया गया था। निगमन का मूल्यांकन 214 और 280 एनएम पर असंबद्ध कणों के साथ सहायक कणों के अवशोषण की तुलना करके किया गया था।
  4. 14 दिनों तक की अवधि के लिए पशु उपयोग से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर सहायक एमओएमपी-टीएनएलपी और खाली टीएनएलपी स्टोर करें। एक नए टीएनएलपी फॉर्मूलेशन की स्थिरता का पूरी तरह से आकलन करने के लिए, समय-समय पर एसईसी द्वारा संग्रहीत टीएनएलपी का विश्लेषण करें।
    नोट: स्थिरता सूत्रीकरण से सूत्रीकरण तक भिन्न होगी।

11. सीरम परीक्षण

  1. मादा 3 सप्ताह के चूहों को प्राप्त करें (बीएएलबी / सी, एन = 6)।
  2. चूहों को इंट्रामस्क्युलर रूप से (यानी) प्रत्येक हिंदलिम्ब में एमओएमपी के 10 μg के साथ एमओएमपी के 10 μg के साथ टीकाकरण करें, जिसमें 5 μg CPG और 1 μg FSL-1 (प्रति इंजेक्शन कुल मात्रा = 50 एमएल) शामिल है।
  3. टीकाकरण के बाद, चूहों का निरीक्षण करें जब तक कि वे उरोस्थि पुनरावृत्ति को बनाए रखने में सक्षम न हों।
  4. प्रारंभिक टीकाकरण (प्राइम) के चार सप्ताह बाद, जानवरों को दूसरी बार (बूस्ट) एमओएमपी-टीएनएलपी के रूप में एमओएमपी के 10 μg के साथ 5 μg CPG और 1 μg FSL-1 (प्रति इंजेक्शन कुल मात्रा = 50 एमएल) के साथ टीका लगाएं।
  5. प्रारंभिक टीकाकरण के बाद 56 वें दिन, एंटीबॉडी टिटर्स का आकलन करने के लिए रक्त एकत्र करें। जाइलज़िन (0.3 मिलीग्राम / 20 ग्राम शरीर का वजन) और केटामाइन (3.0 मिलीग्राम / 20 ग्राम शरीर के वजन) के घोल को इंजेक्ट करके चूहों को एनेस्थेटाइज करके शुरू करें। यह सुनिश्चित करने के लिए सामने और पीछे के पैरों को पिंच करें कि कोई झटका नहीं है। एनेस्थीसिया के दौरान आंखों के सूखेपन को रोकने के लिए आंखों के आसपास पेट्रोलियम जेली लगाएं।
  6. एक माइक्रो-हेमटोक्रिट केशिका ट्यूब का उपयोग करके, रेट्रो-ऑर्बिटल प्लेक्सस को पंचर करें। एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 100 एमएल रक्त एकत्र करें।
  7. रक्त संग्रह के बाद, चूहों का निरीक्षण करें जब तक कि वे संज्ञाहरण से ठीक न हो जाएं और उरोस्थि की पुनरावृत्ति को बनाए रख सकें।
  8. रक्त के थक्के को 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें और फिर 10 मिनट के लिए 2,000 × ग्राम पर घूमें। सीरम इकट्ठा करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
  9. इस समय, क्लैमाइडिया मुरिडेरम के साथ जानवरों को चुनौती दें या उन्हें इच्छामृत्यु दें। चूहों को पहले ज़ाइलेज़िन (0.3 मिलीग्राम / 20 ग्राम शरीर के वजन) और केटामाइन (3.0 मिलीग्राम / 20 ग्राम शरीर के वजन) के घोल को इंजेक्ट करके चूहों को इच्छामृत्यु दें, इसके बाद ग्रीवा अव्यवस्था।
  10. ऊपर वर्णित पश्चिमी सोख्ता तकनीकों का उपयोग करके एमओएमपी के लिए विशिष्ट सीरम एंटीबॉडी का परीक्षण करें। सभी प्रतिरक्षित चूहों से माउस सेरा पूल करें और 1: 5,000 कमजोर पड़ने पर प्राथमिक एंटीबॉडी के स्थान पर पूल किए गए सीरम का उपयोग करें।

Representative Results

1 एमएल सेल-मुक्त प्रतिक्रिया से एमओएमपी-टीएनएलपी के एनआई आत्मीयता शुद्धिकरण का एसडीएस-पेज प्रोफाइल चित्र 1 बी में दिखाया गया है। प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप एमओएमपी और 49एपोए 1 प्रोटीन दोनों के लिए अभिव्यक्ति के उच्च स्तर हुए। पिछले परिणामों से पता चला है कि डीएमपीसी और टेलोडेंड्रिमर की उपस्थिति में त्रिभुज 49एपीओए 1 की सेल-मुक्त अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप टेलोडेंड्रिमर नैनोलिपोप्रोटीन कणों (टीएनएलपी) 4 का निर्माण हुआ। एमओएमपी के सह-क्षालन से संकेत मिलता है कि एमओएमपी टीएनएलपी के साथ जुड़ा हुआ है, क्योंकि हिज-टैग केवल टीएनएलपी मचान पर मौजूद है, न कि एमओएमपी पर। एमओएमपी एक अत्यधिक अघुलनशील प्रोटीन है जिसे केवल टीएनएलपी के साथ कॉम्प्लेक्सिंग के माध्यम से जोड़ा जा सकता है, जिसे झिल्ली प्रोटीन के घुलनशीलता को सुविधाजनक बनाने के लिए दिखाया गया है।

एमओएमपी-टीएनएलपी युक्त क्षालन अंशों को पूल किया गया था और प्रतिदीप्ति-आधारित मात्रा उपकरण का उपयोग करके कुल प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित की गई थी, या एक उपकरण जो प्रोटीन की मात्रा के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए 280 एनएम पर अवशोषण के माध्यम से एकाग्रता को मापता है। एमओएमपी वैक्सीन की सटीक खुराक की अनुमति देने के लिए, शुद्ध परिसरों में एमओएमपी की एकाग्रता निर्धारित करना भी महत्वपूर्ण है। हमने जेल डेंसिटोमेट्री (चित्रा 2) के आधार पर एमओएमपी को मापने के लिए एक विधि विकसित की, जिसमें ज्ञात एकाग्रता के साथ एक शुद्ध पुनः संयोजक एमओएमपी का उपयोग मानक के रूप में किया गया था। मानक वक्र स्थापित करके और एमओएमपी-टीएनएलपी नमूने से तुलना करके, एमओएमपी एकाग्रता को सटीक रूप से निर्धारित किया जा सकता है। शुद्ध नमूने में एमओएमपी एकाग्रता के निर्धारण ने विभिन्न पैमानों पर सेल-मुक्त प्रतिक्रियाओं में एमओएमपी की उपज का अनुमान लगाने में सक्षम बनाया, जो डाउनस्ट्रीम अध्ययनों के लिए उपयुक्त प्रतिक्रिया सेटअप की योजना बनाने के लिए महत्वपूर्ण है (तालिका 3)।

एमओएमपी को एक मजबूतप्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए ऑलिगोमर्स बनाने की आवश्यकता है। एमओएमपी की ऑलिगोमेरिक स्थिति का परीक्षण करने के लिए, एमओएमपी-टीएनएलपी का विश्लेषण गर्मी और कम करने वाले एजेंट डिथियोथ्रेइटोल (डीटीटी, 50 एमएम, चित्रा 3 ए) दोनों की उपस्थिति और अनुपस्थिति में किया गया था। एमओएमपी के उच्च-क्रम वाले ऑलिगोमर्स की पहचान एसडीएस-पेज के माध्यम से की गई थी जब नमूनों को गर्मी और डीटीटी के साथ इलाज नहीं किया गया था। इसकी तुलना में, डीटीटी की उपस्थिति में गर्मी के साथ इलाज किए गए नमूनों ने जेल पर मुख्य रूप से दो अलग-अलग बैंड दिखाए, जो एमओएमपी और 49एपीओए 1 (क्रमशः लगभग 40 केडीए और 22 केडीए) के अनुरूप थे। ये परिणाम एमओएमपी के ऑलिगोमर गठन के लिए जिम्मेदार जेल बैंडिंग पैटर्न से निकटता से मिलते जुलते हैं, जो इसकी प्रभावशीलता के लिए महत्वपूर्ण है।

एमओएमपी प्रोटीन के चर डोमेन पर रैखिक एपिटोप के खिलाफ एक एंटीबॉडी, एमएबी 40 का उपयोग करके आगे पश्चिमी धब्बा विश्लेषण ने एक समान बैंडिंग पैटर्न दिखाया, जो एमओएमपी प्रोटीन द्वारा ओलिगोमर गठन की पुष्टि करता है। एमओएमपी ऑलिगोमर गठन को प्रभावित करने वाला एक महत्वपूर्ण कारक सेल-मुक्त प्रतिक्रिया सेटअप के दौरान एमओएमपी प्लास्मिड और 49एपीओए 1 प्लास्मिड के बीच का अनुपात है। तालिका 4 में प्लास्मिड के अनुपात और टीएनएलपी में एमओएमपी की परिणामी सम्मिलन दर को सूचीबद्ध किया गया है। पिछले अध्ययनों से संकेत मिलता है कि क्लैमाइडियाल एमओएमपी और अन्य बाहरी झिल्ली प्रोटीन मुख्य रूप से ट्रिमर्स12 के रूप में मौजूद हो सकते हैं। सेल-मुक्त प्रतिक्रिया में ट्रिमर गठन को अधिकतम करने के लिए, प्रति एनएलपी तीन एमओएमपी प्रोटीन के करीब सम्मिलन दर होना वांछनीय है, जो ~ 25: 1 एमओएमपी-टू-49एपीओए 1 प्लास्मिड अनुपात से मेल खाती है।

एमओएमपी और टीएनएलपी की उपस्थिति का पता लगाने के लिए एक डॉट ब्लॉट परख का उपयोग अधिक सुव्यवस्थित विधि के रूप में किया गया था। कुल एमओएमपी का पता लगाने के लिए एमएबी 40 एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था। टीएनएलपी की उपस्थिति का आकलन करने के लिए टीएनएलपी के 49एपीओए1 पाड़ पर हिस-टैग को लक्षित एमएबीएचआईएस एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था। एमएबी 40 और एमएबीएचआईएस एंटीबॉडी के सह-सिग्नलिंग ने एमओएमपी-टीएनएलपी गठन का संकेत दिया। नियंत्रण प्रतिक्रिया ने खाली टीएनएलपी का उत्पादन किया, जिसने केवल एमएबीएचआईएस (चित्रा 3 सी) से सकारात्मक संकेत दिखाया। सेल-फ्री रिएक्शन में उत्पादित एमओएमपी-टीएनएलपी की इम्युनोजेनेसिटी का परीक्षण करने के लिए, हमने सीपीजी + एफएसएल -1 के साथ एमओएमपी-टीएनएलपी को जोड़ा और ऊपर वर्णित प्राइम-बूस्ट आहार में चूहों में इंट्रामस्क्युलर रूप से (यानी) इंजेक्शन दिया। सेरा को प्रतिरक्षित चूहों से एकत्र किया गया था, और एमओएमपी-विशिष्ट आईजीजी एंटीबॉडी को पश्चिमी धब्बा परख (चित्रा 4) का उपयोग करके मापा गया था। एडजुवेंट एमओएमपी-टीएनएलपी के साथ इंजेक्ट किए गए चूहों के सेरा ने मजबूत एमओएमपी बाइंडिंग दिखाई, जो दर्शाता है कि एमओएमपी-टीएनएलपी विवो में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्राप्त कर सकता है।

Figure 1
चित्र 1: एमओएमपी-टीएनएलपी की अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण । (ए) सेल-मुक्त प्रतिक्रिया के छोटे एलिकोट वाले ट्यूबों की छवि जो जीएफपी प्लास्मिड (बाएं) के बिना लाइसेट की तुलना में यूवी प्रकाश स्रोत (दाएं) के तहत जीएफपी नियंत्रण को सफलतापूर्वक व्यक्त करती है। (ख) एसडीएस-पेज के बाद एसवाईपीआरओ रूबी से सना प्रोटीन जेल एमओएमपी-टीएनएलपी की शुद्धिकरण प्रोफाइल को दर्शाता है। एमओएमपी 40 केडीए पर माइग्रेट करता है और 49एपीओए1 22 केडीए पर माइग्रेट होता है। संक्षेप: एमओएमपी = क्लैमाइडिया प्रमुख बाहरी झिल्ली प्रोटीन; टीएनएलपी = टेलोडेंड्रिमर नैनोलिपोप्रोटीन कण; एमओएमपी-टीएनएलपी = एमओएमपी-टीएनएलपी कॉम्प्लेक्स; जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन-एन्कोडिंग प्लास्मिड; एमडब्ल्यू = आणविक भार मार्कर; टी = कुल सेल-मुक्त लाइसेट; एफटी = प्रवाह-थ्रू; आर 1-आर 3 = सेल-मुक्त प्रतिक्रिया एलिकोट; W1, W6 = धोया 1 और 6; E1-E7 = 1 से 7 तक का क्षतिन; त्रिभुज49ApoA1 = उसका टैग किया गया माउस ApoA1 व्युत्पन्न। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एमओएमपी-टीएनएलपी नमूनों में एमओएमपी का परिमाणीकरण। (ए) एमओएमपी की मात्रा का निर्धारण करने के लिए एसवाईपीआरओ रूबी के साथ सना एसडीएस-पेज जेल। मानक वक्र प्राप्त करने के लिए ज्ञात एकाग्रता के साथ पुनः संयोजक एमओएमपी को जेल पर लोड किया गया था। प्रत्येक लेन में 0.1 μg, 0.5 μg, 1.0 μg, 2.0 μg और 4.0 μg MOMP शामिल थे। एमओएमपी-टीएनएलपी के जिन नमूनों की मात्रा निर्धारित की जा रही थी, उन्हें उसी जेल पर लोड किया गया था। (बी) एमओएमपी एकाग्रता मानक वक्र डेंसिटोमेट्री का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था। सामान्यीकृत बैंड घनत्व और एमओएमपी की मात्रा से संबंधित एक समीकरण स्थापित किया गया था। समीकरण का उपयोग अज्ञात नमूनों में एमओएमपी सामग्री की गणना करने के लिए किया गया था। संक्षेप: एमओएमपी = क्लैमाइडिया प्रमुख बाहरी झिल्ली प्रोटीन; टीएनएलपी = टेलोडेंड्रिमर नैनोलिपोप्रोटीन कण; एमओएमपी-टीएनएलपी = एमओएमपी-टीएनएलपी कॉम्प्लेक्स; एसडीएस-पेज = सोडियम डोडेसिलसल्फेट पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सेल-मुक्त-उत्पादित एमओएमपी-टीएनएलपी एमओएमपी को उच्च-क्रम संरचनाओं को बनाने की अनुमति देता है। (ए) एमओएमपी-टीएनएलपी का एसडीएस-पेज जेल, गर्मी के उपचार के साथ और बिना और एसवाईपीआरओ रूबी से सना एजेंट डीटीटी को कम करना। गर्मी और डीटीटी के साथ, एमओएमपी मुख्य रूप से ~ 40 केडीए पर एक मोनोमर बैंड के रूप में दिखाई दिया, क्योंकि गर्मी और कम करने वाले एजेंट ने उच्च क्रम के एमओएमपी संरचना के बहुमत को तोड़ दिया। गर्मी और डीटीटी की अनुपस्थिति में, उच्च-क्रम बैंड मौजूद थे, जो एमओएमपी ऑलिगोमर रचना का संकेत देते थे। (ख) अकेले एमओएमपी-टीएनएलपी और एमओएमपी का पश्चिमी धब्बा, अनुपचारित और गर्मी और डीटीटी के साथ उपचारित किया जाता है। स्थानांतरण के बाद, झिल्ली को एमएबी 40 (1: 1,000 कमजोर पड़ने) के साथ जांच की गई थी। SYPRO रूबी-दाग वाले जेल के समान एक बैंडिंग पैटर्न देखा गया, जो पुष्टि करता है कि उच्च आणविक भार बैंड वास्तव में MOMP ऑलिगोमर्स थे। (ग) एमओएमपी-टीएनएलपी के डॉट ब्लॉट और खाली टीएनएलपी नमूनों (दो प्रतियों में) की एमएबी40 और एमएबीएचआईएस से जांच की गई। संक्षेप: एमओएमपी = क्लैमाइडिया प्रमुख बाहरी झिल्ली प्रोटीन; टीएनएलपी = टेलोडेंड्रिमर नैनोलिपोप्रोटीन कण; एमओएमपी-टीएनएलपी = एमओएमपी-टीएनएलपी कॉम्प्लेक्स; एसडीएस-पेज = सोडियम डोडेसिलसल्फेट पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन; डीटीटी = डिथियोथ्रेइटोल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: सेल-मुक्त-उत्पादित एमओएमपी-टीएनएलपी अत्यधिक इम्युनोजेनिक है। प्रतिरक्षित चूहों के सीरम ने मजबूत एंटी-एमओएमपी आईजीजी संकेत दिखाया। चूहों को प्रतिरक्षित करने के लिए सीपीजी + एफएसएल -1 के साथ सहायक एमओएमपी-टीएनएलपी का उपयोग किया गया था। छह प्रतिरक्षित चूहों से सेरा एकत्र किया गया, पूल किया गया, और एमओएमपी-टीएनएलपी की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया। सीरम एक पश्चिमी सोख्ता परख में एमओएमपी को बांधने में सक्षम था और मजबूत आईजीजी सिग्नल (बाएं) दिखाया। प्राथमिक एंटीबॉडी (दाएं) के रूप में एमएबी 40 का उपयोग करने वाले पश्चिमी धब्बा ने समान बैंड दिखाए, यह दर्शाता है कि सीरम में एमओएमपी-विशिष्ट आईजीजी था। संक्षेप: एमओएमपी = क्लैमाइडिया प्रमुख बाहरी झिल्ली प्रोटीन; टीएनएलपी = टेलोडेंड्रिमर नैनोलिपोप्रोटीन कण; एमओएमपी-टीएनएलपी = एमओएमपी-टीएनएलपी कॉम्प्लेक्स; सीपीजी = कोलेस्ट्रॉल-संशोधित सीपीजी सहायक; एफएसएल -1 = लिपोफिलिक सहायक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

बफर नाम NaH2PO4 NaCl इमिडाज़ोल पीएच
बाइंडिंग बफर 50 mM 300 mM 10 mM 8.0
वॉश बफर 50 mM 300 mM 20 mM 8.0
क्षालन बफर 1 50 mM 300 mM 250 mM 8.0
क्षालन बफर 2 50 mM 300 mM 500 mM 8.0

तालिका 1: निकल आत्मीयता शुद्धिकरण के लिए आवश्यक बफर की सूची प्रत्येक घटक और पीएच की सांद्रता का विवरण देती है।

रनटाइम 50 मिनट
प्रवाह दर 6.0 एमएल /
ढाल प्रकार दोहरा
बफर ए एच20 में 10 एमएम टीईएए
बफर बी MECN
ढाल % बफर बी
0 मिनट 25%
30 मिनट 60%
30.5 मिनट 100%
40 मिनट 100%
40.5 मिनट 25%
50 मिनट 25%

तालिका 2: कोलेस्ट्रॉल-संशोधित सीपीजी के उलट चरण एचपीएलसी शुद्धिकरण के लिए शर्तें। संक्षेप: टीईएए = ट्राइथाइलअमोनियम एसीटेट; एमसीएन = एसिटोनिट्राइल।

सेल-मुक्त लाइसेट (एमएल) डीएमपीसी लिपिड (मिलीग्राम) टेलोडेंड्रिमर (मिलीग्राम) एमओएमपी प्लास्मिड (μg) शुद्ध एमओएमपी उपज (मिलीग्राम)
1 4 0.4 15 0.5
2 8 0.8 30 1.1
3 12 1.2 45 1.6
5 20 2 75 2.7

तालिका 3: लिपिड, टेलोडेंड्रिमर और प्लास्मिड की मात्रा का उपयोग अलग-अलग स्केल सेल-मुक्त प्रतिक्रियाओं और संबंधित पैदावार के लिए किया जाता है। संक्षेप: एमओएमपी = क्लैमाइडिया प्रमुख बाहरी झिल्ली प्रोटीन; डीएमपीसी = 1,2-डिमिरिस्टोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन।

प्लास्मिड इनपुट का अनुपात, MOMP: Δ49ApoA1 1:1 5:1 10:1 25:1 50:1 100:1
उत्पादित प्रोटीन की मात्रा का अनुपात, MOMP: Δ49ApoA1 0.02 0.32 0.64 3.46 6.55 20.04
प्रति टीएनएलपी एमओएमपी सम्मिलन की अनुमानित संख्या 0.03 0.37 0.75 4.04 7.65 23.39

तालिका 4: एक सेल-मुक्त प्रतिक्रिया में प्लास्मिड अनुपात और परिणामस्वरूप एमओएमपी सम्मिलन दर। संक्षेप: एमओएमपी = क्लैमाइडिया प्रमुख बाहरी झिल्ली प्रोटीन; टीएनएलपी = टेलोडेंड्रिमर नैनोलिपोप्रोटीन कण; त्रिभुज49ApoA1 = उसका टैग किया गया माउस ApoA1 व्युत्पन्न।

Discussion

क्लैमाइडिया सबसे आम यौन संचारित संक्रमण है जो पुरुषों और महिलाओं दोनों को प्रभावित करता है। हालांकि क्लैमाइडिया पर वैक्सीन अनुसंधान दशकों तक फैला हुआ है, लेकिन एक सुरक्षित और प्रभावी टीका जिसे बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए बढ़ाया जा सकताहै, अभी भी अज्ञात है। क्लैमाइडिया एमओएमपी को सुरक्षात्मक वैक्सीन एंटीजन के रूप में प्रमुख उम्मीदवार माना जाता है; हालांकि, एमओएमपी अत्यधिक हाइड्रोफोबिक है और गलत फोल्डिंग14,15 के लिए प्रवण है। आगे के अध्ययन से पता चला है कि एमओएमपी ओलिगोमेरिक राज्यों में मौजूद है जो इसकी इम्युनोजेनेसिटी11 के लिए आवश्यक हैं। यहां विस्तृत एक मान्य, सेल-मुक्त सह-अभिव्यक्ति विधि है जो टीएनएलपी नैनोपार्टिकल के भीतर एक वैक्सीन के रूप में गठित ऑलिगोमेरिक एमओएमपी का उत्पादन करती है, जिसमें प्रति 3 एमएल लाइसेट में लगभग 1.5 मिलीग्राम शुद्ध एमओएमपी की पैदावार होती है। इस पूरी तरह से संगठित प्रक्रिया को औद्योगिक उत्पादन के लिए और बढ़ाया जा सकता है, जिससे टीकों के उत्पादन के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण के रूप में इसकी संभावनाएं बढ़ सकती हैं।

हमने पहले एनएलपी 3,16 के भीतर एम्बेडेड झिल्ली प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए सेल-मुक्त अभिव्यक्ति का उपयोग करने के साथ-साथ टेलोडेंड्रिमर-स्थिर डिस्क में अभिव्यक्ति पर प्रकाशित किया है। हालांकि, इस बाद की तकनीक ने अधिक विषमता और कम घुलनशीलता के साथ झिल्ली-प्रोटीन कणों का उत्पादन किया। इसके अतिरिक्त, एमओएमपी-टेलोडेंड्रिमर कणों की इम्युनोजेनेसिटी एमओएमपी-टीएनएलपीकणों की तुलना में स्पष्ट नहीं है।

इस प्रक्रिया को बैक्टीरियल मेम्ब्रेन प्रोटीन की अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जो सबयूनिट टीकों में उपयोग के लिए एंटीजन के रूप में आशाजनक उम्मीदवार हैं। न केवल यह प्रक्रिया घुलनशील जीवाणु झिल्ली प्रोटीन का उत्पादन करती है, बल्कि समग्र नैनोपार्टिकल संरचना विभिन्न प्रकार के लिपोफिलिक वैक्सीन सहायक दवाओं का उपयोग करके आगे संशोधन के लिए उत्तरदायी है, जिसमें कोलेस्ट्रॉल मोइटी या एफएसएल -1 के लिए संयुग्मित सीपीजी शामिल है, लेकिन सीमित नहीं है। बैक्टीरिया से अन्य उम्मीदवार एंटीजन की अभिव्यक्ति संभव है, हालांकि इष्टतम पैदावार प्राप्त करने के लिए अभिव्यक्ति तापमान, लिपिड पसंद और अभिव्यक्ति प्रणाली के प्रकार जैसे मापदंडों का पता लगाने की आवश्यकता हो सकती है।

इसके अतिरिक्त, इस प्रक्रिया में प्लास्मिड विकल्प और अनुपात महत्वपूर्ण हैं। उपयोग किए जाने वाले दोनों प्लास्मिड का निर्माण एक ही रीढ़ की हड्डी से किया जाना चाहिए। यदि आवेषण लगभग समान लंबाई के हैं, तो अनुपात प्लास्मिड के द्रव्यमान पर आधारित हो सकते हैं, जैसा कि यहां वर्णित है। हालांकि, मोल्स पर आधारित अनुपात अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम देगा, खासकर जब प्रतिक्रियाओं को स्केल किया जाता है। स्क्रीन-स्केल प्रतिक्रियाओं (< 0.5 एमएल) में अच्छी तरह से काम करने वाले अनुपात बड़ी प्रतिक्रियाओं पर लागू नहीं हो सकते हैं और अतिरिक्त अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। गैर-झिल्ली प्रोटीन को अभी भी सेल-मुक्त किट का उपयोग करके व्यक्त किया जा सकता है, लेकिन घुलनशील उत्पाद का उत्पादन करने के लिए लिपिड नैनोपार्टिकल (सह-अभिव्यक्ति) की आवश्यकता नहीं हो सकती है। इसके अतिरिक्त, जबकि यह प्रोटोकॉल सीपीजी और एफएसएल -1 के साथ सहायक होने का वर्णन करता है, यह प्रणाली अन्य लिपोफिलिक सहायक दवाओं के साथ निर्माण या इच्छानुसार घुलनशील सहायक दवाओं के साथ मिश्रण करने के लिए उपयुक्त है।

सेल-मुक्त अभिव्यक्ति प्रतिक्रिया स्थापित करते समय संदूषण से बचना आवश्यक है क्योंकि यह पैदावार को प्रभावित कर सकता है। प्रतिक्रिया के लिए कोई भी योजक, जिसमें प्लास्मिड भी शामिल हैं, अत्यधिक शुद्ध होना चाहिए। इसके अतिरिक्त, व्यक्त प्रोटीन केवल उन सामग्रियों और समाधानों के संपर्क में होना चाहिए जो एंडोटॉक्सिन संदूषण से मुक्त हैं। उम्मीदवार फॉर्मूलेशन में एंडोटॉक्सिन संदूषण इम्यूनोलॉजिकल परख के असंगत और नकली परिणाम पैदा कर सकता है और पर्याप्त मात्रा में हानिकारक हो सकता है। जबकि यहां वर्णित नहीं है, निकल आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी के बाद अतिरिक्त शुद्धिकरण आवश्यक हो सकता है यदि एसडीएस-पेज के माध्यम से बाद के विश्लेषण चरणों में कई दूषित पदार्थ देखे जाते हैं। यह एसईसी के साथ पूरा किया जा सकता है, हालांकि शर्तों को सूत्रीकरण के आधार पर अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।

Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई ज्ञात प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित या व्यक्तिगत संबंध नहीं हैं जो इस पेपर में रिपोर्ट किए गए काम को प्रभावित कर सकते थे।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एलर्जी एंड इन्फेक्शियस डिजीज से सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा अनुदान आर 21 AI20925 और यू 19 AI144184 द्वारा समर्थित किया गया था। यह काम अमेरिकी ऊर्जा विभाग के तत्वावधान में लॉरेंस लिवरमोर नेशनल लेबोरेटरी द्वारा अनुबंध डीई-एसी 52-07एनए27344 [एलएलएनएल-जेआरएनएल-822525, एलएलएनएल-वीडियो-832788] के तहत किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) as powder Avanti Polar Lipids 850345
1.5 mL endotoxin-free centrifuge tubes Eppendorf 2600028
1 M Trizma hydrochloride solution Millipore Sigma T2194
Acetic acid, glacial, ACS reagent, ≥99.7% Millipore Sigma 695092
Bio-Dot apparatus Bio-Rad 1706545
Buffer Dam for XCell SureLock Life Technologies EI0012
C24 Incubator shaker New Brunswick Scientific
Cell-Free Expression System: RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit BiotechRabbit BR1400201
cOmplete His-Tag Purification Resin Roche Molecular Diagnostics 5893682001
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche Molecular Diagnostics 4693132001
CpG-ODN1826 Biosearch Technologies T9449
D-(+)-Trehalose dihydrate Millipore Sigma 71509
Dialysis tubes D-Tube Dialyzer Maxi Millipore Sigma 71508-3
Disposable, polypropylene fritted columns 10 mL capacity Bio-Rad 7311550EDU
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (PBS) Millipore Sigma D8537
Electrophoresis Power Supply
Endosafe PTS cartridge Thermo Fisher Scientific NC9594798
Endosafe-PTS Testing System Charles River
Gel wash solution: 10% methanol, 7% acetic acid
HCl and NaOH solutions for pH adjustment
HPLC with UV-vis diode array detector Shimadzu
HyClone HyPure culture-grade water VWR 82007-328
iBlot 2 Dry Blotting System Life Technologies
iBlot 2 Transfer Stacks, PVDF Life Technologies IB24001
Image Studio V2.0 software Li-COR Biiosciences
Imidazole Millipore Sigma I5513
Immun-Blot PVDF Membrane Bio-Rad 1620177
LI-COR Odyssey Fc imager Li-COR Biiosciences
Lyophilizer Labconco
Methanol (≥99.9%) Millipore Sigma 34860
Microcentrifuge
Microwave oven
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific  ND-ONE-W
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm Life Technologies NP0321
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Life Technologies NP0007
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) Life Technologies NP000202
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) Life Technologies NP0009
Odyssey Blocking Buffer in TBS containing 0.2% Tween 20 Li-COR Biosciences 927-50000
Orbital Shaker
PBS-T (1x PBS, 0.2% Tween 20, pH 7.4)
PEG5K-CA8 Telodendrimer (custom synthesis product)
pIVEX2.4d vector Roche Molecular Diagnostics
Plasmid Maxi Kit Qiagen 12162
Primary antibody: MAb40 (monoclonal antibody to the variable domain 1 (VD1) of C. muridarum MOMP, de la Maza laboratory)4
Primary antibody: MAbHIS, Penta-His antibody Qiagen 34660
Probe sonicator
Qubit 3.0 Fluorometer Life Technologies Q33216
Qubit Protein Assay Kit Life Technologies Q33212
Rainin Pipette tips: LTS 1000 µL Rainin 17002428
Rainin Pipette tips: LTS 20 µL Rainin 17002429
Rainin Pipette tips: LTS 200 µL Rainin 17002426
Rainin Pipettes Rainin
Secondary antibody: IRDye 800CW goat (polyclonal) anti-mouse IgG (heavy and light) Li-COR Biosciences 926-32210
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard Life Technologies LC5925
Sodium chloride NaCl Millipore Sigma S7653
Sodium phosphate monobasic NaH2PO4 Millipore Sigma  S0751
Superdex 200, 5/150 GL column Cytiva GE28-9909-45
Synthetic diacylated lipoprotein-TLR2/6 FSL-1 Invivogen  tlrl-fsl
SYPRO Ruby Protein Gel Stain Life Technologies S12001
TWEEN 20 Millipore Sigma P1379
UV light source
Vacufuge Bench Top Centrifuge Eppendorf
Vortexer
VWR 15 mL conicals (89039-666) VWR
VWR 50 mL conicals (89039-656) VWR
XCell SureLock Mini-Cell (Life Technologies ) Life Technologies EI0001

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References

  1. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
  2. Coleman, M. A., et al. Expression and association of the Yersinia pestis translocon proteins, YopB and YopD, are facilitated by nanolipoprotein particles. PLoS One. 11 (3), 0150166 (2016).
  3. Cappuccio, J. A., et al. Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 7 (11), 2246-2253 (2008).
  4. He, W., et al. Controlling the diameter, monodispersity, and solubility of ApoA1 nanolipoprotein particles using telodendrimer chemistry. Protein Science. 22 (8), 1078-1086 (2013).
  5. He, W., et al. Cell-free production of a functional oligomeric form of a Chlamydia major outer-membrane protein (MOMP) for vaccine development. Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 15121-15132 (2017).
  6. Tifrea, D. F., et al. Induction of protection in mice against a Chlamydia muridarum respiratory challenge by a vaccine formulated with the major outer membrane protein in nanolipoprotein particles. Vaccines. 9 (7), 755 (2021).
  7. Cleveland, T. E., et al. Small-angle X-ray and neutron scattering demonstrates that cell-free expression produces properly formed disc-shaped nanolipoprotein particles. Protein Science. 27 (3), 780-789 (2018).
  8. Fischer, N. O., et al. Conjugation to nickel-chelating nanolipoprotein particles increases the potency and efficacy of subunit vaccines to prevent West Nile encephalitis. Bioconjugate Chemistry. 21 (6), 1018-1022 (2010).
  9. Fischer, N. O., et al. Colocalized delivery of adjuvant and antigen using nanolipoprotein particles enhances the immune response to recombinant antigens. Journal of the American Chemical Society. 135 (6), 2044-2047 (2013).
  10. Fischer, N. O., et al. Evaluation of nanolipoprotein particles (NLPs) as an in vivo delivery platform. PLoS One. 9 (3), 93342 (2014).
  11. Pal, S., Peterson, E. M., de la Maza, L. M. Vaccination with the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein can elicit an immune response as protective as that resulting from inoculation with live bacteria. Infection and Immunity. 73 (12), 8153-8160 (2005).
  12. Sun, G., et al. Structural and functional analyses of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 189 (17), 6222-6235 (2007).
  13. Hafner, L. M., Wilson, D. P., Timms, P. Development status and future prospects for a vaccine against Chlamydia trachomatis infection. Vaccine. 32 (14), 1563-1571 (2014).
  14. Findlay, H. E., McClafferty, H., Ashley, R. H. Surface expression, single-channel analysis and membrane topology of recombinant Chlamydia trachomatis Major Outer Membrane Protein. BMC Microbiology. 5, 5 (2005).
  15. Sun, G., Pal, S., Weiland, J., Peterson, E. M., de la Maza, L. M. Protection against an intranasal challenge by vaccines formulated with native and recombinant preparations of the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein. Vaccine. 27 (36), 5020-5025 (2009).
  16. He, W., et al. Cell-free expression of functional receptor tyrosine kinases. Scientific Reports. 5 (1), 12896 (2015).

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Gilmore, S. F., He, W., Evans, A.… More

Gilmore, S. F., He, W., Evans, A. C., Tifrea, D. F., Pal, S., Segelke, B., Peters, S. K. G., Vannest, B. D., Fischer, N. O., Rasley, A., de la Maza, L. M., Coleman, M. A. Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development. J. Vis. Exp. (181), e63028, doi:10.3791/63028 (2022).

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