Summary
Den nuværende protokol præsenterer en hurtig, effektiv og blid metode til isolering af enkeltceller, der er egnede til encellet RNA-seq-analyse fra et kontinuerligt voksende museæg, musetænder og menneskelige tænder.
Abstract
Mus og menneskelige tænder repræsenterer udfordrende organer for hurtig og effektiv celleisolation til enkeltcellede transskriptomiske eller andre applikationer. Dental papirmasse væv, rig på den ekstracellulære matrix, kræver en lang og kedelig dissociation proces, der er typisk ud over den rimelige tid for enkeltcellede transcriptomics. For at undgå kunstige ændringer i genekspressionen gik tiden fra aflivningen af et dyr, indtil analysen af enkelte celler skal minimeres. Dette arbejde præsenterer en hurtig protokol, der gør det muligt at opnå enkeltcellet suspension fra mus og menneskelige tænder i en fremragende kvalitet egnet til scRNA-seq (single-cell RNA-sekventering). Denne protokol er baseret på accelererede væv isolation trin, enzymatisk fordøjelse, og efterfølgende forberedelse af endelige encellet suspension. Dette muliggør hurtig og skånsom behandling af væv og gør det muligt at bruge flere dyre- eller menneskeprøver til at opnå celleophæng med høj levedygtighed og minimale transskriptionsmæssige ændringer. Det forventes, at denne protokol kan guide forskere interesseret i at udføre scRNA-seq ikke kun på musen eller menneskelige tænder, men også på andre ekstracellulære matrix-rige væv, herunder brusk, tæt bindevæv, og dermis.
Introduction
Enkeltcellet RNA-sekventering er et effektivt værktøj til dechifrering af in vivocellepopulationsstruktur, hierarki, interaktioner og homøostase1,2. Resultaterne afhænger imidlertid stærkt af det første trin i denne avancerede analyse - forberedelsen af en enkeltcellet suspension af perfekt kvalitet ud af det komplekse, velorganiserede væv. Dette omfatter at holde celler i live og forhindre uønskede, kunstige ændringer i genekspression profiler af cellerne3,4. Sådanne ændringer kan føre til en unøjagtig karakteristik af befolkningsstrukturen og fejlfortolkning af de indsamlede data.
Der er udviklet specifikke protokoller for isolering ud af en lang række væv5,6,7,8. De anvender normalt mekanisk dissociation i kombination med yderligere inkubation med forskellige proteolytiske enzymer. Disse omfatter typisk trypsin, kollagen, dispases, papain6,7,8,9, eller kommercielt tilgængelige enzym blandinger såsom Accutase, Tryple, etc.5. Den mest kritiske del, der påvirker transcriptome kvalitet er enzymatisk fordøjelse. Det blev påvist, at langvarig inkubation med enzymer ved 37 °C påvirker genekspressionen og forårsager opregulering af mange stressrelaterede gener10,11,12,13. Den anden kritiske parameter i isolationsprocessen er dens samlede længde, da det er blevet vist, at celletransskriptomer ændrer sig efter vævskæmi14. Denne protokol præsenterer en effektiv protokol for blid isolering af enkelte celler fra mus og menneskelige tænder, hurtigere end andre, tidligere anvendte protokoller til isolering af celler fra komplekse væv5,6,9,11,13,15,16.
Denne protokol præsenterer, hvordan man hurtigt dissekere blødt væv fra den hårde tand og forberede en enkeltcellet suspension egnet til scRNA-seq. Denne metode anvender kun et centrifugeringstrin og minimerer effekten af uønskede transskriptionelle ændringer ved at reducere vævshåndterings- og fordøjelsestiden og holde væv og celler på 4 °C det meste af tiden. Proceduren viser isolering af celler fra mus fortænder, molar, og menneskelig visdom tænder som et eksempel, men primært bør arbejde for andre tænder i forskellige organismer. Den komplette protokol visualiseres skematisk i figur 1. Denne protokol er for nylig blevet brugt til at generere en dental celle type atlas opnået fra mus og menneskelige tænder1.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i henhold til de internationale og lokale regler og godkendt af Ministeriet for Uddannelse, Ungdom og Sport, Tjekkiet (MSMT-8360/2019-2; MSMT-9231/2020-2; MSMT-272/2020-3). Denne protokol blev testet med både mandlige og kvindelige wildtype C57BL/6 og CD-1 mus og med genetisk modificerede Sox10::iCreERT2 mice17 (kombineret med forskellige reporter systemer) på en C57BL/6 baggrund. Forsøg med humane prøver blev udført med godkendelse af udvalgene for etik af det medicinske fakultet, Masaryk University Brno &St. Anne's Faculty Hospital i Brno, Tjekkiet.
1. Eksperimentel opsætning og udarbejdelse af løsninger
- Opsætning af instrumenter
- Nedkøl centrifugen til 4 °C.
- Inkubationskammeret opvarmes til 37 °C.
- Start facs-maskinen (Fluorescensaktiveret cellesortering) og indstil alle temperaturen i sorteringsglasset (herunder opsamlingsrørholderen) til 4 °C. Udfør instrumentets kvalitetskontrol, indstil faldforsinkelsen.
- Indstil den foreløbige gating strategi og udføre test sortering.
BEMÆRK: Når du bruger FACS, skal du bruge 100 μm dysen.
- Klargør løsningerne (trin 1.2.1-1.2.3).
- Vaskeopløsning: Forbered frisk 2% FBS (Fosterkvægserum) i HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution).
- Fordøjelsesblanding: Forbered frisk kollagen P (3 U/mL) helt opløst i HBSS.
- Valgfrit: Klargør frisk HBSS + BSA (0,04%) og chill analytisk kvalitet methanol i en -20 °C fryser til opbevaring af encellet suspension ved -80 °C.
BEMÆRK: Trin 1 skal udføres før eksperimentets start. Sammensætningen af de anvendte løsninger er sammenfattet i supplerende tabel 1.
2. Tilberedning af forsøgsdyr/s og mennesketand
- Forbered forsøgsdyrene (musen).
- Aflive musen i henhold til de lokale regler; f.eks. ved overdosis af bedøvelsesmidler som beskrevet tidligere1.
ADVARSEL: Reglerne for human aflivelse af forsøgsdyr varierer lokalt. Følg altid gyldige lokale regler. - Gå straks videre til vævs dissektionstrinnet (trin 3).
BEMÆRK: Hvis vævet fra forsøgsdyrene ikke umiddelbart kan dissekeres (f.eks. på grund af overførsel fra dyrestaldeanlæg), skal forsøgsdyrene placeres på is og udføre vævs dissektion så hurtigt som muligt. For at få flere celler fra mus molar pulps, skal du bruge yngre (6 uger og mindre) dyr. Med stigende alder falder størrelsen af tandmasse. Mus fortænder for det meste holde deres struktur med stigende alder, så dyr i forskellige aldre kan bruges til væv dissektion.
- Aflive musen i henhold til de lokale regler; f.eks. ved overdosis af bedøvelsesmidler som beskrevet tidligere1.
- Forbered den menneskelige tand
BEMÆRK: Menneskelige tænder blev udvundet af en klinisk relevant grund. Hver diagnose blev behandlet individuelt, og en erfaren tandlæge udførte altid tandudtrækningen.- Sæt straks den friskudvundne tand i et 50 mL rør med iskold HBSS, og hold røret på is indtil videre behandling.
BEMÆRK: Brug af bevarede visdomstænder fra patienter indtil 25-30 år anbefales til det højeste celleudbytte.
- Sæt straks den friskudvundne tand i et 50 mL rør med iskold HBSS, og hold røret på is indtil videre behandling.
3. Væv dissektion
- Hold forsøgsdyret bag hovedet og se på det ventrale aspekt af hovedet, så halen peger væk.
- Brug små, skarpe saks, hurtigt fjerne huden fra underkæben til at udsætte mandibulær bue, det bløde væv mellem hver halvdel af mandibles, og de tilstødende ansigtsmuskler.
- Lav et dybt snit fra hver side af underkæben; først gennem m. massør langs den buccal side af underkæben op til temporomandibulære fælles, og derefter langs den indre del af hver halvdel af underkæben gennem bunden af mundhulen (se supplerende figur 1).
- Skær alle muskler og ledbånd langs underkæben op til temporomandibulære fælles fra både udvendige og indersiden af mundhulen.
BEMÆRK: Undgå at skære knogler. Dette kan skade den mest apikale del af fortænderne. - Tag underkæben ved hjælp af bøjet spids pincet og fjern den. Derefter opdeles den dissekerede underkæbe i to halvdele med en saks ved at skære gennem mandibular symphysis (se supplerende figur 1).
- Brug en industriel lav fnugtørsker til at gnave det resterende bløde væv fra hver halvdel af underkæben. Når begge dele af underkæben er renset, skal du placere dem i en færdiglavet petriskål med iskold HBSS.
BEMÆRK: Fra dette punkt fremad, arbejde på is. Yderligere dissektion af musetænder og kindtænder udføres under et stereomikroskop med en sort baggrund. - Mus mandibulære snit
- Til dissektion af mandibulære snit fjernes alveolærryggen med alle tre kindtænder og knæk på transversally den mandibulære bue på det sted, der svarer til positionen mellem den første og anden molar.
BEMÆRK: Et skarpt skalpelblad nr. 11 og pincet bruges til at udføre dette trin (se Materialetabel). - Træk forsigtigt snittet ud af resten af tandstikket.
BEMÆRK: Hvis det lykkes, vil det ekstraherede snit indeholde intakte apikale dele, herunder epitelvæv med komplette livmoderhalskræft sløjfer. - Hvis det er nødvendigt, fjerne de resterende fragmenter af knoglen stadig knyttet til fortænderne med pincet og en skalpel.
- Læg de dissekerede snit i friske, iskolde HBSS og dissekere væv af interesse: cervikal løkke, dental papirmasse, eller andre dele af tanden.
- Læg det dissekerede bløde væv i en dråbe frisk, iskold HBSS midt i en 10 cm petriskål. Bliv på isen.
- Til dissektion af mandibulære snit fjernes alveolærryggen med alle tre kindtænder og knæk på transversally den mandibulære bue på det sted, der svarer til positionen mellem den første og anden molar.
- Musedibular kindtænder
- Til dissekere mandibulære kindtænder skal du helt fjerne alveolærryggen fra resten af underkæben ved hjælp af et skalpelblad.
- Flyt den dissekerede alveolær crest i frisk, iskold HBSS i en Petriskål og fjern forsigtigt alle de resterende fragmenter af alveolær knogler fastgjort til rødderne.
- Placer de dissekerede kindtænder uden alveolær knogle i frisk, iskold HBSS. For at eksponere pulpen skal du begynde at fjerne dele af dentinen fra den apikale side ved hjælp af fine, skarpe spids pincet, indtil du når pulphulen.
- Når papirmasse hulrum er nået, omhyggeligt dissekere dental papirmasse ved hjælp af et par skarpe spids pincet og placere det bløde væv af tandmasse i en dråbe frisk, iskold HBSS i midten af en 10 cm Petri parabol holdes på is.
BEMÆRK: Da muse molarmassemasser er ekstremt små, skal du tilpasse forstørrelsen på stereomikroskopet i overensstemmelse hermed.
- Mennesketand
- Vask menneskelige tand igen i iskold HBSS at fjerne det resterende blod.
- Placer tanden i tre tykvæggede sterile plastikposer og brug en støbejern bordplade ingeniørens skruestik til at knække tanden. Brug skruekæberne med flad overflade for at undgå at trænge ind i poserne.
- Stram langsomt skruestikken, indtil du hører tanden knække; fjern det fra poserne og læg den i frisk, iskold HBSS i en petriskål.
- Brug to pincet, tag tandmassen ud, rengør den fra alle rester af hårdt væv og læg den i en dråbe iskold HBSS midt i en 10 cm petriskål, der holdes på is.
FORSIGTIG: Humant væv kan potentielt være smitsomt. Når du arbejder med humant væv, skal du bruge beskyttelsesudstyr for at undgå direkte kontakt med vævet.
4. Forberedelse af encellet suspension
- Der fremstilles et 15 mL rør med 2,5 mL fordøjelsesblanding bestående af Kollagenase P (3 U/mL) helt opløst i HBSS. Opbevar opløsningen på is, indtil den er brugt.
BEMÆRK: Brug altid frisklavet kollagen P; ikke fryse aliquots. Kollagen P-aktiviteten varierer fra batch-til-batch. Kontroller aktiviteten af batchen, før fortynding. Kollagen P aktiveres af calcium, hvis mængde allerede er tilstrækkelig i det lyfile pulver. Derfor er det unødvendigt at berige enzymblandingen med calcium. Kollagen P er ikke inaktiveret af FBS, men kan inaktiveres af chelaterende midler (f.eks. Ethylenediaminetetraacetic - EDTA). Standsning af dissociationsprocessen sikres ved at fortynde Collagenase P i Vaskeopløsningen (2% FBS i HBSS). Det har vist sig, at tilføje FBS øger celle levedygtighed og det endelige antal celler efter sortering18. - Skær vævet i alle retninger i de mindst mulige stykker ved hjælp af et rundformet skalpelblad nr. 10. Aggregere vævsstykkerne i midten af dråben og skær gentagne gange vævsaggregaterne ved hjælp af et rundformet (nr. 10) skalpelblad. Gentag denne proces flere gange, indtil materialet er tilstrækkeligt hakket.
- Overfør de strimlede vævsstykker ved hjælp af en 1 mL pipettespids ind i den forberedte fordøjelsesblanding.
BEMÆRK: Hvis et større antal dyr behandles på én gang, opdeles vævet i flere rør med Kollagen P. Den maksimale mængde pr. rør er pulper fremstillet af ca. 10 musetænder. I tilfælde af molarer, hvor pulper er meget mindre, kan antallet af forarbejdede pulper øges tilstrækkeligt. Når du bruger menneskelige tænder, skal du maksimalt bruge 2-3 pulper pr. rør afhængigt af pulpstørrelsen. - Røret placeres i en forvarmet inkubator på 37 °C med en shaker. Vip røret inde i shakeren til en vinkel på 60° og indstil hastigheden til 150-200 rpm for at sikre konstante affjedringsbevægelser inde i røret.
- Kraftigt triturere suspensionen hver 3-4 min med en 1 ML pipette spids til at opløse alle klumper.
BEMÆRK: Med tiden bliver klumperne mindre og blødere, indtil de næsten forsvinder. - I alt inkuberes i 15-20 min. I slutningen af inkubationen triturerer du for sidste gang og tilsæt derefter langsomt iskold Vaskeopløsning til et sidste volumen på 12 mL.
- Fjern de resterende klumper eller stykker forkalket væv ved at filtrere suspensionen ved hjælp af en 50 μm cellesnak.
- Tag 10-20 μL af den filtrerede celleaffjedring og tæl cellerne under centrifugering ved hjælp af et celletællingskammer (Hæmocytometer). Centrifuge i 5 min ved 300 x g ved 4 °C. Fjern supernatanten ved hjælp af en 10 mL serologisk pipette.
BEMÆRK: Hvis antallet af celler er begrænset, der ikke kan tælles i fortyndet suspension, skal du springe celleoptællingen over og bruge alle cellerne til videre behandling. - Valgfrit: Fortsæt til fiksering og opbevaring21.
- Ophæng pellets (op til 107 celler) igen i 100 uL af HBSS + BSA (0,04%).
- Tilsæt 400 μL af kølet methanol og bland langsomt.
- Inkuber celleaffjedringen i 15 minutter på is.
- Opbevares ved -80 °C, indtil den er behandlet (højst 1 måned).
- Brug pelleten igen i vaskeopløsningen. Sigt efter 700-1200 celler/μL af vaskeopløsningen.
- Hold røret på is indtil videre behandling.
BEMÆRK: Udfør om nødvendigt fikseringen og opbevaringen ved -80 °C. Det anbefales dog, at celleaffjedringen straks behandles for scRNA-seq. Yderligere trin vil afhænge baseret på den encellede RNA seq-protokol. Når scRNA-seq-protokollen bruger et mikrofluidisk system (nogle sc-RNA-seq-virksomheder gør), indlæses cellerne baseret på producentens retningslinjer enten direkte eller efter cellesortering. - For FACS skal du gå videre til trin 5.
5. Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS)
- Før du sorterer, skal du forberede cellesorteringsinstrumentet.
- Nedkøl hele systemet til 4 °C, udfør instrumentets kvalitetskontrol, indstil faldforsinkelsen og spændingen på afbøjningspladerne. Sæt opsamlingsrør i opsamlingsrørholderen.
BEMÆRK: For at undgå yderligere centrifugeringstrin, der resulterer i et uundgåeligt celletab, skal du sortere celler i en mikrotube (1,5 mL) med en lille mængde (25-50 μL) af vaskeopløsningen.
- Nedkøl hele systemet til 4 °C, udfør instrumentets kvalitetskontrol, indstil faldforsinkelsen og spændingen på afbøjningspladerne. Sæt opsamlingsrør i opsamlingsrørholderen.
- Valgfrit: Udfør levedygtighed farvning før FACS.
- Propidiumodididid i celleaffjedring før FACS til en endelig koncentration 0,5 μg/mL og inkuberes i 15 min ved 4 °C.
- Læg prøven i cellesorteringskoden. Indstil en streng gating strategi for at fjerne cellerester, doublets, og døde celler. Sorter cellerne i et forberedt rør eller multi-brønd plader. Et eksempel på en gatingstrategi er vist i figur 2.
BEMÆRK: For at minimere manipulationstrin og fremskynde protokollen anbefales det at anvende en streng gatingstrategi (foreslået i figur 2) i stedet for at bruge en levedygtighedsfarvning. For at adskille immuncellerne fra den isolerede population kan CD45 antistoffarvning udføres. For at udføre dette skal celleaffjedring genbruges i 100 μL farvningsopløsning (PBS + 2% FBS + anti-CD45-APC konjugeret antistof 1/100 fortynding). Inkuber i 15 minutter på is beskyttet mod lys og udfør FACS direkte.
Representative Results
Eksemplarisk isolering af enkeltceller blev udført fra to mandibulære snit fra en 6 uger gammel C57BL/6 mus mand. Efter denne protokol blev der udarbejdet en enkeltcellet suspension, og efterfølgende blev der udført encellet sekventering. Den forberedte enkeltcelleaffjedring blev analyseret og sorteret ved hjælp af FACS (figur 2). For det første blev FSC-A (forward scatter, area) og SSC-A (side scatter, område) plotte anvendt, og en passende gating strategi blev brugt til at vælge en befolkning med forventet størrelse og granularitet til at filtrere vores celle vragrester og celle doublets eller aggregater (Figur 2A). Denne valgte population (P1), der tæller 38% af alle hændelser, blev yderligere brugt, og FSC-A- og FSC-H -H-parametre (fremadrettet scatter, højde) blev anvendt til at fjerne de resterende celledubler (Figur 2B). Populationen uden celledouble (P2) medregnet 95% af P1 kan efterfølgende bruges til scRNA-seq. Alternativt kan yderligere gating bruges til at vælge befolkningen af interesse (f.eks udtryk for fluorescerende proteiner eller levende / død farvning). For at kontrollere antallet af levende/døde celler i den endelige suspension blev PI-farvningen (propidiumiod) udført (Figur 2C). P3-populationen, der indeholdt PI- (levende) celler, var 98,4% ud af moderselskabet P2-populationen og 35,5% ud af de samlede hændelser. Det samlede antal filtrerede, døde (PI+) celler var 1887.
Det endelige antal celler, der blev opnået uden levedygtighedsfarvning, der var egnet til RNA-seq (P2), talte 118.199 celler fra to musetænder. Det betyder antallet af næsten 60.000 levende celler fra et mandibulært snit.
For at afklare antallet af immunceller i den endelige encellede suspension blev der anvendt to tilgange. For det første blev CD45 antistoffarvning og efterfølgende FACS-analyse anvendt. Som en supplerende metode blev det samlede antal immunceller (CD45+) i scRNA-seq-data analyseret. FACS analyse viste 14,44% af CD45 + celler (13,20% levende og 1,24% døde) (Figur 3A). Analyse af scRNA-seq-data viste 10,90 % af cd45-udtrykkende celler (figur 3B). Faldet i CD45+ celler i scRNA-seq-data kan skyldes yderligere tærskeling under scRNA-seq-analyse.
Disse repræsentative data om eksemplet med musetænder viser, at den givne protokol i kombination med streng gating strategi er effektiv til at opnå et stort antal celler ud af en enkelt musetand uden behov for yderligere brug af levedygtighed farvning. Forholdet mellem immunceller (CD45+) var mindre (13,2 %). Desuden blev det tidligere vist, at immuncellerne er afgørende for at opretholde tand homøostase, så fjerne dem fra scRNA-seq analyse under FACS ville være kontraproduktivt i nogle applikationer.
Figur 1: Skematisk repræsentation af protokollen. Forskellige trin, herunder temperaturforhold og forventet tid, er repræsenteret for at forberede enkeltcellet suspension fra mus og menneskelige tænder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Eksempel på gating-strategien. FSC-A og SSC-A gating blev brugt til at producere P1-porten, hvilket afspejler cellepopulationen med forventet størrelse og granularitet og filtrerede celle- og ekstracellulært matrixaffald og de fleste store begivenheder (A). Efterfølgende blev P1-populationen plottet i FSC-H og FCS-A plot, som filtrerede celledoubler fra (B). Denne P2 befolkning blev derefter analyseret for tilstedeværelsen af døde celler ved propidium jod (C). Antallet af hændelser/celler pr. port er repræsenteret i (D). (FSC-A - fremad scatter, område; SSC-A - side scatter, område; FSC-H - fremad scatter, højde; PI - propidium jod). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Kvantificering af immuncellerne. Kvantificeringen af immuncellerne blev udført ved FACS-analyse af celler, der var plettet med anti-CD45-antistof, og Live/Dead-analyse ved hjælp af propidiumiod farvning (A). Yderligere kvantificering af immunceller blev udført under scRNA-seq-analyse (B). (CD45-APC - anti-CD45 allophycocyanin konjugeret antistof; PI - propidium jod; t-SNE - t-distribueret stokastisk nabo indlejring). Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: Oversigt over underkæb dissektionsprocessen. Stiplede linjer illustrerer foreslåede nedskæringer. TMJ - temporomandibular fælles, m. masster - musculus masster. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 1: Sammensætningen af de løsninger, der anvendes i undersøgelsen. Klik her for at downloade denne tabel.
Discussion
Studere tænder og knogler på cellulære eller molekylære niveau er generelt udfordrende, da celler danner disse væv er omgivet af forskellige former for hårde matricer19. Et af de vigtigste mål for at udføre encellet RNA-seq på tandvæv er behovet for at få celler af interesse hurtigt og uden kunstige ændringer i deres transskriptomer. For at opnå dette blev der udviklet en meget effektiv protokol, der er egnet til isolering af celler fra mus og menneskelige tandmasser, hvilket giver mulighed for hurtig generering af enkeltcellede suspensioner til alle transskriptomiske applikationer. Dette blev sikret ved hurtig vævsisolering, minimering af trinene i vævs- og cellemanipulationer og strømlining af den mekaniske og enzymatiske fordøjelse.
De mest kritiske trin i denne protokol er hurtig vævsbehandling og tilstrækkelig enkeltcellet suspensionspræparat8,9. En manuel tilgang bruges til at opnå dental papirmasse uden at udnytte en dental boremaskine eller andre varme-genererende enheder. Overophedning kan forårsage et kunstigt udtryk for varmechokproteiner og andre gener, hvilket i sidste ende fører til, at de analyserede genekspressionsmønstre ikke er repræsentative for det oprindelige væv20. Manuel væv høst kan være et udfordrende skridt, der sandsynligvis vil have brug for nogle uddannelse på forhånd. Pulpen skæres derefter i små stykker og fordøjes enzymatisk ved 37 °C. Bortset fra 15-20 min enzymatisk fordøjelse udføres hele protokollen ved 4 °C. Vævsbehandling og især den enzymatiske fordøjelse blev minimeret til den kortest mulige tid, da en mere langvarig inkubation ved 37 °C kan forårsage ændringer i genekspressionsmønstre10. Mekanisk fjernelse af dentin anbefales før enzymatisk fordøjelse. Dentin og pulp-vedhæftet predentin indeholder en stor mængde kollagen, og dens overdrevne tilstedeværelse kan reducere effektiviteten af fordøjeopløsningen. Efter at være blevet fjernet fra kroppen (eller død af organismer), blev det vist, at cellerne begynder at ændre deres genekspression mønstre hurtigt12. Derfor bør celleisolation og behandling udføres så hurtigt som muligt. Den nuværende protokol reducerer behandlingstiden til 35-45 min fra isolering af vævet (aflivning af dyr) til forberedelse af encellet suspension.
En alternativ ændring af denne teknik er cellebevarelse til senere brug. Dette opnås ved methanolfiksering. Metanolfast celleaffjedring kan opbevares i op til 1 måned ved -80 °C som beskrevet i protokollen21. Når det er muligt, skal du dog udføre scRNA-seq direkte, da det blev påvist, at enkeltcelledata fra metanolfaste encellede suspensioner kan lide af øget udtryk for stressrelaterede gener og forurening med omgivende RNA22. Dette trin kan have brug for yderligere ændringer i henhold til producentens protokoller.
Før den første anvendelse af denne protokol anbefales det at udføre flere valideringstrin for at teste teknikken. Det er vores erfaring, at vi tester de førnævnte kritiske trin i protokollen. Derudover foreslår vi at teste effektiviteten af kollagen P-opløsningen og teste håndteringen af vævsdesociationstrinnet. Specifikt, omkring de første 5 minutter efter indledningen af kollagen P inkubation, bør stykker af væv samles sammen. Dette er en fælles situation. Aggregater opløses hver 3-4 minutter ved hjælp af en 1 mL pipette, og med stigende tid, bør de blive mindre, indtil knap synlige.
Desuden anbefales det at udføre celletælling i et celletællingskammer før centrifugering og før og efter filtrering for at opdage mulige celletab på grund af suboptimal supernatant fjernelse. Hvis den endelige enkeltcelleaffjedring skal renses, kan FACS bruges. Cellesortering gør det ikke kun muligt at fjerne snavs eller døde celler, men gør det vigtigt at berige den endelige suspension med fluorescerende mærkede celler13,19. For at undgå forskydningsstress eller tilstopning af cellesortering anvendes en bred dyse (85 μm eller 100 μm). Dette vil yderligere forbedre levedygtigheden af de sorterede celler.
Denne teknik blev designet og testet på både mus og menneskelige tænder. Den vigtigste begrænsende faktor er det lille antal celler i de reducerede tandmasser af tænderne på ældre mus (kindtænder) og mennesker. Antag, at et større antal celler skal opnås, eller celler fra tænderne på ældre patienter skal erhverves. En mulig løsning er at behandle et højere antal tænder og flette dem ind i et enkelt parti, efterfølgende behandles som en prøve.
Levende celler af human dental pulp blev for det første isoleret mere end tyve år siden ved hjælp af en enzym blanding af kollagenase I og dispase23. Siden da blev isolationer af tandmasseceller udbredt, og flere teknikker er blevet brugt5,6,7,8. Den kritiske betydning af den metode, der præsenteres her, er tilpasningen af alle isolationstrin for at gøre isolationen hurtig og skånsom for at sikre den høje kvalitet af den endelige celleaffjedring til scRNA-seq. Højere celleudbytte kan opnås ved mere langvarig inkubation med enzymer. Denne protokol giver en effektiv løsning til hurtigt at få enkelte celler fra mus og menneskelige tænder af passende kvalitet til enkeltcellet RNA-sekventering. Denne teknik forventes at blive meget udbredt til andre væv eller organismer med kun små tekniske ændringer.
Disclosures
Forfattere erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
J.K. blev støttet af Grant Agency of Masaryk University (MUNI/H/1615/2018) og af midler fra Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet MU til juniorforsker. J.L. blev støttet af Grant Agency of Masaryk University (MUNI/IGA/1532/2020) og er en Brno Ph.D. Talent Scholarship Holder - Finansieret af Brno City Kommune. T.B. blev støttet af Den Østrigske Videnskabsfond (Lise Meitner tilskud: M2688-B28). Vi takker Lydie Izakovicova Holla og Veronika Kovar Matejova for deres hjælp til at få menneskelige tænder. Endelig takker vi Radek Fedr og Karel Soucek for deres venlige hjælp med FACS sortering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
| CellTrics 50 µm, sterile | Sysmex | 04-004-2327 | |
| Collagenase P (COLLP-PRO) | Roche | 11213857001 | |
| CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 10 | AESCULAP | 16600495 | |
| CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 11 | AESCULAP | 16600509 | |
| Fetal Bovine Serum (South America), Ultra low Endotoxin | Biosera | FB-1101/500 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) without Ca2+ and Mg2+ | SIGMA | H6648 | |
| Industrial low lint wipes, MAX60 | Dirteeze | MAX60B176 | |
| Industrial strong tweezers, style 660, bent serrated pointed tips, 150mm | Value-Tec | 50-014366 | |
| Methyl alcohol A.G. | Penta | 21210-11000 | |
| Propidium Iodide Solution | BioLegend | 421301 | |
| Scalpel handle | CM Instrumente | AG-013-10 | |
| Serological pipettes 10mL, individually wrapped, 200 pcs. | CAPP | SP-10-C | |
| Stereo microscope | Leica | EZ4 | |
| Surgical scissors (9cm) | CM Instrumente | AI-430-09Y | |
| Tissue culture dish Ø 100 mm | TPP | 93100 |
References
- Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nature Communications. 11 (1), 4816 (2020).
- Soldatov, R., et al. Spatiotemporal structure of cell fate decisions in murine neural crest. Science. 364 (6444), (2019).
- Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 0 (0), (2021).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, (2018).
- Chiba, Y., et al. Single-cell RNA-sequencing from mouse incisor reveals dental epithelial cell-type specific genes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Debnath, S., et al. Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation. Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).
- Kanton, S., Treutlein, B., Camp, J. G. Chapter 10 - Single-cell genomic analysis of human cerebral organoids. Methods in Cell Biology. 159, 229-256 (2020).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nature Medicine. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- O'Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).
- van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
- Miyawaki-Kuwakado, A., et al. Transcriptome analysis of gene expression changes upon enzymatic dissociation in skeletal myoblasts. Genes to Cells. 26 (7), 530-540 (2021).
- Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 7944 (2020).
- Ferreira, P. G., et al. The effects of death and post-mortem cold ischemia on human tissue transcriptomes. Nature Communications. 9 (1), 490 (2018).
- He, W., Ye, J., Xu, H., Lin, Y., Zheng, Y. Differential expression of α6 and β1 integrins reveals epidermal heterogeneity at single-cell resolution. Journal of Cellular Biochemistry. 121 (3), 2664-2676 (2020).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Laranjeira, C., et al. Glial cells in the mouse enteric nervous system can undergo neurogenesis in response to injury. The Journal of Clinical Investigation. 121 (9), 3412-3424 (2011).
- Song, X., et al. Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability and genome stability. FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).
- Greenblatt, M. B., Ono, N., Ayturk, U. M., Debnath, S., Lalani, S. The unmixing problem: A guide to applying single-cell RNA sequencing to bone. Journal of Bone and Mineral Research. 34 (7), 1207-1219 (2019).
- Charlebois, D. A., Hauser, K., Marshall, S., Balázsi, G. Multiscale effects of heating and cooling on genes and gene networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (45), 10797-10806 (2018).
- Chen, J., et al. PBMC fixation and processing for Chromium single-cell RNA sequencing. Journal of Translational Medicine. 16 (1), 198 (2018).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
