Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

שיטות ספקטרופוטומטריות לחקר מטבוליזם גליקוגן אאוקריוטי

Published: August 19, 2021 doi: 10.3791/63046
Automatic Translation
1
1Department of Biochemistry & Nutrition, Des Moines University

Summary

טכניקות למדידת הפעילות של אנזימי מפתח של מטבוליזם גליקוגן מוצגות, באמצעות ספקטרופוטומטר פשוט הפועל בטווח הנראה לעין.

Abstract

גליקוגן מסונתז כצורת אחסון של גלוקוז על ידי מגוון רחב של אורגניזמים, החל מחיידקים וכלה בבעלי חיים. המולקולה מורכבת משרשראות ליניאריות של שאריות גלוקוז מקושרות α1,4 עם ענפים המוחדרים באמצעות תוספת של α1,6-linkages. הבנת האופן שבו סינתזה ופירוק של גליקוגן מוסדרים וכיצד גליקוגן משיג את המבנה המסועף האופייני שלו דורשת מחקר של האנזימים של אחסון גליקוגן. עם זאת, השיטות הנפוצות ביותר לחקר פעילויות אנזימים אלה משתמשות בדרך כלל בריאגנטים או בטכניקות שאינן זמינות לכל החוקרים. במאמר זה נדון בסוללה של הליכים שהם פשוטים מבחינה טכנית, חסכוניים ועדיין מסוגלים לספק תובנות חשובות לגבי השליטה באחסון גליקוגן. הטכניקות דורשות גישה לספקטרופוטומטר, הפועל בטווח של 330 עד 800 ננומטר, ומתוארות בהנחה שהמשתמשים ישתמשו בחלוקי פלסטיק חד פעמיים. עם זאת, ההליכים ניתנים להרחבה בקלות וניתן לשנות אותם לשימוש בקורא microplate, מה שמאפשר ניתוח מקביל מאוד.

Introduction

גליקוגן מופץ באופן נרחב בטבע, כאשר התרכובת נמצאת בחיידקים, פרוטיסטים רבים, פטריות ובעלי חיים. במיקרואורגניזמים, גליקוגן חשוב להישרדות התאים כאשר חומרי המזון מגבילים, ובאורגניזמים גבוהים יותר כמו יונקים, סינתזה ופירוק של גליקוגן משמשים למאגר רמות הגלוקוז בדם 1,2,3. חקר חילוף החומרים של גליקוגן הוא, אם כן, בעל חשיבות לתחומים מגוונים כגון מיקרוביולוגיה ופיזיולוגיה של יונקים. הבנת חילוף החומרים של גליקוגן דורשת לחקור את האנזימים העיקריים של סינתזת גליקוגן (גליקוגן סינתאז ואנזים המסתעף) ופירוק גליקוגן (גליקוגן פוספורילאז ואנזים מסתעף). מבחני תקן הזהב של גליקוגן סינתאז, פוספורילאז, הסתעפות ופירוק פעילויות אנזימים משתמשים באיזוטופים רדיואקטיביים. לדוגמה, גליקוגן סינתאז נמדד בדרך כלל בבדיקה רדיוכימית עצורה על ידי שילוב של גלוקוז מ-UDP-[14 C]גלוקוז (במקרה של אנזימים מן החי והפטריות) או ADP-[14C]גלוקוז (במקרה של אנזימים חיידקיים) לתוך גליקוגן 4,5. באופן דומה, גליקוגן פוספורילאז נמדד בכיוון של סינתזת גליקוגן, בעקבות שילוב גלוקוז מ[14C]גלוקוז-1-פוספט לתוך גליקוגן6. אנזים ההסתעפות נבדק על ידי מדידת יכולתו של אנזים זה לעורר שילוב של [14 C]גלוקוז מגלוקוז-1-פוספט לשרשראות α1,4 מקושרות על ידי גליקוגן פוספורילאז7, ופעילות האנזים המתפרק נקבעת על ידי מעקב אחר יכולתו של האנזים לשלב [14C]גלוקוז בגליקוגן8 . למרות שהם רגישים מאוד, ומאפשרים את השימוש בהם בתמציות תאים גולמיים עם רמות נמוכות של פעילות אנזימים, הסובסטרטים הרדיואקטיביים יקרים וכפופים לדרישות הרגולטוריות הנלוות לשימוש ברדיואיזוטופים. חסמים אלה מציבים את השימוש במבחנים מסוימים מחוץ להישג ידם של עובדים רבים. עם זאת, במשך שנים רבות תואר מגוון מרשים של גישות ספקטרופוטומטריות למדידת אנזימים אלה. באופן כללי, גישות אלה מסתמכות בסופו של דבר על מדידת הייצור או הצריכה של NADH/NADPH, או על יצירת קומפלקסים צבעוניים בין גליקוגן ליוד. לפיכך, הם פשוטים וניתן לבצע אותם באמצעות ספקטרופוטומטרים פשוטים המצוידים רק במנורות הבזק טונגסטן או קסנון.

בדיקות ספקטרופוטומטריות של גליקוגן סינתאז מסתמכות על מדידת הנוקלאוזיד דיפוספט המשתחרר מתורם נוקלאוטיד הסוכר, כאשר גלוקוז מתווסף לשרשרת הגליקוגןההולכת וגדלה 9,10. הנוהל למדידת פעילות גליקוגן סינתאז המתואר בסעיף 1 לפרוטוקול, להלן, הוא שינוי של זה שתואר על ידי Wayllace et al.11, וסכמת הצימוד מוצגת להלן:

(גלוקוז) n + UPD-גלוקוז → (גלוקוז)n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + פוספונולפירובט → פירובט + ATP

פירובט + NADH + H+ → לקטט + NAD+

גליקוגן סינתאז מוסיף גלוקוז מ-UDP-גלוקוז על גליקוגן. ה-UDP שנוצר בתהליך זה מומר ל-UTP על ידי נוקלאוזיד דיפוספט קינאז (NDP kinase), בתגובה שיוצרת ADP. ה- ADP, בתורו, משמש כמצע לפירובט קינאז, אשר פוספורילטים את ה- ADP באמצעות פוספונולפירובט כתורם פוספט. הפירובט המתקבל מומר ללקטט על ידי האנזים לקטט דהידרוגנאז בתגובה הצורכת NADH. הבדיקה יכולה, אם כן, להתבצע באופן רציף, תוך מעקב אחר הירידה בספיגה ב 340 ננומטר כמו NADH נצרך. הוא מותאם בקלות לשימוש עם אנזימים הדורשים ADP-גלוקוז כתורם גלוקוז. כאן, שלבי הצימוד פשוטים יותר מכיוון שה-ADP המשתחרר על ידי פעולת הגליקוגן סינתאז מופעל ישירות על ידי פירובט קינאז.

קיימים מגוון מבחנים ספקטרופוטומטריים לקביעת פעילות גליקוגן פוספורילאז. בגרסה הקלאסית, האנזים מונע לאחור, בכיוון של סינתזת גליקוגן, כפי שמוצג להלן:

(גלוקוז) n + גלוקוז-1-פוספט → (גלוקוז)n+1 + Pi

במרווחי זמן מתוזמנים מוסרים אליקוטים של תערובת התגובה, וכמות הפוספט המשוחררת מכמתת12,13. בידינו, בדיקה זו הייתה בשימוש מוגבל בשל נוכחותו של פוספט חופשי הניתן למדידה בקלות בתכשירים מסחריים רבים של גלוקוז-1-פוספט, בשילוב עם הריכוזים הגבוהים של גלוקוז-1-פוספט הדרושים לפעולת פוספורילאז. במקום זאת, השתמשנו באופן שגרתי בבדיקה חלופית המודדת את הגלוקוז-1-פוספט המשתחרר כאשר הגליקוגן מתפרק על-ידי זרחן13. נעשה שימוש בסכמת תגובה מצומדת, המומחשת להלן.

(גלוקוז) n + Pi → (גלוקוז)n-1 + גלוקוז-1-פוספט

גלוקוז-1-פוספט → גלוקוז-6-פוספט

גלוקוז-6-פוספט + NADP + → 6-פוספוגלוקונולקטון + NADPH + H+

הגלוקוז-1-פוספט מומר לגלוקוז-6-פוספט על-ידי פוספוגלוקוטאז, והגלוקוז-6-פוספט מתחמצן ל-6-פוספוקונולקטון, עם הפחתה מקבילה של NADP+ ל-NADPH. הנוהל המפורט בסעיף 2 לפרוטוקול, להלן, נגזר משיטות שתוארו על ידי Mendicino et al.14 ו- Schreiber & Bowling 15. הבדיקה יכולה להתבצע בקלות באופן רציף, עם עלייה בספיגה ב 340 ננומטר לאורך זמן, המאפשר את קביעת קצב התגובה.

קביעה ספקטרופוטומטרית של פעילות אנזים מתפרקת מסתמכת על מדידת הגלוקוז המשתחרר על ידי פעולת האנזים על גבול הזרחן דקסטרין16. תרכובת זו מיוצרת על ידי טיפול ממצה בגליקוגן פוספורילאז. מאחר שפעולת הגליקוגן פוספורילאז עוצרת 4 שאריות גלוקוז מנקודת ענף α1,6, דקסטרין הגבול מכיל גליקוגן, שהשרשראות החיצוניות שלו קוצרו ל~4 שאריות גלוקוז. הכנת דקסטרין גבול הפוספורילאז מתוארת כאן, באמצעות הליך הנגזר מאלו שפותחו על ידי Taylor et al.17 ו- Makino & Omichi 18.

פירוק הוא תהליך בן שני שלבים. פעילות 4-α-glucanotransferase של אנזים הפירוק הדו-כיווני מעבירה תחילה שלוש שאריות גלוקוז מנקודת הענף לקצה הלא-מצמצם של שרשרת גלוקוז סמוכה α1,4 המקושרת. שאריות הגלוקוז הבודדות המקושרות α1,6 שנותרו בנקודת הענף עוברות הידרוליזה על-ידי פעילות α1,6-גלוקוזידאז19. הבדיקה מבוצעת בדרך כלל בצורה עצורה, כאשר הגלוקוז משתחרר לאחר זמן נתון (או סדרה של פעמים) נמדד במבחן אנזים מצומד כפי שמוצג להלן:

(גלוקוז) n → (גלוקוז)n-1 + גלוקוז

גלוקוז + ATP → גלוקוז-6-פוספט + ADP

גלוקוז-6-פוספט + NADP + → 6-פוספוגלוקונולקטון + NADPH + H+

קביעת NADPH המיוצר נותן מדד לייצור גלוקוז. הנוהל המתואר בסעיף 3 לפרוטוקול, להלן, מבוסס על הליך שתואר על ידי Nelson et al.16. כמו השיטות האחרות המסתמכות על צריכה או ייצור של NADH/NADPH, הבדיקה רגישה למדי. עם זאת, נוכחות של עמילאזות או גלוקוזידאזות אחרות, שיכולות גם לשחרר גלוקוז חופשי מפוספורילאז המגבילות את הדקסטרין, תגרום להפרעות משמעותיות (ראו דיון).

הקביעה הצבעונית של פעילות אנזימי הסתעפות מסתמכת על העובדה ששרשראות α1,4 של גלוקוז מאמצות מבנים סליליים הנקשרים ליוד, ויוצרים קומפלקסים צבעוניים20. צבע הקומפלקס שנוצר תלוי באורך השרשראות המקושרות α1,4. לפיכך, עמילוז, המורכב משרשראות ארוכות, ברובן לא מסותתות, של גלוקוז α1,4 המקושר, יוצר קומפלקס כחול עמוק עם יוד. לעומת זאת, גליקוגנים, שהשרשראות החיצוניות שלהם הן בדרך כלל בסדר גודל של 6 עד 8 שאריות גלוקוז בלבד, יוצרים קומפלקסים כתומים-אדומים. אם תמיסה של עמילוז מודגרת באנזים מסתעף, הכנסת הענפים לתוך העמילוז גורמת ליצירת שרשראות סוכר קצרות יותר α1,4 המקושרות זו לזו. לפיכך, מקסימום הספיגה של קומפלקסי העמילוז/יוד נע לעבר אורכי גל קצרים יותר. ההליך הנדון כאן נגזר מזה שפורט על ידי Boyer & Preiss21 ופעילות האנזים המסתעף מכמתת כהפחתה בספיגת קומפלקס העמילוז/יוד ב-660 ננומטר לאורך זמן.

כפי שניתן לראות בקלות מהדיון לעיל, העובדה שצבעי הקומפלקסים הנוצרים בין שרשראות יוד ו-α1,4-גלוקוז משתנים עם אורך השרשרת פירושה שספקטרום הספיגה של קומפלקסים של גליקוגן/יוד צריך להשתנות עם מידת הסתעפות הגליקוגן. זה אכן המקרה, וגליקוגנים/גליקוגנים פחות מסועפים עם שרשראות חיצוניות ארוכות יותר בולעים אור באורך גל ארוך יותר מאשר גליקוגנים מסועפים יותר / בעלי שרשראות חיצוניות קצרות יותר. לפיכך, ניתן להשתמש בתגובת צביעת היוד כדי לקבל נתונים מהירים ואיכותיים על מידת הסתעפות הגליקוגן22. הצבע הכתום-חום נוצר כאשר קומפלקסים גליקוגן עם יוד אינו אינטנסיבי במיוחד. עם זאת, ניתן לשפר את התפתחות הצבע על ידי הכללת תמיסת קלציום כלוריד רוויה22. זה מגביר את הרגישות של השיטה פי 10 ומאפשר ניתוח מוכן של כמויות מיקרוגרם של גליקוגן. הבדיקה לקביעת ההסתעפות המתוארת בסעיף 4 לפרוטוקול, להלן, מותאמת מתוך נוהל שפותח על ידי קריסמן22. הוא מתבצע פשוט על ידי שילוב דגימת הגליקוגן עם תמיסת יוד וסידן כלורי בקובט ואיסוף ספקטרום הספיגה מ 330 ננומטר ל 800 ננומטר. מקסימום הספיגה משתנה לכיוון אורכי גל ארוכים יותר ככל שמידת ההסתעפות יורדת.

באופן קולקטיבי, השיטות המתוארות כאן מספקות אמצעים פשוטים ואמינים להערכת פעילותם של האנזימים המרכזיים של חילוף החומרים של גליקוגן, ולהשגת נתונים איכותיים על היקף הסתעפות הגליקוגן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. קביעת פעילות גליקוגן סינתאז

  1. הכן פתרונות מלאי של ריאגנטים נדרשים כפי שמצוין בטבלה 1 (לפני יום הניסוי).
רכיב הנחיות נסיעה
50 מ"מ טריס pH 8.0 ממיסים 0.61 גרם של בסיס Tris ב ~ 80 מ"ל של מים.  מצננים ל-4 מעלות צלזיוס.   התאם את ה- pH ל- 8.0 עם HCl והפוך את עוצמת הקול עד 100 מ"ל עם מים.
מאגר HEPES של 20 mM להמיס 0.477 גרם של HEPES ב ~ 80 מ"ל של מים.  כוונן את ה- pH ל- 7.0 עם NaOH והגבר את עוצמת הקול ל- 100 מ"ל עם מים.
132 מ"מ טריס/32 מ"מ חיץ KCl pH 7.8 ממיסים 1.94 גרם בסיס טריס ו-0.239 גרם KCl ב~90 מ"ל מים.  התאם את ה-pH ל-7.8 באמצעות HCl והשלם את עוצמת הקול ל-100 מ"ל בעזרת מים.
0.8% עם גליקוגן צדפות שוקלים 80 מ"ג של גליקוגן צדפות ומוסיפים למים.  הכינו את הנפח הסופי של עד 10 מ"ל עם מים וחממו בעדינות/ערבבו להמסה מלאה של גליקוגן.
100 mM UDP-גלוקוז ממיסים 0.31 גרם של UDP-גלוקוז במים והופכים את הנפח הסופי עד 1 מ"ל.  יש לאחסן ב-aliquots, קפואים ב-20°C-.   יציב במשך מספר חודשים.
50 מ"מ ATP יש להמיס 0.414 גרם ATP ב~ 13 מ"ל מים.  כוונן את ה- pH ל- 7.5 באמצעות NaOH והשלם את עוצמת הקול ל- 15 מ"ל עם מים.  יש לאחסן ב-aliquots קפואים בטמפרטורה של -20°C.   יציב במשך מספר חודשים.
100 מ"מ גלוקוז-6-פוספט pH 7.8 יש להמיס 0.282 גרם גלוקוז-6-פוספט ב~ 7 עד 8 מ"ל מים.  התאם את ה-pH ל-7.8 באמצעות NaOH.  הפוך את נפח עד 10 מ"ל עם מים.  יש לאחסן קפואים בטמפרטורה של -20°C.   יציב במשך שישה חודשים לפחות.
40 מ"מ פוספונולפירובט להמיס 4 מ"ג של phosphoenolpyruvate ב 0.5 מ"ל של 20 mM HEPES חיץ pH 7.0.  יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.   יציב במשך שבוע אחד לפחות.
0.5 מ' MnCl2 יש להמיס 9.90 גרם של MnCl2 בנפח סופי של 100 מ"ל מים.
NDP קינאז שחזרו את האבקה הליופילית עם כמות מספקת של מים כדי לתת תמיסת U/μl אחת.  מכינים אליקוטים, מקפיאים בחנקן נוזלי ומאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.   יציב לפחות שנה אחת.

טבלה 1: מלאי הפתרונות הדרושים לבדיקת פעילות גליקוגן סינתאז.

  1. ביום הבדיקה, הכינו תמיסת עבודה חדשה של 4 mM NADH על ידי המסת 4.5 מ"ג של NADH ב-1.5 מ"ל של 50 mM Tris-HCl, pH 8.0. יש לאחסן על קרח, מוגן מפני האור.
  2. הפשרת פתרונות של UDP-גלוקוז, ATP, פוספונולפירובט ו-NDP קינאז על הקרח.
  3. מחממים מראש אמבט מים ל -30 מעלות צלזיוס.
  4. הגדר כל בדיקת גליקוגן סינתאז בצינור של 1.5 מ"ל על-ידי הוספת ריאגנטים של תערובת התגובה המפורטים בטבלה 2.
רכיב נפח (μl)
160 mM טריס / 32 mM KCl מאגר pH 7.8 250
מים 179
100 מ"מ גלוקוז-6-פוספט, pH 7.8 58
0.8% עם גליקוגן צדפות 67
50 מ"מ ATP 80
4 דקותנענע 80
100 mM UDP-גלוקוז 28
40 מ"מ פוספונולפירובט 20
0.5 מ' MnCl2 8
כרך אחרון 770

טבלה 2: תערובת תגובת הרכב לבדיקת פעילות גליקוגן סינתאז.

הערה: כדי להקל על ההגדרה, ניתן ליצור תערובת אב המכילה מספיק מכל אחד מהריאגנטים המפורטים לעיל כדי להשלים את מספר הבדיקות המתוכננות.

  1. הכן תגובה ריקה, שבה NADH בתערובת לעיל מוחלף במים. מעבירים לקובט מתקרילט חד פעמי ומשתמשים בו כדי להגדיר את האפס על הספקטרופוטומטר ב-340 ננומטר.
  2. קח אחד 770 μL של תערובת aliquot של תגובה בצינור 1.5 מ"ל. מוסיפים 2 μL של NDP kinase ו-2 μL של תערובת פירובט קינאז/לקטט דהידרוגנאז, מערבבים בעדינות ודוגרים בטמפרטורה של 30°C למשך 3 דקות כדי לחמם מראש את תערובת התגובה.
  3. הוסף 30 μL של הדגימה המכילה גליקוגן סינתאז ב 20 mM Tris buffer, pH 7.8; מערבבים, ומעבירים את תערובת התגובה לקובט מתקרילט חד פעמי.
  4. הכניסו את הקובט לתוך הספקטרופוטומטר ותעדו את הספיגה ב-340 ננומטר במרווחים מתוזמנים למשך 10 עד 20 דקות. לתכנן את הספיגה שהושגה כנגד הזמן.
    הערה: יש לבצע תגובה שבה דגימת הגליקוגן סינתאז מוחלפת בחיץ Tris של 20 mM כדי לשלוט על חמצון לא אנזימטי של NADH. בהתאם לטוהר הדגימה, ייתכן שיידרשו תגובות בקרה אחרות. ראה דיון לפרטים.
  5. קבע את קצב התגובה (ראה תוצאות לקבלת פרטים).

2. קביעת פעילות גליקוגן פוספורילאז

  1. הכן פתרונות מלאי כמפורט בטבלה 3 (לפני יום הניסוי).
רכיב הנחיות נסיעה
125 מ"מ צינורות pH 6.8 ממיסים 3.78 גרם של צינורות במים.  כוונן את ה-pH ל-6.8 עם NaOH והגבר את עוצמת הקול ל-100 מ"ל עם מים.
8% עם גליקוגן צדפות שוקלים 0.8 גרם של גליקוגן צדפות ומוסיפים למים.  הכינו את הנפח הסופי של עד 10 מ"ל עם מים וחממו בעדינות/ערבבו להמסת גליקוגן.  יש לאחסן קפוא בטמפרטורה של -20°C.
200 mM נ פוספט pH 6.8 יש להמיס 2.63 גרם של Na 2 HPO 4.7H 2 Oו-1.41 גרם של NaH2PO4. H2O במים.  הביאו את הנפח עד 100 מ"ל עם מים.
1 מ"מ גלוקוז-1,6-ביספוספט יש להמיס 2 מ"ג גלוקוז-1,6-ביספוספט ב-4 מ"ל מים.  Aliquot ולאחסן קפוא ב -20 מעלות צלזיוס.   יציב לפחות מספר חודשים.
10 מ"מ NADP יש להמיס 23 מ"ג NADP ב-3 מ"ל מים.  Aliquot ולאחסן קפוא ב -20 מעלות צלזיוס.   יציב לפחות מספר חודשים.

טבלה 3: מלאי הפתרונות הדרושים לבדיקת פעילות גליקוגן פוספורילאז.

  1. מחממים מראש אמבט מים ל-30 מעלות צלזיוס
  2. הגדר כל בדיקת גליקוגן פוספורילאז בצינור של 1.5 מ"ל על ידי הוספת ריאגנטים של תערובת התגובה המפורטים להלן (טבלה 4).
רכיב נפח (μl)
125 mM צינורות מאגר pH 6.8 160
מים 70
8% עם גליקוגן צדפות 100
200 מ"מ נה פוספט 6.8 400
1 מ"מ גלוקוז-1,6-ביספוספט 20
10 מ"מ NADP 20
כרך אחרון 770

טבלה 4: תערובת תגובת הרכב לבדיקת פעילות גליקוגן פוספורילאז.

הערה: כדי להקל על ההגדרה, ניתן ליצור תערובת אב המכילה מספיק מכל אחד מהריאגנטים המפורטים לעיל כדי להשלים את מספר הבדיקות המתוכננות.

  1. הכן תגובה ריקה המכילה את הרכיבים המפורטים בטבלה 4 אך הוסף 30 μL נוספים של 25 mM PIPES buffer, pH 6.8 (מוכן על ידי דילול 125 mM PIPES מאגר 1/5 עם מים). מעבירים לקובט מתקרילט חד פעמי ומשתמשים בו כדי להגדיר את האפס על הספקטרופוטומטר ב-340 ננומטר.
  2. קח אחד 770 μL aliquot של תערובת תגובה בצינור 1.5 מ"ל. הוסיפו 1 μL של גלוקוז-6-פוספט דהידרוגנאז ו-1 μL של פוספוגלוקומוטאז, ערבבו בעדינות ודגרו בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות כדי לחמם מראש את תערובת התגובה.
  3. הוסף 30 μL של הדגימה המכילה גליקוגן phosphorylase ב 25 mM PIPES buffer, pH 6.8. מערבבים ומעבירים את תערובת התגובה לקובט מתקרילט חד פעמי.
  4. הכניסו את הקובט לתוך הספקטרופוטומטר ותעדו את הספיגה ב-340 ננומטר במרווחים מתוזמנים למשך 10 עד 20 דקות. לתכנן את הספיגה שהושגה כנגד הזמן.
    הערה: יש לכלול תגובה שבה גליקוגן פוספורילאז מוחלף במאגר PIPES של 25 mM. בהתאם לטוהר דגימת הגליקוגן פוספורילאז, ייתכן שיהיה צורך גם בבקרות אחרות (ראו דיון לפרטים).
  5. קבע את קצב התגובה (ראה תוצאות מייצגות לקבלת פרטים).

3. קביעת פעילות אנזים מפרק גליקוגן

  1. הכן פתרונות מלאי כפי שמצוין בטבלה 5 (לפני יום הניסוי).
רכיב הנחיות נסיעה
חיץ זכרים של 100 מ"מ ממיסים 1.61 גרם של חומצה זכרית ב~ 80 מ"ל מים.  התאם את ה- pH ל- 6.6 עם NaOH והפוך את הנפח הסופי לעד 100 מ"ל עם מים.
300 מ"ר טריאתנולמין הידרוכלוריד / 3 מ"מ MgSO4 pH 7.5 יש להמיס 27.85 גרם של טריאתנולמין הידרוכלוריד ו-0.370 גרם של MgSO4. 7H2O ב ~ 400 מ"ל של מים.  התאם את ה- pH ל- 7.5 עם NaOH וצור נפח סופי של 500 מ"ל עם מים.
150 מ"מ ATP / 12 מ"מ NADP יש להמיס 1.24 גרם ATP ב~ 10 מ"ל מים.  עקוב אחר ה- pH והוסף NaOH כדי לשמור על pH של ~ 7.5 כאשר ה- ATP מתמוסס.  הוסף 0.138 גרם של NADP.  התאם את ה- pH ל~ 7.5 עם NaOH והשלם עד נפח סופי של 15 מ"ל עם מים. יש לאחסן ב-aliquots בטמפרטורה של 20°C. יציב במשך מספר חודשים.
50 mM מאגר פוספט Na pH 6.8 יש להמיס 32.81 גרם של Na 2 HPO 4.7H 2 Oו-17.61 גרם של NaH2PO4. H2O במים.  הביאו את הנפח לנפח סופי של 5 ליטר עם מים.

טבלה 5: מלאי הפתרונות הדרושים לבדיקת פעילות האנזים המסתעף של גליקוגן.

  1. להכין פוספורילאז להגביל דקסטרין
    1. להמיס 0.3 גרם של גליקוגן צדפות ב 10 מ"ל של 50 mM חיץ נתרן פוספט, pH 6.8.
    2. יש להמיס כמות מספקת של אבקת פוספורילאז A שעבר ליאופיליזציה כדי להניב 60 U של פעילות במאגר פוספט של 50 mM, pH 6.8.
      הערה: בהתאם לכמות הזרחן A שנרכשה, המסה הדרושה תשתנה אך בדרך כלל היא בין 5 ל-10 מ"ג אבקה.
  2. יש להוסיף 60 U של זרחן A לתמיסת הגליקוגן ולהעביר לשקית דיאליזה. יש לבצע דיאליזה בטמפרטורת החדר כנגד 1 ליטר של חיץ נתרן פוספט של 50 mM, pH 6.8 למשך 8 שעות. החליפו למאגר הדיאליזה הטרי והמשיכו את הדגירה למשך הלילה.
  3. יש להוסיף עוד 10 U של זרחן A ולהחליף למאגר דיאליזה טרי. לאחר 8 שעות, שוב להחליף חיץ דיאליזה טרי ולהמשיך את הדגירה לילה.
  4. מעבירים את תכולת שקית הדיאליזה לצינור צנטריפוגה ומרתיחים במשך 10 דקות. מצננים על קרח, ואז צנטריפוגה בגודל 10,000 x גרם למשך 15 דקות.
  5. מעבירים את הסופרנטנט לשקית דיאליזה ועושים דיאליזה למשך 8 שעות כנגד שלושה שינויים של 2 ליטר מים מזוקקים.
  6. מעבירים את תכולת תיק הדיאליזה לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. מדוד את עוצמת הקול והוסף שני נפחים של אתנול מוחלט קר כקרח כדי לזרז את גבול הדקסטרין. תן את הצינור לעמוד על הקרח במשך 30 דקות.
    הערה: משקע לבן אמור להתחיל להיווצר מיד עם הוספת אתנול, אך אם לא, להוסיף טיפה של 3 M NaCl.
  7. צנטריפוגה ב 15,000 x גרם במשך 15 דקות ולהשליך את supernatant. יש לשטוף את הכדור הלבן של דקסטרין מוגבל פעמיים עם 66% אתנול v/v, באמצעות ~30 מ"ל לכל שטיפה.
  8. מעבירים את הדקסטרין המוגבל למכתש ומניחים לו להתייבש לחלוטין. כאשר דקסטרין הגבול יבש, טוחנים לאבקה עם מזיק ומעבירים לכלי מתאים לאחסון; יבש ב-4°C.
  9. לשימוש כמצע אנזים מנטרל, הכינו תמיסה של 1% w/v במים.
  10. מחממים מראש אמבט מים ל -30 מעלות צלזיוס.
  11. מחממים מראש בלוק חימום או אמבט מים ל 95 מעלות צלזיוס.
  12. הכינו ארבעה צינורות של 1.5 מ"ל שכל אחד מהם מכיל 100 μL של חיץ זכר, 80 μL של דקסטרין גבול זרחן ו-10 μL של מים. צינורות אלה ישמשו לביצוע בדיקת האנזים המנטרל. תייג שניים מהצינורות תגובה ושני הצינורות האחרים שליטה.
  13. במרווחי זמן מתוזמנים, יש להוסיף 10 μL מדגימת האנזים debranching לצינורות התגובה ו-10 μL של חיץ אשר שימשו להכנת דגימת אנזים ההסתעפות לצינורות הבקרה. דגירה ב-30 מעלות צלזיוס.
  14. בנקודות זמן מוגדרות (למשל, דגירה של 5, 10 ו-20 דקות), יש למשוך 50 μL מכל צינור תגובה ובקרה ולהניח מיד לתוך בלוק החימום או אמבט המים בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס. מחממים במשך 3 דקות.
  15. צנטריפוגה ב 15,000 x גרם במשך 2 דקות על מנת להסיר חלבון מזורז.
    הערה: בשלב זה, ניתן לעצור את ההליך במידת הצורך. ניתן לאחסן את הדגימות המחוממות בהקפאה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד להמשך מדידת הגלוקוז המשוחרר (שלב 17, להלן).
  16. מדידת גלוקוז משוחרר
    1. העבירו 40 μL של הסופרנטנט מהדגימות המחוממות לקולטות מתקרילט חד-פעמיות והוסיפו 833 μL של חיץ טריאתנולמין הידרוכלוריד/מגנזיום סולפט, 67 μL של תערובת NADP/ATP ו-60 μL של מים. מערבבים על ידי צנרת למעלה ולמטה בעדינות, נזהרים לא להכניס בועות אוויר.
      הערה: כדי להקל על ההגדרה, ניתן ליצור תערובת אב המכילה מספיק מכל אחד מהריאגנטים המפורטים לעיל כדי להשלים את מספר הבדיקות המתוכננות.
    2. הכינו תגובה ריקה על ידי שילוב של 100 μL של חיץ maleate, 80 μL של פוספורילאז להגביל דקסטרין, ו 20 μL של מים. מערבבים היטב, ומעבירים 40 μL לקובט מתקרילט חד פעמי. יש להוסיף 833 μL של טריאתנולמין הידרוכלוריד/מגנזיום סולפט וכו' כמתואר בשלב 3.17.1.
    3. הגדר את האפס על הספקטרופוטומטר ב-340 ננומטר באמצעות התגובה הריקה.
    4. הוסיפו 0.5 מיקרוגרם של גלוקוז-6-פוספט דהידרוגנאז לכל קובט. מערבבים בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה לאט. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ולאחר מכן רשמו את הספיגה ב-340 ננומטר.
      הערה: ערכי הספיגה צריכים להיות נמוכים, מה שמעיד על זיהום קטן של הדגימות בגלוקוז-6-פוספט.
    5. יש להוסיף 0.5 μL של הקסוקינאז לכל קובט. מערבבים בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה לאט. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, ולאחר מכן לרשום את הספיגה ב-340 ננומטר.
    6. ממשיכים את הדגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות נוספות. הקלט שוב את הספיגה ב-340 ננומטר. אם הספיגה עלתה מזו שנרשמה ב-15 דקות, המשיכו את הדגירה למשך 5 דקות נוספות ובדקו שוב את הקליטה. תעד את הספיגה הסופית ב-340 ננומטר שהושגה.
    7. עבור כל דגימה, הפחיתו את הספיגה ב-340 ננומטר שנרשמה לאחר הוספת גלוקוז-6-פוספט דהידרוגנאז מהספיגה הסופית המתקבלת לאחר הוספת הקסוקינאז. התווה את הערכים שהתקבלו כנגד משך הזמן שבו הדגימה המתאימה הודגרה עם אנזים debranching.

4. קביעת פעילות אנזים מסתעף גליקוגן

  1. לפני יום הניסוי, הכינו תמיסת יוד/KI על ידי המסת 2.6 גרם של KI ב-10 מ"ל מים. במכסה אדים, שוקלים 0.26 גרם יוד ומוסיפים לתמיסת KI.
    אזהרה: יוד מזיק במגע עם העור או בשאיפה. מערבבים להמסת היוד ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מוגנים מפני האור. הכינו גם מאגר צינורות 125 mM, pH 6.8 (ראה טבלה 3).
  2. כאשר מתחילים ניסויים, לעשות מלאי עובד של ריאגנט יוד חומצי.
    1. יש ליטול 45.7 מ"ל מים בצינור של 50 מ"ל ולהוסיף 150 מיקרו-ליטר של תמיסת יוד/KI ואחריה 150 מיקרו-ליטר של 1 M HCl.
    2. מערבבים היטב ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מוגנים מפני האור. הפתרון יציב לפחות 3 ימים בתנאים אלה.
  3. ביום הניסוי, הכינו תמיסה טרייה של 10 מ"ג/מ"ל של עמילוז.
    1. שוקלים 50 מ"ג אמילוז ומעבירים לצינור של 15 מ"ל.
    2. יש להוסיף 200 μL של אתנול מוחלט ולנער בעדינות.
    3. יש להוסיף 500 μL של 2 M KOH ולנער בעדינות.
      אזהרה: KOH גורם לכוויות קשות בעור ולנזק לעיניים. השתמש בציוד מגן אישי מתאים.
    4. יש להוסיף 0.5 מ"ל מים תוך כדי ניעור עדין. אם העמילוז אינו מתמוסס לחלוטין, הוסיפו עוד 0.5 מ"ל מים.
    5. התאם את ה- pH ל- ~6.5 עד 7.0 עם 1 M HCl.
      אזהרה: HCl עלול לגרום לגירוי בעיניים, בעור ובדרכי הנשימה. השתמש בציוד מגן אישי מתאים.
    6. מוסיפים מים כדי להגיע לנפח סופי של 5 מ"ל.
    7. יש לעקר על ידי מעבר דרך מסנן קצה מזרק 0.2 מיקרומטר ולאחסן בטמפרטורת החדר. אין לצנן או להקפיא.
  4. מחממים מראש אמבט מים ל -30 מעלות צלזיוס.
  5. הכינו שתים-עשרה צינורות של 1.5 מ"ל, שכל אחד מהם מכיל 1 מ"ל של מגיב יוד חומצי. מניחים בצד על הספסל. אלה ישמשו לעצירת תגובת אנזימי ההסתעפות.
  6. הכינו ארבעה צינורות של 1.5 מ"ל שכל אחד מהם מכיל 150 מיקרול של עמילוז, 150 μL של חיץ PIPES ו-45 μL של מים. צינורות אלה ישמשו לביצוע בדיקת אנזים ההסתעפות. תייג שניים מהצינורות תגובה ושני הצינורות האחרים שליטה.
  7. במרווחי זמן מתוזמנים, יש להוסיף 5 μL של דגימת אנזים מסתעף לצינורות התגובה ו-5 μL של חיץ אשר שימשו להכנת דגימת אנזים ההסתעפות לצינורות הבקרה. דגירה ב-30 מעלות צלזיוס.
  8. בנקודות זמן מוגדרות (למשל, דגירה של 5, 10 ו-15 דקות), יש למשוך 10 μL מכל צינור תגובה ובקרה ולהוסיף לצינורות 1.5 מ"ל המכילים 1 מ"ל של מגיב יוד חומצי. מוסיפים עוד 140 מיקרוגרם מים ומערבבים היטב. העברה לקוביות חד פעמיות.
    הערה: הדוגמאות צריכות להיות בצבע כחול והתמיסה צריכה להיות נקייה מכל זרז. הצבע שנוצר יציב לפחות שעתיים בטמפרטורת החדר.
  9. הכינו דגימה המכילה 1 מ"ל של מגיב יוד חומצי ו 150 μL של מים. מערבבים היטב ומעבירים לקובט. השתמש ב- cuvette זה כדי להגדיר את האפס על הספקטרופוטומטר ב- 660 ננומטר.
  10. קרא את הספיגה של כל אחת מ-12 הדגימות ב-660 ננומטר. קבע את קצב התגובה של אנזים ההסתעפות על-ידי הפחתת הספיגה המתקבלת בנוכחות אנזים מסתעף (תגובה) מהספיגה כאשר אין אנזים מסתעף (בקרה) בכל נקודת זמן. ראה תוצאות נציג לקבלת פרטים.

5. הערכה איכותית של הסתעפות גליקוגן

  1. הכן תמיסת קלציום כלוריד רוויה על ידי הוספת 74.5 גרם של סידן כלורי נטול מים ל~ 40 מ"ל מים וערבוב. מוסיפים עוד קצת מים וממשיכים לערבב. הפוך את עוצמת הקול עד 100 מ"ל עם מים והמשך לערבב עד שה- CaCl2 מתמוסס לחלוטין.
  2. הכן מלאי עבודה של מגיב צבע יוד/CaCl 2 על-ידי ערבוב של 50 מיקרון של תמיסת מלאי KI/יוד (ראה שלב 4.1, לעיל) עם 13 מ"ל של תמיסת CaCl2 רוויה בצינור של 15 מ"ל. מערבבים היטב ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מוגנים מפני האור. הפתרון יציב לפחות שבוע בתנאים אלה.
  3. קביעת הסתעפות
    1. בצינור של 1.5 מ"ל, יש לשלב 650 μL של מלאי ריאגנטים בצבע יוד/CaCl2 עם 100 μL מים ולערבב היטב. מעבירים את התמיסה לקובט מתקרילט חד פעמי.
      הערה: התמיסה בקובט צריכה להיות בצבע צהוב בהיר וחיוור.
    2. מניחים בספקטרופוטומטר, ופועלים במצב סריקת אורך גל, אוספים ספקטרום רקע מ-330 ננומטר עד 800 ננומטר.
    3. בשפופרת של 1.5 מ"ל, יש לשלב 650 מיקרון ליטר של יוד עובד/CaCl2 ריאגנט צבע עם 50 מיקרוגרם של גליקוגן צדפות. הביאו את הנפח הסופי ל-750 מיקרו-ליטר עם מים וערבבו היטב. מעבירים את התמיסה לקובט מתקרילט חד פעמי.
      הערה: התמיסה בקובט צריכה להיות שקופה וצבעה כתום/חום עמוק.
    4. מניחים בספקטרופוטומטר ואוספים ספקטרום קליטה מ-330 ננומטר עד 800 ננומטר.
    5. חזור על שלבים 4.4.3 עד 4.4.4 עם 50 מיקרוגרם עמילופקטין ו-30 מיקרוגרם אמילוז.
      הערה: דגימת העמילופקטין צריכה להיות צהובה/ירוקה ודגימת העמילוז צריכה להיות ירוקה/כחולה. שתי הדוגמאות צריכות להיות ברורות. הקומפלקסים הצבעוניים הנוצרים יציבים, ללא שינוי בספקטרום הקליטה, למשך שעה אחת לפחות בטמפרטורת החדר.
    6. כדי לקבל אינדיקציה למבנה המסועף של דגימת גליקוגן לא מאופיינת, יש לשלב 25 מיקרוגרם עד 50 מיקרוגרם גליקוגן עם 650 μL של יוד עובד / ריאגנט צבע CaCl2 . המשך כנ"ל, מביא את הנפח ל 750 μL עם מים, ערבוב יסודי, והעברת לקובט מתקרילט.
      הערה: דגימת הגליקוגן צריכה להניב צבע צהוב/כתום עד כתום/חום, בהתאם למידת ההסתעפות (אורך השרשראות החיצוניות) של הגליקוגן הקיים. שוב, המדגם צריך להיות ברור. ראה תוצאות נציג לקבלת פרטים.
    7. לאסוף את ספקטרום הספיגה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

קביעת פעילות גליקוגן סינתאז
איור 1 מראה תוצאות מייצגות של מבחני גליקוגן סינתאז באמצעות אנזימים מטוהרים. בלוח A, לאחר השהיה קלה, חלה ירידה ליניארית בספיגה של 340 ננומטר לאורך זמן לתקופה של כ-12 דקות. קצב השינוי בספיגה באיור 1A היה ~0.12 יחידות ספיגה לדקה. קצב השינוי בספיגה בין ~0.010 ל-~0.20 יחידות ספיגה לדקה הוא אופטימלי ויש להתאים את כמות הגליקוגן סינתאז שנוסף לשיעורי התשואה בטווח זה. בלוח B מוצגת התוצאה של הוספת כמות גדולה מדי של גליקוגן סינתאז לבדיקה. כאן, התגובה הושלמה בתוך 2 הדקות הראשונות. תגובת הבקרה, שבמקרים אלה לא הכילה גליקוגן סינתאז, לא הראתה ירידה ניתנת למדידה בספיגה לאורך זמן. כפי שפורט בדיון, השימוש בהומוגנטים של רקמות בבדיקה זו הוא אפשרי לחלוטין, אם כי נדרשות תגובות בקרה נוספות.

הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בגליקוגן צדפות כמצע, אשר עובד היטב עם גליקוגן סינתאזות ממינים רבים ושונים. עם זאת, יש לציין כי גליקוגן סינתאזות עשויות להציג פעילות משתנה למדי בהתאם לסוג הגליקוגן המועסק. לכן, מומלץ לסקור מגוון צורות של גליקוגן לפני תחילת כל מחקר מפורט.

הפרוטוקול שניתן כולל גלוקוז-6-פופוספט בתערובת התגובה, שכן סינתזות גליקוגן רבות מופעלות באופן אלוסטרי על ידי תרכובת זו 9,23,24,25,26. ביצוע בדיקות בנוכחות והיעדר גלוקוז-6-פוספט (המרכיב את נפח התגובה עם מים), מאפשר חישוב של יחס פעילות -/+ גלוקוז-6-פוספט, המהווה אינדיקציה שימושית למצב הזרחון של סינתזות גליקוגן יונקים ופטרייתיים 1,27.

קביעת פעילות הגליקוגן סינתאז מהשינוי בספיגה היא פשוטה למדי. מקדם ההכחדה של NADH נלקח כ- 6220 M-1 cm-1, ומאפשר חישוב קצב השינוי בריכוז NADH מקצב שינוי הספיגה כדלקמן:

קצב שינוי בספיגה של 0.12 יחידות לדקה מתאים ל- 0.12/6220 = 1.93 x 10-5 mol/L/min שינוי בריכוז NADH. הנפח בקובט היה 0.8 מ"ל, כלומר השינוי בכמות NADH היה: 1.93 x 10-5 x 0.8 x 10-3 = 3.46 x 10-8 מול לדקה. נפח האנזים שנוסף היה 60 μL, 3.46 x 10-8 x (1000 / 60) = 5.76 x 10-7 mol NADH נצרך / min/mL אנזים.

מאחר שקיים קשר של אחד לאחד בין ה-NADH הנצרך לבין הגלוקוז המשולב בגליקוגן, קצב התגובה יכול לבוא לידי ביטוי כ-5.76 x 10-7 מול גלוקוז משולב/דקה/מ"ל.

כאשר תכולת החלבון בדגימת האנזים ידועה, פעילות האנזים הספציפית יכולה להתבטא כחלבון μmol המשלב חלבון/דקה/מ"ג או חלבון משולב גלוקוז nmol/min/mg, לפי הצורך.

כפי שצוין במבוא, הפרוטוקול מותאם בקלות למדידת הפעילות של גליקוגן סינתאזות המשתמשות ב- ADP-גלוקוז כתורם גלוקוז. זה מושג על ידי החלפה פשוטה של UDP-גלוקוז עם ADP-גלוקוז בתערובת התגובה. יתר על כן, גם NDP קינאז וגם ATP מושמטים מתערובת התגובה, שכן ה-ADP המשתחרר במהלך פעולת גליקוגן סינתאז הוא מצע ישיר לפירובט קינאז.

Figure 1
איור 1: תוצאות מייצגות של בדיקות של פעילות גליקוגן סינתאז. הספקטרופוטומטר היה אמור לבצע קריאה אחת לדקה למשך זמן כולל של 20 דקות. לוח A מראה את שלב ההשהיה הקצר הצפוי ואחריו ירידה ליניארית בספיגה עם הזמן (ניסיוני). לא נרשמה ירידה בספיגה שצוינה בתגובת הבקרה. קצב התגובה מחושב משיפוע שינוי הספיגה בפאזה הליניארית (בין 5 ל -16 דקות). לוח B מציג את התוצאה של הוספת יותר מדי אנזים. כאן, NADH מותש תוך 2 דקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

קביעת פעילות גליקוגן פוספורילאז
איור 2 מראה נתונים מייצגים מבדיקת גליקוגן פוספורילאז באמצעות אנזים מטוהר. עם ההכנה המשמשת כאן, הבדיקה הייתה ליניארית במשך כ -3 דקות. הכניסה מציגה קו רגרסיה המשורטט דרך הנקודות מזמן 0 עד 2.5 דקות. השיפוע של קו זה מראה שקצב שינוי הספיגה הוא 0.022 יחידות ספיגה לדקה. קצב עלייה בספיגה של סביב 0.01 עד 0.04 הוא אופטימלי, שכן הבדיקה תסטה מלינאריות די מהר אם יש יותר מדי אנזים. קצב היווצרות NADPH מחושב ממקדם ההכחדה אשר, כמו זה של NADH, הוא 6220 M-1 cm-1. עבור כל מול אחד של NADPH שנוצר, מול-אחד של גלוקוז-1-פוספט הופק על ידי פעולה של גליקוגן פוספורילאז. לפיכך, ניתן לבטא את פעילות האנזים ככמות גלוקוז-1-פוספט המשתחררת מגליקוגן ליחידת זמן, לאחר חישוב דומה לזה שתואר לעיל.

תנאי התגובה ניתנים להתאמה בקלות לאותם פוספורילאזות הרגישות למודולציה אלוסטרית. האפקטים הנדרשים פשוט כלולים בתערובת מאסטר התגובה, ומחליפים חלק מהמים. אזהרה חשובה היא שיש להראות כי המשפיע עצמו אינו משפיע על פעילותם של אנזימי הצימוד, פוספוגלוקומוטאז וגלוקוז-6-פוספט דהידרוגנאז.

לבסוף, כמו עם גליקוגן סינתאז שתואר לעיל, סוג הגליקוגן המשמש כמצע עשוי להשפיע על קצב התגובה. אמנם גליקוגן צדפות עובד היטב עם זרחן ממינים רבים, אבל הוא לא תמיד יכול להיות הבחירה האופטימלית.

Figure 2
איור 2: תוצאות מייצגות של בדיקות של פעילות גליקוגן פוספורילאז. הספקטרופוטומטר היה אמור לבצע קריאה אחת כל 30 שניות למשך זמן כולל של 10 דקות. נרשמה עלייה מתמדת בספיגה בנוכחות גליקוגן פוספורילאז (ניסיוני), בעוד שהתגובה ללא תוספת זרחן נותרה בנקודת ההתחלה (Control). הכניסה מראה הרחבה של תקופת התגובה הראשונית, המדגימה את הלינאריות של היווצרות המוצר ביחס לזמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

קביעת פעילות אנזים מפרק גליקוגן
הנתונים המוצגים באיור 3 מייצגים בדיקה של אנזים פירוק גליקוגן באמצעות אנזים טיהור מטוהר. בכל נקודת זמן, השינוי בספיגה שהתרחש בהיעדר אנזים הסתעפות נוסף (Control) הופחת מהשינוי בספיגה שהתרחש בנוכחות אנזים מסתעף (תגובה). ערכי הספיגה שהתקבלו היו אז מתווים. כאמור לעיל, שיעור השינוי של ריכוז NADPH מחושב מהשיפוע הראשוני של העקומה על ידי ניתוח רגרסיה. בדוגמה זו, העלייה ב-NADPH ליחידת זמן הייתה ליניארית במשך 10 דקות, עם שיפוע של 0.0079 יחידות ספיגה לדקה. בעוד שנתונים אלה ניתנים לשימוש מושלם, תוספת של מעט פחות אנזים הייתה נותנת שיפוע רדוד יותר ומאפשרת פאזה ליניארית ארוכה יותר. לחלופין, ניתן לבצע קריאות נוספות על ידי הסרת אליקוטים למדידה באינקובציה של 2 דקות ו-7 דקות. קביעת פעילות האנזים המתפרק היא פשוטה מאוד, שכן מול אחד של NADPH נוצר עבור כל מול אחד של גלוקוז המשתחרר על ידי פעילות α1,6-גלוקוזידאז של אנזים debranching. לפיכך, קצב התגובה יכול לבוא לידי ביטוי ככמות הגלוקוז המשתחררת מפוספורילאז מגבילה דקסטרין ליחידת זמן, לאחר אותו סוג של חישוב ששימש למבחני גליקוגן סינתאז ופוספורילאזות, לעיל.

Figure 3
איור 3: תוצאות מייצגות של בדיקות של פעילות האנזים מפרק גליקוגן. דגימות של דקסטרין גבול פוספורילאז טופלו באנזים מתפרק במשך 5, 10, 20 או 40 דקות. העלייה בספיגה ב-340 ננומטר, שהופקה כאשר NADP הופחת ל-NADPH בבדיקת אנזים מצומד, נמדדה בדגימות שנלקחו בכל אחת מנקודות הזמן הללו. התגובה הראתה פאזה ליניארית, שנמשכה לפחות 10 דקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

קביעת פעילות אנזים הסתעפות גליקוגן
איור 4 מציג נתונים ממבחני אנזים מסתעף גליקוגן. בכל אחת מנקודות הזמן שצוינו, נמדדה ספיגת דגימות הבקרה והתגובה. הספיגה של דגימת התגובה ב-660 ננומטר הופחתה מזו של דגימת הבקרה המתאימה, והפרש הספיגה הושווה כנגד הזמן. לאחר מכן שורטטו קו רגרסיה דרך הנקודות (לוח A). קצב התגובה יכול לבוא לידי ביטוי פשוט כשינוי בספיגה ב-660 ננומטר ליחידת זמן. השינוי המרבי בספיגה שיכול להתרחש בבדיקה זו הוא רק ~0.4 יחידות ספיגה, המייצגות הסתעפות מקסימלית של העמילוז המוסף על ידי אנזים ההסתעפות (לוח B). יתר על כן, כאשר הספיגה של צינורות התגובה יורדת ביותר מ~0.2 יחידות ספיגה מתחת לזו של הבקרה, הבדיקה כבר אינה בטווח הליניארי ולא ניתן לבצע הערכה של קצב התגובה (לוח B).

עמילוז המשמש כמצע בהליך זה יתחיל להשאיר פתרון די בקלות אם מקורר או קפוא ולאחר מכן מופשר. לכן, חשוב להפוך את תמיסת המצע עמילוז לרעננה ולוודא שלא נוצר משקע לפני השימוש.

Figure 4
איור 4: תוצאות מייצגות של בדיקות של פעילות אנזים מסתעף גליקוגן. דגימות של עמילוז טופלו באנזים מסתעף. Aliquots הוסרו בנקודות הזמן המוצגות והוספו לריאגנט יוד חומצי. הספיגה של קומפלקס עמילוז/יוד שנוצרה נמדדה אז ב-660 ננומטר. הנתונים המוצגים מייצגים את ההבדל בספיגה בין דגירי בקרה שלא היו בעלי אנזים מסתעף לבין תגובות שהכילו אנזים מסתעף. לוח A מראה ירידה בספיגה ב-660 ננומטר עקב פעילות אנזים מתפרקת, שהייתה ליניארית במשך ~20 דקות. לוח B ממחיש את הטווח הדינמי הצר של הבדיקה, כאשר השינוי המרבי בספיגה שניתן לייצר הוא ~0.4 יחידות ספיגה והלינאריות אובדת כאשר השינוי בספיגה הוא ~0.2 יחידות ספיגה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הערכה איכותית של היקף הסתעפות הגליקוגן
עמילוז, עמילופקטין, דקסטרין מוגבל פוספורילאז, גליקוגן שבודד משמרים שולבו עם תמיסת סידן כלורי יוד/רוויה וספקטרום הספיגה של הקומפלקסים שהתקבלו נאסף (איור 5). באמצעות המסות של גליקוגן, עמילופקטין ועמילוז שניתנו בפרוטוקול שתואר לעיל, קריאת הספיגה המרבית המתקבלת צריכה להיות סביב 0.7 עד 0.8, כפי שמוצג כאן (לוחות A ו- B). מקסימום הספיגה של עמילוז ועמילופקטין הוא בסביבות 660 ננומטר ו-500 ננומטר, ו-385 ננומטר בהתאמה. גבול הפוספורילאז דקסטרין נכלל כאן, שכן איסוף ספקטרום הספיגה של קומפלקס דקסטרין/יוד עם מגבלת זרחן מספק בדיקה מהירה של היקף עיכול הזרחן שהושג במהלך הכנת סובסטרט אנזים מתפרק זה. גליקוגן מרוב המקורות מייצר שתי פסגות, אחת בגובה של כ-400 ננומטר ופסגה שנייה ב-460 ננומטר (איור 5B). תזוזות שמאלה בספקטרום הספיגה של גליקוגן מצביעות על הסתעפות מוגברת/ירידה באורך השרשרת החיצונית. לעומת זאת, הסטות ימינה מצביעות על ירידה בהסתעפות/הגדלת אורך השרשרת החיצונית.

תמיסת הקלציום כלוריד הרוויה צפופה ודגימות הגליקוגן הנוספות ייצרו שכבה לרוחב החלק העליון כאשר מוסיפים אותה. לכן, ערבוב זהיר יש צורך להשיג פתרון הומוגני. בנוסף, אם דגימות הפחמימות שבהן נעשה שימוש אינן מומסות במלואן לפני הערבוב עם תמיסת הסידן כלורי, ייווצרו אגרגטים כהים בקובט. אגרגטים אלה יעכבו כמובן את איסוף ספקטרום הספיגה וחשוב לוודא שהתמיסה בקובטה ברורה לפני שממשיכים במדידות כלשהן.

Figure 5
איור 5: תוצאות מייצגות מההערכה האיכותית של הסתעפות גליקוגן. דגימות של פוספורילאז מטוהר להגביל דקסטרין, עמילופקטין, עמילוז (פאנל A) או גליקוגן (פאנל B) שולבו עם תמיסת יוד / סידן כלורי רווי ואת ספקטרום הספיגה של קומפלקסים שהתקבלו נמדדו מ 330 ננומטר עד 800 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

באופן כללי, היתרונות העיקריים של כל השיטות המוצגות הם העלות הנמוכה, הקלות, המהירות וחוסר ההסתמכות על ציוד מיוחד. החיסרון העיקרי המשותף לכולם הוא רגישות בהשוואה לשיטות זמינות אחרות. קל להעריך את הרגישות של ההליכים הכרוכים בייצור או צריכה של NADH/NADPH. בהתחשב בכך שמקדם ההכחדה של NADH/NADPH הוא 6.22 M-1 cm-1, אריתמטיקה פשוטה מצביעה על כך שניתן לזהות בקלות שינויים של ~10-20 μM בריכוז. עם נפחי הבדיקה המתוארים במאמר הנוכחי, זה מתאים ליכולת למדוד כמויות בטווח של ~ 10-20 nmol. אפשר לטעון שזה די רגיש. עם זאת, ניתן להתאים את הפעילות הספציפית של מצעים מסומנים ברדיו, כך שניתן יהיה להגדיל את הרגישות מעבר לגבול המבחנים הספקטרופוטומטריים די בקלות. אף על פי שבדיקת אנזימי ההסתעפות וההערכה האיכותית של הסתעפות הגליקוגן מסתמכות שתיהן על היווצרות קומפלקסים בין יוד לפולימרים המקושרים לגלוקוז α1,4, התפוקה מכל בדיקה שונה וגם הרגישויות שלהם שונות. שיקולים ספציפיים לכל אחד מהמבחנים המתוארים נדונים להלן.

קביעת פעילות גליקוגן סינתאז
בדיקת האנזים המצומד המתוארת כאן מאפשרת בדיקה מתמשכת של פעילות גליקוגן סינתאז, אשר שימושית בקביעת פרמטרים קינטיים. הוא גם ניתן להרחבה בקלות והליך דומה מאוד תואר לשימוש בלוחות מיקרוטיטר, מה שמאפשר לבצע מדידות מקבילות מאוד של פעילות האנזים28. אנו משתמשים בבדיקה זו באופן שגרתי עם סינתזות גליקוגן רקומביננטיות מטוהרות29. עם זאת, ההליכים המתוארים פותחו במקור לשימוש בהומוגנטים של רקמות (לדוגמה, ראו Danforth10 ו- Leloir et al.9). אזהרה כאן היא כי הרקמה homogenate חייב להיות מדולל כראוי לפני השימוש. הדילול נחוץ כדי להפחית את העכירות של ההומוגנט ואת ההפרעה של אנזימים/מצעים מתחרים בהומוגנט. יתר על כן, כדי לקחת בחשבון את צריכת NADH שאינה תלויה בפעילות גליקוגן סינתאז, יש לכלול תגובות ריקות המכילות את כל רכיבי התגובה למעט UDP-גלוקוז. פעילות הגליקוגן סינתאז נקבעת לאחר מכן על ידי הפחתת קצב השינוי בספיגת NADH בהיעדר UDP-גלוקוז מזה המתקבל בנוכחות תרכובת זו.

קביעת פעילות גליקוגן פוספורילאז
בדומה לבדיקת גליקוגן סינתאז, ניתן לבצע את המדידה הספקטרופוטומטרית של פעילות הזרחן באופן רציף, בעוד שמבחני זרחן אחרים נעצרים במבחנים13. הוא גם ניתן להתאמה בקלות לשימוש בלוחות מיקרוטיטר או ביישומים אחרים בעלי תפוקה גבוהה15. שוב, השימוש בו עם הומוגנטים של רקמות דורש דילול מתאים כדי להפחית עכירות/תגובות מפריעות. לדוגמה, גלוקוז-6-פוספט הוא מטבוליט שופע למדי ונוכחותו בהומוגנט רקמתי תגרום לייצור NADPH באמצעות אנזים צימוד גלוקוז-6-פוספט דהידרוגנאז ללא תלות בפעילות פוספורילאז. כאשר עובדים עם הומוגנאטים של רקמות, יש לכלול תגובות בקרה המכילות הומוגנט רקמתי מדולל כראוי וכל מרכיבי הבדיקה האחרים למעט פוספט וגליקוגן. פעילות הפוספורילאז מחושבת לאחר מכן על ידי הפחתת ייצור ה-NADPH בהיעדר גליקוגן/פוספט מזה המתרחש בנוכחות תרכובות אלה. המלצות ספציפיות הנוגעות למידת הדילול המתאימה של סוגים שונים של תמצית רקמת יונקים ניתן למצוא ב- Mezl et al.13.

קביעת פעילות אנזים מפרק גליקוגן
למרות שתואר כאן כבדיקה עצורה, ניתן להתאים ולבצע הליך זה בקלות ולבצע אותו באופן רציף16. מכיוון שהבדיקה מסתמכת על ייצור גלוקוז, השימוש בה בתמציות רקמה גולמיות חייב לקחת בחשבון את שחרור הגלוקוז מפוספורילאז להגביל את הדקסטרין על ידי אנזימים שאינם אנזים מתפרק, ואת יצירת הגלוקוז על ידי פעולה של אנזימים כאלה על גליקוגן אנדוגני הנמצא בתמצית הרקמה. שאלת הגליקוגן האנדוגני מטופלת בקלות באמצעות תגובת בקרה שאליה לא מתווסף דקסטרין גבול פוספורילאז. ניתן להעריך את נוכחותן של פעילויות אחרות של α-גלוקוזידאז בתגובות מקבילות שבהן מלטוז, ולא פוספורילאז מגביל דקסטרין, קיים כמצע.

קביעת פעילות אנזים הסתעפות גליקוגן
מבין המבחנים הכמותיים השונים שנדונו, בדיקת אנזים ההסתעפות הצבעונית היא ללא ספק הכי פחות רגישה. ואכן, ההערכה היא כי הרגישות היא סביב 50-100 פעמים פחות מזה שהושג עם השיטה הרדיוכימית, שבו גירוי של תגובת phosphorylase גליקוגן על ידי תוספת של אנזים הסתעפות נמדד21. בדומה לבדיקת האנזים המסתעף, גם בדיקת אנזים ההסתעפות רגישה לנוכחות של פעילות גלוקוזידאז מזהמת, שכן עיכול העמילוז ישפיע על קשירת היוד. כמה דרכים לעקיפת הבעיה הוצעו כדי לאפשר שימוש במבחנים דומים לאלה המתוארים כאן בנוכחות פעילות גלוקוזידאז מזהמת30. עם זאת, לדעתנו בדיקה זו מתאימה ביותר לחקר אנזימי הסתעפות גליקוגן מטוהרים או מטוהרים חלקית, כאשר פעילויות מפריעות כאלה הן מינימליות או נעדרות.

הערכה איכותית של היקף הסתעפות הגליקוגן
הניתוח המפורט של הסתעפות גליקוגן הוא מייגע למדי, בדרך כלל כולל שילוב של עיכול אנזימטי, שינוי כימי ומגוון טכניקות הפרדה כדי לנתח את המוצרים שנוצרו31. בעוד שהמבחן הצבעוני המתואר כאן בבירור אינו יכול להניב מידע דומה על המבנה העדין של הגליקוגן, הוא מספק מדידה פשוטה ומהירה של הסתעפות פחות או יותר. יתר על כן, הספקטרום המתקבל אכן מכיל מידע נוסף. לדוגמה, כפי שנדון תחת תוצאות מייצגות, דגימות של גליקוגן נמצאות בדרך כלל עם שיאי ספיגה ב~400 ננומטר ו~460 ננומטר. השיא ב~400 ננומטר מייצג ככל הנראה שרשראות חיצוניות קצרות בחלקיקי גליקוגן, שכן הוא משופר בגליקוגן המבודד ממוטנטים של שמרים ללא אנזים מסתעף ביחס לשמרים מסוג בר32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא ידוע על ניגודי עניינים הקשורים לעבודה זו ולא הייתה כל תמיכה כספית לעבודה זו שיכולה הייתה להשפיע על תוצאותיה.

Acknowledgments

המחבר רוצה להודות לקרוליין דיטמר ואנדרו בריטינגהם על תובנותיהם ודיונים מועילים רבים. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מקרן החינוך והמחקר האוסטאופתית של איווה (IOER 03-17-05 ו- 03-20-04).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amylopectin (amylose free) from waxy corn Fisher Scientific A0456
Amylose Biosynth Carbosynth YA10257
ATP, disodium salt MilliporeSigma A3377
D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt MilliporeSigma G6893
D-glucose-6-phosphate, sodium salt MilliporeSigma G7879
Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast MilliporeSigma 10127655001
Glycogen, Type II from oyster MilliporeSigma G8751
Hexokinase MilliporeSigma 11426362001
Methacrylate cuvettes, 1.5 mL Fisher Scientific 14-955-128 Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below
β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt MilliporeSigma N0505
β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt MilliporeSigma 43420
Nucleoside 5'-diphosphate kinase MilliporeSigma N0379
Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt MilliporeSigma P7127
Phosphoglucomutase from rabbit muscle MilliporeSigma P3397
Phosphorylase A from rabbit muscle MilliporeSigma P1261
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle MilliporeSigma P0294
UDP-glucose, disodium salt MilliporeSigma U4625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilson, W. A., et al. Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).
  2. Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasitic protists. Trends in Parasitology. 1471 (21), 00144-00146 (2021).
  3. Roach, P. J. Glycogen and its metabolism. Current Molecular Medicine. 2 (2), 101-120 (2002).
  4. Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. A rapid filter paper assay for UDPglucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose. Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).
  5. Fox, J., Kawaguchi, K., Greenberg, E., Preiss, J. Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli B ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan 4-alpha-glucosyltransferase. Biochemistry. 15 (4), 849-857 (1976).
  6. Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases. Analytical Biochemistry. 47 (1), 20-27 (1972).
  7. Brown, D. H., Illingworth, B., Cori, C. F. The mechanism of the de novo synthesis of polysaccharide by phosphorylase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (4), 479-485 (1961).
  8. Nelson, T. E., Larner, J. A rapid micro assay method for amylo-1,6-glucosidase. Analytical Biochemistry. 33 (1), 87-101 (1970).
  9. Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose. Archives of Biochemistry and Biophysics. 81 (2), 508-520 (1959).
  10. Danforth, W. H. Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis. Journal of Biological Chemistry. 240, 588-593 (1965).
  11. Wayllace, N. Z., et al. An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases. Molecular Biology Reports. 39 (1), 585-591 (2012).
  12. Shapiro, B., Wertheimer, E. Phosphorolysis and synthesis of glycogen in animal tissues. Biochemical Journal. 37 (3), 397-403 (1943).
  13. Mezl, V. A., Knox, W. E. Comparison of two methods for the assay of glycogen phosphorylase in tissue homogenates. Enzyme. 13 (4), 197-202 (1972).
  14. Mendicino, J., Afou-Issa, H., Medicus, R., Kratowich, N. Fructose-1, 6-diphosphatase, phosphofructokinase, glycogen synthetase, phosphorylase, and protein kinase from swine kidney. Methods in Enzymology. 42, 375-397 (1975).
  15. Schreiber, W. E., Bowling, S. An automated assay of glycogen phosphorylase in the direction of phosphorolysis. Annals of Clinical Biochemistry. 27, Pt 2 129-132 (1990).
  16. Nelson, T. E., Kolb, E., Larner, J. Purification and properties of rabbit muscle amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase. Biochemistry. 8 (4), 1419-1428 (1969).
  17. Taylor, C., Cox, A. J., Kernohan, J. C., Cohen, P. Debranching enzyme from rabbit skeletal muscle. Purification, properties and physiological role. European Journal of Biochemistry. 51 (1), 105-115 (1975).
  18. Makino, Y., Omichi, K. Purification of glycogen debranching enzyme from porcine brain: evidence for glycogen catabolism in the brain. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70 (4), 907-915 (2006).
  19. Lee, E. Y. C., Whelan, W. J. The Enzymes Vol. 5. Boyer, P. D. , Academic Press. 191-234 (1971).
  20. Yu, X., Houtman, C., Atalla, R. H. The complex of amylose and iodine. Carbohydrate Research. 292, 129-141 (1996).
  21. Boyer, C., Preiss, J. Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli b alpha-1,4,-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltansferase. Biochemistry. 16 (16), 3693-3699 (1977).
  22. Krisman, C. R. A method for the colorimetric estimation of glycogen with iodine. Analytical Biochemistry. 4, 17-23 (1962).
  23. Friedman, D. L., Larner, J. Studies on UDPG-alpha-glucan transglucosylase. iii. Interconversion of two forms of muscle UDPG-alpha-glucan transglucosylase by a phosphorylation-dephosphorylation reaction sequence. Biochemistry. 2, 669-675 (1963).
  24. Hanashiro, I., Roach, P. J. Mutations of muscle glycogen synthase that disable activation by glucose 6-phosphate. Archives of Biochemistry and Biophysics. 397 (2), 286-292 (2002).
  25. Huang, K. P., Cabib, E. Yeast glycogen synthetase in the glucose 6-phosphate-dependent form. I. Purification and properties. Journal of Biological Chemistry. 249 (12), 3851-3857 (1974).
  26. Pederson, B. A., Cheng, C., Wilson, W. A., Roach, P. J. Regulation of glycogen synthase. Identification of residues involved in regulation by the allosteric ligand glucose-6-P and by phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 275 (36), 27753-27761 (2000).
  27. Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes. Biochemical Journal. 441 (3), 763-787 (2012).
  28. Gosselin, S., Alhussaini, M., Streiff, M. B., Takabayashi, K., Palcic, M. M. A continuous spectrophotometric assay for glycosyltransferases. Analytical Biochemistry. 220 (1), 92-97 (1994).
  29. Wilson, W. A., Pradhan, P., Madhan, N., Gist, G. C., Brittingham, A. Glycogen synthase from the parabasalian parasite Trichomonas vaginalis: An unusual member of the starch/glycogen synthase family. Biochimie. 138, 90-101 (2017).
  30. Krisman, C. R. alpha-1,4-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltransferase from liver. Biochimica et Biophysica Acta. 65, 307-315 (1962).
  31. Sandhya Rani, M. R., Shibanuma, K., Hizukuri, S. The fine structure of oyster glucogen. Carbohydrate Research. 227, 183-194 (1992).
  32. Dittmer, K. E., Pradhan, P., Tompkins, Q. C., Brittingham, A., Wilson, W. A. Cloning and characterization of glycogen branching and debranching enzymes from the parasitic protist Trichomonas vaginalis. Biochimie. 186, 59-72 (2021).

Tags

ביוכימיה גיליון 174
שיטות ספקטרופוטומטריות לחקר מטבוליזם גליקוגן אאוקריוטי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilson, W. A. Spectrophotometric… More

Wilson, W. A. Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism. J. Vis. Exp. (174), e63046, doi:10.3791/63046 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter