Summary
La disección crioseccional permite la preparación fresca y congelada del nicho neurogénico más grande en el cerebro murino para un análisis profundo del proteoma cuantitativo. El método es preciso, eficiente y causa una perturbación tisular mínima. Por lo tanto, es ideal para estudiar el microambiente molecular de este nicho, así como otros órganos, regiones y especies.
Abstract
El nicho neurogénico subependimario consiste en una cinta paraventricular de la pared ventricular lateral del ventrículo lateral. La zona subependimaria (ZEE) es una región delgada y distinta expuesta a los ventrículos y al líquido cefalorraquídeo. El aislamiento de este nicho permite el análisis de un microambiente de células madre neurogénicas. Sin embargo, la extracción de tejidos pequeños para el análisis del proteoma es un desafío, especialmente para el mantenimiento de una profundidad de medición considerable y el logro de una robustez confiable. Se desarrolló un nuevo método denominado crio-sección-disección (CSD), que combina alta precisión con una perturbación mínima del tejido, para abordar estos desafíos. El método es compatible con los métodos de espectrometría de masas (MS) de última generación que permiten la detección de reguladores de nicho poco abundantes. Este estudio comparó el CSD y sus datos de proteoma con el método y los datos obtenidos por microdisección de captura láser (LCM) y una disección estándar de montaje completo. El método CSD resultó en el doble de profundidad de cuantificación en menos de la mitad del tiempo de preparación en comparación con el LCM y, al mismo tiempo, superó claramente la precisión de disección de la disección de todo el monte. Por lo tanto, CSD es un método superior para recolectar la ZEE para el análisis del proteoma.
Introduction
Como la neurogénesis está restringida en el cerebro adulto, varias estrategias de reparación del sistema nervioso central se beneficiarían enormemente de una mayor comprensión de los fundamentos del reemplazo neuronal adulto. Los roedores nos han ayudado a comprender los mecanismos básicos de la neurogénesis postnatal, aunque cabe señalar que la neurogénesis adulta es muy dependiente de la especie. En ratones, hay tres nichos adultos de células madre neurales (NSC). El hipotálamo es un nicho adulto de NSC con potencial neurogénico1,2, mientras que la neurogénesis adulta continua se restringe principalmente al hipocampo3 y a la ZEE de las paredes laterales de los ventrículos laterales4,5,6. La ZEE es la región germinal más grande que contiene NSC (células tipo B) que se convierten en neuroblastos (células tipo A) a través de células progenitoras amplificadoras de tránsito (células tipo C). La ZEE contiene 20-35% de células tipo B, 1-15% de células tipo C, 1-30% de células tipo A y 25-50% de células ependimarias7. La ZEE presenta una microarquitectura compleja, con células endoteliales, células microgliales y células ependimarias que residen e influyen en el nicho de células madre8,9,10. Aunque las neuronas son escasas en la ZEE, los axones que emanan de fuentes distantes como el cuerpo estriado, el área tegmental ventral o el hipotálamo alcanzan e influyen en las células tipo B4. Una característica única de este nicho de células madre es la separación entre el sitio de proliferación y el sitio de diferenciación. Después de la proliferación, los progenitores neuronales migran varios milímetros desde la ZEE hasta el bulbo olfatorio, donde se diferencian terminalmente en neuronas y se integran en circuitos neuronales preexistentes. Las investigaciones sobre los programas intrínsecos celulares asociados con la neurogénesis ya han proporcionado conocimientos importantes para las estrategias experimentales terapéuticas de reprogramación y trasplante de células15,16,17,18,19,20. Sin embargo, las señales celular-extrínsecas también regulan la neurogénesis, y los entornos tisulares pueden determinar el destino neurogénico de las células madre11,12,14,21,22,23. En consecuencia, la investigación del microambiente de los nichos neurogénicos y su interacción con las células madre es de crucial importancia.
La matriz extracelular (ECM) y otras proteínas secretadas son una gran parte del microambiente. Para una identificación y cuantificación precisas, un enfoque proteómico es más adecuado que un enfoque transcriptómico para determinar la composición de ecm debido a la baja correlación entre el transcriptoma y los niveles de proteína para ECM24,25. Además, hay evidencia sustancial de que los reguladores de nicho en la ZEE no son producidos exclusivamente por células que pueblan el nicho en sí. Lugares más distantes, como el plexo coroideo, secretan señales moduladoras transmitidas a las células madre a través del líquido cefalorraquídeo22,23. La investigación del proteoma de nicho puede ayudar a identificar los reguladores de nicho presentes en el nicho independientemente de su sitio de producción, dado que una proporción sustancial del microambiente extracelular es ensamblado por proteínas.
Para recolectar la zona ventricular murina para un análisis proteómico imparcial, se requiere un método con alta precisión, capturando la cinta paraventricular delgada de aproximadamente 50 μm que contiene células madre mientras se excluye el tejido del cuerpo estriado adyacente. Además, la perturbación tisular durante la disección debe minimizarse para analizar el microambiente extracelular porque las proteínas solubles, incluidos los factores de crecimiento o las citoquinas, podrían eliminarse fácilmente. Aunque es posible analizar los espectros de masas del tejido fijo, el agente requerido, como el paraformaldehído, reducirá la profundidad de identificación de proteínas y puede introducir modificaciones posttraduccionales. Una disección común de SEZ de montaje entero, por ejemplo, para la recolección de células para el análisis de clasificación celular activado por fluorescencia, elimina toda la ZEE con tijeras26. Esta disección estándar es rápida con una perturbación tisular mínima. Sin embargo, no se puede evitar la contaminación estriatal de las muestras. Por el contrario, LCM tiene la ventaja sobresaliente de una precisión de disección superior. Sin embargo, la LCM puede introducir perturbaciones tisulares, por ejemplo, debido a la tinción de fondo o la desnaturalización de proteínas causada por láser. Para combinar las fortalezas de la disección de todo el monte y la LCM, se desarrolló un nuevo método que es compatible con la EM, denominado crio-sección-disección (CSD), (Figura 1A-D). El CSD permite la extracción de la ZEE y la disección de la ZEE de las paredes mediales de los ventrículos laterales (MEZ), que es una región de control ideal, en su mayoría no neurogénica para la ZEE (ver el protocolo). El proteoma de nicho obtenido por la combinación de CSD y métodos de EM de última generación demostró ser útil para la caracterización e identificación de nuevos reguladores en este nicho adulto de NSC25. Por lo tanto, este método será útil para la determinación de la composición de proteínas del tejido SEZ.
Protocol
Todos los procedimientos experimentales en este estudio se realizaron de acuerdo con las directrices alemanas y de la Unión Europea y fueron aprobados por el comité institucional de cuidado de animales y el gobierno de la Alta Baviera (Regierung von Oberbayern). Solo se utilizaron ratones machos C57Bl6 entre las edades de 8-10 semanas para los experimentos.
1. Preparación del cerebro del ratón (~ 15 min por ratón)
- Prepare el medio de disección agregando 5 ml de 1 M de HEPES (concentración final de 10 mM) a 500 ml de 1 x Solución de sal equilibrada de Hank (HBSS).
NOTA: El tiempo de almacenamiento del medio de disección (+4 °C) no debe exceder las 2 semanas. - Sacrifica a los ratones por dislocación cervical y disecciona cuidadosamente el cerebro.
NOTA: Al investigar la ECM, el tejido debe estar preferiblemente sin modificar. La luxación cervical mantiene el tiempo de disección lo más corto posible, evitando así la autodigestión enzimática post-mortal tanto como sea posible. Si la extracción de sangre es crítica para la pregunta de investigación, simplemente perfunda el ratón transcardialmente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de extirpar el cerebro. - Extraiga el cerebro mediante disección manual y colóquelo en un plato de cultivo que contenga un medio de disección helado (Figura 1B - 1).
NOTA: Mantenga los cerebros en medio de disección en hielo durante toda la disección. - Retire el bulbo olfatorio (OB) con un bisturí (Figura 1B - 2) mediante un corte coronal recto entre el OB y el polo anterior de la corteza.
- Retire el polo anterior de la corteza con el bisturí utilizando un corte coronal para hacer visibles los ventrículos laterales en el plano coronal (Figura 1B - 3).
NOTA: Asegúrese de que el corte coronal esté hecho ~ 5 mm rostralmente desde el quiasma óptico; de lo contrario, se perderá la parte rostral de la ZEE/MEZ. - Usando tijeras, abra ambos ventrículos laterales desde la parte superior, comenzando con una sección sagital desde la superficie cortical hasta la luz ventricular, y alargue este corte en forma de C siguiendo la flexión ventricular (Figura 1B - 4).
- Conecte los extremos caudales de la incisión sagital izquierda y derecha por medio de un corte coronal adicional con las tijeras.
NOTA: Los tres cortes ahora forman un trapecio y facilitarán la eliminación de la corteza y el cuerpo calloso en el siguiente paso. - Extirpar la corteza y el cuerpo calloso que cubren los ventrículos laterales con fórceps (Figura 1B - 5). Luego, retire la corteza y el cuerpo calloso que cubren las paredes ventriculares mediales. Aquí, haga cortes adicionales si el tejido está unido a las paredes ventriculares mediales, o simplemente levante la corteza y el cuerpo calloso con tijeras para desalojar el tejido.
- Extienda cuidadosamente las paredes ventriculares con fórceps (Figura 1B - 6). Retire el plexo coroideo con fórceps.
NOTA: La extirpación completa del plexo coroideo es importante para evitar interferencias con los siguientes pasos de disección y evitar la posible contaminación de las muestras SEZ/MEZ. - Coloque el cerebro en un portaobjetos de vidrio y coloque el portaobjetos de vidrio sobre hielo seco para congelar el cerebro. Mantenga las paredes ventriculares en la configuración abierta.
NOTA: Asegure suficiente distancia entre las paredes lateral y medial del ventrículo para facilitar la disección precisa y exclusiva de SEZ y MEZ. Si el tejido se contrae de nuevo en una configuración cerrada, use las pinzas para fijar las paredes en la posición deseada durante la congelación. Evite cualquier daño a la ZEE/MEZ. Intente aplicar una fuerza mínima, principalmente en el borde superior de los ventrículos abiertos.
2. Seccionamiento del cerebro preparado (~ 15 min por ratón)
- Corte las secciones coronales de 50-100 μm de espesor del cerebro hasta el final del ventrículo lateral con un criostato y monte las secciones en portaobjetos de vidrio. Asegúrese de que el cerebro esté unido a la placa de unión del criostato en el cerebro posterior con el medio OCT y que ninguna OCT entre en contacto con el cerebro anterior, especialmente en los ventrículos.
NOTA: El medio OCT interferirá con las mediciones de EM. Sin embargo, si el tejido se utilizará para un ensayo de anticuerpos, no es necesario excluir el medio OCT. No se recomienda el uso de portaobjetos de vidrio recubiertos. Las diapositivas recubiertas aplican demasiada fuerza adhesiva sobre el tejido, impidiendo así la translocación de la muestra de tejido de las diapositivas al tubo de la microcentrífuga en los siguientes pasos.
3. Disección a mano alzada de rebanadas cerebrales (~ 30 min por ratón)
- Coloque los portaobjetos de vidrio con las secciones cerebrales sobre hielo seco bajo un microscopio de disección (Figura 1C - 1).
- Prepare los tubos de la microcentrífuga sobre hielo seco y asegúrese de que los tubos permanezcan en hielo seco durante al menos 1 minuto para estar lo suficientemente fríos antes de la transferencia de la muestra.
NOTA: Use tubos de microcentrífuga de alta calidad, ya que algunos tubos de baja calidad pueden arrojar plástico en los pasos posteriores de digestión de tejidos asociados con las mediciones de EM. - Levante las rodajas del hielo seco durante 15-30 s para lograr una descongelación breve e incompleta para hacer que la mielina compacta del cuerpo estriado sea observable como puntos blancos densos.
NOTA: La localización de la frontera entre la ZEE y el cuerpo estriado se vuelve factible (Figura 1C - 2, ver Figura 2A para la exclusión de mielina y una comparación con el método de montura completa). Si la descongelación lleva demasiado tiempo, el proceso se puede acelerar presionando un dedo cubierto de guante en el lado opuesto del portaobjetos de vidrio. Sin embargo, esta maniobra debe practicarse ya que la descongelación excesiva ocurre fácilmente. - Separe la ZEE con un bisturí preenfriado del estriado adyacente (Figura 1C, D).
- Transfiera la ZEE como una pieza entera o seccionada en 2-4 partes en un tubo de microcentrífuga utilizando el borde romo del bisturí enfriado. Si el tejido se va a utilizar para otro tipo de análisis que no sea la EM, transfiera la muestra de tejido al recipiente apropiado (por ejemplo, una placa de 96 pocillos).
NOTA: Cortar el tejido completamente congelado puede provocar que el tejido se rompa rápidamente y se caiga del portaobjetos. Cortar el tejido completamente descongelado conduce a la desintegración del tejido. Asegúrese de que el tejido no esté completamente congelado ni completamente descongelado.
Representative Results
Al seguir los pasos anteriores, las muestras de tejido en los tubos de microcentrífuga están listas y son compatibles con la preparación de muestras de EM. Después de la preparación de la muestra, obtuvimos ~ 5-7 μg de péptidos por muestra de SEZ o MEZ por ratón. Sin embargo, las cantidades finales de los péptidos pueden depender del método de preparación de la EM. En las comparaciones de proteomas a continuación, la identificación y cuantificación de proteínas (500-1.000 proteínas por muestra) se incrementó al hacer coincidir computacionalmente los espectros de péptidos con las bibliotecas de espectros de péptidos creadas para cada región tisular25,27. En particular, el método de nanofraccionamiento sin pérdidas utilizado aquí para la creación de las bibliotecas de espectros de péptidos actualmente no está disponible comercialmente. Los datos brutos de MS se analizaron utilizando el software MaxQuant28, logrando precisiones de masa en el rango de partes por billón29. El entorno Max Quant permite la coincidencia entre ejecuciones de MS. La abundancia de proteínas se cuantificó mediante un algoritmo de cuantificación sin etiquetas30. La tinción inmunohistoquímica se realizó en tejidos frescos congelados y se realizó como se informó anteriormente25 (ver la Tabla de Materiales).
Crio-sección-disección
Las ZEE y MEZ completas de ratones adultos (n = 4) se obtuvieron mediante CSD (ver Figura 1 y protocolo). La corteza somatosensorial (Cx) fue diseccionada con tijeras quirúrgicas. Otros 4 ratones fueron diseccionados de la misma manera; sin embargo, el tejido diseccionado se agrupó en una muestra por región para crear la biblioteca de proteomas (10.923 proteínas identificadas) para aumentar la identificación y cuantificación de proteínas en las muestras individuales25. En las cuatro muestras individuales, (media ± DE) se cuantificaron 6.673 ± 317,4 proteínas en la ZEE y 6.747 ± 37,7 en la MEZ. Todos los datos de proteómica de MS se depositaron en el Consorcio ProteomeXchange a través del repositorio de socios PRIDE31 , y el número de acceso para los proteomas informados aquí es ProteomeXchange: PXD016632 (http://proteomecentral.proteomexchange.org).
Comparación con la disección de montura completa
La disección de montaje completo se realizó según un protocolo estándar26. La disección de montura completa reveló un número similar de proteínas (aproximadamente 6.000 para SEZ y 6.000 para Cx, n = 4 por grupo) en comparación con CSD25. Una de las mejoras previstas del uso de CSD para la ZEE, en lugar de un protocolo de disección de montaje completo, es la reducción de la posible contaminación estriatal. En muestras de ZEE contaminadas con tejido de otra región, las proteínas candidatas detectadas no se pueden asignar a una región, ya que el enriquecimiento significativo puede resultar de la región de interés y del contaminante. Inmunohistoquímicamente, las cápsulas internas ricas en mielina positiva de la glicoproteína asociada a la mielina (MAG) del cuerpo estriado se identificaron en las muestras de montura completa, pero rara vez en las muestras de CSD (Figura 2A). La contaminación estriatal en las muestras de todo el monte podría confirmarse identificando el enriquecimiento de proteínas de mielina en la ZEE en comparación con las muestras de materia gris (GM) de la corteza somatosensorial (Cx) (Figura 2B). Tenga en cuenta que grandes partes del Cx GM, especialmente las capas superiores de Cx, no están mielinizadas32.
A medida que grandes haces de fibra pasan a través del cuerpo estriado, la contaminación por esta región resultó en el enriquecimiento de proteínas de mielina en comparación con el Cx. Las proteínas de mielina utilizadas como marcadores de contaminación estriatal en las muestras de ZEE fueron la proteína básica de mielina (MBP), la glicoproteína asociada a la mielina (MAG), la proteína proteolipídica 1 (Plp1) y la 2',3'-nucleótido cíclico 3'-fosfodiesterasa (Cnp). Todas las proteínas marcadoras de mielina se enriquecieron significativamente en la ZEE en comparación con la Cx. Por el contrario, las comparaciones de las cuatro proteínas marcadoras de mielina en el conjunto de datos csd no arrojaron diferencias significativas al comparar la ZEE con Cx (Figura 2B). Los datos proteómicos del cuerpo estriado33 apoyan la hipótesis de que el enriquecimiento de proteínas de mielina en las muestras SEZ de la disección de todo el monte fue causado por la contaminación con tejido estriatal. Por lo tanto, el CSD evitó en gran medida la contaminación por tejido estriatal (rico en mielina compacta) en comparación con una disección de montura completa.
El análisis imparcial del proteoma del tejido no disociado puede revelar proteínas extracelulares interesantes. Con una disección mejorada utilizando el CSD, las proteínas asociadas a extracelulares se enriquecieron significativamente en las muestras en comparación con las muestras de montura completa (Figura 2C, prueba de enriquecimiento de anotación). El CSD y la disección de montura completa muestran un enriquecimiento comparable de los términos de ontología génica (GO) "exosoma vesicular extracelular" y "parte de la región extracelular". Sin embargo, el término GO "matrisoma asociado" está ligeramente más enriquecido en el CSD que en la disección de todo el monte. En consecuencia, la enzima de unión cruzada ECM y el regulador de neurogénesis transglutaminasa-2 (Tgm2) recientemente descubiertos se encontraron enriquecidos en la ZEE en comparación con Cx utilizando el CSD25. Por el contrario, no se encontraron diferencias entre las muestras sez y Cx obtenidas por la disección de todo el monte (Figura 2D). Los datos proteómicos del cuerpo estriado33 apoyan la hipótesis de que la detección del regulador de neurogénesis Tgm2 por disección de montura entera se vio impedida por la contaminación con tejido estriatal. Por lo tanto, en general, la disección crioseccional es una mejora exitosa pero también necesaria de la disección estándar para el análisis de proteomas específicos de nicho.
Comparación con la microscopía de captura láser
La mitad frontal de la ZEE y la MEZ de 3 ratones adultos se obtuvieron para LCM (Figura 3A). En general, el método LCM exhibe algunas desventajas, específicamente con respecto a la perturbación y eficiencia del tejido. Para visualizar la región de interés bajo el microscopio de disección, es necesaria la tinción de fondo, que potencialmente elimina las proteínas pequeñas o solubles de interés, por ejemplo, factores de crecimiento, citoquinas o reguladores de ECM como enzimas. Además, las diapositivas pasan diferentes tiempos a temperatura ambiente durante la extracción con láser. Además, el propio láser podría desnaturalizar proteínas de interés.
CSD tiene una ventaja considerable sobre LCM en cuanto al tiempo y esfuerzo necesarios para realizar la disección: el paso 1 del protocolo debe realizarse de manera similar tanto para CSD como para LCM; sin este paso, las paredes ventriculares permanecen adherentes, lo que dificulta la separación de las muestras MEZ y SEZ. Dado que las secciones de CSD (100 μm) son 6-7 veces más gruesas que el espesor máximo34 de las secciones de LCM (15 μm), el paso 2 (seccionamiento del cerebro) y el paso 3 (eliminación de MEZ y SEZ de cada sección coronal) tomarán al menos 6-7 veces más tiempo para LCM. La tinción de fondo necesaria y la configuración del microscopio láser consumirán tiempo adicional. Aquí, se tardó tres veces más en cosechar el 50% de la ZEE y MEZ de 3 animales por LCM en comparación con el 100% de la SEZ y MEZ de 4 animales por CSD, constituyendo una ventaja de velocidad de ocho veces de CSD. En resumen, la LCM no solo requiere una cantidad notable de esfuerzo adicional, sino que el tejido también está sujeto a un período sustancialmente más largo de manipulación y cambios de temperatura que pueden comprometer la dinámica y la confiabilidad de los datos generados por el análisis posterior.
Los resultados de EM de CSD se compararon con los resultados de la microdisección de captura láser (LCM). Ambos conjuntos de datos se emparejaron con la biblioteca proteómica generada mediante la agrupación de muestras de CSD. En promedio, LCM produjo 3,441 ± 270.0 y 3,613 ± 238.7 proteínas individuales en la ZONA SEZ y la zona ventricular medial, respectivamente (Figura 3B). Dada la notable diferencia en la identificación de proteínas, el análisis de componentes principales (PCA) mostró una separación distinta según el método de disección (componente 1: 62,7%, no mostrado). El componente 2 mostró la mayor separación para SEZ y MEZ entre las muestras de LCM (8,5%, Figura 3C). El componente 3 también parece separar LCM y CSD; sin embargo, esta diferencia podría deberse a diferencias basadas en el método en lugar del número de proteínas identificadas (6,4%). Sin embargo, la separación regional general siguió siendo sorprendentemente distinta para los datos de criodisección y mucho mejor que para LCM. Esta discrepancia en la dinámica de los datos puede ser el resultado de diferentes tiempos pasados por las muestras a temperatura ambiente durante la disección con láser o una mayor susceptibilidad de pequeñas cantidades de tejido a la variabilidad en los protocolos proteómicos posteriores y las mediciones de espectrometría de masas.
Para buscar diferencias en el perfil proteómico de la ECM, se realizó una prueba de enriquecimiento de anotación 2D entre CSD y LCM para la ZEE y MEZ (Figura 3D). El cálculo del enriquecimiento relativo de los términos GO entre muestras de LCM y CSD permite la comparación de la dinámica relativa del proteoma de los grupos de proteínas ECM entre los dos métodos a pesar de la cantidad desigual de tejido y las diferencias en el protocolo de disección. Las gráficas revelan una buena correlación entre LCM y CSD. Las anotaciones "parte de la región extracelular" y "orgánulo unido a la membrana extracelular" se enriquecen de manera similar tanto en métodos como en regiones. Por lo tanto, el aumento de la demanda de tiempo de LCM no parece ser compensado por una sensibilidad relativamente mayor para las proteínas asociadas a ECM. En cambio, CSD proporciona una identificación / cuantificación más robusta al comparar los datos de la muestra para la neurogénesis y las proteínas ECM asociadas a SEZ Tgm2, trombospondina-4 (Thbs4), S100a6 y tenacin-C (Tnc) (Figura 3E). En el caso de TnC, aunque cuantificado en todas las muestras, sólo el CSD mostró enriquecimiento para SEZ en comparación con MEZ. Sin embargo, las proteínas de membrana basal asociadas a la ZEE Nidogen-1 (Nid1), la subunidad beta-2 de laminina (Lamb2) y la proteína central de proteoglicano de sulfato de heparán específica de la membrana basal (Hspg2)35 mostraron un enriquecimiento aún más robusto en la ZEE (en comparación con MEZ) en las muestras de LCM que en las muestras de CSD (no se muestra). Por lo tanto, CSD puede proporcionar muestras de tejido que proporcionan un proteoma cuantitativo preciso y profundo para la caracterización de SEZ en un marco de tiempo razonable, sin preocuparse por la integridad del tejido comprometida o la pérdida de proteínas.
Estadística
Las pruebas estadísticas, las pruebas de enriquecimiento de anotaciones 2D y la PCA se realizaron en el entorno de Perseo. Las proteínas se incluyeron en el análisis si se detectó un valor válido para cada método en al menos una muestra. La abundancia de proteínas y las comparaciones numéricas se visualizaron utilizando un software de análisis de datos (ver la Tabla de Materiales). Se empleó un control basado en la permutación de la tasa de descubrimiento falso (FDR) (FDR se estableció en 0,05, 250 aleatorizaciones) para las comparaciones de proteínas. Para las pruebas de enriquecimiento de anotación 2D36, los términos GO mostrados se enriquecen significativamente (FDR se estableció en 0,02 utilizando el método de control FDR de Benjamini-Hochberg).
Figura 1: El método de crio-sección-disección. (A) Visión general de la región de interés: el ventrículo lateral con la ZEE neurogénica y la MEZ no neurogénica. Neuroblastos inmunoteñidos con Dcx. (B) Eliminación gradual del OB, el polo anterior, la corteza y el cuerpo calloso por encima de los ventrículos y el plexo coroideo: 1. colocación en medio de disección, 2. eliminación de OB, 3. eliminación del polo anterior de la corteza, 4. incisiones sagitales de la parte superior ventricular, 5. extracción de la parte superior ventricular, 6. diseminación de las paredes ventriculares. (C) rodajas coronales de 100 μm del cerebro de ratón recién congelado, (1.) antes y (2.) después de la extracción de las paredes ventriculares con un bisturí helado. Barras de escamas = 4 mm (D) Tinción de una sección coronal de un ventrículo lateral (GFAP: verde; DAPI: azul), mostrando la SEZ y MEZ diseccionadas con el CSD. Barras de escala = 300 μm (A), 200 μm (D). Abreviaturas: CSD = disección crio-sección; ZEE = zona subependimaria; MEZ = zona ependimaria medial; Dcx = Doble corteza; OB = bulbo olfativo; GFAP = proteína ácida fibrilar glial; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Precisión de disección superior con la criosección-disección en comparación con la disección de montaje completo. (A) Imagen inmunohistoquímica de una muestra seZ obtenida por disección de montaje completo (izquierda). La inclusión de tejido estriatal rico en mielina se visualiza mediante tinción contra MAG (verde). Tinción de una ZEE diseccionada con el CSD (derecha).. En CSD, casi toda la mielina estriatal (tinción contra MAG, verde) se excluye de la cinta de muestra. Los núcleos se visualizaron utilizando DAPI (azul). (B) Comparación del enriquecimiento de marcadores de mielina en SEZ vs. Cx de montura entera (MBP: p = 0,0074; MAG: p = 0,0016; Plp1: p = 0,0011; CNP: p = 0,0029) y CSD (MBP: p = 0,0667; MAG: p = 0,0236; Plp1: p = 0,3420; CNP: p = 0,1842). (C) Ensayo de enriquecimiento por anotación 2D que compare la ZEE de montura completa con las muestras de LA ZSV-CUS. Los términos GO espacio extracelular y matrisoma asociado están más enriquecidos en los datos csd que en los datos de todo el conjunto. (D) La abundancia de proteínas del regulador NSC Tgm225 trazada para la disección de todo el monte y el CSD. Tgm2 se enriquece significativamente en la ZEE en comparación con el Cx en CSD (CSD: p = 0,0029; Monto entero: p = 0,1775). Para B y D: Como referencia, datos de proteomas de Sharma et al.33 con mediciones de estriado y corteza trazados para las proteínas correspondientes mostradas en las muestras de montura completa y CSD. Barras de escala = 200 μm (A). Abreviaturas: CSD = disección crio-sección; ZEE = zona subependimaria; MAG = glicoproteína asociada a la mielina; Cx = corteza somatosensorial; MBP = proteína básica de mielina; Plp1 = proteolípido-proteína 1; CNP = 2',3'-nucleótido cíclico 3'-fosfodiesterasa; GO = ontología génica; NSC = célula madre neural; Tgm2 = tranglutaminasa 2; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol; LFQ = cuantificación sin etiquetas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Mejora de la cuantificación de proteínas extracelulares con criosección-disección en comparación con LCM. (A) Tinción violeta de Cresyl de un ventrículo lateral antes y después de la captura con láser de la ZEE y MEZ (izquierda). A modo de comparación, la incisión CSD de la ZEE y MEZ (derecha). Barras de escala = 150 μm. (B) Comparación del número de proteínas detectadas en las muestras SEZ y MEZ de CSD y LCM. Los datos se presentan como media ± SD. (C) Análisis de componentes principales de las muestras SEZ y MEZ comparando CSD y LCM (componente 2: 8,5% de la varianza; componente 3: 6,4%). (D) Enriquecimiento de anotaciones 2D de la sección crio y láser diseccionada MEZ (Arriba) y SEZ (Abajo). Los términos GO orgánulo extracelular y parte de la región extracelular están significativamente enriquecidos (puntos rojos). (E) Abundancias de proteínas marcadoras extracelulares asociadas a SEZ en SEZ y MEZ para LCM (Tnc: p = 0.3789) y las muestras de CSD (Tgm2: p = 0.2940; S100a6: p = 0,0218; THBS4: p = 0,3941; Tnc: p = 0,0004). Abreviaturas: CSD = disección crio-sección; LCM = microdisección de captura láser; ZEE = zona subependimaria; MEZ = zona ependimaria medial; GO = ontología génica; Tnc = Tenacina-C; Tgm2 = transglutaminasa 2; S100a6 = proteína de unión al calcio S100 A6; THBS4 = trombospondina-4; LFQ = cuantificación sin etiquetas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
El método CSD permitió extraer con precisión el tejido SEZ y generar un proteoma confiable con una profundidad significativa utilizando MS. CSD muestra una clara ventaja en comparación con la disección de montura completa en términos de contaminación estriatal muy reducida de muestras SEZ y enriquecimiento de proteínas extracelulares. Como también es posible detectar un número similar de proteínas en muestras individuales (~ 6,500 proteínas por muestra) con CSD y disección de montaje completo, el tiempo adicional para CSD vale la pena el esfuerzo. LCM proporciona una disección SEZ más precisa, pero alcanzó una profundidad de proteoma más baja, con solo 3.500 proteínas por muestra a pesar de usar el mismo protocolo MS que CSD (coincidencia de bibliotecas y cuantificación sin etiquetas). Es importante destacar que la variabilidad fue mucho mayor, probablemente debido al tiempo de preparación ocho veces mayor por muestra. El PCA de las muestras obtenidas por LCM y CSD revela una clara separación de ambos métodos con grupos estrechos específicos de la región separados sólidamente entre sí. En contraste, las muestras de LCM mostraron una distribución más dispersa, que probablemente se deba en parte a la duración de la preparación. No está claro si la recolección de muchas más muestras durante un período más largo habría producido un proteoma de igual robustez y profundidad con LCM. Calcular una estimación, recolectar un volumen de muestra similar al que se hace para CSD tomaría de 5 a 8 veces más tiempo con LCM, incluso hasta 15 veces más si se incluyeran muestras proporcionadas para las bibliotecas de espectros de péptidos, y gran parte de ella en condiciones de descongeladas. Además, teniendo en cuenta las perturbaciones adicionales del tejido necesarias para la LCM (tinción de fondo, disección con láser), la LCM proporcionó poca o ninguna ganancia sobre la CSD. Por lo tanto, la CSD puede considerarse más adecuada para la investigación del proteoma extracelular, específicamente para la ZEE.
En particular, si la región de interés es más pequeña que la ZEE (por ejemplo, investigando solo la capa celular ependimaria), un enfoque a mano alzada queda atrás de la precisión de la LCM. Por ejemplo, el uso de CSD para separar el ependimal de la capa subependimaria es difícil ya que la capa ependimaria tiene solo un diámetro celular de ancho, y la demarcación hacia la capa subependimaria no es visible a simple vista en el tejido fresco congelado. Por lo tanto, la LCM será una mejor opción que la CSD si una disección precisa en una escala inferior a 50 μm es más importante que el tejido no perturbado o mantener el tiempo de disección corto. Sin embargo, para regiones con un ancho de 50 μm y más, la precisión de CSD es comparable a la de LCM para el análisis de proteínas ECM.
La ECV ya ha demostrado ser útil al contribuir a la investigación del papel funcional de la ECM en el nicho neurogénico25. Por lo tanto, la aplicación continua de CSD en la ZEE para diversas investigaciones de proteínas y proteomas (o incluso la secuenciación de ARN de un solo núcleo) podría conducir a la detección de más reguladores de neurogénesis, marcadores de activación de células madre y una comprensión más profunda de la fisiología del nicho de células madre de SEZ. Teniendo en cuenta la disminución de la neurogénesis en el envejecimiento de la SEZ37, un análisis conciso de los cambios de ECM de la ZEE de ratones envejecidos frente a los jóvenes podría promover la comprensión de los mecanismos exactos de nicho que fomentan el desarrollo y mantenimiento de NSC38,39. Además, la influencia de la inflamación y la lesión en la neurogénesis seZ está bien establecida40,41,42,43. El enriquecimiento del fibrinógeno derivado de la sangre en la ZEE después de una lesión cerebral cortical y su influencia en la astrogligénesis de la ZEE y la formación de cicatrices44 pone de relieve la posible influencia de los cambios en el microambiente inducidos por traumatismos en la fisiología de las células madre de la ZEE. Por lo tanto, la investigación del proteoma SEZ-ECM en asociación con la lesión cerebral utilizando CSD podría ayudar a dilucidar los mecanismos por los cuales la lesión y la inflamación afectan la neurogénesis. Es importante destacar que el método también podría ser aplicable a los nichos neurogénicos del cerebro humano en la salud y la enfermedad, ya que a menudo se puede obtener tejido fresco congelado de las cirugías. Además, dadas las diferencias de especies en la neurogénesis adulta, también sería fascinante aplicar el método CSD a otras especies, por ejemplo, en asociación con la neurogénesis estriatal. Además, con otros métodos de detección de proteínas, las diferencias en los factores de crecimiento producidos localmente se pueden investigar de manera precisa y eficiente utilizando CSD para la ZEE y MEZ (por ejemplo, ELISA).
Por último, el procedimiento de disección podría modificarse potencialmente para la extracción precisa de otras regiones del cerebro, también para preguntas de investigación no relacionadas con la neurogénesis. Por ejemplo, CSD incluye un breve paso de semi-descongelación, durante el cual la mielina compacta es visible como áreas blancas distintas del tejido cerebral residual más translúcido. Con una simple modificación del método, esta característica permitiría la disección precisa de solo tejido compacto de mielina del cuerpo calloso, que podría someterse a un análisis proteómico de los cambios relacionados con la lesión. Una sugerencia de una modificación del protocolo que permitiría la disección insensible del cuerpo es omitir los pasos 1.5-1.9 del protocolo y proceder directamente a preparar las secciones coronales en lugar de abrir los ventrículos para hacer accesibles la ZEE y la MEZ. Luego, coloque las secciones sobre hielo seco, levante brevemente y descongele las rodajas, y simplemente retire el cuerpo calloso con un bisturí. Esta preparación ahora debería estar lista para cualquier análisis que requiera una disección eficiente del tejido del cuerpo calloso nativo.
En resumen, este estudio presenta un método de microdisección que podría usarse para el análisis confiable del proteoma de nicho neurogénico ventricular. Los datos subrayan la compatibilidad y utilidad del método CSD junto con el análisis proteómico basado en EM del microambiente SEZ. La combinación de precisión, eficiencia y perturbación tisular mínima hacen del CSD una valiosa extensión de los métodos existentes.
Disclosures
Los autores no declaran intereses contrapuestos
Acknowledgments
Deseamos agradecer sinceramente a Mathias Mann por permitirnos realizar grandes partes de los experimentos en su laboratorio, a Fabian Coscia por su ayuda con la LCM y el análisis del proteoma, a Tatiana Simon-Ebert por las disecciones de monturas completas, y a Korbinian Mayr e Igor Paron por su ayuda técnica. Agradecemos la financiación del Consejo Alemán de Investigación a MG (SFB870, TFR274), la UE (Eranet S-700982-5008-001), el ERC (aERC "NeuroCentro" a MG), la beca postdoctoral de la Sociedad Sueca de Investigación Médica (SSMF, a JK) y las fundaciones y fondos KI (2020-01351, a JK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat CM3050S | Leica | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| Dumont no. 5SF forceps, Inox super fine tip | Fine Science Tools | cat. no. 11252-00 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution with CaCl2 and MgCl2 | Invitrogen | cat. no. 24020 | |
| HEPES buffer solution (1 M) | Invitrogen | cat. no. 15630 | |
| Microscope slides | RS France | cat. no. BPB018 | |
| Safe-lock tubes, PCR clean 2.0 mL | Eppendorf | cat. no. 0030123344 | |
| Spring scissors, Vannas-Tubingen 5 mm | Fine Science Tools | cat. no. 15003-08 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | cat. no. 5518083 | |
| Tissue culture dishes 60 mm | Greiner Bio-One | cat. no. 633180 | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor secondary antibodies (488, 555) (1/1,000) | ThermoFisher Scientific | cat. no. A-11001 | |
| DAPI | Sigma | cat. no. D9542 | |
| guinea pig polyclonal anti-DCX 1:500 | Millipore | cat. no. AB2253, | |
| mouse monoclonal anti-GFAP 1:500 | Sigma | cat. no. G3893 | |
| mouse monoclonal anti-MAG 1:400 | Millipore | cat. no. MAB1567 | |
| Software | |||
| GraphPad Prism version 9 | GraphPad Software, San Diego California USA | www.graphpad.com | |
| Perseus Version 1.6.10.50 | Max-Planck Institute for Biochemistry, Munich Bavaria Germany | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ZEN imaging software | Carl Zeiss |
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