Summary
Der Goldstandard in der Kardiologie für zelluläre und molekulare Funktionsexperimente sind Kardiomyozyten. Dieser Artikel beschreibt Anpassungen an die Nicht-Langendorff-Technik zur Isolierung von Maus-Kardiomyozyten.
Abstract
Der Bedarf an reproduzierbaren und technisch einfachen Methoden, die qualitativ hochwertige Kardiomyozyten liefern, ist für die Forschung in der Herzbiologie von entscheidender Bedeutung. Zelluläre und molekulare funktionelle Experimente (z. B. Kontraktion, Elektrophysiologie, Kalziumzyklus usw.) an Kardiomyozyten sind der Goldstandard für die Etablierung von Krankheitsmechanismen. Die Maus ist die Spezies der Wahl für funktionelle Experimente und die beschriebene Technik ist speziell für die Isolierung von Maus-Kardiomyozyten. Bisherige Methoden, die einen Langendorff-Apparat erfordern, erfordern ein hohes Maß an Training und Präzision für die Aortenkanülierung, was häufig zu einer Ischämie führt. Das Feld verlagert sich hin zu Langendorff-freien Isolationsmethoden, die einfach und reproduzierbar sind und lebensfähige Myozyten für die physiologische Datenerfassung und Kultur liefern. Diese Methoden verkürzen die Ischämiezeit im Vergleich zur Aortenkanülierung erheblich und führen zu zuverlässig erhaltenen Kardiomyozyten. Unsere Anpassung an die Langendorff-freie Methode umfasst eine initiale Perfusion mit eiskalter Clearing-Lösung, die Verwendung einer stabilisierenden Plattform, die eine stabile Nadel während der Perfusion gewährleistet, und zusätzliche Verdauungsschritte, um zuverlässig gewonnene Kardiomyozyten für den Einsatz in funktionellen Messungen und Kulturen zu gewährleisten. Diese Methode ist einfach und schnell durchzuführen und erfordert wenig technisches Geschick.
Introduction
Eine wesentliche Idee in der herzbiologischen Literatur ist seit Jahrzehnten der molekulare Wirkmechanismus. Der Wirkmechanismus muss etabliert sein, um verlässliche Studien zu veröffentlichen. Eine gut etablierte Strategie zur Bestimmung molekularer Mechanismen sind isolierte Kardiomyozytenstudien, die qualitativ hochwertige Kardiomyozyten benötigen, um vertrauenswürdige Daten zu erhalten. Zelluläre und molekulare Experimente, die an Kardiomyozyten durchgeführt werden, um den Wirkmechanismus zu bestimmen, sind der Goldstandard für die Untersuchung von Kontraktion1, Elektrophysiologie2, Calcium (Ca 2+) -Zyklus3, Myofilament Ca2+ Sensitivität4, Zytoskelett5, Metabolismus6, Wirkungen von Hormonen7, Signalmoleküle8, Arzneimittelstudien9 etc. Die Maus ist aufgrund der Leichtigkeit der genetischen Manipulation, ihrer geringen Größe, ihrer relativ kurzen Lebensdauer, ihrer geringen Kosten usw. zur Spezies der Wahl für die meisten herzbiologischen Experimente geworden10. Die zuverlässige Isolierung hochwertiger Maus-Kardiomyozyten ist jedoch mit den derzeitigen Techniken nicht trivial.
Labore isolieren Kardiomyozyten seit fast 70 Jahren11. Praktisch alle Techniken zur Isolierung von Kardiomyozyten beruhen auf der Verdauung des Herzens über verschiedene Enzyme (Kollagenase, Protease, Trypsin usw.). In den frühen Perioden (1950er bis 1960er Jahre) wurde die Chunk-Methode angewendet, bei der das Herz entfernt, in viel kleinere Stücke geschnitten und in Lösung mit Kollagenase / Protease / Trypsin12 inkubiert wurde. In den 1970er Jahren implementierten Labore die verbesserte "Langendorff"-Methode13, bei der Kardiomyozyten mit einer auf Koronararterienperfusion basierenden Isolationstechnik isoliert wurden (retrograde Perfusion mit Enzym über den Langendorff-Apparat); Diese Technik ist auch heute noch die dominierende Methode der Myozytenisolierung auf diesem Gebiet, ~50 Jahre später14,15,16. Neuere Arbeiten haben sich auf die Kanülierung des Herzens in vivo verlagert, um die Hypoxiezeit und ischämische Schäden zu begrenzen, was zu überlegenen Kardiomyozytenisolierungen (bessere Ausbeute und höhere Qualität) führt17. In jüngster Zeit hat sich dies zu einer in vivo durchgeführten Langendorff-freien Herzperfusion entwickelt 18,19,20,21,22. Wir haben die Langendorff-freie Kardiomyozyten-Isolationstechnik auf Basis der Technik von Ackers-Johnson et al.18 weiterentwickelt und verschiedene Komponenten aus den vielen bisherigen Isolationstechniken adaptiert. Zu diesen wichtigen Anpassungen gehören die Injektion eines eiskalten Clearing-Puffers und der Einbau einer Stützplattform zur Stabilisierung der Nadel, die eine verringerte Manipulation des Herzens ermöglicht. Ebenfalls detailliert in dieser Technik ist die Temperaturkontrolle der injizierten Puffer (37 °C), die die Zeit zwischen In-vivo-Injektion und Aufschluss aufgrund einer geringeren EDTA-Perfusion verkürzte, wie zuvor veröffentlicht18. Durch die Verringerung der Manipulation des Herzens und damit die Minimierung der Größe der Einstichstelle wird eine gründliche und konstante Durchblutung der Koronararterien erreicht. Wir verfeinerten die Technik auch mit einem sekundären Chunk-Aufschluss, der Menge an EDTA im injizierten Clearing-Puffer und änderten den pH-Wert. Unsere beschriebene Technik ist zuverlässiger, effizienter und erfordert im Vergleich zur Verwendung des Langendorff-Geräts keine umfangreiche Ausbildung/Übung (Tabelle 1).
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Protocol
Alle in dieser Studie durchgeführten Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Ohio State University in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien genehmigt.
1. Vorbereitung der Lösung
ANMERKUNG: Die Pufferkonzentrationen sind Tabelle 2 zu entnehmen.
- Präisolation (bis zu 2 Wochen vor der Myozytenisolierung)
- Perfusionspufferbasis: Bereiten Sie 1 l Perfusionspufferbasis (NaCl, KCl,NaH2PO4, HEPES, Glucose und BDM) in 1 l hochreinen 18,2 MΩ·cm H2O vor. Stellen Sie vor der 0,22 μm Sterilfiltration einen pH-Wert von 7,4 ein. Bei 4 °C bis zum Tag der Isolierung lagern.
- Clearing-Puffer: Bereiten Sie 1 l Clearing-Puffer (NaCl, KCl, NaH2 PO 4, HEPES, Glucose, EDTA und BDM) in 1 l hochreinen 18,2 MΩ·cm H2O vor. Stellen Sie vor der 0,22 μm Sterilfiltration einen pH-Wert von7,4 ein. Bei 4 °C bis zum Tag der Isolierung lagern.
- 100 mM CaCl 2 Stammlösung: 1,11 g CaCl 2 werden abgewogen und in 100 ml hochreines 18,2 MΩ·cm H2 O aufgelöst. Bei Raumtemperatur bis zum Tag der Isolierunglagern.
- Liberase-Aliquote: Lösen Sie 5 mg Verdauungsenzyme in 5 ml sterilem, RNase-freiem Wasser auf. 0,8 ml Aliquote herstellen und bis zum Tag der Isolierung bei -20 °C lagern.
- Laminieren Sie das Geschirr: Tragen Sie 100 μl 40 μg/ml Mauslaminin auf sterile 30-ml-Petrischalen mit Glasboden auf. 30 Minuten einwirken lassen und überschüssiges Laminin entfernen. Legen Sie das Laminin auf eine Petrischale mit UV-Inkubation bei Raumtemperatur für 30 min. Bei 4 °C bis zum Tag der Isolierung lagern (laminierte Petrischalen können bis zu 2 Wochen verwendet werden).
- DMEM-Medien: In einer Biosicherheitswerkbank 2,5 ml FBS, 0,5 ml Penicillin-Streptomycin (50 U/ml-50 μg) und 1 ml 500 mM BDM zu 46 ml DMEM geben. Bei 4 °C bis zum Tag der Isolierung lagern (Medien können bis zu 2 Wochen verwendet werden).
- M199-Medien: Bereiten Sie 1 l M199-Medien (NaHCO3, HEPES, L-Glutathion, M199, BDM und BSA) in 1 l hochreinem 18,2 MΩ·cm H2O vor. Vor der Sterilfiltration auf pH 7,4 einstellen (0,22 μm Filter). Bei 4 °C bis zum Tag der Isolierung lagern.
- 500 mM BDM-Vorrat: 0,5 g BDM zu 10 ml hochreinem 18,2 MΩ·cm H2O. Bei 4 °C bis zum Tag der Isolierung lagern.
- Stabilisierende Plattformerstellung: Bilden Sie Spielteig um die Basis der Nadel, die in den Luer-Absperrhahn geschraubt ist. Formen Sie die Petrischale, die das Herz enthält, und stellen Sie sicher, dass sich die Nadel in der richtigen Höhe für die Ventrikelinjektion befindet (~ 5 mm über dem Boden der Schale).
- Der Tag der Isolation
- Perfusionspuffer: Am Tag der Isolierung 9,5 mg MgCl2 auf 100 ml Perfusionspufferbase geben. Vollständig mischen lassen, bevor 30 ml des fertigen Perfusionspuffers entfernt werden, und in eine saubere, 100-ml-Glasflasche mit weitem Mund und Schraubverschluss (Aufschlusspuffer) geben.
HINWEIS: Diese Zusätze können am Tag der Isolierung ohne zusätzliche pH-Einstellungen vorgenommen werden, da ihre Zugabe den pH-Wert vernachlässigbar verändert.- Entfernen Sie 12 ml Perfusionspuffer und legen Sie ihn zur Seite (Stopppuffer). Gießen Sie die restlichen 58 ml Perfusionspuffer in eine weitere saubere, 100-ml-Weithalsglasflasche mit Schraubverschluss. Lagern Sie den verbleibenden Perfusionspuffer während der gesamten Isolierung bei 37 °C.
- Aufschlusspuffer: 7,5 μl 100 mM CaCl2 bis 30 ml Perfusionspuffer für eine Endkonzentration von 25 μM zugeben. Unmittelbar vor der Isolierung 770 μl Liberase in den Aufschlusspuffer geben, um eine Endkonzentration von 26 μg/ml zu erreichen.
- Stopppuffer: 240 mg BSA in 12 ml Perfusionspuffer auflösen. Während der gesamten Isolierung bei 37 °C lagern.
- Clearing-Puffer: Bereiten Sie eine 3-ml-Spritze mit Clearing-Puffer vor und befreien Sie die Nadel von Blasen. Bis zur Isolation auf Eis lagern.
- Perfusionspuffer: Am Tag der Isolierung 9,5 mg MgCl2 auf 100 ml Perfusionspufferbase geben. Vollständig mischen lassen, bevor 30 ml des fertigen Perfusionspuffers entfernt werden, und in eine saubere, 100-ml-Glasflasche mit weitem Mund und Schraubverschluss (Aufschlusspuffer) geben.
2. Vielfältige Vorbereitung
- Reinigen Sie den temperaturgesteuerten Verteiler mit frisch aufbereitetem Perfusionspuffer und achten Sie darauf, dass keine Blasen zurückbleiben. Schrauben Sie mit einem Luer-Lock-Anschluss eine 27-G-Nadel ein und befreien Sie sie von Blasen. Ein geklärter Verteiler ist für eine erfolgreiche Isolierung unerlässlich.
3. Tierische Vorbereitung
- Injizieren Sie der Maus unmittelbar vor der Isolierung intraperitoneal 100 mg/kg Ketamin und 20 mg/kg Xylazin nach Körpergewicht. Bei diesem Verfahren wurde eine männliche, 4 Monate alte C57Bl/6-Maus verwendet.
- Legen Sie die Maus bei Bedarf auf ein erhitztes OP-Pad, um die Sedierung zu fördern. Zelten Sie die Arme der Maus und kleben Sie die Gliedmaßen und den Schwanzansatz an eine blaue Laborwindel. Stellen Sie sicher, dass das Tier durch den Rückzug des Zehen-Kneif-Reflexes vollständig betäubt ist. Tragen Sie ein steriles Tuch um den Operationsbereich auf.
4. Verfahren zur Isolierung von Kardiomyozyten
- Legen Sie das Brustbein der Maus frei und schneiden Sie seitlich zur Mittellinie proximal durch die Rippen und zur Achselhöhle. Schneiden Sie das Zwerchfell vorsichtig vollständig durch und achten Sie auf flache Schnitte, um das Herz zu vermeiden. Klemmen Sie das Brustbein mit einem Hämostat fest und falten Sie die Rippen nach hinten, um die Brusthöhle freizulegen.
- Entfernen Sie vorsichtig das Perikard aus dem Herzen und schneiden Sie die untere Hohlvene unmittelbar distal des Herzens vollständig durch. Verwenden Sie eine 3-ml-Spritze mit einer 27-g-Nadel, um 3 ml eiskalten Clearing-Puffer über 1 Minute schnell in den rechten Ventrikel des Herzens zu injizieren.
- Halten Sie das Herz vorsichtig mit einer Pinzette fest und ziehen Sie es vom Körper weg, wobei Sie so viel wie möglich von der Aorta freilegen. Klemmen Sie mit einem Hämostat die aufsteigende Aorta fest, achten Sie darauf, die Vorhöfe nicht einzuklemmen, und schneiden Sie das Herz aus der Brust.
- Übertragen Sie das geklemmte Herz schnell auf den Deckel einer Polypropylen-Petrischale mit ca. 10 ml warmem Perfusionspuffer. Setzen Sie das geklemmte Herz in die Stützplattform ein und injizieren Sie mit einer stabilisierten 27-G-Nadel, die am Verteiler befestigt ist, 10 ml temperaturgesteuerten 37 °C-Perfusionspuffer über 5 Minuten in den linken Ventrikel.
- Übertragen Sie das festgeklemmte Herz und die Stützplattform in eine Petrischale mit ca. 5 ml Verdauungspuffer. Tauschen Sie die Eingangsspritzen gegen eine 50-ml-Spritze mit 25 ml Aufschlusspuffer aus.
- Befreien Sie den Verteiler vor der Injektion von Blasen und verbleibendem Perfusionspuffer. Setzen Sie die Nadel vorsichtig in die gleiche Nadelposition an der linksventrikulären Spitze ein.
- Verwenden Sie eine Perfusionspumpe, um mit einer 50-ml-Spritze 15 Minuten lang temperaturgesteuerten Aufschlusspuffer bei 37 °C in den linken Ventrikel zu injizieren. Kontrollieren Sie die Temperatur der Lösung mit einem Wassermantel, der zuvor so kalibriert wurde, dass er eine 37 °C-Lösung am Ende der Nadel ausstößt.
- Entfernen Sie die Ventrikel aus den Vorhöfen und geben Sie sie in ein 10-ml-Becherglas. Geben Sie 3 ml Verdauungspuffer in das Becherglas und schneiden Sie die Ventrikel mit einer scharfen Schere in große Stücke. Das Becherglas mit Alufolie abdecken und 5 min in ein auf 37 °C vorgeheiztes Schüttelwasserbad stellen.
- Entsorgen Sie den Überstand und achten Sie darauf, dass keine Gewebestücke entfernt werden. Resuspendieren Sie die Gewebebrocken in 3 ml Aufschlusspuffer und triturieren Sie sie etwa 4 Minuten lang oder bis eine homogene Mischung erreicht ist.
- Filtern Sie die Zellen durch ein 70-μm-Nylon-Zellsieb in ein 50-ml-Polypropylenröhrchen.
- Das Filtrat wird in ein 14-ml-Polypropylenröhrchen mit rundem Boden zurückgeführt und 1 Minute lang bei 100 U/min zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 3 ml Stopppuffer.
- Geben Sie 54 μl 100 mM CaCl 2 -Bestand in die resuspendierten Zellen, um eine endgültige CaCl2-Konzentration von 1,8 mM zu erreichen. Dieser Schritt kann auch schrittweise durchgeführt werden, um die Zellausbeute zu erhöhen.
- Lassen Sie lebende Zellen 10 Minuten lang durch die Schwerkraft absetzen, bevor Sie den Überstand mit den toten Zellen entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet in Lagerlösung (Perfusionslösung mit 200 μM CaCl2). Diese Zellen können nun für funktionelle Experimente (z. B. Kalzium-Bildgebung/-Kontraktion, Patch-Klemme usw.), Kulturen usw. verwendet werden.
HINWEIS: Die Zellen können auch in labor- oder experimentabhängigen Lösungen resuspendiert werden.
5. Zellkultur
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder mit einem gerasterten Deckglas. Da Myozyten sehr groß sind, ist die Zählung mit einem Hämozytometer nicht immer genau. Dies wird verwendet, um eine Vorstellung davon zu bekommen, wie viele Zellen ungefähr aus der Isolierung gewonnen wurden.
- Verdünnen Sie die Zellen mit DMEM-Medien auf ~25.000 Zellen/ml. Geben Sie 1 ml Zelllösung in jede Vertiefung.
- Inkubation bei 37 °C, 95 % O 2, 5 % CO 2 für2 h.
- Saugen Sie DMEM-Medien vorsichtig aus jeder Vertiefung ab und fügen Sie 2 ml M199-Medien hinzu.
- Inkubation bei 37 °C, 95% O 2, 5% CO2 für bis zu 24 h.
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Representative Results
Es gibt einige Elemente, die bei der Bestimmung des Erfolgs einer Isolation zu berücksichtigen sind. Erstens müssen die Kardiomyozyten stäbchenförmig sein und keine Membranbläschen aufweisen, wie die in Abbildung 1 isolierten Zellen. Eine typische Isolierung ergibt ~80% der Myozyten, die stäbchenförmig sind. Wenn die Isolierung weniger als 50% stäbchenförmige Zellen ergibt, wird dies als erfolglose Isolierung angesehen und Kardiomyozyten werden nicht verwendet. Schließlich sollten die Kardiomyozyten ruhig sein. Spontan kontrahierende Myozyten zeigen eine Ca2+-Intoleranz und liefern unzuverlässige Daten. Von allen Isolationen, die mit der oben genannten Technik durchgeführt wurden, werden fast alle Isolationen als erfolgreich angesehen. Kultivierte Kardiomyozyten gelten als erfolgreich, wenn sie stäbchenförmig ohne Membranbläschen oder abgerundete Kanten mit hohen Überlebensraten sind (Abbildung 2).
Tabelle 1. Eine Tabelle mit den Unterschieden zwischen unserer Methode, den Langendorff-Methoden, und den zuvor veröffentlichten Langendorff-freien Methoden zur Isolierung von Maus-Kardiomyozyten. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Konzentrationen des Puffermediums. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Abbildung 1. (A) 4 Monate alte C57Bl/6-Maus-Kardiomyozyten, aufgenommen mit Hilfe der Hellfeldmikroskopie. Ausbeute: ~80%; 20-fache Vergrößerung. (B) Hellfeldbild eines 4 Monate alten C57Bl/6-Maus-Kardiomyozyten. Kardiomyozyten sind ruhig und weisen eine Stäbchenform ohne Membranbläschen auf. Die Maßstabsleiste beträgt 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. (A) Die 4 Monate alten C57Bl/6-Maus-Kardiomyozyten, die 24 h lang in M199-Medien kultiviert wurden. Lebensfähigkeit: ~80%; 20-fache Vergrößerung. (B) Myozyten, die 24 h lang kultiviert wurden. Nach 24 h zeigen Kardiomyozyten eine Stäbchenform ohne Membranbläschen. (C) % Überlebenskurve für Kardiomyozyten, die 24 h lang mit der beschriebenen Methode kultiviert wurden. Die Maßstabsleiste beträgt 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Der Hauptvorteil unserer Langendorff-freien Kardiomyozyten-Isolationstechnik besteht darin, dass sie Hypoxie und ischämische Zeit begrenzt, da keine Kanülierung an einem Langendorff-Gerät erforderlich ist. Alternativ zu den klassischen Langendorff-Techniken, die mehrere Minuten benötigen, um das Herz zu entfernen, zu reinigen und aufzuhängen, was oft zu einer ischämischen Schädigung der Myozyten führt, beinhaltet unsere Methode eine In-vivo-Reinigung des Blutes über eine eiskalte Reinigungslösung. Der eiskalte Clearing-Puffer enthält Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), chelatisiert irreversibel zweiwertige Kationen, um Calcium effizient zu entfernen, was ihn zu einem hervorragenden Antikoagulans macht und somit die Kontraktion stoppt23. Die Verwendung von eiskalten Lösungen hemmt die Kontraktion, indem sie den Ionenaustausch und die Zellstoffwechselrate verlangsamt und so Schäden durch Ischämie verhindert24. Durch den Verzicht auf eine Aortenkanülierung erzeugen Langendorff-freie Techniken robuste Myozyten, was zu einer zuverlässigeren Vorbereitung führt, um vertrauenswürdige Daten zu liefern, was bei Langendorff-Isolationsmethoden nicht immer der Fall ist.
Dies ist eine Variation einer zuvor veröffentlichten Langendorff-freien Isolationstechnik18 mit Anpassungen, die in Tabelle 1 hervorgehoben sind. Am wichtigsten ist, dass diese Technik eine stabilisierende Plattform einführt, die die Anzahl der Male begrenzt, mit denen die Nadel entfernt und aus dem Herzen ersetzt werden muss. Jede unnötige Bewegung, die in die Nadel eingeführt wird, während sie in den Ventrikel eingeführt wird, erweitert die Einstichstelle. Eine breitere Punktionsstelle führt zu einem Rückfluss aus dem Ventrikel von der Punktionsstelle, einem verminderten Druck im Herzen und einem verminderten Fluss zu den Herzkranzgefäßen. Dieses Problem wird durch die Verwendung der Stabilisierungsplattform behoben. Durch die Begrenzung der Nadelbewegung und der Häufigkeit, mit der die Nadel entfernt und ersetzt wird (eins im Vergleich zu dreimal, wie zuvor beschrieben18), halten wir einen gleichmäßigen Fluss zu den Herzkranzgefäßen aufrecht und erreichen eine konsistente Verdauung. Eine weitere wichtige Anpassung war die Hinzufügung eines temperaturgesteuerten Mantels, um die Enzymlösungen beim Eintritt in das Herz bei 37 °C zu halten (das Temperaturbad wurde so kalibriert, dass es bei 37 °C aus der Nadel ausgestoßen wird). Das verwendete Verdauungsenzym hat bei 37 °C eine optimale Reaktionsaktivität, und die Zugabe einer Temperaturkontrolle erhöht die Enzymaktivität und verkürzt somit die Verdauungszeit. Liberase hat auch eine minimale Variabilität von Charge zu Charge und eine höhere Reproduzierbarkeit im Vergleich zu anderen Enzymen. Eine weitere Anpassung bisheriger Techniken ist eine verringerte Menge an injizierter Clearinglösung. Die Verringerung der Menge an Clearing-Puffer, die in das Herz gelangt, und die Möglichkeit, dass mehr Blut durch Perfusionspuffer gereinigt wird, verringert die Inaktivierung des Verdauungsenzyms durch EDTA. Ein weiterer Grund dafür, dass unsere Methode durchweg erfolgreiche Myozytenisolierungen erreicht, ist der Einsatz von BDM. BDM ist ein Myosin-Inhibitor, der den Power-Stroke-Mechanismus des Sarkomers verhindert, wodurch die Kontraktion gehemmt und die Reoxygenierungsverletzung während der Verdauung begrenzt wird. Durch die Begrenzung der Kontraktion verhindern wir den Kalziumkreislauf und die inhärente Produktion reaktiver Sauerstoffspezies in kontrahierenden Myozyten in Kultur. Da das Nährmedium Calcium enthält, ist es möglich, dass sich die Myozyten zusammenziehen und die nachfolgende Ausbeute nach der Kultur verringern. Wir haben uns dafür entschieden, die Myozyten in BDM zu kultivieren, um eine Kontraktion zu verhindern und die Ausbeutezu erhöhen 25,26. BDM kann nach der Kultur immer mit großem Erfolg für funktionelle Messungen aus Myozyten ausgewaschen werden. Alternativ können alle Schritte dieses Verfahrens ohne Zusatz von BDM durchgeführt werden, aber Isolierungen können bei BDM-freien isolierten Myozyten nicht als "erfolgreich" angesehen werden.
Neben der ischämischen Zeit gibt es viele andere Faktoren, die bestimmen, ob eine Isolierung robuste Myozyten produziert. Da es in den einzelnen Laboren unterschiedliche Bedingungen gibt, müssen die Personen, die die Isolierung durchführen, möglicherweise die Menge an Enzym und/oder Kalzium, die Perfusionszeit und/oder die Pumpendrehzahl sowie die Geschwindigkeit und/oder Zeit des Schaukelwasserbades ändern. Diese Parameter hängen vom verwendeten Mausmodell ab, z. B. gesund oder krank, alternd usw.
Obwohl diese Technik nicht die chirurgischen Fähigkeiten erfordert, die für die Langendorff-basierten Techniken erforderlich sind, gibt es immer noch entscheidende Schritte, um die Technik erfolgreich zu machen. Das häufigste Problem, das bei dieser Technik zu schlechten Myozyten führt, ist darauf zurückzuführen, dass Blasen in das Perfusionssystem eindringen und den Zugang des Myokardgewebes zum Perfusionspuffer blockieren. Die Lösung für dieses Problem ist sorgfältiges Üben, um Blasen zu vermeiden (durch die richtige Spritzenreinigungstechnik, die richtige Nadelreinigungstechnik, das Aufstoßen des Blasenverteilers beim Spritzenwechsel usw.) sowie mehrere Austrittspunkte aus dem Perfusionssystem, falls eine Blase im Verteiler steckt. Ohne Blasen erreichen wir unserer Erfahrung nach nahezu 100% erfolgreiche Myozytenisolierungen (definiert als über 50% stäbchenförmige Myozyten; der Durchschnitt liegt bei ~80%).
Während die Methode durch den Wegfall der für die Langendorff-Methode erforderlichen chirurgischen Fähigkeiten vereinfacht wurde, wurde diese angepasste Methode bisher nur an Mäusen ausprobiert. Ein weiterer Vorteil der Langendorff-freien Methode besteht darin, dass sie, wie zuvor beschrieben, für viele murine Modelle (d.h. vom Neugeborenen bis zur Seneszenz) verwendet werdenkann 19. Leider sind größere Säugetiere (z. B. Hunde, Schweine usw.) aufgrund der Größe ihres Herzens nicht für diese Technik geeignet. Es wäre unmöglich, das Herz mit genügend Lösung zu durchbluten, um zuverlässige Myozyten zu gewinnen.
Unsere Adaption der Langendorff-freien Methode ist eine zuverlässige Methode für die erfolgreiche Isolierung von Maus-Kardiomyozyten. Im Vergleich zur Langendorff-Methode erfordert dieser alternative Ansatz wenig technisches Geschick, um konsistent Kardiomyozyten zu erhalten.
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Disclosures
Es müssen keine Interessenkonflikte offengelegt werden.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Grants R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) und T32 HL134616 (Sturgill und Salyer) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cc Bd Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-827-52 | |
| 10 mL Pyrex Low-Form Beaker | Cole-Palmer | UX-34502-01 | |
| 100 mL polypropylene cap glass media storage bottle | DWK Life Sciences | UX-34523-00 | |
| 14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap | Fisher Sci | 14-959-11B | |
| 2,3-Butanedione Monoxime | Sigma | B0753 | >98% |
| 3 cc BD Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-823-435 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-20-C | |
| 50 mL BD Syringe without Needle | Fisher Sci | 13-689-8 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Cole-Palmer | EW-22999-84 | |
| 95% O2 5% CO2 | |||
| AIMS Space Gel Heating Pad | Fisher Sci | 14-370-223 | |
| BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles | Becton Dickinson | 305109 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3803 | Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98% |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C7902 | >99% |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | Suitable for cell culture, >99.5% |
| DMEM | Fisher Sci | 11965092 | |
| EDTA | Fisher Sci | AAA1071336 | |
| Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| FBS | R&D Systems (Bio-techne) | S11195 | |
| Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators | Fisher Sci | 13-874-432 | |
| Hartman Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 15921 | |
| Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set | Fisher Sci | 02-671-11 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | >99.5% |
| Labeling Tape | Fisher Sci | 15-901-10R | |
| Legato 100 Syringe Pump | kdScientific | 788100 | |
| L-glutathione | Fisher Sci | ICN19467980 | |
| Liberase TH Research Grade | Sigma | 5401135001 | High thermolysin concentration |
| M199 | Fisher Sci | MT10060CV | |
| Magnesium Chloride | Invitrogen | AM9530G | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | |
| Pen/Strep | Fisher Sci | ||
| Potassium Chloride | Sigma | P5405 | >99% |
| Precision Digital Reciprocating Water Bath | ThermoFisher Scientific | TSCIR19 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Suitable for cell culture |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | >99% |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | >99% |
| Sterile Cell Strainer 70 µm | Fisher Sci | 22-363-548 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| VWR Absorbent Underpads | Fisher Sci | NC9481815 |
References
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