Summary
Guldstandarden inom kardiologi för cellulära och molekylära funktionella experiment är kardiomyocyter. Denna artikel beskriver anpassningar till icke-Langendorff-tekniken för att isolera muskardiomyocyter.
Abstract
Behovet av reproducerbara men tekniskt enkla metoder som ger kardiomyocyter av hög kvalitet är avgörande för forskning inom hjärtbiologi. Cellulära och molekylära funktionella experiment (t.ex. kontraktion, elektrofysiologi, kalciumcykling, etc.) på kardiomyocyter är guldstandarden för att fastställa sjukdomsmekanism(er). Musen är den art som valts för funktionella experiment och den beskrivna tekniken är specifikt för isolering av muskardiomyocyter. Tidigare metoder som kräver en Langendorff-apparat kräver hög grad av träning och precision för aortakannulation, vilket ofta resulterar i ischemi. Fältet skiftar mot Langendorff-fria isoleringsmetoder som är enkla, reproducerbara och ger livskraftiga myocyter för fysiologisk datainsamling och odling. Dessa metoder minskar kraftigt ischemitiden jämfört med aortakanylering och resulterar i tillförlitligt erhållna kardiomyocyter. Vår anpassning till den Langendorff-fria metoden inkluderar en initial perfusion med iskall rensningslösning, användning av en stabiliseringsplattform som säkerställer en stadig nål under perfusion och ytterligare matsmältningssteg för att säkerställa tillförlitligt erhållna kardiomyocyter för användning i funktionella mätningar och odling. Denna metod är enkel och snabb att utföra och kräver liten teknisk skicklighet.
Introduction
I årtionden är en viktig idé i hjärtbiologisk litteratur den molekylära verkningsmekanismen. Verkningsmekanismen måste fastställas för att tillförlitliga studier ska kunna publiceras. En väletablerad strategi för att bestämma molekylär mekanism är isolerade kardiomyocytstudier, som kräver högkvalitativa kardiomyocyter för att uppnå tillförlitliga data. Cellulära och molekylära experiment som utförs på kardiomyocyter för att bestämma verkningsmekanismen är guldstandarden för att undersöka sammandragning1, elektrofysiologi2, kalcium (Ca 2+) cykling3, myofilament Ca2+ känslighet4, cytoskelett5, metabolism6, effekter av hormoner7, signalmolekyler8, läkemedelsstudier9 etc. Musen har blivit den art som valts för de flesta hjärtbiologiska experiment på grund av enkel genetisk manipulation, dess lilla storlek, dess relativt korta livslängd, låga kostnad etc10. Den tillförlitliga isoleringen av högkvalitativa muskardiomyocyter är emellertid inte trivial med nuvarande tekniker.
Labs har isolerat kardiomyocyter i nästan 70 år11. Praktiskt taget alla tekniker för att isolera kardiomyocyter är beroende av matsmältningen av hjärtat via olika enzymer (kollagenas, proteas, trypsin, etc.). Under de tidiga perioderna (1950-1960-talet) användes segmentmetoden, som innebar att hjärtat avlägsnades, skars i mycket mindre bitar och inkuberades i lösning med kollagenas / proteas / trypsin12. På 1970-talet implementerade laboratorier den förbättrade "Langendorff" -metoden13, som isolerade kardiomyocyter med hjälp av en kranskärlsperfusionsbaserad isoleringsteknik (retrograd perfusion med enzym via Langendorff-apparaten); Denna teknik är fortfarande den dominerande metoden för myocytisolering i fältet idag, ~ 50 år senare14,15,16. Det senaste arbetet har övergått till kanylering av hjärtat in vivo för att begränsa hypoxitiden och ischemisk skada, vilket resulterar i överlägsen kardiomyocytisolering (bättre avkastning och högre kvalitet)17. Nyligen har detta utvecklats till att utföra in vivo, Langendorff-fria hjärtperfusioner 18,19,20,21,22. Vi har utvecklat den Langendorff-fria kardiomyocytisoleringstekniken baserad på Ackers-Johnson et al.18-tekniken och anpassat olika komponenter från de många tidigare isoleringsteknikerna. Dessa viktiga anpassningar inkluderar injektion av en iskall rensningsbuffert och införlivandet av en stödjande plattform för att stabilisera nålen, vilket möjliggör minskad manipulation av hjärtat. I denna teknik beskrivs också temperaturkontroll av injicerade buffertar (37 °C), vilket minskade tiden mellan in vivo-injektion och matsmältning på grund av mindre EDTA-perfusion som tidigare publicerats18. Genom att minska manipulationen av hjärtat och därmed minimera punkteringsställets storlek erhålls grundlig och konstant perfusion av kranskärlen. Vi förfinade också tekniken med en sekundär bitmetod digestion, mängden EDTA i den injicerade clearingbufferten och ändrade pH. Vår beskrivna teknik är mer tillförlitlig, effektivare och kräver inte omfattande utbildning/övning jämfört med användning av Langendorff-apparaten (tabell 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer som utfördes i denna studie godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Ohio State University i enlighet med NIH-riktlinjerna.
1. Beredning av lösning
Anmärkning: Se tabell 2 för buffertkoncentrationer.
- Förisolering (upp till 2 veckor före myocytisolering)
- Perfusionsbuffertbas: Bered 1 liter perfusionsbuffertbas (NaCl, KCl, NaH2PO4, HEPES, glukos och BDM) i 1 liter ultraren 18,2 MΩ · cmH2O. Justera till pH 7,4 före 0,22 μm sterilfiltrering. Förvaras vid 4 °C fram till isoleringsdagen.
- Rensningsbuffert: Förbered 1 liter clearingbuffert (NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, HEPES, glukos, EDTA och BDM) i 1 liter ultraren18,2MΩ · cmH2O. Justera till pH7,4 före 0,22 μm sterilfiltrering. Förvaras vid 4 °C fram till isoleringsdagen.
- 100 mM CaCl 2-stamlösning: Väg upp 1,11 gCaCl2 och lös upp i 100 ml ultraren 18,2 MΩ · cmH2O. Förvara i rumstemperatur tills isoleringsdagen.
- Librasalikvoter: Lös 5 mg matsmältningsenzymer i 5 ml sterilt, RNasfritt vatten. Bered 0,8 ml alikvoter och förvara vid -20 °C fram till isoleringsdagen.
- Laminera diskarna: Applicera 100 μL 40 μg/ml muslaminin på sterila 30 ml petriskålar med glasbotten. Låt sitta i 30 minuter och ta bort överflödigt laminin. Ställ laminin på en petriskål med UV-inkubation vid rumstemperatur i 30 minuter. Förvaras vid 4 °C fram till isoleringsdagen (laminerade petriskålar kan användas i upp till 2 veckor).
- DMEM-media: Tillsätt 2,5 ml FBS, 0,5 ml penicillin-streptomycin (50 U / ml-50 μg) och 1 ml 500 mM BDM till 46 ml DMEM i ett biosäkerhetsskåp. Förvaras vid 4 °C fram till isoleringsdagen (media kan användas i upp till 2 veckor).
- M199-media: Bered 1 l M199-media (NaHCO3, HEPES, L-glutation, M199, BDM och BSA) i 1 l ultraren 18,2 MΩ · cmH2O. Justera till pH 7,4 före steril filtrering (0,22 μm filter). Förvaras vid 4 °C fram till isoleringsdagen.
- 500 mM BDM-lager: Tillsätt 0,5 g BDM till 10 ml ultraren 18,2 MΩ · cmH2O. Förvara vid 4 ° C tills isoleringsdagen.
- Stabiliserande plattformsskapande: Forma playdough runt basen på nålen som skruvas fast i Luer-stoppkranen. Forma till petriskålen som innehåller hjärtat och se till att nålen är i rätt höjd för ventrikelinjektion (~ 5 mm ovanför skålens botten).
- Dagen för isolering
- Perfusionsbuffert: På isoleringsdagen tillsätts 9,5 mg MgCl2 till 100 ml perfusionsbuffertbas. Låt blanda helt innan du tar bort 30 ml färdig perfusionsbuffert och placera den i en ren, bred mun, 100 ml glasflaska med skruvlock (digestionsbuffert).
OBS: Dessa tillägg kan göras på isoleringsdagen utan ytterligare pH-justeringar eftersom deras tillsats försumbart förändrar pH-värdet.- Ta bort 12 ml perfusionsbuffert och ställ åt sidan (stoppbuffert). Häll de återstående 58 ml perfusionsbuffert i en annan ren, bred mun, 100 ml glasflaska med skruvlock. Förvara den återstående perfusionsbufferten vid 37 °C under isoleringen.
- Digestionsbuffert: Tillsätt 7,5 μL 100 mM CaCl2 till 30 ml perfusionsbuffert för en slutlig koncentration på 25 μM. Omedelbart före isoleringen, tillsätt 770 μL liberase till rötningsbufferten för en slutlig koncentration på 26 μg/ml.
- Stoppbuffert: Lös 240 mg BSA i 12 ml perfusionsbuffert. Förvaras vid 37 °C under hela isoleringen.
- Rensningsbuffert: Förbered en 3 ml spruta med rensningsbuffert och rensa nålen från bubblor. Förvara på is tills isolering.
- Perfusionsbuffert: På isoleringsdagen tillsätts 9,5 mg MgCl2 till 100 ml perfusionsbuffertbas. Låt blanda helt innan du tar bort 30 ml färdig perfusionsbuffert och placera den i en ren, bred mun, 100 ml glasflaska med skruvlock (digestionsbuffert).
2. Förberedelse av grenrör
- Rensa det temperaturkontrollerade grenröret med nyberedd perfusionsbuffert, var noga med att se till att inga bubblor finns kvar. Använd en Luer lock-kontakt, skruva in en 27 G nål och rensa från bubblor. Ett rensat grenrör är viktigt för en lyckad isolering.
3. Beredning av djur
- Injicera musen intraperitonealt med 100 mg/kg ketamin och 20 mg/kg xylazin i kroppsvikt omedelbart före isoleringen. Denna procedur använde en manlig, 4 månader gammal C57Bl/6-mus.
- Om det behövs, placera musen på en uppvärmd kirurgisk kudde för att uppmuntra sedering. Tält musens armar och tejpa fast svansens lemmar och bas på en blå labbblöja. Se till att djuret är helt bedövat genom uttag av tå-klämreflex. Applicera ett sterilt draperi runt operationsområdet.
4. Förfarande för isolering av kardiomyocyter
- Exponera musens bröstben och, lateralt mot mittlinjen, skär proximalt genom revbenen och till axillen. Skär försiktigt helt genom membranet, se till grunda snitt för att undvika hjärtat. Kläm bröstbenet med en hemostat och vik revbenen bakåt för att exponera brösthålan.
- Ta försiktigt bort perikardiet från hjärtat och skär helt genom den sämre vena cava, omedelbart distalt mot hjärtat. Använd en 3 ml spruta med en 27 G nål för att snabbt injicera 3 ml iskall rensningsbuffert i hjärtats högra kammare under 1 minut.
- Håll försiktigt hjärtat med pincett och dra bort från kroppen och exponera så mycket av aortan som möjligt. Använd en hemostat, kläm den stigande aortan, var försiktig så att du inte klämmer fast atrierna och skär hjärtat från bröstet.
- Överför snabbt det fastspända hjärtat till locket på en petriskål av polypropen med cirka 10 ml varm perfusionsbuffert. Placera det fastspända hjärtat i stödplattformen och använd en stabiliserad 27 G-nål fäst vid grenröret för att injicera 10 ml temperaturkontrollerad perfusionsbuffert på 37 °C i vänster kammare under 5 minuter.
- Överför det fastspända hjärtat och stödplattformen till en petriskål med cirka 5 ml matsmältningsbuffert. Byt sprutor mot en 50 ml spruta med 25 ml rötningsbuffert.
- Rensa grenröret från eventuella bubblor och återstående perfusionsbuffert före injektion. Sätt försiktigt tillbaka nålen i samma nålposition i vänster kammartopp.
- Använd en perfusionspump för att injicera temperaturkontrollerad rötningsbuffert på 37 °C i vänster kammare i 15 minuter med en 50 ml spruta. Kontrollera lösningens temperatur med en vattenmantel som tidigare kalibrerats för att mata ut 37 °C lösning i nålens ände.
- Ta bort ventriklerna från förmaken och överför till en 10 ml bägare. Tillsätt 3 ml digestionsbuffert i bägaren och skär ventriklerna i stora bitar med en vass sax. Täck bägaren med aluminiumfolie och lägg i ett förvärmt skakvattenbad till 37 °C i 5 minuter.
- Kassera supernatanten, var försiktig så att du undviker att ta bort några bitar av vävnad. Återsuspendera vävnadsbitarna i 3 ml digestionsbuffert och triturera i ca 4 minuter eller tills en homogen blandning uppnås.
- Filtrera cellerna genom en 70 μm nyloncellsil till ett 50 ml polypropenrör.
- Sätt tillbaka filtratet i ett 14 ml rundbottnat polypropenrör och centrifugera i 1 min vid 100 rpm. Kassera supernatanten och suspendera pelleten igen i 3 ml stoppbuffert.
- Tillsätt 54 μl 100 mM CaCl 2-stam till de återsuspenderade cellerna för en slutlig CaCl2-koncentration på 1,8 mM. Detta steg kan också utföras stegvis för att öka cellutbytet.
- Låt levande celler sedimentera genom tyngdkraften i 10 minuter innan du tar bort supernatanten som innehåller döda celler. Återsuspendera pelleten i lagringslösning (perfusionslösning med 200 μMCaCl2). Dessa celler kan nu användas för funktionella experiment (dvs. kalciumavbildning / sammandragning, lappklämma, etc.), odling etc.
OBS: Cellerna kan också återsuspenderas i laboratorie- eller experimentberoende lösningar.
5. Cellodling
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer eller med ett fältvisningsantal med hjälp av en rutnätad täckslip. Eftersom myocyter är mycket stora är det inte alltid korrekt att räkna med en hemocytometer. Detta används för att få en uppfattning om ungefär hur många celler som erhölls från isoleringen.
- Späd cellerna till ~25 000 celler/ml med DMEM-media. Tillsätt 1 ml celllösning till varje brunn.
- Inkubera vid 37 °C, 95 % O2, 5 %CO2 i 2 timmar.
- Aspirera försiktigt DMEM-media från varje brunn och tillsätt 2 ml M199-media.
- Inkubera vid 37 °C, 95 % O2, 5 %CO2 i upp till 24 timmar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det finns några faktorer att undersöka när man bestämmer framgången för en isolering. Först måste kardiomyocyterna vara stavformade utan membranfläckar, såsom cellerna isolerade i figur 1. En typisk isolering kommer att ge ~ 80% av myocyterna som stavformade. Om isoleringen ger något mindre än 50% stavformade celler, anses det vara en misslyckad isolering och kardiomyocyter används inte. Slutligen bör kardiomyocyterna vara lugna. Spontant sammandragande myocyter visar Ca2 + intolerans och kommer att producera opålitliga data. Av alla isoleringar som utförs med ovanstående teknik anses nästan alla isoleringar vara framgångsrika. Odlade kardiomyocyter anses vara framgångsrika om de är stavformade utan membranblebs eller rundade kanter med hög överlevnad (figur 2).
Tabell 1. En tabell över noterade skillnader mellan vår metod, Langendorff-metoder, och tidigare publicerade Langendorff-fria metoder för att isolera muskardiomyocyter. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Koncentrationer av buffertmedier. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Figur 1. (A) 4 månader gamla C57Bl/6-muskardiomyocyter avbildade med ljusfältsmikroskopi. Utbyte: ~ 80%; 20x förstoring. (B) Ljusfältsbild av en 4 månader gammal C57Bl/6 muskardiomyocyt. Kardiomyocyter är vilande, uppvisar stavform utan membranfläckar. Skalstången är 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. (A) De 4 månader gamla C57Bl/6-muskardiomyocyterna odlade i 24 timmar i M199-media. Livskraft: ~ 80%; 20x förstoring. b) Myocyter odlade i 24 timmar. Vid 24 timmar uppvisar kardiomyocyter stavform utan membranfläckar. c) Överlevnadskurva i % för kardiomyocyter odlade under 24 timmar med den beskrivna metoden. Skalstången är 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den främsta fördelen med vår Langendorff-fria kardiomyocytisoleringsteknik är att den begränsar hypoxi och ischemisk tid genom att inte kräva kanylering till en Langendorff-apparat. Alternativt till klassiska Langendorff-tekniker som tar flera minuter att ta bort, rengöra och hänga hjärtat, vilket ofta resulterar i ischemisk skada på myocyten, inkluderar vår metod en in vivo-rensning av blod via en iskall clearinglösning. Den iskalla rensningsbufferten innehåller etylendiamintetraättiksyra (EDTA), irreversibelt kelaterar tvåvärda katjoner för att effektivt avlägsna kalcium, vilket gör det till ett utmärkt antikoagulant och stoppar därför sammandragning23. Användningen av iskalla lösningar hämmar sammandragning genom att bromsa jonbyte och cellulär metabolisk hastighet, vilket förhindrar skador orsakade av ischemi24. Genom att eliminera behovet av aortakanulering producerar Langendorff-fria tekniker robusta myocyter vilket resulterar i en mer tillförlitlig beredning för att ge tillförlitliga data, vilket inte alltid är fallet för Langendorff-isoleringsmetoder.
Detta är en variant av en tidigare publicerad Langendorff-fri isoleringsteknik18 med anpassningar som markeras i tabell 1. Viktigast av allt introducerar denna teknik en stabiliserande plattform som begränsar antalet gånger nålen måste tas bort och bytas ut från hjärtat. Varje onödig rörelse som införs i nålen medan den sätts in i ventrikeln vidgar punkteringsstället. En bredare punkteringsplats resulterar i återflöde ut ur ventrikeln från punkteringsstället, minskat tryck i hjärtat och minskat flöde till kranskärlen. Det här problemet åtgärdas med hjälp av stabiliseringsplattformen. Genom att begränsa nålens rörelse och antalet gånger nålen tas bort och byts ut (en jämfört med tre gånger som tidigare beskrivits18) upprätthåller vi ett konsekvent flöde till kranskärlen och uppnår konsekvent matsmältningen. En annan viktig anpassning var tillägget av en temperaturkontrollerad mantel för att bibehålla enzymlösningar vid 37 °C när de kom in i hjärtat (temperaturbadet kalibrerades för att mata ut vid 37 °C från nålen). Det använda digestionsenzymet har optimal reaktionsaktivitet vid 37 °C, och tillsatsen av temperaturkontroll ökar enzymaktiviteten, vilket minskar matsmältningstiden. Liberase har också minimal lot-to-lot-variabilitet och har högre reproducerbarhet jämfört med andra enzymer. En annan anpassning av tidigare tekniker är en minskad mängd injicerad clearinglösning. Att minska mängden clearingbuffert för att komma in i hjärtat och tillåta mer blod att rensas genom perfusionsbuffert minskar inaktiveringen av matsmältningsenzymet av EDTA. En annan anledning till att vår metod konsekvent uppnår framgångsrika myocytisoleringar är genom användning av BDM. BDM är en myosinhämmare som förhindrar sarkomerens kraftslagsmekanism, vilket hämmar sammandragning och begränsar reoxygeneringsskada under matsmältningen. Genom att begränsa sammandragningen förhindrar vi kalciumcykling och inneboende reaktiv syreradikalproduktion i sammandragande myocyter i odling. Eftersom odlingsmediet innehåller kalcium är det möjligt att myocyterna kan dra ihop sig och minska efterföljande utbyte efter odling. Vi väljer att odla myocyterna i BDM för att förhindra sammandragning och öka utbytet25,26. BDM kan alltid tvättas ur myocyter för funktionella mätningar efter odling med stor framgång. Alternativt kan alla steg i denna procedur utföras utan tillsats av BDM, men isoleringar kan inte betraktas som "framgångsrika" på BDM-fria isolerade myocyter.
Förutom ischemisk tid finns det många andra faktorer som avgör om en isolering kommer att producera robusta myocyter. Eftersom det finns olika förhållanden i de enskilda laboratorierna kan de personer som utför isoleringen behöva ändra mängden enzym och / eller kalcium, perfusionstiden och / eller pumphastigheten och den gungande vattenbadhastigheten och / eller tiden. Dessa parametrar kommer att vara beroende av den använda musmodellen, såsom frisk eller sjuk, åldrande etc.
Även om denna teknik inte kräver den kirurgiska skicklighet som behövs för Langendorff-baserade tekniker, finns det fortfarande kritiska steg för att göra tekniken framgångsrik. Det vanligaste problemet som ger dåliga myocyter med denna teknik beror på att bubblor kommer in i perfusionssystemet och blockerar myokardvävnaden från åtkomst till perfusionsbufferten. Lösningen på detta problem är noggrann övning för att undvika bubblor (via korrekt sprutrensningsteknik, korrekt nålrensningsteknik, rapning av bubblornas grenrör vid byte av sprutor etc.), liksom flera utgångspunkter från perfusionssystemet om en bubbla fastnar i grenröret. Utan bubblor får vi enligt vår erfarenhet nära 100% framgångsrika myocytisoleringar (definierade som över 50% stavformade myocyter; genomsnittet är ~ 80%).
Medan metoden har förenklats genom att den kirurgiska skicklighet som krävs för Langendorff-metoden har tagits bort, har denna anpassade metod endast prövats på möss. En annan fördel med den Langendorff-fria metoden är att den kan användas för många murina modeller (dvs. från nyfödda till åldrande), som tidigare beskrivits19. Tyvärr kommer större däggdjur (t.ex. hundar, grisar, etc.) inte att vara lämpliga för denna teknik på grund av storleken på deras hjärtan. Det skulle vara omöjligt att perfusera hjärtat med tillräckligt med lösning för att förvärva tillförlitliga myocyter.
Vår anpassning av den Langendorff-fria metoden är en pålitlig metod för framgångsrik isolering av muskardiomyocyter. Jämfört med Langendorff-metoden kräver detta alternativa tillvägagångssätt liten teknisk skicklighet för att konsekvent erhålla kardiomyocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grants R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) och T32 HL134616 (Sturgill och Salyer).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cc Bd Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-827-52 | |
| 10 mL Pyrex Low-Form Beaker | Cole-Palmer | UX-34502-01 | |
| 100 mL polypropylene cap glass media storage bottle | DWK Life Sciences | UX-34523-00 | |
| 14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap | Fisher Sci | 14-959-11B | |
| 2,3-Butanedione Monoxime | Sigma | B0753 | >98% |
| 3 cc BD Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-823-435 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-20-C | |
| 50 mL BD Syringe without Needle | Fisher Sci | 13-689-8 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Cole-Palmer | EW-22999-84 | |
| 95% O2 5% CO2 | |||
| AIMS Space Gel Heating Pad | Fisher Sci | 14-370-223 | |
| BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles | Becton Dickinson | 305109 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3803 | Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98% |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C7902 | >99% |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | Suitable for cell culture, >99.5% |
| DMEM | Fisher Sci | 11965092 | |
| EDTA | Fisher Sci | AAA1071336 | |
| Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| FBS | R&D Systems (Bio-techne) | S11195 | |
| Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators | Fisher Sci | 13-874-432 | |
| Hartman Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 15921 | |
| Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set | Fisher Sci | 02-671-11 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | >99.5% |
| Labeling Tape | Fisher Sci | 15-901-10R | |
| Legato 100 Syringe Pump | kdScientific | 788100 | |
| L-glutathione | Fisher Sci | ICN19467980 | |
| Liberase TH Research Grade | Sigma | 5401135001 | High thermolysin concentration |
| M199 | Fisher Sci | MT10060CV | |
| Magnesium Chloride | Invitrogen | AM9530G | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | |
| Pen/Strep | Fisher Sci | ||
| Potassium Chloride | Sigma | P5405 | >99% |
| Precision Digital Reciprocating Water Bath | ThermoFisher Scientific | TSCIR19 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Suitable for cell culture |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | >99% |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | >99% |
| Sterile Cell Strainer 70 µm | Fisher Sci | 22-363-548 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| VWR Absorbent Underpads | Fisher Sci | NC9481815 |
References
- Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).
- Ziolo, M. T., et al. Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit a nitric oxide-mediated reduction in the calcium current. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (9), 1691-1699 (2001).
- Traynham, C. J., et al. Diesterified nitrone rescues nitroso-redox levels and increases myocyte contraction via increased SR Ca(2+) handling. PLoS One. 7 (12), 52005 (2012).
- Nixon, B. R., et al. Combined troponin I Ser-150 and Ser-23/24 phosphorylation sustains thin filament Ca(2+) sensitivity and accelerates deactivation in an acidic environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 177-185 (2014).
- Swager, S. A., et al. Claudin-5 levels are reduced from multiple cell types in human failing hearts and are associated with mislocalization of ephrin-B1. Cardiovascular Pathology. 24 (3), 160-167 (2015).
- Pinckard, K. M., et al. A novel endocrine role for the BAT-released lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function. Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).
- Roof, S. R., Shannon, T. R., Janssen, P. M., Ziolo, M. T. Effects of increased systolic Ca2+ and phospholamban phosphorylation during beta-adrenergic stimulation on Ca2+ transient kinetics in cardiac myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), 1570-1578 (2011).
- Harris, J. E., et al. Exercise-induced 3'-sialyllactose in breast milk is a critical mediator to improve metabolic health and cardiac function in mouse offspring. Nature Metabolism. 2 (8), 678-687 (2020).
- Roof, S. R., et al. CXL-1020, a novel nitroxyl (HNO) prodrug, is more effective than milrinone in models of diastolic dysfunction-a cardiovascular therapeutic: an efficacy and safety study in the rat. Frontiers in Physiology. 8, 894 (2017).
- Milani-Nejad, N. J. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Harary, I., Farley, B. In vitro studies of single isolated beating heart cells. Science. 131 (3414), 1674-1675 (1960).
- Kono, T. Roles of collagenases and other proteolytic enzymes in the dispersal of animal tissues. Biochimica Biophysica Acta. 178 (2), 397-400 (1969).
- Baker, J. B. An improved apparatus for mammalian heart perfusion. The Journal of Physiology. 115 (1), 30-32 (1951).
- Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 72 (1), 327-333 (1976).
- Motayagheni, N. Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia. MethodsX. 4, 508-512 (2017).
- Zhang, Z., et al. An improved procedure for isolating adult mouse cardiomyocytes for epicardial activation mapping. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (24), 11257-11263 (2021).
- Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), 0160605 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).
- Myachina, T. A., Butova, X. A., Khohlova, A. D. A modified Langendorff-free method for isolation of cadiomyocytes from adult rat heart. AIP Conference Proceedings. 2174 (1), 020140 (2019).
- Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice. Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).
- Omatsu-Kanbe, M., Fukunaga, R., Mi, X., Matsuura, H. An antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice. Journal of Visualized Experiments. (171), e61866 (2021).
- Bers, D. M., Patton, C. W., Nuccitelli, R. A practical guide to the preparation of Ca2+ buffers. Methods in Cell Biology. 99, 126 (1994).
- Grosso, D. S., Frangakis, C. J., Carlson, E. C., Bressler, R. Isolation and characterization of myocytes from the adult rat heart. Preparative Biochemistry. 7 (5), 383-401 (1977).
- Thum, J. B. Butadione Monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. American Journal of Physiology. 271 (3), 1250-1255 (1996).
