Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन के आत्म-संघों का पता लगाने और विशेषता बताने के लिए पैरामैग्नेटिक विश्राम वृद्धि

Published: September 23, 2021 doi: 10.3791/63057
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry and Structural Biology and Greehey Children’s Cancer Research Institute, The University of Texas Health Science Center at San Antonio

Summary

आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन में कमजोर और क्षणिक अंतर-और इंट्रा-आणविक इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए पैरामैग्नेटिक विश्राम वृद्धि एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के आवेदन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है।

Abstract

प्रोटीन के भीतर आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन और आंतरिक रूप से अव्यवस्थित क्षेत्र मानव प्रोटिओम का एक बड़ा और कार्यात्मक रूप से महत्वपूर्ण हिस्सा बनाते हैं। इन अनुक्रमों की अत्यधिक लचीली प्रकृति उन्हें विभिन्न बायोमोलेक्यूलर भागीदारों के साथ कमजोर, लंबी दूरी और क्षणिक बातचीत बनाने की अनुमति देती है। विशिष्ट लेकिन कम-आत्मीयता इंटरैक्शन नकली बंधन को बढ़ावा देते हैं और एक आंतरिक रूप से अव्यवस्थित खंड को लक्षित साइटों की भीड़ के साथ बातचीत करने में सक्षम बनाते हैं। इन इंटरैक्शन की क्षणिक प्रकृति के कारण, उन्हें संरचनात्मक जीव विज्ञान विधियों द्वारा चिह्नित करना मुश्किल हो सकता है जो एक एकल, प्रमुख रचना बनाने के लिए प्रोटीन पर निर्भर करते हैं। पैरामैग्नेटिक विश्राम वृद्धि एनएमआर कमजोर और क्षणिक इंटरैक्शन के संरचनात्मक आधार को पहचानने और परिभाषित करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है। आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन और उनके प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड, या अन्य बायोमोलेक्यूलर भागीदारों के बीच बनने वाले कम आबादी वाले मुठभेड़ परिसरों को चिह्नित करने के लिए पैरामैग्नेटिक विश्राम वृद्धि का उपयोग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है।

Introduction

आंतरिक विकार (आईडी) प्रोटीन (आईडीपी) या प्रोटीन (आईडीआर) के भीतर क्षेत्रों का वर्णन करता है जो सहज रूप से स्थिर माध्यमिक या तृतीयक संरचनाओं में मुड़ते नहीं हैं लेकिन जैविक रूप से सक्रिय होते हैं। आम तौर पर, आईडीपी / आईडीआर का कार्यशारीरिक स्थितियों में बायोमोलेक्यूल्स के साथ विशिष्ट अभी तक प्रतिवर्ती बातचीत की सुविधा प्रदान करना है। इस प्रकार, आईडीपी और आईडीआर सेलुलर कार्यों की एक श्रृंखला में शामिल हैं, जिसमें बहु-प्रोटीन परिसरों की भर्ती, संगठन और स्थिरीकरण शामिल हैं, उदाहरण के लिए, स्प्लिसोसोम2 की असेंबली और गतिविधि, डीएनए क्षति3 की साइटों पर घटकों की भर्ती और संगठन, प्रतिलेखन परिसरों 4 की भर्ती का संगठन और स्थिरीकरण, या क्रोमैटिन रिमॉडेलर बीएएफ5।. इसके अतिरिक्त, आईडीपी सिग्नलिंग नेक्सस में पाए जाते हैं जहां विभिन्न बाध्यकारी भागीदारों के लिए उनकी संकीर्णता उन्हें सेलुलर प्रोटीन नेटवर्क6 के माध्यम से सूचना हस्तांतरण में मध्यस्थता करने में सक्षम बनाती है। हाल के काम ने आईडीआर क्षेत्रों के लिए तरल-तरल चरण पृथक्करण की प्रक्रिया के माध्यम से बायोमोलेक्यूलर कंडेनसेट बनाने के लिए स्व-संबद्ध होनेकी प्रक्रिया का भी खुलासा किया है। आईडी से जुड़े उपरोक्त कार्यों में से कई को अब कंडेनसेट गठन8 के कुछ पहलू को शामिल करने के लिए भी माना जाता है। बायोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स असेंबली, स्थिरीकरण, मचान और सिग्नल ट्रांसडक्शन के लिए आईडी के महत्व के बावजूद, उनके विशिष्ट इंटरैक्शन के परमाणु विवरण की पहचान करना मुश्किल है क्योंकि आईडीपी और आईडीआर आमतौर पर एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी या क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके संरचनात्मक जांच के लिए उत्तरदायी नहीं हैं।

परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) आईडी की जांच के लिए एक आदर्श तकनीक है क्योंकि यह कठोर या समरूप संरचनात्मक पहनावा की उपस्थिति पर निर्भर नहीं है, लेकिन व्यक्तिगत नाभिक के तत्काल स्थानीय वातावरण पर रिपोर्ट करता है। किसी दिए गए अणु में नाभिक की अनुनाद आवृत्ति, या रासायनिक बदलाव, स्थानीय इलेक्ट्रॉनिक वितरण द्वारा प्रेरित कमजोर चुंबकीय क्षेत्रों से प्रभावित होता है, जो बदले में बंधन की लंबाई, कोण, अन्य नाभिकों की निकटता, बाध्यकारी भागीदारों के साथ बातचीत औरअन्य कारकों पर निर्भर होता है। इस प्रकार, प्रत्येक नाभिक अपने स्थानीय रासायनिक वातावरण में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील एक अद्वितीय, साइट-विशिष्ट संरचनात्मक जांच के रूप में कार्य करता है। इन फायदों के बावजूद, एनएमआर एक थोक तकनीक है, और देखा गया रासायनिक बदलाव एक विशेष नाभिक द्वारा नमूना किए गए सभी वातावरणों का औसत है। एनएमआर तकनीकों की एक श्रृंखला, जिनमें से कई इस अंक में वर्णित हैं, को औसत रासायनिक शिफ्ट10,11 में निहित उच्च ऊर्जा, कम आबादी वाले बायोमोलेक्यूलर अनुरूपता के बारे में संरचनात्मक, गतिशील और गतिज जानकारी को पुनर्प्राप्त करने के लिए विकसित किया गया है। यद्यपि क्षणिक रूप से आबादी है, इन राज्यों की पहचान और परिमाणीकरण कार्यात्मक तंत्र के विवरण को निर्धारित करनेके लिए महत्वपूर्ण हैं। उदाहरण के लिए, आईडीपी और आईडीआर के मामले में, विरूपण पहनावा अधिमानतः नमूना रचना के लिए पक्षपाती हो सकता है जो शारीरिक बाध्यकारी भागीदारों के साथ मुठभेड़ परिसरों के गठन के लिए उत्पादक हैं। इन अवस्थाओं का पता लगाना, साथ ही अवशेष-विशिष्ट अंतर-और अंतर-आणविक इंटरैक्शन और गतिशीलता की पहचान, प्रोटीन फ़ंक्शन और जटिल गठन के अंतर्निहित संरचनात्मक तंत्र को निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है।

आईडीपी/आईडीआर-मध्यस्थता वाले बायोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स के गठन के लिए महत्वपूर्ण क्षणिक, कम आबादी वाले राज्यों की जांच के लिए पैरामैग्नेटिक रिलैक्सेशन एन्हांसमेंट (प्री) एनएमआर का उपयोग करने के लिए एकप्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। यह दृष्टिकोण क्षणिक प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है जैसे कि जो α-सिन्यूक्लिन 14,15 से एमिलॉयड फाइब्रिल की असेंबली को बढ़ावा देते हैं या एफयूएस16 के स्व-संघ को बढ़ावा देते हैं, साथ ही विशिष्ट प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को चिह्नित करने के लिए जैसे कि सिग्नलिंग प्रोटीन17 के बीच। एक स्व-संबद्ध आईडीपी का एक उदाहरण प्रस्तुत किया गया है, जहां विशिष्ट अंतर-और इंट्रा-आणविक इंटरैक्शन के परिणामस्वरूप अधिमानतः कॉम्पैक्ट राज्यों के साथ-साथ साइट-विशिष्ट इंटरैक्शन होते हैं जो आत्म-संघ को चलाते हैं।

प्री एक नाभिक के चुंबकीय द्विध्रुवीय संपर्क से एक आइसोट्रोपिक जी-टेन्सर के साथ एक पैरामैग्नेटिक केंद्र तक उत्पन्न होता है, जिसे आमतौर पर नाइट्रोक्साइड समूह पर एक अप्रकाशित इलेक्ट्रॉन के रूप में या पैरामैग्नेटिक धातु परमाणु18 (चित्रा 1) के रूप में आपूर्ति की जाती है। जबकि अनिसोट्रोपिक जी-टेंसर वाले परमाणु भी एक प्री प्रभाव उत्पन्न करते हैं, इन प्रणालियों का विश्लेषण छद्म-संपर्क शिफ्ट (पीसीएस) या अवशिष्ट द्विध्रुवीय युग्मन (आरडीसी) 13,19 द्वारा योगदान किए गए भ्रामक प्रभावों के कारण अधिक कठिन है। एक नाभिक और पैरामैग्नेटिक केंद्र के बीच बातचीत की ताकत दोनों के बीच <आर -6> दूरी पर निर्भर है। इस बातचीत के परिणामस्वरूप परमाणु विश्राम दर में वृद्धि होती है, जो लंबी दूरी की बातचीत (~ 10-35 ए) के लिए भी पता लगाने योग्य रेखा को चौड़ा करने का कारण बनती है, क्योंकि अप्रकाशित इलेक्ट्रॉन का चुंबकीय क्षण इतना मजबूत20,21 है। प्री के साथ क्षणिक अवस्थाओं का पता लगाना संभव है यदि निम्नलिखित दो शर्तों को पूरा किया जाता है; (1) क्षणिक बातचीत एनएमआर टाइमस्केल पर तेजी से विनिमय में है (देखा गया रासायनिक बदलाव विनिमय राज्यों का जनसंख्या-भारित औसत है); और (2) प्रमुख अवस्था11 की तुलना में क्षणिक रूप से आबादी वाली अवस्था में नाभिक से पैरामैग्नेटिक केंद्र की दूरी कम होती है। अनुप्रस्थ प्री को 2 Γ निरूपित किया जाता है और, व्यावहारिक उद्देश्यों के लिए, एक पैरामैग्नेटिक सेंटर और एक डायमैग्नेटिक नियंत्रण वाले नमूने के बीच 1एच अनुप्रस्थ छूट दरों में अंतर से गणना की जाती है। प्री के सिद्धांत और तेज और धीमी विनिमय व्यवस्था ओं में संबंधित छद्म संपर्क बदलावों के गहन उपचार के लिए, पाठक को क्लोर और सहकर्मियों13,22 द्वारा व्यापक समीक्षाओं के लिए संदर्भित किया जाता है। यहां, केवल उस स्थिति पर विचार किया जाता है जहां 1एचएन -Γ2 तेजी से विनिमय शासन में है, जहां प्री की आर -6-निर्भरता के कारण, देखी गई विश्राम दर उस दूरी से संबंधित है जिस पर पैरामैग्नेटिक केंद्र नाभिक तक पहुंचता है और साथ ही उस रचना में कितना समय खर्च करता है। इसलिए, क्षणिक अनुरूपता जिसमें एक करीबी दृष्टिकोण शामिल नहीं होता है, एक छोटा प्री उत्पन्न करता है, जबकि करीबी बातचीत, भले ही अल्पकालिक हो, एक बड़ा प्री उत्पन्न करेगी।

आईडीपी के लिए, प्री का उपयोग एकल अणु (इंट्रामॉलिक्यूलर) और अलग-अलग अणुओं (इंटरमॉलिक्युलर) के बीच होने वाली बातचीत को मापने और अंतर करने के लिए किया जाता है। एक अनुचुम्बकीय केंद्र को एनएमआर दृश्यमान (जैसे, 15एन-लेबल) या एनएमआर अदृश्य (जैसे, प्राकृतिक बहुतायत 14एन) प्रोटीन से जोड़कर, प्री के स्रोत (अंतर-या अंतर-आणविक) को निर्धारित किया जा सकता है (चित्रा 2)। साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस जो सिस्टीन अवशेष का परिचय देता है, प्रोटीन23 में एक पैरामैग्नेटिक सेंटर (स्पिन-लेबल) को संलग्न करने का एक सुविधाजनक तरीका है। स्पिन लेबल के रूप में उपयोग के लिए कई प्रकार के अणुओं का प्रस्ताव किया गया है, जिसमें धातु चेलेटिंग (ईडीटीए-आधारित) और फ्री-रेडिकल (नाइट्रोक्साइड-आधारित) 24 शामिल हैं। विभिन्न नाइट्रोक्साइड स्पिन लेबल का वर्णन किया गया है और विभिन्न सिस्टीन-प्रतिक्रियाशील रसायनज्ञों जैसे कि मीथेनथियोसल्फोनेट, मैलिमाइड और आयोडोसिटामाइड25,26 (चित्रा 1) के साथ उपलब्ध हैं। टैग या लिंकर का अंतर्निहित लचीलापन कुछ विश्लेषणों के लिए समस्याग्रस्त हो सकता है, और इन स्थितियों में, टैग की गति को सीमित करने के लिए विभिन्न रणनीतियों का प्रस्ताव किया गया है, जैसे कि भारी रासायनिक समूहों को जोड़कर या टैग को प्रोटीन (दो साइट अटैचमेंट) में लंगर डालने के लिए दूसरे लिंकर का उपयोग करना। 28. इसके अतिरिक्त, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध टैग में डायस्टेरोमेरिक प्रोटीन हो सकते हैं लेकिन आम तौर पर यह देखे गए प्री29 में योगदान नहीं देगा। मैलिमाइड रसायन विज्ञान के माध्यम से एक मुक्त सिस्टीन से जुड़े 3-मालिमिडो-प्रॉक्सिल का उपयोग वर्णित है क्योंकि यह आसानी से उपलब्ध, लागत प्रभावी, गैर-प्रतिवर्ती है, और कम करने वाले एजेंट ट्रिस (2-कार्बोक्कथाइल) फॉस्फीन (टीसीईपी) को लेबलिंग प्रतिक्रिया के दौरान समाधान में बनाए रखा जा सकता है। चूंकि 3-मालिमिडो-प्रॉक्सिल में एक आइसोट्रोपिक जी-टेंसर होता है, इसलिए कोई पीसीएस या आरडीसी प्रेरित नहीं होते हैं, और पैरामैग्नेटिक और डायमैग्नेटिक नमूनेदोनों के लिए एक ही रासायनिक शिफ्ट असाइनमेंट का उपयोग किया जा सकता है।

1एचएन-टी 2 को दो समय-बिंदु रणनीति (टी ए, टीबी) का उपयोग करके मापा जाता है जिसे पहले 8 से 12 समय बिंदुओं30 से युक्त पूर्ण विकास श्रृंखला एकत्र करने के रूप में सटीक दिखाया गया है। पहली बार बिंदु (टी ए) को व्यावहारिक के रूप में शून्य के करीब सेट किया गया है, और दूसरे समय बिंदु की इष्टतम लंबाई किसी दिए गए नमूने के लिए सबसे बड़ी अपेक्षित प्री के परिमाण पर निर्भर है और इसका अनुमान लगाया जा सकता है: टीबी ~ 1.15 / (आर 2, डाय + Γ 2) जहां आर 2, डाय डायमैग्नेटिक नमूना13 के आर 2 का प्रतिनिधित्व करता है। यदि सबसे बड़े पीआरई का परिमाण अज्ञात है, तो प्रोटीन के 1एच टी 2 के टी बी को ~ एक गुना तक सेट करना एक अच्छा प्रारंभिक अनुमान है और सिग्नल को शोर में सुधार करने के लिए टी2 को समायोजित करके आगे अनुकूलित किया जाता है। यह दो-बिंदु माप रणनीति पीआरई को मापने के लिए आवश्यक प्रयोगात्मक समय को काफी कम कर देती है और अधिक सिग्नल औसत के लिए समय की अनुमति देती है, खासकर जब से अणुओं के बीच गैर-विशिष्ट संपर्कों के प्रभाव को कम करने के लिए अपेक्षाकृत पतला नमूने का उपयोग किया जाता है। एचएसक्यूसी-आधारित पल्स अनुक्रम का उपयोग 1एचएन-टी 2 को मापने के लिए किया जाता है और इसे कहीं और विस्तार से वर्णित किया गयाहै। बेहतर संवेदनशीलता के लिए, आगे और पीछे के अयोग्य हस्तांतरण की कठोर दालों को आकार की दालों के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है; वैकल्पिक रूप से, अनुक्रम आसानी से ट्रॉसी-आधारित रीडआउट31 में परिवर्तित हो जाता है। चूंकि आईडीपी में आमतौर पर समान आकार के गोलाकार प्रोटीन की तुलना में संकीर्ण रेखा चौड़ाई (अंतर्निहित विकार के कारण) के परिणामस्वरूप बहुत लंबी अनुप्रस्थ छूट दर होती है, अप्रत्यक्ष आयाम में लंबे अधिग्रहण समय का उपयोग वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन में सुधार और आईडीपी के लिए निहित रासायनिक बदलाव फैलाव सीमा को कम करने के लिए किया जा सकता है।

प्री प्रोटीन-प्रोटीन और प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है, विशेष रूप से बातचीत जो क्षणिक या कम आबादी वाले हैं। पीआरई को मापने के लिए उपयुक्त एनएमआर नमूने की तैयारी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है, जिसमें प्रोटीन शुद्धिकरण, साइट-निर्देशित स्पिन लेबलिंग, पल्स प्रोग्राम को स्थापित और कैलिब्रेट करना, एनएमआर डेटा को संसाधित करना और व्याख्या करना शामिल है। महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक विचारों पर ध्यान दिया जाता है जो डेटा की गुणवत्ता और प्रयोगात्मक परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं, जिसमें नमूना एकाग्रता, स्पिन-लेबल का चयन और पैरामैग्नेटिक घटकों को हटाना शामिल है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

प्रोटोकॉल के लिए सामान्य आवश्यकताएं: प्रोटीन शोधन सुविधाएं, यूवी-विस स्पेक्ट्रोमीटर, उच्च क्षेत्र एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर और ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर, पोस्ट-प्रोसेसिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर सहित; NMRPip32, Sparky 33, (या CCPN विश्लेषण 34, या NMRViewJ35)।

1. प्री माप के लिए प्रोटीन की पुनः संयोजक अभिव्यक्ति और शुद्धि।

  1. रुचि के प्रोटीन के लिए एक अभिव्यक्ति निर्माण डिजाइन करें ताकि एक एकल सिस्टीन अवशेष मौजूद हो। प्रोटीन ऑफ इंटरेस्ट36 में विभिन्न पदों पर एक मुक्त सिस्टीन पेश करने के लिए कई उत्परिवर्तन ों की आवश्यकता होगी।
  2. एक स्थापित प्रोटोकॉल37 का उपयोग करके रुचि के प्रोटीन के प्राकृतिक बहुतायत (14एन) या 15एन-लेबल नमूने को व्यक्त और शुद्ध करें।
    कोलाई अभिव्यक्ति प्रणाली पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए लागत प्रभावी और मजबूत विधि प्रदान करती है क्योंकि 15एन का समस्थानिक संवर्धन बायोमोलेक्यूलर हेटरोन्यूक्लियर एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए न्यूनतम आवश्यकता है। विशिष्ट कदम न्यूनतम मीडिया, क्रोमैटोग्राफिक शुद्धिकरण और आत्मीयता शुद्धि टैग को हटाने में अभिव्यक्ति हैं। यह प्रोटोकॉल मानता है कि एक मजबूत अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण प्रोटोकॉल स्थापित किया गया है जो एनएमआर जांच के लिए उपयुक्त गुणवत्ता के पर्याप्त प्रोटीन का उत्पादन कर सकता है।
    1. मुक्त सिस्टीन की प्रतिक्रिया और आईडीपी के लिए इंटरमॉलिक्युलर डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड के गठन को रोकने के लिए सभी शुद्धिकरण चरणों में बफर में 1 एमएम रिड्यूसिंग एजेंट (डीटीटी या टीसीईपी) बनाए रखें।
      नोट: कुछ प्रणालियां प्रोटीन की विशिष्ट विशेषताओं के साथ-साथ शुद्धिकरणके लिए चुने गए तापमान, पीएच और बफर सिस्टम के आधार पर गैर-कम करने वाली स्थितियों के लिए अधिक सहिष्णु और कम एकत्रीकरण प्रवण हो सकती हैं।
    2. आगे बढ़ने से पहले शुद्धिकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले आत्मीयता टैग को हटा दें क्योंकि वे अप्रत्याशित तरीकों से प्रोटीन के साथ गैर-विशेष रूप से बातचीत कर सकते हैं या संभवतः प्रतिक्रियाशील सिस्टीन अवशेष हो सकते हैं जो अनजाने में एक अनपेक्षित अनुलग्नक साइट के रूप में काम कर सकते हैं।
    3. विलायक पीआरई के योगदान का आकलन करने के लिए स्पिन-लेबल के घुलनशील संस्करण के साथ मिश्रित सिस्टीन उत्परिवर्तन (ओं) के बिना 15एन लेबल संदर्भ नमूना तैयार करें।

2. 3-मालिमिडो-प्रॉक्सिल नाइट्रोक्साइड स्पिन लेबल का संयुग्मन

  1. शुद्ध प्रोटीन को 50 mM Tris pH 7 और 1 mM TCEP युक्त डिगैस्ड बफर में स्टोर या एक्सचेंज करें; प्रोटीन घुलनशीलता में सहायता के लिए आवश्यक होने पर बफर में 8 एम यूरिया भी हो सकता है।
    वैकल्पिक रूप से, तेजी से एक प्रोटीन स्टॉक समाधान को डिगैस्ड 50 एमएम ट्रिस पीएच 7 और 1 एमएम टीसीईपी बफर के कम से कम 10 वॉल्यूम समकक्षों में पतला करें। सुनिश्चित करें कि स्पिन-लेबल जोड़ने से पहले प्रोटीन एकाग्रता कम से कम 100 μM है।
  2. एक स्टॉक घोल से 3-मालेमिडो प्रॉक्सिल को ब्याज के प्रोटीन से 20 गुना अधिक दाढ़ में जोड़ें। नमूने को प्रकाश और ऑक्सीजन से बचाएं और कमरे के तापमान या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें; कोमल रॉकिंग या न्यूट्रेशन लेबलिंग दक्षता में सुधार कर सकता है।
  3. 95% इथेनॉल में 3-मालेमिडो प्रॉक्सिल पाउडर को घोलकर स्पिन-लेबल के स्टॉक समाधान तैयार करें। स्टॉक के एलिकोट को 6 महीने से कम समय के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. महत्वपूर्ण कदम: गैर-विशिष्ट विलायक पीआरई को रोकने के लिए गैर-प्रतिक्रियाशील मुक्त स्पिन-लेबल को हटा दें। जेल निस्पंदन या (अधिमानतः) प्रोटीन नमूने के व्यापक डायलिसिस द्वारा इसे प्राप्त करें। यह कदम एनएमआर के लिए उपयुक्त बफर में प्रोटीन को भी पेश करेगा।
    नोट: एजेंटों को कम करने के लिए नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए, और बफर घटकों के बीच संगतता पर विचार किया जाना चाहिए; उदाहरण के लिए, टीसीईपी फॉस्फेट-आधारित बफर में जल्दी से खराब हो जाता है, और इस संयोजन से बचा जानाचाहिए।
  5. पैरामैग्नेटिक आयनों या स्पिन-लेबल बुझाने वालों को हटाने के लिए द्विसंयोजक और संक्रमण धातुओं के लिए एक चेलेटिंग राल चयनात्मक के साथ इस चरण से आगे उपयोग किए जाने वाले सभी बफर का इलाज करें। यदि प्रोटीन को एनएमआर बफर में संग्रहीत नहीं किया जा सकता है, तो एनएमआर के लिए उपयुक्त बफर में प्रोटीन को तेजी से पतला करने के लिए केंद्रित करें।
  6. स्पिन-लेबल निगमन की दक्षता की निगरानी।
    1. समाधान40 में मुक्त सल्फहाइड्रील समूहों को निर्धारित करने के लिए एलमैन के अभिकर्मक (5,5-डिथियो-बिस-(2-नाइट्रोबेंजोइक एसिड) का उपयोग करें।
      नोट: विस्तृत प्रोटोकॉल निर्माता से उपलब्ध हैं। यहां उद्देश्यों के लिए, स्पिन-लेबल के समावेश को निर्धारित करना महत्वपूर्ण है, मुक्त सल्फहाइड्रील समूहों की एकाग्रता की तुलना कुल प्रोटीन एकाग्रता से की जाती है। मुक्त सल्फहाइड्रील समूहों का प्रतिशत अणुओं का प्रतिशत है जिनके पास नाइट्रोक्साइड स्पिन लेबल संलग्न नहीं है।
    2. रुचि के प्रोटीन में स्पिन-लेबल निगमन का न्याय करने के लिए टैग किए गए सिस्टीन अवशेषों के अनुरूप चोटी की तीव्रता की निगरानी करें।
      नोट: यह प्रोटीन के स्पिन लेबलिंग की डिग्री निर्धारित करने के लिए एक तेज़ और प्रभावी दृष्टिकोण है। स्पिन-लेबल के पूर्ण समावेश के परिणामस्वरूप स्पेक्ट्रम से चोटी गायब हो जाएगी। आईडीपी की खराब फैलाव विशेषता के साथ उत्परिवर्ती सिस्टीन अवशेषों के अनुरूप शिखर को हमेशा आसानी से पहचाना नहीं जा सकता है, और इस प्रकार एलमैन के अभिकर्मक (चरण 2.6.1) के उपयोग की सिफारिश की जाती है।

3. इंट्रा- या इंटर-आणविक प्री को मापने के लिए एनएमआर नमूना तैयार करें

  1. इंट्रामोलेक्यूलर प्री के माप के लिए नमूना तैयार करें
    1. 15एन समस्थानिक रूप से समृद्ध, स्पिन-लेबल प्रोटीन को कम से कम 100 μM की एकाग्रता के लिए तैयार करें, लेकिन एनएमआर के लिए उपयुक्त बफर में 300 μM से अधिक नहीं। कुल नमूना मात्रा (डी2ओ सहित) 500 - 550 μL है।
      नोट: सामान्य एनएमआर बफर में फॉस्फेट, एसीटेट, (बाई) कार्बोनेट और टीआरआईएस शामिल हैं। गुड के बफर जैसे एमईएस, एचईपीईएस भी उपयुक्त हो सकते हैं। अन्य समाधान घटकों के साथ कोई क्रॉस-रिएक्टिविटी सुनिश्चित करने के लिए बफर का चयन करते समय सावधानी बरतें।
    2. सुनिश्चित करें कि पानी के साथ एमाइड प्रोटॉन विनिमय के प्रभाव को कम करने के लिए पीएच ~ 7.2 या उससे कम है। नमक की एकाग्रता को यथासंभव कम रखें (आमतौर पर 150 एमएम से कम), हालांकि प्राथमिक विचार प्रोटीन स्थिरता बनाए रखना है।
      नोट: उच्च नमक की स्थिति में एनएमआर प्रयोगों के संचालन के लिए दृष्टिकोण कहीं और वर्णित किया गयाहै।
  2. इंटरमॉलिक्युलर प्री के माप के लिए नमूना तैयार करें
    1. इस चरण या चरण 3.1 का पालन करें; वे एक साथ नहीं किए जाते हैं। चुने हुए एनएमआर बफर में 14एन प्राकृतिक बहुतायत, स्पिन-लेबल प्रोटीन तैयार करें।
    2. 15एन आइसोटोपिक रूप से समृद्ध गैर-स्पिन-लेबल प्रोटीन को 1% -50% 14एन प्राकृतिक बहुतायत स्पिन-लेबल प्रोटीन के साथ मिलाकर प्रोटीन का नमूना तैयार करें ताकि अंतिम एकाग्रता 3.1.1 में तैयार किए गए नमूने के समान हो। कुल नमूना मात्रा (डी2ओ सहित) 500 - 550 μL है।
    3. अध्ययन किए गए प्रत्येक प्रोटीन के लिए 15एन और 14एन प्रोटीन के अनुपात को अनुभवपूर्वक अनुकूलित करें। 14एन-स्पिन-लेबल प्रोटीन के 1%, 5%, और 20% के अनुपात अच्छे शुरुआती बिंदु हैं।
      नोट: अतिरिक्त 14एन-स्पिन-लेबल प्रोटीन के कार्य के रूप में प्री का बिल्डअप एक विशिष्ट प्रभाव इंगित करता है; देखा गया प्री नमूना-विशिष्ट है क्योंकि यह दूरी और जनसंख्या (जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है) पर निर्भर करता है, और इसलिए 14एन-स्पिन-लेबल प्रोटीन के उच्च अनुपात की आवश्यकता होगी यदि बातचीत विशेष रूप से क्षणिक17 है।
  3. एनएमआर (या तो इंट्रा- या इंटर-मॉलिक्यूलर) नमूने को 5 मिमी एनएमआर ट्यूब में स्थानांतरित करें जो लंबे स्टेम (9") ग्लास पिपेट या माइक्रोपिपेट का उपयोग करके उच्च-क्षेत्र मैग्नेट में उपयोग के लिए उपयुक्त है। सुनिश्चित करें कि सभी एनएमआर नमूनों में फील्ड लॉकिंग की सुविधा के लिए डी2ओ का 5% -10% शामिल है।
    नोट: एनएमआर ट्यूब जो आवश्यक नमूना मात्रा को कम करने के लिए बहुलक प्लग का उपयोग करते हैं, प्रभावी नमूना शिमिंग से संबंधित कठिनाइयों के कारण प्री माप के लिए अनुशंसित नहीं हैं।

4. एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर स्थापित करें और विशिष्ट मापदंडों का प्रयोग करें

  1. सुपरकंडक्टिंग, हाई-फील्ड एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर के आसपास काम करते समय अत्यधिक सावधानी बरतें।
    नोट: चुंबक की ओर धातु की वस्तुओं के अचानक त्वरण के कारण चोटें, प्रत्यारोपित चिकित्सा उपकरणों के साथ हस्तक्षेप, और चुंबक बुझाने की स्थिति में एन 2 और हे2 गैस की अचानक रिहाई के कारण श्वासावरोध शामिल है। निम्नलिखित कदम मानते हैं कि पाठक आवश्यक प्रशिक्षण से गुजर चुका है, इन और अन्य स्थानीय खतरों से अवगत है, और एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर संचालित करने के लिए सुविधा प्रबंधक से अनुमोदन प्राप्त किया है। जब किसी कदम या निर्देश के संदेह में हो, तो स्पेक्ट्रोमीटर को संभावित व्यक्तिगत चोट या क्षति को रोकने के लिए सुविधा प्रबंधक या अनुभवी उपयोगकर्ता से परामर्श करें।
  2. निम्नलिखित चरण अधिग्रहण नियंत्रण सॉफ्टवेयर के आधुनिक संस्करण को चलाने वाले एक वाणिज्यिक एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर को मानते हैं। पल्स प्रोग्राम और पैरामीटर फ़ाइलों को डाउनलोड करें और उन्हें उपयुक्त निर्देशिकाओं में रखें।
    नोट: एक पल्स प्रोग्राम और पैरामीटर सेट जो ब्रुकर स्पेक्ट्रोमीटर और टॉपस्पिन (3.2 या बाद में) के साथ उपयोग के लिए उपयुक्त है, लेखकों के अनुरोध पर उपलब्ध हैं।
    1. महत्वपूर्ण कदम: गैर-देशी एनएमआर पल्स प्रोग्राम स्थापित करने के साथ परिचित माना जाता है; यदि आवश्यक हो तो सुविधा प्रबंधक या एक अनुभवी उपयोगकर्ता से परामर्श करें।
  3. चुंबक में नमूना रखें, लॉक कमांड का उपयोग करके 2एच सिग्नल पर लॉक करें, सुविधा प्रोटोकॉल के अनुसार 1एच चैनल को ट्यून और मिलान करें (सटीक प्रक्रिया इस बात पर निर्भर करेगी कि जांच रिमोट ट्यून और मैच मॉड्यूल से लैस है या नहीं)।
  4. विलायक सिग्नल दमन को अनुकूलित करने के लिए टॉपशिम सबरूटीन का उपयोग करके शिम्स को समायोजित करें।
  5. मानक विधियों का उपयोग करके 1एच और 15एन 90 ° दालों को कैलिब्रेट करें।
    1. पॉप्ट प्रोग्राम का उपयोग करके 1एच पल्स को कैलिब्रेट करें (पल्स लंबाई का अनुमान लगाने के लिए पहले पल्सेकल का उपयोग करें)।
    2. एक मानक नमूने के खिलाफ 15एन पल्स को कैलिब्रेट करें; सुनिश्चित करें कि यह मान हाल ही में तकनीकी निदेशक या अनुभवी उपयोगकर्ता के साथ चर्चा करके कैलिब्रेट किया गया है।
    3. वैकल्पिक रूप से, एक एचएमक्यूसी प्रयोग के 90 डिग्री दालों में से एक को बदलकर नमूने पर 15एन पल्स को कैलिब्रेट करें जब तक कि शून्य संकेत प्राप्त न हो जाए।
    4. आकार उपकरण (एसटीडीपी) सबरूटीन का उपयोग करके आकार की दालों के लिए सही क्षीणन निर्धारित करें।
    5. फ़ोल्डर आइकन पर क्लिक करके उपयुक्त पल्स आकार फ़ाइल खोलें। आकार की दालें एसीक्यूपर्स के पल्स पैरामीटर सेक्शन में पाई जाती हैं।
    6. पल्स परिभाषा फ़ाइल लोड करें और आकार का विश्लेषण करें > तरंग का विश्लेषण करें पर क्लिक करें। कैलिब्रेटेड 1एच 90 डिग्री हार्ड पल्स, वांछित आकार की पल्स लंबाई, और रोटेशन (90 डिग्री या 180 डिग्री) इनपुट करें।
    7. कैलिब्रेटेड 90 ° पल्स के लिए क्षीणन में शक्ति स्तर के परिवर्तन को जोड़कर आकार की पल्स के शक्ति स्तर की गणना करें।
  6. स्वीप चौड़ाई, वाहक आवृत्ति को अनुकूलित करने और पानी के दमनकी जांच करने के लिए एक मानक 1एच, 15एन एचएसक्यूसी (एचएसक्यूसीटीएफपीएफ 3जीपीएसआई) रिकॉर्ड करें।
  7. स्वीप चौड़ाई और अप्रत्यक्ष आयाम वृद्धि की संख्या को sw और td आदेशों का उपयोग करके या सीधे उपयुक्त संवाद बॉक्स में समायोजित करें। आमतौर पर, पीआरई एकत्र करने के लिए, वर्णक्रमीय चौड़ाई को चुना जाता है ताकि स्पेक्ट्रम मोड़ा न जाए।

5. 1एच एन-टी2 प्रयोग सेट करें

  1. ऊपर वर्णित आकार की दालों को कैलिब्रेट करें (4.4.5-4.5.7)। प्री प्रयोग के लिए आकार की पल्स पैरामीटर फाइलें Eburp2.1000 (90° पल्स), Reburp.1000 और Iburp2.1000 हैं। ACQUPARS टैब पर पल्स पैरामीटर अनुभाग में कैलिब्रेटेड पल्स लंबाई दर्ज करें।
  2. यह प्रयोग दो समय-विलंब बिंदु दृष्टिकोण30 का उपयोग करके 1एचएन-टी 2 को मापता है।
    1. vdlist फ़ाइल को संपादित करके समय देरी सेट करें, पहली देरी (Ta) 0.01 ms पर सेट है।
    2. अपेक्षित अधिकतम प्री (T b ~ 1.15/(R 2, dia + Γ 2) के संबंध का उपयोग करके दूसरी देरी चुनें, (T b) जहां R 2, dia डायमैग्नेटिक नमूना13 के R 2 का प्रतिनिधित्व करता है। देखे गए विश्राम में पूर्व योगदान के परिमाण के पूर्व ज्ञान के बिना, एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु टी बी को ~ 1 x 1एच टी2 पर सेट करना है।
    3. फिर टी ए और टी बी स्पेक्ट्रा की पहली वेतन वृद्धि (ईएफपी कमांड के साथ संसाधित) की तुलना करके और टी बी को समायोजित करके एक उपयुक्त मूल्य निर्धारित करें ताकि सिग्नल अपने प्रारंभिक मूल्य के 40% -50% के बीच क्षय हो जाए।
      नोट: यह दृष्टिकोण वर्णक्रमीय सिग्नल-टू-शोर को अनुकूलित करता है, उन नमूनों के लिए एक आवश्यक विचार जो अत्यधिक केंद्रित नहीं हो सकते हैं (< 50 μM)। टीबी के उपयुक्त मान नमूना निर्भर हैं लेकिन आमतौर पर औसत आकार के प्रोटीन के लिए 8 - 40 एमएस से होते हैं।
  3. रिकॉर्ड करने के लिए जटिल बिंदुओं की संख्या और पर्याप्त सिग्नल औसत के लिए स्कैन की संख्या निर्धारित करें। चूंकि आईडीपी में तुलनीय आकार के मुड़े हुए प्रोटीन की तुलना में 15एन टी2 लंबा होता है, इसलिए अप्रत्यक्ष आयाम में लंबे अधिग्रहण समय का उपयोग किया जा सकता है।
    नोट: यह मान प्रोटीन की विशिष्ट विशेषताओं पर निर्भर है, लेकिन मोटे तौर पर 15एन टी2 से अनुमान लगाया जा सकता है और एफआईडी में सिग्नल क्षय की निगरानी द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है। प्रत्यक्ष आयाम के लिए, 1024 * जटिल बिंदु (13 पीपीएम स्वीप चौड़ाई, 112.6 एमएस अधिग्रहण समय) अधिकांश नमूनों के लिए पर्याप्त है।
  4. प्रयोग समय की गणना करने के लिए कमांड एक्सपैट का उपयोग करें, और उसके बाद कमांड जेडजी के साथ प्रयोग शुरू करें।

6. एस्कॉर्बिक एसिड के साथ स्पिन-लेबल को कम करके एक डायमैग्नेटिक नमूना बनाएं

  1. एनएमआर बफर में सोडियम एस्कॉर्बेट को घोलें और मूल एनएमआर बफर से मेल खाने के लिए पीएच को समायोजित करें।
  2. सोडियम एस्कॉर्बेट स्टॉक की एकाग्रता की गणना करें ताकि स्पिन-लेबल की एकाग्रता पर एस्कॉर्बेट की 10x दाढ़ की अधिकता को नमूना मात्रा के कम से कम परिवर्तन के साथ जोड़ा जा सके। उदाहरण के लिए, 100 μM प्रोटीन नमूने के लिए, एस्कॉर्बेट का 100 mM स्टॉक उपयुक्त है। स्पिन-लेबल को कम करने के लिए एस्कॉर्बिक एसिड स्टॉक समाधान के 5.5 μL को जोड़ने की आवश्यकता होगी, जो कुल नमूना मात्रा का केवल 1% है।
  3. ट्यूब के रिम के नीचे एक बूंद रखकर एनएमआर ट्यूब में एस्कॉर्बिक एसिड की आवश्यक मात्रा जोड़ें, ट्यूब को कैप करें, मिश्रण करने के लिए ट्यूब को सावधानीपूर्वक घुमाएं, और फिर ट्यूब के निचले हिस्से में नमूने को व्यवस्थित करने के लिए 10-20 सेकंड के लिए 200-400 एक्स जी पर घुमाएं।
  4. प्रकाश से बचाने के लिए एनएमआर ट्यूब को पन्नी में लपेटें और प्रतिक्रिया को कम से कम 3 घंटे तक आगे बढ़ने दें।
  5. पैरामैग्नेटिक नमूने के लिए उपयोग किए जाने वाले समान मापदंडों का उपयोग करके डायमैग्नेटिक नमूने पर 1एचएन-टी 2 रिकॉर्ड करें।
  6. दालों को रीकैलिब्रेट करें। हालांकि, उन्हें पैरामैग्नेटिक माप से नहीं बदलना चाहिए था; यदि वे काफी भिन्न हैं (> 0.5 μs अंतर), नमूना गुणवत्ता (जैसे, गिरावट, वर्षा) पर विचार करें।
  7. सुनिश्चित करें कि निर्दिष्ट छूट देरी (वीडीलिस्ट), डमी स्कैन की संख्या, एकत्र किए गए स्कैन की संख्या, एकत्र किए गए जटिल बिंदुओं की संख्या, अधिग्रहण समय, स्वीप चौड़ाई और वाहक आवृत्तियों सहित सभी अधिग्रहण पैरामीटर डायमैग्नेटिक और पैरामैग्नेटिक नमूनों के लिए समान रहें।

7. पैरामैग्नेटिक और डायमैग्नेटिक स्पेक्ट्रा की प्रक्रिया

  1. डेटा की प्रतिलिपि स्थानीय कंप्यूटर या कार्यस्थान पर बनाएँ जिसमें NMRPip और Sparky स्थापित और कॉन्फ़िगर किया गया है. प्रयोग डेटा निर्देशिका में प्रोक नाम का फ़ोल्डर बनाएँ जिसमें सेर फ़ाइल है.
  2. NMRPip स्क्रिप्ट fid.com, p3d.com, और nmrproc.com को proc में कॉपी करें (लेखकों के अनुरोध पर प्रोसेसिंग स्क्रिप्ट उपलब्ध हैं)।
    1. Bruker डेटा स्वरूप (ser) को NMRPip स्वरूप में कनवर्ट करने के लिए fid.com स्क्रिप्ट का उपयोग करें।
    2. स्यूडो3 डी विमानों को अलग-अलग स्पेक्ट्रा में विभाजित करने के लिए p3D.com स्क्रिप्ट का उपयोग करें।
    3. fid.com स्क्रिप्ट के आउटपुट को पढ़ने के लिए nmrproc.com स्क्रिप्ट का उपयोग करें, विलायक दमन लागू करें, विंडो फ़ंक्शन, कच्चे डेटा (शून्य भरने) में शून्य जोड़ें, चरण सुधार लागू करें, फूरियर परिवर्तन निष्पादित करें, प्रदर्शन के लिए डेटा को ट्रिम करें और संसाधित डेटा को डिस्क पर लिखें। स्क्रिप्ट दर्ज की गई प्रत्येक छूट देरी (टी ए और टीबी) के लिए एक फ़ाइल का उत्पादन करेगी।
      नोट: इनमें से प्रत्येक स्क्रिप्ट प्रत्येक प्रयोग के विशिष्ट विवरण के लिए प्रसंस्करण को अनुकूलित करने के लिए अनुकूलन योग्य है। एनएमआरपाइप वेबसाइट32 से उपलब्ध एनएमआरपाइप वितरण में ट्यूटोरियल और उदाहरण डेटा सेट शामिल हैं। एनएमआरड्रा का उपयोग प्रसंस्करण के दौरान वर्णक्रमीय देखने के लिए किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, उचित चरण कोण आदि सेट करना)। NMRPip कमांड के लिए उपलब्ध विकल्पों को कमांड nmrPip-help का उपयोग करके देखा जा सकता है।

8. अनुनाद असाइनमेंट स्थानांतरित करें और शिखर ऊंचाइयों को निकालें।

  1. कमांड सेथडर [फ़ाइल नाम] -एनडीआईएम 2 का उपयोग करके प्रत्येक स्पेक्ट्रम फ़ाइल (टी ए, टीबी पैरामैग्नेटिक और डायमैग्नेटिक नमूने दोनों के लिए) के लिए फ़ाइल हेडर जानकारी बदलें।
  2. चरण 8.3-8.5 के बाद चोटीकी ऊंचाइयों को निकालने के लिए स्पार्की का उपयोग करें। NMRPip (NMRDraw) 32, CCPN विश्लेषण 34, और NMRViewJ35 सहित अन्य सॉफ्टवेयर पैकेज भी उपयुक्त हैं।
  3. स्पार्की में वर्णक्रमीय फ़ाइलों को पढ़ें। इस चरण में डेटा सेट में प्रोटीन में स्पिन-लेबल की प्रत्येक स्थिति के लिए मापा जाने वाला पैरामैग्नेटिक और डायमैग्नेटिक नमूने दोनों के लिए प्रत्येक समय बिंदु स्पेक्ट्रा (टी ए, टीबी) के लिए एक स्पेक्ट्रम शामिल होगा।
  4. चोटियों को चुनने के लिए स्पार्की का उपयोग करें (कमांड: एफ 8, फिर क्लिक करें और खींचें) और संदर्भ पीकलिस्ट से ट्रांसफर पीक सूची टूल का उपयोग करके असाइनमेंट स्थानांतरित करें।
    नोट: देखे गए पीआरई36 की अनुक्रम-विशिष्ट व्याख्या के लिए रुचि के प्रोटीन के अनुनाद असाइनमेंट आवश्यक हैं।
    1. पैरामैग्नेटिक और डायमैग्नेटिक स्पेक्ट्रा दोनों में आकृति को एक ही स्तर पर सेट करें। आकृति निर्धारित करना सुनिश्चित करें ताकि समय की देरी के बाद एकत्र किए गए स्पेक्ट्रा जानबूझकर चोटियों को बाहर न करें, लेकिन पर्याप्त उच्च हों ताकि टीए स्पेक्ट्रा अत्यधिक शोर न करें।
  5. प्रत्येक स्पेक्ट्रम के लिए नई पीक सूचियों को सहेजें और मापा पीक तीव्रता और स्पार्की परिकलित सिग्नल टू शोर अनुपात शामिल करें (कमांड: एलटी टू ओपन पीकलिस्ट, तीव्रता और एसएनआर कॉलम शामिल करने के लिए विकल्प पर क्लिक करें, कमांड: सहेजें)।

9. प्रत्येक अवशेष के लिए 1एचएन-टी 2 दरों को निकालें और प्री की गणना करें।

  1. पीक सूचियों को स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर या पायथन जैसी पसंदीदा प्रोग्रामिंग भाषा में आयात करें।
    नोट: प्रोटीन पर प्रत्येक स्पिन-लेबल स्थिति के लिए, डेटासेट में संबंधित चरम तीव्रता के साथ चार शिखर सूचियां शामिल होंगी, पैरामैग्नेटिक और डायमैग्नेटिक प्रयोगों दोनों के लिए टी ए और टीबी में से एक।
  2. समीकरण का उपयोग करके पैरामैग्नेटिक और डायमैग्नेटिक दोनों नमूनों के लिए 1एचएन आर2 की गणना करें:
    Equation 1
    Equation 2
  3. पैरामैग्नेटिक और डायमैग्नेटिक नमूनों के लिए प्रत्येक अवशेष के लिए छूट दर निर्धारित करने के लिए उपरोक्त समीकरण का उपयोग करें।
  4. समीकरण का उपयोग करके प्रत्येक अवशेष के लिए 1एचएन -Γ2 दर निर्धारित करें:
    Equation 3
  5. प्रत्येक अवशेष के लिए चरम ऊंचाई की अनिश्चितता की गणना करने के लिए स्पार्की परिकलित सिग्नल टू शोर अनुपात (एसएनआर) का उपयोग करें।
  6. समीकरण का उपयोग करके त्रुटि का प्रचार करें:
    Equation 4
  7. प्लॉट 1एचएन -Γ2 9.6 में गणना की गई त्रुटि सहित स्कैटर प्लॉट का उपयोग करके अवशेष संख्या के एक फ़ंक्शन के रूप में।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इंट्रामोलेक्यूलर 1 एचएन -Γ2 पीआरई को आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन ईडब्ल्यूएसआर 142 (चित्रा 3) के कम-जटिलता डोमेन से प्राप्त एक स्व-संबद्ध, आंतरिक रूप से अव्यवस्थित टुकड़े (अवशेष 171-264) पर दर्ज किया गया था। स्पिन-लेबल अनुलग्नक बिंदु (उदाहरण के लिए, चित्र 3 में अवशेष 178 या 260) के निकट अनुक्रमिक निकटता में अवशेषों को काफी व्यापक होने की उम्मीद है और स्पेक्ट्रम में पता लगाने योग्य नहीं हैं। अनुलग्नक बिंदु से क्रमिक रूप से रखे गए अवशेष अभी तक बढ़े हुए Γ2 को स्पिन-लेबल के स्थानिक रूप से करीब (10-35 ए) दिखाया गया था। ईडब्ल्यूएसआर 1 171-264 के मामले में, प्री प्रभाव के स्रोत को जिम्मेदार ठहराना जटिल है क्योंकि यह अंतर-और अंतर-अवशेष संपर्कों के संयोजन से उत्पन्न हो सकता है और नाभिक से पैरामैग्नेटिक केंद्र तक की दूरी, उस रचना की आबादी और इलेक्ट्रॉन और परमाणु स्पिन को जोड़ने वाले वेक्टर की गतिशीलता पर निर्भर है। इसके अलावा, इंट्रामोलेक्यूलर संपर्कों से उत्पन्न होने वाले पीआरई का परिमाण एकाग्रता-निर्भर नहीं है, जबकि इंटरमॉलिक्युलर संपर्कों से उत्पन्न होने वाले पीआरई एकाग्रता के साथ-साथ प्रोटीन अणुओं के बीच संबंध के कैनेटीक्स और गतिशीलता पर निर्भर करते हैं।

इन आंकड़ों की एक संभावित व्याख्या यह है कि आईडीपी नमूने के अनुरूपण हैं जो एक विस्तारित श्रृंखला की तुलना में अधिक कॉम्पैक्ट हैं। वैकल्पिक रूप से, पीआरई ईडब्ल्यूएसआर 1 के स्व-संघ के लिए जिम्मेदार इंटरमॉलिक्युलर संपर्कों से उत्पन्न हो सकते हैं, या पीआरई इंट्रा- और इंटरमॉलिक्युलर संपर्कों दोनों के संयोजन से हो सकते हैं। यहां प्रस्तुत मामले में, जो अज्ञात रहता है वह यह है कि अवशेष स्पिन-लेबल के कितने करीब पहुंचते हैं या कितने समय तक वे निकटता में रहते हैं। ईडब्ल्यूएसआर 1 171-264 जैसे अत्यधिक लचीले अणुओं के साथ, इन मापदंडों को गुणात्मक रूप से अलग करना मुश्किल हो सकता है। स्पिन-लेबल को विभिन्न अवशेष स्थितियों पर रखकर, श्रृंखला के विभिन्न हिस्सों के बीच संपर्कों की पहचान की जा सकती है, जो विशिष्ट इंटरैक्शन की अधिक सटीक व्याख्या प्रदान करती है जो स्व-संघ के लिए कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक हो सकती है (चित्रा 3)। इंटरमॉलिक्युलर पीआरई (14एन स्पिन-लेबल प्रोटीन को 15 एन गैर-स्पिन लेबल प्रोटीन के साथ मिश्रित करना), औसत से बड़े पीआरई (जैसे, अवशेष 196 या 215, चित्रा 3) के साथ अवशेषों की उत्परिवर्तन रणनीति को नियोजित करना, और गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन, आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी और विश्लेषणात्मक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन जैसे अन्य बायोफिज़िकल तरीकों का उपयोग करना, आईडीपी के विरूपण पहनावा को चिह्नित करने के लिए उपयोगी हैं।

Figure 1
चित्रा 1: मुक्त सिस्टीन अवशेषों के साथ लगाव की सुविधा के लिए एक अप्रकाशित इलेक्ट्रॉन और विभिन्न कार्यात्मक समूहों वाले अणु जो आमतौर पर पैरामैग्नेटिक विश्राम एजेंटों के रूप में उपयोग किए जाते हैं। डायमैग्नेटिक अणुओं को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। (ए) 3-मालिमिडो-2,2,5,5-टेट्रामिथाइल-1-पाइरोलिडिनिलोक्सी, फ्री रेडिकल (3-मालिमिडो-प्रॉक्सिल) (बी) 3-कार्बोक्सी-2,2,5,5-टेट्रामिथाइल-1-पाइरोलिडिनिलोक्सी, फ्री रेडिकल (3-कार्बोक्सी-प्रॉक्सिल) (सी) 3-(2-आयोडोएसिटामिडो)-2,2,5,5-टेट्रामिथाइल-1-पाइरोलिडिनोक्सी, फ्री रेडिकल (3-2-2-5-5-टेट्रामिथाइल-1-पाइरोलिडिनलोक्सी)) (1-एसिटोक्सी-2,2,5,5-टेट्रामिथाइल-δ-3-पाइरोलिन-3-मिथाइल) मीथेनथियोसल्फोनेट (एसिटोक्सी-एमटीएसएल) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: इंट्रा- और इंटरमॉलिक्युलर प्री का चित्रण। (ए) इंट्रामोलेक्यूलर प्री, लाल सर्कल 15एन-लेबल प्रोटीन से जुड़े एक पैरामैग्नेटिक सेंटर के प्रभावी त्रिज्या का प्रतिनिधित्व करता है। प्री प्रभाव पैरामैग्नेटिक अणु से दूरी पर <आर -6> निर्भरता के साथ कम हो जाता है। (बी) इंटरमॉलिक्युलर प्री, पैरामैग्नेटिक समूह (लाल सर्कल), 14एन (प्राकृतिक बहुतायत) प्रोटीन (नीला) पर स्थित है जो एनएमआर के लिए अदृश्य है। गैर-एनएमआर सक्रिय प्रोटीन पर पैरामैग्नेटिक समूह के प्रभाव को 15एन प्रोटीन (काले) के साथ निकट संपर्क में आने पर बढ़ी हुई छूट दर के रूप में देखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: 1 एचएन -Γ2 ईडब्ल्यूएसआर 1के आंतरिक रूप से अव्यवस्थित डोमेन के अवशेष 171-264 के लिए दरें। स्थिति (ए) 178 या (बी) 260 पर एक सेरीन अवशेष जिसे सिस्टीन में उत्परिवर्तित किया गया है, 3-मालिमिडो-प्रॉक्सिल स्पिन-लेबल (लाल *) के लिए अनुलग्नक बिंदु के रूप में कार्य करता है। बढ़ी हुई छूट दर टैग के स्थान पर होती है, बढ़ी हुई छूट की अन्य साइटें इंट्रामोलेक्यूलर इंटरैक्शन का संकेत देती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

प्री का उपयोग करके आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन और विभिन्न बाध्यकारी भागीदारों के बीच कम आबादी पर मौजूद क्षणिक इंटरैक्शन को चिह्नित करने के लिए एक विधि प्रस्तुत की गई है। दिखाए गए उदाहरण में, प्रोटीन स्व-संबद्ध है, और इस प्रकार प्री अंतर और इंट्रामोलेक्यूलर इंटरैक्शन के संयोजन से उत्पन्न हो सकता है। इस विधि को आसानी से विषम नमूनों तक बढ़ाया जाता है जहां दो अलग-अलग प्रोटीनों के बीच बातचीत की विशेषता हो सकती है। प्रोटीन के विभिन्न क्षेत्रों के बीच बातचीत के बारे में पूरक जानकारी प्रोटीन के भीतर विभिन्न पदों पर स्पिन-लेबल रखकर उपलब्ध है। इसके अतिरिक्त, एनएमआर सक्रिय (15एन) और एनएमआर निष्क्रिय (14एन) प्रजातियों के बीच स्पिन-लेबल को बारी-बारी से, देखे गए प्री के इंट्रा-और इंटर-आणविक स्रोतों को एक दूसरे से अलग किया जा सकता है, जिससे मुठभेड़ परिसरों के बारे में जानकारी मिलती है। यहां उल्लिखित प्रयोग जटिल इंटरैक्शन पर रिपोर्ट कर सकता है, भले ही वे माइक्रोसेकंड टाइमस्केल13 पर हों।

इस विधि के केंद्र में सिस्टीन अवशेषों से लगाव द्वारा रुचि के प्रोटीन में एक स्पिन-लेबल टैग का समावेश है। कुछ प्रोटीनों में एक देशी सिस्टीन हो सकता है जो स्पिन-लेबल संलग्न करने के लिए उपयुक्त है (डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड में भाग नहीं लेता है, सतह उजागर होता है)। आईडीपी के लिए, सिस्टीन का विलायक जोखिम आमतौर पर एक मुद्दा नहीं है। अधिकांश मामलों में, साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस43 का उपयोग करके सिस्टीन को रूढ़िवादी उत्परिवर्तन (सेरीन से सिस्टीन या अन्य अनियंत्रित ध्रुवीय अमीनो एसिड से सिस्टीन तक) के रूप में पेश करना वांछनीय है। प्रस्तुत उदाहरण में, ईडब्ल्यूएसआर 1 के टुकड़े में देशी सिस्टीन नहीं होते हैं और सेरीन में समृद्ध होते हैं; इस प्रकार, एक उत्परिवर्तन रणनीति तैयार करना सरल था। प्रोटीन जिसमें देशी सिस्टीन (एस) होते हैं, एक अधिक जटिल मामला पेश करते हैं, और मूल कार्य को बाधित नहीं करने के लिए देखभाल करने की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, संरचनात्मक रूप से महत्वपूर्ण डाइसल्फ़ाइड बंधन को तोड़ना)44। इसके अलावा, स्पिन-लेबलिंग के लिए एक एकल सिस्टीन को शामिल करने के लिए, देशी सिस्टीन को एक अवशेष में उत्परिवर्तित किया जाना चाहिए जो स्पिन-लेबल (कोई मर्कैप्टो समूह नहीं) के साथ प्रतिक्रिया नहीं करता है और इसके आकार और अन्य गुणों के आधार पर, सेरीन सिस्टीन के लिए एक अच्छा विकल्प है। यदि देशी सिस्टीन को उत्परिवर्तित करने की आवश्यकता है, तो उत्परिवर्ती के सावधानीपूर्वक लक्षण वर्णन की आवश्यकता होती है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि वे मूल संरचना और कार्य को बनाए रखते हैं। वाइल्डटाइप प्रोटीन की तुलना में उत्परिवर्ती के सरल 1एच, 15एन एचएसक्यूसी प्रोटीन संरचना के लिए गड़बड़ी (यहां तक कि मामूली) के शक्तिशाली संकेतक हैं, और यह दृष्टिकोण आईडीपी45 के लिए भी उपयोगी है। विचार करने के अन्य तरीकों में परिपत्र द्विचरवाद, विश्लेषणात्मक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन, या जैव रासायनिक दृष्टिकोण जैसे गतिविधिपरख 46 हैं।

प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, कठोर, उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करने के लिए तकनीकी विचारों में एनएमआर नमूने की तैयारी के दौरान आयनिक अशुद्धियों को हटाना शामिल है। यह उपयोग से पहले चेलटिंग राल पर सभी समाधानों को पारित करके प्राप्त किया जाता है। इसके अलावा, नाइट्रोक्साइड स्पिन लेबल के लगाव के दौरान ठीक से डिगैस्ड बफर का उपयोग करना महत्वपूर्ण है क्योंकि ऑक्सीजन की उपस्थिति लेबलिंग की दक्षता को कम कर सकती है। डायमैग्नेटिक संदूषण देखे गए प्री में कमी में योगदान देगा; हालांकि, इंट्रामोलेक्यूलर पीआरई पर प्रभाव कम स्पष्ट है और इसे कम करके कम किया जा सकताहै। इसलिए, प्रयोग के साथ आगे बढ़ने के लिए 100% लेबल निगमन प्राप्त करना आवश्यक नहीं है, खासकर यहां प्रस्तुत गुणात्मक व्याख्या के लिए। यदि अपूर्ण स्पिन-लेबल अनुलग्नक से मुक्त सिस्टीन समस्याग्रस्त हैं, तो कुछ मर्काप्टो-प्रतिक्रियाशील रसायनज्ञ (जैसे, मैलिमाइड) पूरे प्रयोग26 में नमूने में एक कम करने वाले एजेंट को बनाए रखने के लिए उत्तरदायी हैं। यह महत्वपूर्ण है कि पैरामैग्नेटिक और डायमैग्नेटिक नमूने एक-दूसरे से यथासंभव निकटता से मेल खाते हैं। डायमैग्नेटिक नियंत्रण बनाने के लिए एस्कॉर्बिक एसिड के साथ स्पिन-लेबल को कम करते समय, एस्कॉर्बिक एसिड स्टॉक समाधान में टाइटिंग से पेश किए गए कमजोर पड़ने वाले कारक पर विचार करें। एनएमआर बफर में अपेक्षित कामकाजी एकाग्रता से कम से कम 10 गुना एस्कॉर्बिक एसिड स्टॉक को बनाए रखकर इस कमजोर पड़ने को कम किया जा सकता है।

एनएमआर डेटा का विश्लेषण करने के लिए कई सॉफ्टवेयर पैकेज उपलब्ध हैं, जिनमें एनएमआरपाइप 32, स्पार्की 33, सीसीपीएन विश्लेषण34, एनएमआरवीयूजे35, दूसरों के बीच शामिल हैं। स्पेक्ट्रल प्रोसेसिंग के लिए एनएमआरपाइप और स्पेक्ट्रल विश्लेषण (पीक पिकिंग और परिमाणीकरण) के लिए स्पार्की के संयोजन को इस संयोजन के उपयोग में आसानी के कारण यहां वर्णित किया गया था। NMRPip आमतौर पर वर्णक्रमीय प्रसंस्करण के लिए कई एनएमआर समूहों द्वारा उपयोग किया जाता है, लेकिन NMRPip सुइट में विश्लेषण के सभी चरणों को पूरा करने के लिए आवश्यक उपकरण होते हैं, हालांकि एक महत्वपूर्ण सीखने की अवस्था के साथ। एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डेटा को भी संसाधित किया जा सकता है। स्पार्की को वर्णक्रमीय विश्लेषण के लिए चुना गया था क्योंकि इसके उपयोग में आसानी और नौसिखिए उपयोगकर्ताओं द्वारा तेजी से उत्थान किया गया था। वर्णक्रमीय विश्लेषण (चोटी को चुनना और पीक ऊंचाइयों को मापना) के लिए कई विकल्प उपलब्ध हैं जो आसानी से सीसीपीएन विश्लेषण, या एनएमआरवीडब्ल्यूजे सहित स्पार्की की कार्यक्षमता के लिए विकल्प हो सकते हैं। विशेष रूप से, इनमें से कई कार्यक्रमों में अतिव्यापी कार्यक्षमताएं हैं और उपयोगकर्ता को उन कार्यक्रमों के संयोजन का चयन करने की सलाह दी जाती है जिनके साथ वे सबसे अधिक आरामदायक हैं।

खराब रासायनिक बदलाव फैलाव आईडीपी के साथ एक अंतर्निहित समस्या है जिससे महत्वपूर्ण अनुनाद ओवरलैप होता है और चरम ऊंचाई के माप में त्रुटि की शुरूआत होती है। इस समस्या को कम करने के लिए विभिन्न रणनीतियों का प्रस्ताव किया गया है। सबसे सीधा, और यहां नियोजित में से एक, आईडीपी की लंबी अनुप्रस्थ छूट विशेषता का लाभ उठाना है और बस 15एन (अप्रत्यक्ष) आयाम में अधिग्रहण समय का विस्तार करना है। वैकल्पिक रूप से, ट्रिपल अनुनाद एचएनसीओ प्रयोग सी अनुनाद के बेहतर फैलाव के कारण आईडीपी में अनुनाद ओवरलैप को हल करने के लिए उपयोगी है। पीआरई को मापने के लिए एचएनसीओ के टीआरओएसवाई और एचएसक्यूसी दोनों संस्करणों का प्रस्ताव किया गया है और इन्हें अन्यत्र वर्णित किया गयाहै। हालांकि, बेहतर रिज़ॉल्यूशन हमेशा प्रयोग की बढ़ती जटिलता, डेटा संग्रह के लिए अधिक समय और एक उपयुक्त नमूना तैयार करने के लिए अतिरिक्त लागत ( 13सी का संवर्धन) के लिए पर्याप्त महत्वपूर्ण नहीं होता है। यह वास्तव में यहां प्रस्तुत ईडब्ल्यूएसआर 1 171-264 का मामला है, जहां अप्रत्यक्ष आयाम में लंबे अधिग्रहण समय के साथ एकत्र किए गए ट्रॉसी-एचएनसीओ और 1एच, 15एन एचएसक्यूसी के बीच गैर-अतिव्यापी अवशेषों की संख्या में कोई महत्वपूर्ण सुधार नहीं देखा गया था।

ऊपर उल्लिखित यह प्रक्रिया आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन के भीतर और बीच मौजूद कमजोर इंटरैक्शन को चिह्नित करने के लिए प्री प्रयोगों की उपयोगिता पर केंद्रित है। प्री की बायोमोलेक्यूलर एनएमआर में बहुत व्यापक उपयोगिता है, जिसमें लंबी दूरी के संरचनात्मक संयम और विरल आबादी वाले संवहन राज्यों का मात्रात्मक निर्धारण शामिल है। उदाहरण के लिए, क्लोर और सहकर्मियों ने एक प्रोटीन48 के अलग-अलग डोमेन के बीच या इकट्ठे प्रोटीन कॉम्प्लेक्स17 के सबयूनिट्स के बीच बातचीत से उत्पन्न क्षणिक इंटरैक्शन का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए प्री के उपयोग का बीड़ा उठाया है। प्रोटीन51 के साथ-साथ अत्यधिक पैरामैग्नेटिक सिस्टम52 की समग्र तह को निर्धारित करने में मदद करने के लिए लंबी दूरी के अवरोधों को प्राप्त करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्री के कई उदाहरण हैं, जिनमें बड़े प्रोटीन49, या उपन्यास प्री टैग50 शामिल हैं। अंत में, जबकि पीसीएस इस चर्चा के दायरे से परे है, उन्हें महत्वपूर्ण जैव-आणविक समस्याओं पर लागू किया गया है जिन्हें कहीं और वर्णित किया गयाहै। ऊपर प्रस्तुत विधि पीआरई का उपयोग करके आईडीपी के अनुरूपण और इंटरैक्शन की जांच के लिए उपयुक्त है और नौसिखिए उपयोगकर्ताओं के लिए सुलभ होने के लिए डिज़ाइन की गई थी। प्री के विश्लेषण के लिए अधिक मात्रात्मक दृष्टिकोण के लिए, उपयोगकर्ता को 11,24,30,31 के भीतर संदर्भित कई उत्कृष्ट लेखों को संदर्भित किया जाता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

सभी लेखकों ने पांडुलिपि को पढ़ा और अनुमोदित किया है। हितों के टकराव की कोई घोषणा नहीं की गई है।

Acknowledgments

हम सहायक चर्चाओं और तकनीकी सहायता के लिए डॉ जिनफा यिंग और क्रिस्टिन कैनो को धन्यवाद देते हैं। डीएसएल एक सेंट बाल्ड्रिक स्कॉलर है और सेंट बाल्ड्रिक फाउंडेशन (634706) के समर्थन को स्वीकार करता है। इस काम को वेल्च फाउंडेशन (एक्यू -2001-20190330) द्वारा डीएसएल, मैक्स और मिनी टोमेरलिन वोएलकर फंड (वोल्कर फाउंडेशन यंग इन्वेस्टिगेटर ग्रांट टू डीएसएल), यूटीएचएसए स्टार्ट-अप फंड टू डीएसएल और सीएनजे को बच्चों के स्वास्थ्य में ग्रीहे ग्रेजुएट फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था। यह काम स्ट्रक्चरल बायोलॉजी कोर फैसिलिटीज में किए गए शोध पर आधारित है, जो सैन एंटोनियो में टेक्सास स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र विश्वविद्यालय में संस्थागत अनुसंधान कोर का हिस्सा है, जो अनुसंधान के लिए उपाध्यक्ष के कार्यालय और मेस कैंसर सेंटर ड्रग डिस्कवरी एंड स्ट्रक्चरल बायोलॉजी शेयर्ड रिसोर्स (एनआईएच पी 30 CA054174) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 µm and 0.22 µm syringe filters Millipore Sigma SLHVM33RS
SLGVR33RS		 Filter lysate before first purification step and before size exclusion chromatography.
100 mm Petri Dish Fisher FB0875713 Agar plates for bacterial transformation.
14N Ammonium chloride Sigma Aldrich 576794 Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein
15N Ammonium chloride Sigma Aldrich 299251 Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein
3 L Fernbach baffled flask Corning 431523 Bacterial expression culture
3-Maleimido-Proxyl Sigma Aldrich 253375 Nitroxide spin label
50 mL conical centrifuge tubes Thermo Fisher 14-432-22 Solution/protein storage
Amicon centrifugal filter Millipore Sigma UFC900308 Protein concentration
Ampicillan Sigma Aldrich A5354 Antibiotic for a selective marker, exact choice depends on the expression construct plasmid
Analytical balance Oahus 30061978 Explorer Pro, for weighing reagents
Ascorbic acid Sigma Aldrich AX1775 Reduces nitroxide spin label
Autoclave Sterilize glassware and culture media
Calcium chloride Sigma Aldrich C4901 M9 media component
Centrifuge bottles Thermo Fisher 010-1459 Harvest E. coli cells after recombinant protein expression
Centrifuge, hand-crank Thomas Scientific 0241C68 Boekel hand-driven, low-speed centrifuge with 15 mL buckets that can accommodate NMR tubes
Chelex 100 Sigma Aldrich C7901 Remove contaminating paramagnetic compounds from buffer solutions
Computer workstation Linux or Mac OS compatable with NMR data processing and analysis software packages such as NMRPipe and Sparky
Deuterium oxide Sigma Aldrich 151882 Needed for NMR lock signal
Dextrose Sigma Aldrich D9434 M9 media component
Dibasic Sodium Phosphate Sigma Aldrich S5136 M9 media component
Ellman's reagent (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) Thermo Fisher 22582 Quantification of free cystiene residues
High speed centrifuge tubes Thermo Fisher 3114-0050 Used to clear bacterial lysate.
High-field NMR instrument (600 - 800 MHz) Bruker Equiped with a multichannel cryogenic probe and temperature control
IMAC column, HisTrap FF Cytvia 17528601 Initial fractionation of crude bacterial lysate
Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG) Sigma Aldrich I6758 Induces protein expression for genes under control of lac operator
LB agar Thermo Fisher 22700025 Items are used for transforming E. coli to express protein of interest, substitions for any of these items with like products is acceptable.
LB broth Thermo Fisher 12780052
Low-pressure chromatography system Bio-Rad 7318300 BioRad BioLogic is used for low-pressure chomatograph such as running IMAC columns
Magnesium sulfate Sigma Aldrich M7506 M9 media component
Medium pressure chromatography system Bio-Rad 7880007 BioRad NGC equipped with a multi-wavelength detector, pH and conductivity monitors, and automatic fraction collector
MEM vitamin solution Sigma Aldrich M6895 M9 media component
Microfluidizer Avestin EmulsiFlex-C3 Provides rapid and efficient bacterial cell lysis
Micropipettes Thermo Fisher Calibrated set of micropippetters with properly fitting disposable tips (available from multiple manufacturers e.g. Eppendorf)
Monobasic potassium phosphate Sigma Aldrich 1551139 M9 media component
NMR pipettes Sigma Aldrich 255688 To remove sample from NMR tube
NMR sample tube NewEra NE-SL5 Suitable for high-field NMR spectrometers
Preparative Centrifuge Beckman Coulter Avanti J-HC Harvest E. coli cells after recombinant protein expression
Round bottom polystyrene centrifuge tubes Corning 352057 Clear bacterial lysate
Shaking incubator Eppendorf S44I200005 Temperature controlled growth of E. coli starter and expression cultures
Sodium chloride Sigma Aldrich S5886 M9 media component
Sonicating water bath and vacuum source Thomas Scientific Used to degas buffer solutions
Sonicator Thermo Fisher FB505110 Used for bacterial cell lysis or shearing bacterial DNA
Spectrophotometer Implen OD600 Diluphotometer Monitor growth of E.coli protein expression cultures
Superdex 200 16/600 size exculsion colum Cytvia 28989333 Final protein purification step
Topspin software, version 3.2 or later Bruker Operating software for the NMR instrument
Transformation competent E. coli cells Thermo Fisher C600003 One Shot BL21 Star (DE3) chemically competent E. coli, other strains may be compatable
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) ThermoFisher 20490 Reducing agent compatable with some sulfhydryl-reactive conjugations
UV-Vis spectrophotometer Implen NP80 Measure protein concentration.
Water bath, temperature controlled ThermoFisher FSGPD25 For heat shock step of bacterial transformation
Yeast extract Sigma Aldrich Y1625 For supplementing M9 media if required

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dyson, H. J., Wright, P. E. Intrinsically unstructured proteins and their functions. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 6 (3), 197-208 (2005).
  2. Korneta, I., Bujnicki, J. M. Intrinsic disorder in the human spliceosomal proteome. PLoS Computational Biology. 8 (8), 1002641 (2012).
  3. Frege, T., Uversky, V. N. Intrinsically disordered proteins in the nucleus of human cells. Biochemistry and Biophysics Reports. 1, 33-51 (2015).
  4. Liu, J., et al. Intrinsic disorder in transcription factors. Biochemistry. 45 (22), 6873-6888 (2006).
  5. El Hadidy, N., Uversky, V. N. Intrinsic disorder of the BAF complex: Roles in chromatin remodeling and disease development. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), (2019).
  6. Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (1), 18-29 (2015).
  7. Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
  8. Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
  9. Cavanagh, J. Protein NMR spectroscopy : principles and practice. 1st edition. , Elsevier. (2018).
  10. Sekhar, A., Kay, L. E. NMR paves the way for atomic level descriptions of sparsely populated, transiently formed biomolecular conformers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (32), 12867-12874 (2013).
  11. Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
  12. Alderson, T. R., Kay, L. E. NMR spectroscopy captures the essential role of dynamics in regulating biomolecular function. Cell. 184 (3), 577-595 (2021).
  13. Clore, G. M., Iwahara, J. Theory, practice, and applications of paramagnetic relaxation enhancement for the characterization of transient low-population states of biological macromolecules and their complexes. Chemical Reviews. 109 (9), 4108-4139 (2009).
  14. Wu, K. P., Baum, J. Detection of transient interchain interactions in the intrinsically disordered protein alpha-synuclein by NMR paramagnetic relaxation enhancement. Journal of the American Chemical Society. 132 (16), 5546-5547 (2010).
  15. Janowska, M. K., Wu, K. P., Baum, J. Unveiling transient protein-protein interactions that modulate inhibition of alpha-synuclein aggregation by beta-synuclein, a pre-synaptic protein that co-localizes with alpha-synuclein. Scientific Reports. 5, 15164 (2015).
  16. Murthy, A. C., et al. Molecular interactions underlying liquid-liquid phase separation of the FUS low-complexity domain. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (7), 637-648 (2019).
  17. Fawzi, N. L., Doucleff, M., Suh, J. Y., Clore, G. M. Mechanistic details of a protein-protein association pathway revealed by paramagnetic relaxation enhancement titration measurements. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (4), 1379-1384 (2010).
  18. Griffith, O. H., Waggoner, A. S. Nitroxide free radicals: spin labels for probing biomolecular structure. Accounts of Chemical Research. 2 (2), 17-24 (1969).
  19. Bertini, I., Luchinat, C., Parigi, G., Ravera, E. NMR of Paramagnetic Macromolecules, Applications to Metallobiomolecules and Models. 2 edn. , Elsevier Science. (2016).
  20. Bloembergen, N., Purcell, E. M., Pound, R. V. Relaxation effects in nuclear magnetic resonance absorption. Physical Review. 73 (7), 679-712 (1948).
  21. Solomon, I. Relaxation processes in a system of two spins. Physical Review. 99 (2), 559 (1955).
  22. Clore, G. M. Practical aspects of paramagnetic relaxation enhancement in biological macromolecules. Methods in Enzymology. 564, 485-497 (2015).
  23. Klare, J. P. Site-directed spin labeling EPR spectroscopy in protein research. Biological Chemistry. 394 (10), 1281-1300 (2013).
  24. Clore, G. M., Tang, C., Iwahara, J. Elucidating transient macromolecular interactions using paramagnetic relaxation enhancement. Current Opinion in Structural Biology. 17 (5), 603-616 (2007).
  25. Melanson, M., Sood, A., Torok, F., Torok, M. Introduction to spin label electron paramagnetic resonance spectroscopy of proteins. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (3), 156-162 (2013).
  26. Czogalla, A., Pieciul, A., Jezierski, A., Sikorski, A. F. Attaching a spin to a protein -- site-directed spin labeling in structural biology. Acta Biochimica Polonica. 54 (2), 235-244 (2007).
  27. Lindfors, H. E., de Koning, P. E., Drijfhout, J. W., Venezia, B., Ubbink, M. Mobility of TOAC spin-labelled peptides binding to the Src SH3 domain studied by paramagnetic NMR. Journal of Biomolecular NMR. 41 (3), 157-167 (2008).
  28. Fawzi, N. L., et al. A rigid disulfide-linked nitroxide side chain simplifies the quantitative analysis of PRE data. Journal of Biomolecular NMR. 51 (1-2), 105-114 (2011).
  29. Bleicken, S., et al. gem-Diethyl pyrroline nitroxide spin labels: Synthesis, EPR characterization, rotamer libraries and biocompatibility. ChemistryOpen. 8 (8), 1035 (2019).
  30. Iwahara, J., Tang, C., Clore, G. M. Practical aspects of 1H transverse paramagnetic relaxation enhancement measurements on macromolecules. Journal of Magnetic Resonance. 184, 185-195 (2007).
  31. Venditti, V., Fawzi, N. L. Probing the atomic structure of transient protein contacts by paramagnetic relaxation enhancement solution NMR. Methods in Molecular Biology. 1688, 243-255 (2018).
  32. Delaglio, F., et al. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
  33. Lee, W., Tonelli, M., Markley, J. L. NMRFAM-SPARKY: enhanced software for biomolecular NMR spectroscopy. Bioinformatics. 31 (8), 1325-1327 (2015).
  34. Vranken, W. F., et al. The CCPN data model for NMR spectroscopy: development of a software pipeline. Proteins. 59 (4), 687-696 (2005).
  35. Johnson, B. A. Using NMRView to visualize and analyze the NMR spectra of macromolecules. Methods in Molecular Biology. 278, 313-352 (2004).
  36. Sjodt, M., Clubb, R. T. Nitroxide labeling of proteins and the determination of paramagnetic relaxation derived distance restraints for NMR studies. Bio-Protocol. 7 (7), (2017).
  37. Zhang, H., van Ingen, H. Isotope-labeling strategies for solution NMR studies of macromolecular assemblies. Current Opinion in Structural Biology. 38, 75-82 (2016).
  38. Rabdano, S. O., et al. Onset of disorder and protein aggregation due to oxidation-induced intermolecular disulfide bonds: case study of RRM2 domain from TDP-43. Scientific Reports. 7 (1), 11161 (2017).
  39. Burns, J. A., Butler, J. C., Moran, J., Whitesides, G. M. Selective reduction of disulfides by tris(2-carboxyethyl)phosphine. Journal of Organic Chemistry. 56 (8), 2648-2650 (1991).
  40. Ellman, G. L. Tissue sulfhydryl groups. Archives of Biochemistry and Biophysics. 82 (1), 70-77 (1959).
  41. Binbuga, B., Boroujerdi, A. F., Young, J. K. Structure in an extreme environment: NMR at high salt. Protein Science. 16 (8), 1783-1787 (2007).
  42. Schwartz, J. C., Cech, T. R., Parker, R. R. Biochemical properties and biological functions of FET proteins. Annual Review of Biochemistry. 84, 355-379 (2015).
  43. Nabuurs, S. M., de Kort, B. J., Westphal, A. H., van Mierlo, C. P. Non-native hydrophobic interactions detected in unfolded apoflavodoxin by paramagnetic relaxation enhancement. European Biophysics Journal. 39 (4), 689-698 (2010).
  44. Wiedemann, C., Kumar, A., Lang, A., Ohlenschlager, O. Cysteines and disulfide bonds as structure-forming units: Insights from different domains of life and the potential for characterization by NMR. Frontiers in Chemistry. 8, 280 (2020).
  45. Wommack, A. J., et al. NMR solution structure and condition-dependent oligomerization of the antimicrobial peptide human defensin 5. Biochemistry. 51 (48), 9624-9637 (2012).
  46. Taylor, A. M., et al. Detailed characterization of cysteine-less P-glycoprotein reveals subtle pharmacological differences in function from wild-type protein. British Journal of Pharmacology. 134 (8), 1609-1618 (2001).
  47. Hu, K., Doucleff, M., Clore, G. M. Using multiple quantum coherence to increase the 15N resolution in a three-dimensional TROSY HNCO experiment for accurate PRE and RDC measurements. Journal of Magnetic Resonance. 200 (2), 173-177 (2009).
  48. Anthis, N. J., Doucleff, M., Clore, G. M. Transient, sparsely populated compact states of apo and calcium-loaded calmodulin probed by paramagnetic relaxation enhancement: interplay of conformational selection and induced fit. Journal of the American Chemical Society. 133 (46), 18966-18974 (2011).
  49. Battiste, J. L., Wagner, G. Utilization of site-directed spin labeling and high-resolution heteronuclear nuclear magnetic resonance for global fold determination of large proteins with limited nuclear overhauser effect data. Biochemistry. 39 (18), 5355-5365 (2000).
  50. Donaldson, L. W., et al. Structural characterization of proteins with an attached ATCUN motif by paramagnetic relaxation enhancement NMR spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 123 (40), 9843-9847 (2001).
  51. Gaponenko, V., et al. Protein global fold determination using site-directed spin and isotope labeling. Protein Science. 9 (2), 302-309 (2000).
  52. Trindade, I. B., Invernici, M., Cantini, F., Louro, R. O., Piccioli, M. PRE-driven protein NMR structures: an alternative approach in highly paramagnetic systems. FEBS Journal. 288 (9), 3010-3023 (2021).
  53. Nitsche, C., Otting, G. Pseudocontact shifts in biomolecular NMR using paramagnetic metal tags. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 98-99, 20-49 (2017).

Tags

इस महीने JoVE में अंक 175
आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन के आत्म-संघों का पता लगाने और विशेषता बताने के लिए पैरामैग्नेटिक विश्राम वृद्धि
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Johnson, C. N., Libich, D. S.… More

Johnson, C. N., Libich, D. S. Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins. J. Vis. Exp. (175), e63057, doi:10.3791/63057 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter