Summary
Hier beschrijven we een niet-invasieve monitoringmethode met luciferase en groene fluorescerende eiwitexpressie in verschillende borstkankercellijnen. Dit protocol biedt een techniek om tumorvorming en gemetastaseerde kolonisatie in realtime bij muizen te volgen.
Abstract
Borstkanker is een frequente heterogene maligniteit en de tweede belangrijkste doodsoorzaak bij vrouwen, voornamelijk als gevolg van orgaanmetastase op afstand. Er zijn verschillende diermodellen gegenereerd, waaronder de veelgebruikte orthotopische muismodellen, waarbij kankercellen in het borstvetkussen worden geïnjecteerd. Deze modellen kunnen echter niet helpen bij het monitoren van tumorgroeikinetiek en gemetastaseerde kolonisatie. Geavanceerde hulpmiddelen om kankercellen in realtime bij muizen te volgen, zullen het begrip van tumorbiologie aanzienlijk verbeteren.
Hier werden borstkankercellijnen vastgesteld die stabiel luciferase en groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie brengen. Specifiek bevat deze techniek twee opeenvolgende stappen geïnitieerd door het meten van de luciferase-activiteit in vitro en gevolgd door de implantatie van de kankercellen in borstvetkussens van niet-obese diabetische-ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (NOD-SCID) muizen. Na de injectie worden zowel de tumorgroei als de gemetastaseerde kolonisatie in realtime gevolgd door het niet-invasieve bioluminescentiebeeldvormingssysteem. Vervolgens zal de kwantificering van GFP-expresserende metastasen in de longen worden onderzocht door fluorescentiemicroscopie om de waargenomen bioluminescentieresultaten te valideren. Dit geavanceerde systeem dat luciferase en fluorescentie-gebaseerde detectietools combineert, evalueert kankermetastase in vivo, wat een groot potentieel heeft voor gebruik in borstkankertherapieën en ziektebeheer.
Introduction
Borstkankers zijn wereldwijd frequente vormen van kanker, met ongeveer 250.000 nieuwe gevallen die elk jaar in de Verenigde Staten worden gediagnosticeerd1. Ondanks de hoge incidentie heeft een nieuwe reeks geneesmiddelen tegen kanker de resultaten van borstkankerpatiënten aanzienlijk verbeterd2. Deze behandelingen zijn echter nog steeds ontoereikend, omdat veel patiënten een terugval van de ziekte en gemetastaseerde verspreiding naar vitale organenervaren 2, wat de primaire oorzaak is van morbiditeit en mortaliteit van de patiënt. Daarom is een van de belangrijkste uitdagingen in borstkankeronderzoek het identificeren van de moleculaire mechanismen die de vorming van distale metastasen reguleren om nieuwe middelen te ontwikkelen om hun ontwikkeling te remmen.
Kankermetastase is een dynamisch proces waarbij cellen zich losmaken van de primaire tumor en via de bloedcirculatie naburige weefsels binnendringen. Diermodellen waarin de cellen een vergelijkbare gemetastaseerde cascade ondergaan, kunnen dus de identificatie van de mechanismen die dit proces beheersenvergemakkelijken 3,4. Bovendien zijn deze in vivo modellen essentieel voor de ontwikkeling van borstkanker therapeutische middelen 5,6. Deze orthotopische modellen kunnen echter niet de werkelijke tumorgroeikinetiek aangeven, omdat het effect pas bij beëindiging wordt bepaald. Daarom hebben we een op luciferase gebaseerd hulpmiddel opgezet om tumorontwikkeling en gemetastaseerde kolonisatie in realtime te detecteren. Bovendien drukken deze cellen GFP uit om de gemetastaseerde kolonies te detecteren. Deze aanpak is relatief eenvoudig en omvat geen invasieve procedures3. Het combineren van luciferase en fluorescentiedetectie is dus een nuttige strategie om de preklinische studies van borstkankertherapieën en ziektebeheer te bevorderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle muisexperimenten werden uitgevoerd onder het door de Hebrew University Institutional Animal Care and Use Committee goedgekeurde protocol MD-21-16429-5. Bovendien is de Hebreeuwse Universiteit gecertificeerd door de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC).
1. Cellijn onderhoud
OPMERKING: De menselijke borstkankercellijnen (MCF-7, MDA-MB-468 en MDA-MB-231) werden in dit protocol gebruikt.
- Kweek alle borstkankercellijnen in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine bij 37 °C in een bevochtigde kooldioxide (5% CO2) incubator.
OPMERKING: Controleer de celdichtheid regelmatig; splitsen en uitbreiden voor toekomstig gebruik wanneer ze 70% confluency bereiken.
2. Virusvoorbereiding
- Behandel de HEK293T-cellen met 1 ml trypsine totdat ze loskomen.
- Voeg 10 ml DMEM (10% FBS) toe om de trypsine-activiteit te neutraliseren en breng de celsuspensie over naar een nieuwe centrifugebuis van 15 ml.
- Centrifugeer bij 150 × g gedurende 5 minuten om de cellen te bezinken. Gooi het supernatant na de centrifugering weg en voeg 1 ml vers DMEM-medium toe.
- Bepaal de celconcentratie en zaad 1,2 × 106 cellen/put in een zes-well plaat.
- Verwarm de volgende dag alle benodigde reagentia voor, waaronder transfectiereagens, serumvrij DMEM, envelopplasmide (VSV-G), lentivirusverpakkingsplasmide (ΔVPR) en pLX304 Luciferase-V5 blastplasmide of FUW GFP-plasmide.
- Meng in een 1,5 ml geautoclaveerde centrifugebuis 50 μL serumvrije DMEM met 0,3 μg VSV-G plasmide, 1 μg ΔVPR en 1,2 μg pLX304 Luciferase-V5 blastplasmide of FUW GFP-plasmide.
- Voeg na het grondig mengen van deze plasmiden met het medium 5 μL van het transfectiereagentiaat toe, meng voorzichtig en incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Voeg na incubatie het mengsel druppelsgewijs toe aan de HEK293T-cellen.
- Vervang na 24 uur het groeimedium door 2 ml (30% FBS) DMEM. Oogst de volgende dag (48 uur na de transfectie) het medium dat de virussen bevat ("pLX304 Luciferase-V5 of de FUW GFP-virussen").
OPMERKING: Het gebruik van 30% FBS verbetert de efficiëntie van de virusproductie. - Om HEK293T-celresiduen te voorkomen, voert u het virusbevattende medium door een spuitfilter van 0,45 μm of centrifuge bij 150 × g gedurende 5 minuten en verzamelt u het supernatant.
OPMERKING: Houd voor langdurige opslag de werkende aliquots van het virus op -80 °C.
3. Het vaststellen van cellen die stabiel GFP en luciferase tot expressie brengen ("GFP + Luc + cellen")
- De dag voor het infecteren van de cellen, zaad 8 × 105 cellen per put in een zes-well plaat.
- Vervang na de incubatie 's nachts het groeimedium door vers medium met 8 μg/ml polybreen. Voeg druppelsgewijs 200 μL FUW GFP-virussen toe aan de cellen.
- Optioneel: Om de virusefficiëntie te verbeteren, centrifugeert u de plaat bij 560 × g gedurende 30 minuten (37 °C) (spininfectie).
- Incubeer de cellen gedurende 48 uur en verifieer de GFP-expressie door fluorescentiemicroscopie.
- Sorteer de GFP-tot expressie brengende cellen op fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) (GFP+) (Figuur 1A).
- Infecteer de GFP-gesorteerde cellen met de pLX304 Luciferase-V5 blastvirussen zoals beschreven in stap 3.2.
- Behandel de cellen met blasticidin (10 μg/ml) 30 uur na infectie om te verrijken voor pLX304 Luciferase-V5 blast-expressing cellen (GFP+, Luc+ cellen). Vervang vervolgens om de twee dagen door vers medium dat blasticidin bevat. Behandel bovendien, als controle, naïeve cellen met hetzelfde blasticidin-bevattende medium.
OPMERKING: Een duidelijk verschil tussen de geïnfecteerde en controlecellen moet worden waargenomen na een paar dagen behandeling met blasticidin. Dit effect is cellijnafhankelijk en duurt meestal ~ 8-10 dagen. Een slechte overlevingskans duidt op een lage virale productieopbrengst. Als dat zo is, produceer dan een nieuwe partij virussen, omdat een lage efficiëntie toekomstige experimenten kan beïnvloeden.
4. Valideren van in vitro luciferase activiteit
- Kweek de MCF-7, MDA-MB-468 en MDA-MB-231 GFP+ Luc+ cellen in een plaat van 15 cm tot 80% confluency. Oogst de cellen door trypsinisatie, zoals beschreven in stappen 2.1-2.2.
- Zaai een toenemend aantal cellen in elke put (0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4 × 104) in een zwarte 96-putplaat.
OPMERKING: Zwarte 96-well platen zijn meer geschikt voor het meten van luciferaseniveaus, omdat witte of transparante platen autoluminescentiesignalen produceren. Gebruik ter controle fosfaatbuffered saline (PBS) alleen in één put om ervoor te zorgen dat er geen autoluminescentie van PBS is. - Vul alle putjes met 100 μL DMEM en incubeer gedurende 16-24 uur.
- Bereid luciferine-oplossing in PBS met een concentratie van 1,5 mg / ml uit de voorraad van 30 mg / ml. Vul de voorraad luciferineoplossing aan en bewaar bij -20 °C.
- Was de cellen eenmaal voorzichtig met PBS, voeg 100 μL luciferine-oplossing toe aan elk putje en wacht 2 minuten. Meet ten slotte de luciferase-activiteit in alle borstkankercellen met behulp van bioluminescentie.
OPMERKING: Het onderzoeken van in vitro GFP- en luciferase-expressie voorafgaand aan dierproeven is cruciaal. Bovendien worden lege putjes gebruikt om de achtergrond af te trekken.
5. Muizen injecteren met GFP+ Luc+ cellen
- Breng 5 × 106 (MCF-7 en MDA-MB-468) of 2 × 106 (MDA-MB-231) GFP+ Luc+ cellen over in respectievelijk 200 μL of 100 μL PBS.
- Reinig vóór de injectie de steriele biologische kap met een 5% desinfecterende oplossing (zie de tabel met materialen). Verdoof vervolgens de muizen met gefilterde (0,2 μm) lucht die 4% isofluraan bevat bij een luchtdebiet van 1 l / min gedurende 2−3 minuten.
OPMERKING: Het is essentieel om de juiste verdoving te bevestigen; knijp in de teen van de muis en zoek naar een reactie. - Plaats een kegel over de verdoofde muizenkop in rugligging. Breng dierenartszalf aan op zijn ogen om droogheid onder narcose te voorkomen.
- Veeg de buikstreek van de muis, boven de borstklier, met ethanol met behulp van een wattenstaafje en til de4e borstklier op met een tang.
- Steek de naald 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm) onder het vetkussen en injecteer langzaam 100 μL van de celsuspensie.
OPMERKING: Er verschijnt een ronde uitstulping onder de huid. Bovendien kan een onjuiste injectie leiden tot afwijking in de tumorgroeisnelheid of afwezigheid van tumor in dezelfde experimentele groep. - Haal na de injectieprocedure de muizen uit de kap en breng ze over naar een nieuwe kooi. Houd de muizen in de gaten totdat ze weer bij bewustzijn komen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat alle gebruikte naalden en spuiten in de naaldendoos worden weggegooid.
6. Meten van de luciferase niveaus in GFP+ Luc+ muizen
- Houd vóór de bioluminescentiedetectie de bewuste muis in bedwang door zijn nek met de linkerhand vast te houden. Kantel vervolgens de hand naar links, wat resulteert in de muis naar boven gericht met het onderlichaam in rugligging.
- Injecteer 100 μL luciferine (30 mg/ml) intraperitoneaal (i.p.) in het buikoppervlak van de muis in het kwadrant linksonder in de buik met behulp van een spuit van 1,0 ml met naaldgrootte 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm).
OPMERKING: De punt van de naald mag niet meer dan 3-5 mm van de buikwand worden ingebracht, omdat deze viscerale organen kan binnendringen. Bovendien wordt aanbevolen om i.p. injectie zonder anesthesie uit te voeren, omdat de luciferineverdeling in het lichaam van verdoofde muizen langzamer is dan bij bewuste muizen. Het monitoren van luciferaseniveaus bij bewuste muizen is dus een snellere procedure. - Houd de muis gedurende 7 minuten zonder verdoving gevolgd door 3 minuten in de anesthesiekamer voordat de tumorkinetiek wordt gemeten.
OPMERKING: De incubatietijd varieert tussen de verschillende experimenten, cellijnen en soort tot soort. Daarom wordt aanbevolen om de incubatietijd te kalibreren voordat de experimenten worden gestart. - Verdoof de muizen zoals beschreven in stappen 5.2-5.3.
- Open de software (Tabel met materialen) tijdens de incubatie, initialiseer het beeldvormingssysteem en klik op de knop Initialiseren .
OPMERKING: Houd er rekening mee dat de camera ~ 10 minuten nodig heeft om af te koelen en -90 ° C te bereiken. Bovendien, als achtergrondcontrole, meet de luciferaseniveaus in naïeve muizen (d.w.z. GFP + -muizen geïnjecteerd met cellen die het luciferase-gen niet tot expressie brengen). - Houd de instelling in automatische belichting met behulp van de volgende instellingen: belichtingstijd automatisch, 60 s; Binning Medium, F/Stop 1; Excitatiefilter geblokkeerd; Emissiefilter open. Wanneer de initialisatie is beëindigd, selecteert u Wizard Imaging | Bioluminescentie en klik vervolgens op Volgende | Filter | openen selecteer Muis in het onderwerp van de afbeelding.
- Selecteer in Veldweergave fase C (10 cm) en Onderwerp hoogte: 1,50 cm.
- Klik op Image Setup Stage to C en voordat u op de knop Acquire klikt, moet u ervoor zorgen dat de muis in de juiste rugligging op het werktuig is geplaatst.
- Sluit de deur, klik op de knop Verwerven en wacht tot er een afbeelding op het scherm verschijnt.
OPMERKING: Met de optie Automatische belichting duurt een sterk signaal 5-20 s, afhankelijk van het signaal; een zwak signaal duurt ongeveer 60 s. - Herhaal deze stap voor de andere muizen.
- Om longmetastasen te detecteren, bedekt u het sterke signaal van de primaire tumor met dik zwart kartonpapier en stelt u alleen de ventrale kant van de longen bloot aan de camera. Leg de afbeelding vast met dezelfde parameters als hierboven beschreven.
7. Ex vivo beeld verkrijgen met behulp van bioluminescentie en fluorescentie
- Euthanaseer de muizen met behulp van koolstofdioxide (CO2) inademing in de exsiccator en ontleed de muizen met behulp van een autoclaaf schaar en tang.
- Perfuseer de muizen met 0,9% zoutoplossing, oogst de organen en spoel met 1x PBS om bloedvlekken uit het orgaan te verwijderen.
- Breng het gespoelde orgaan over in een petrischaaltje en plaats het in het stadium van de bioluminescentiemachine. Pas dezelfde bioluminescentie-instelling toe als beschreven in stap 6.2-6.6.
OPMERKING: Vanwege de afname van het luciferasesignaal is deze stap tijdsbeperkend. Dus, na het euthanaseren van muizen, visualiseer het orgaan onmiddellijk door bioluminescentie. - Voor GFP-afbeeldingen past u dezelfde instelling toe als beschreven in stap 6.3, met behulp van het GFP-filter fluorescentie in plaats van bioluminescentie.
- Maak longfoto's met een stereomicroscoop om de aanwezigheid van GFP + - kolonies te onderzoeken.
8. Analyse van bioluminescentiegegevens
- Dubbelklik op de software en selecteer Openen in het menu Bestand .
- Open alle bestanden en minimaliseer ze. Zorg ervoor dat alle eenheden Radiance (Photons) zijn. Klik bovendien op Toepassen op alles om dezelfde parameters voor alle afbeeldingen te behouden.
- Selecteer in het menu Beeld het gereedschapspalet, waarmee een nieuw venster wordt geopend.
- Selecteer in het venster Gereedschapspalet het tabblad ROI-gereedschappen en kies bij Type de gemiddelde ROI van Bkg.
- Selecteer cirkel in de ROI-gereedschappen en teken een kleine cirkel op het thoracale gebied van de muis.
- Dubbelklik op de cirkel, selecteer de optie Gebruiken als BKG voor toekomstige ROI's op het tabblad Achtergrond ROI en klik op Gereed.
9. Meten van de totale flux
- Selecteer in het venster Gereedschapspalet het tabblad ROI-gereedschappen en kies bij Type de optie Meting van ROI.
- Selecteer cirkel in de ROI-tools en teken een grote cirkel op de primaire tumor van de muis.
- Klik met de rechtermuisknop op ROI kopiëren en klik met de rechtermuisknop op ROI plakken in elk afzonderlijk bestand van elke muis.
- Klik op METEN VAN ROI's op het tabblad ROI-tools, dat een nieuw venster opent met de naam ROI-metingen. Houd op dit tabblad de metingentypen als uitstraling (fotonen) en afbeeldingskenmerken als alle ingevulde waarden.
- Exporteer het bestand als metingenbestand (*.txt) of Csv (*.csv) formaat.
- Open de geëxporteerde gegevens in een spreadsheet en neem de totale flux (p/s) en de waarden voor de weken.
OPMERKING: Deze stap kan worden gebruikt om verschillende groepen te meten. Bijvoorbeeld muizen behandeld met een voertuig versus degenen die werden behandeld met een medicijn. - Genereer een XY-plot, waarbij de tijd wordt weergegeven langs de X-as en de totale flux (p/s) langs de Y-as. Neem voor elke week de parameter Total Flux (p/s) voor elke steekproefgroep en bepaal eventuele significante verschillen met behulp van de niet-parametrische Student's t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We genereerden borstkankercellijnen (MDA-MB-231, MCF-7 en MDA-MB-468) die GFP- en luciferasevectoren tot expressie brachten. Concreet werd dit bereikt door een sequentiële infectie. Eerst werden de borstkankercellijnen geïnfecteerd met een lentivirusvector die fluorescerende GFP tot expressie brengt. De GFP-positieve cellen (GFP+) werden 2 dagen na infectie gesorteerd (figuur 1A,B) en geïnfecteerd met de pLX304 Luciferase-V5 vector. Vervolgens werd blasticidin gebruikt om te selecteren op luciferase om de geïndiceerde (GFP +, Luc +) cellen te genereren. Om de in vitro luciferase-activiteit te valideren, toonden we een celnummerafhankelijke toename van de luciferase-activiteitsniveaus (figuur 1C). Daarnaast werd een lineaire correlatie gevonden tussen de luciferase-activiteit en het celgetal (figuur 1D).
Om de detectie van luciferase bij de muizen te bevestigen, werden alle drie de GFP +, Luc + borstkankercellijnen geïnjecteerd in het borstvetkussen van vrouwelijke NOD / SCID-muizen. Vervolgens werden de muizen elke twee weken onderworpen aan bioluminescentiemeting om de tumorgroeikinetiek te bepalen. We ontdekten dat tumorgroeikinetiek varieert tussen de cellijnen; het is sneller in de agressievere MDA-MB-231 en langzamer in de minder agressieve cellijnen MCF-7 en MDA-MB-468 (figuur 2).
Vervolgens werden de fluorescentiemetingen van de geïsoleerde tumoren gegenereerd door de MDA-MB-231 cellijn verkregen. Specifiek, 6 weken na injectie, werden de tumoren geoogst van de muizen om de GFP-fluorescentie te bevestigen; de tumoren bleken hun GFP-expressie te behouden (figuur 3A). Het volgende doel was om te bepalen of metastatische kolonievorming in realtime kon worden beoordeeld in de longen van een levende muis met behulp van de bioluminescentiemachine; positieve bioluminescentiemetingen werden verkregen uit de longen van de hele muis (figuur 3B). Om te verifiëren dat dit positieve gemetastaseerde kolonies waren, werden de longen geoogst en werden de gemetastaseerde kolonies waargenomen voor GFP en bioluminescentie (figuur 3C).
Figuur 1: Validatie van GFP-expressie en luciferase-activiteit in cellen. (A) De GFP-cellen werden gesorteerd op FACS. Representatieve afbeeldingen van MDA-MB-231 niet-GFP- en GFP+ -cellen. (B) MDA-MB-231, MCF-7 en MDA-MB-468 cellen waren geïnfecteerd met GFP-expressing virus, gevolgd door FACS-sortering. Een afbeelding van elke cellijn wordt weergegeven in brightfield (links) en GFP (rechts). De cellen werden vastgelegd onder een Nikon Eclipse 80i microscoop met een vergroting van 10x. Schaalstaven = 100 μm. (C) De bioluminescentie als gevolg van luciferase-activiteit in elke cel werd bepaald door een luminometer. Een toenemend aantal cellen (zoals in A) werd gezaaid in een zwarte 96-well plaat. De kleurenbalk vertegenwoordigt de intensiteit van luminescentie. (D) Een XY-plot die de luciferase-activiteit van MDA-MB-231-cellen aantoont (zoals gemeten in C). Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; SSC-A = gebied van zijdelings verspreide piek; GFP+ = GFP-positief; FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Kinetiek van tumorgroei werd bepaald door de bioluminescentiemachine. In vivo tumorgroeikinetiek werd wekelijks bepaald in NOD-SCID-muizen en de representatieve beelden werden vastgelegd met behulp van bioluminescentie voor (A) MDA-MB-231, (B) MCF-7, (C) MDA-MB-468. De kleurenbalk vertegenwoordigt de intensiteit van luminescentie. (D) Kwantificering van de luminescentieactiviteit wordt gepresenteerd als totale flux. E) MDA-MB-231-muizen; individuele lezing weergegeven als een plot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Verschillende benaderingen om tumorvorming en longmetastase te valideren. (A) De muizen werden geperfuseerd en de tumoren gegenereerd uit MDA-MB-231-cellen werden geoogst. De GFP-niveaus in de tumoren werden gemeten door de bioluminescentiemachine. (B) Longmetastase bij de hele muizen, zoals blijkt uit de bioluminescentie. (C) Om de aanwezigheid van metastasen te bevestigen, werden de longen geoogst en waargenomen onder SMZ18 Nikon Stereomicroscope (brightfield en GFP). Bioluminescente-Luc-monsters werden onmiddellijk na het euthanaseren van de muizen genomen. De kleurenbalk vertegenwoordigt de intensiteit van luminescentie. Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; Luc = luciferase; BLI = beeldvorming van bioluminescentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dierproeven zijn verplicht voor kankeronderzoek 7,8,9, en inderdaad zijn er veel protocollen ontwikkeld 3,6,10,11,12,13,14. De meeste van deze studies bepaalden het biologische effect echter pas aan het einde van de experimenten, en dus blijft de impact op tumorgroeikinetiek of metastasekolonisatie onbepaald. Hier bieden we een niet-invasieve dubbele bioluminescentiebenadering door cellen die GFP en luciferase tot expressie brengen in het borstvetkussen te enten. Met behulp van deze krachtige tool kunnen tumorontwikkeling en metastase bij muizen in realtime worden gevolgd14. Deze techniek bevat echter een paar kritische stappen, die extra voorzichtigheid vereisen. Een van de cruciale stappen voor het succes van dit experiment is bijvoorbeeld het verifiëren van de efficiëntie van infectie door de luciferase- en GFP-expressieniveaus in de cellen te controleren vóór muisinjectie. Zo moeten de blasticidindoseringen15 en het lentivirale productie16-protocol voor elke cellijn worden geoptimaliseerd om de experimentele efficiëntie te verhogen.
Enkele technische problemen kunnen van invloed zijn op het bioluminescentiesignaal in het in vivo experiment. Deze problemen omvatten de beweging van de muis tijdens de bioluminescentiemeting, die de beeldkwaliteit kan verstoren en zo de tumorkinetische curven kan beïnvloeden. De dieren moeten dus volledig worden verdoofd na de substraatinjectie en tijdens de hele procedure. Bovendien kan het tegelijkertijd plaatsen van meerdere dieren in de machine leiden tot inconsistentie in de luminescentiemeting, omdat muizen met een hoog signaal die van minder intensiteit kunnen maskeren. Daarom moeten de luminescentiemetingen voor elke muis afzonderlijk worden uitgevoerd.
Bij het uitvoeren van de in vitro bioluminescentiemeting is het van vitaal belang om het kweekmedium te vervangen door PBS, omdat het medium serum en andere supplementen bevat die het signaal kunnen verstoren. Bovendien is het noodzakelijk om de achtergrondlezing te elimineren door het luminescentiesignaal te meten van een monster dat alleen PBS (geen cellen) bevat.
Dit protocol beschrijft een niet-invasieve techniek om de groei van borstkankercellen en metastasen te meten. In het bijzonder beschrijft dit artikel de injectie van borstkankercellijnen, waarbij zowel GFP als luciferase in de borstvetmat van de muis tot expressie komen. Deze combinatie biedt een snelle en betrouwbare methode om gemetastaseerde kolonisatie in vivo en ex vivo te meten.
Ondanks de duidelijke voordelen van deze methode, heeft het enkele beperkingen. De primaire beperking is de behoefte aan een bioluminescentiemachine, omdat dit een relatief dure machine is en daarom niet altijd beschikbaar. Bovendien is elke lezing tijdrovend en kan de machine dus overboekt en niet beschikbaar zijn. Een andere beperking verwijst naar het protocol zelf. Om het bioluminescentiesignaal in de ex vivo monsters te detecteren, wordt aanbevolen om de muizen te euthanaseren en het monster onmiddellijk te onderzoeken. Deze stap is een tijdsbeperkende fase en is niet haalbaar voor een grote reeks experimenten.
Kortom, deze niet-invasieve bioluminescentietool is zeer gevoelig voor het detecteren van tumorontwikkeling en metastase bij muizen. Dit protocol is niet beperkt tot borstkanker en kan worden toegepast op andere carcinomen zoals long- en alvleesklierkanker. Bovendien, omdat het niet-invasief is, kan het worden toegepast om de werkzaamheid van geneesmiddelen tegen kanker12 en hun effecten op tumorgroeikinetiek in realtime te meten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs hebben bekendgemaakt dat ze geen belangenconflicten hebben.
Acknowledgments
Wij danken de leden van het Y.D.S. laboratorium. We willen het Wohl Institute for Translational Medicine in het Hadassah Medical Center, Jeruzalem, bedanken voor het bieden van de beeldvormingsfaciliteit voor kleine dieren. Deze studie werd ondersteund door de Research Career Development Award van het Israel Cancer Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL eppendorf tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 µL tips | Lifegene | LRT10 | |
| 1000 µL tips | Lifegene | LRT1000 | |
| 15 mL tubes | Lifegene | LTB15-500 | |
| 200 µL tips | Lifegene | LRT200 | |
| 6 well cell culture plate | COSTAR | 3516 | |
| 96 well Plates BLACK flat bottom | Bar Naor | BN30496 | |
| Automated Cell Counters | Thermofisher | A50298 | |
| BD FACSAria III sorter | BD | ||
| BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'') | BD | 302200 | |
| BD Plastipak Syringes 1 mL x 120 | BD | 303172 | |
| Corning 100 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430167 | |
| Corning 150 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430599 | |
| Countess cell counting chamber slides | Thermofisher | C10228 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Eclipse 80i microscope | Nikon | ||
| eppendorf Centrifuge 5810 R | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| FUW GFP | Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| HEK293T | Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| L-Glutamine Solution | Biological industries | 03-020-1A | |
| Living Image Software | PerkinElmer | bioluminescence measurement | |
| MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
| MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
| Pasteur pipettes | NORMAX | 2430-475 | |
| PBS | Hylabs | BP655/500D | |
| pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | #8455 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| pCMV-VSV-G | Addgene | #8454 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| Petri dish 90 mm (90x15) | MINI PLAST | 820-090-01-017 | |
| Pipettes 10ml | Lifegene | LG-GSP010010S | |
| Pipettes 25ml | Lifegene | LG-GSP010050S | |
| Pipettes 5ml | Lifegene | LG-GSP010005S | |
| pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid | Addgene | #98580 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | #107689 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Reagent Reservoirs | Bar Naor | BN20621STR200TC | |
| SMZ18 Stereo microscopes | Nikon | ||
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 190359400 | |
| Syringe filters | Lifegene | LG-FPV403030S | |
| Trypan Blue 0.5% solution | Biological industries | 03-102-1B | |
| Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1a | |
| Vacuum driven Filters | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
| Virusolve | disinfectant | ||
| VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade | Promega | P1043 | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Sigma Aldrich | #6366236001 |
References
- Waks, A. G., Winer, E. P. Breast cancer treatment: A review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
- Jin, X., Mu, P.
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3175 (2011).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
- Kocatürk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e51967 (2015).
- Baker, M.
- Wang, Y., Tseng, J. -C., Sun, Y., Beck, A. H., Kung, A. L. Noninvasive imaging of tumor burden and molecular pathways in mouse models of cancer. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 135-144 (2015).
- Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. -C. In vivo cell tracking with bioluminescence imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (1), 3-10 (2015).
- Paschall, A. V., Liu, K. An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), (2016).
- Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (115), e54040 (2016).
- Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2077 (2010).
- Lv, X., et al. Orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61173 (2020).
- Cheng, R. Y. S., et al. Studying triple negative breast cancer using orthotopic breast cancer model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60316 (2020).
- Bajikar, S. S., et al. Tumor-suppressor inactivation of GDF11 occurs by precursor sequestration in triple-negative breast cancer. Developmental Cell. 43 (4), 418-435 (2017).
- Khatib, A., et al. The glutathione peroxidase 8 (GPX8)/IL-6/STAT3 axis is essential in maintaining an aggressive breast cancer phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21420-21431 (2020).
