Summary
Nous introduisons trois méthodes de culture directe, la culture d’exposition directe et la culture d’exposition pour évaluer la cytocompatibilité in vitro des matériaux d’implants biodégradables. Ces méthodes in vitro imitent différentes interactions cellule-implant in vivo et peuvent être appliquées pour étudier divers matériaux biodégradables.
Abstract
Au cours des dernières décennies, les matériaux biodégradables ont été largement explorés pour des applications biomédicales telles que les implants orthopédiques, dentaires et craniomaxillo-faciaux. Pour dépister les matériaux biodégradables pour des applications biomédicales, il est nécessaire d’évaluer ces matériaux en termes de réponses cellulaires in vitro , de cytocompatibilité et de cytotoxicité. Les normes de l’Organisation internationale de normalisation (ISO) ont été largement utilisées dans l’évaluation des biomatériaux. Cependant, la plupart des normes ISO ont été établies à l’origine pour évaluer la cytotoxicité des matériaux non dégradables, offrant ainsi une valeur limitée pour le dépistage des matériaux biodégradables.
Cet article présente et discute trois méthodes de culture différentes, à savoir la méthode de culture directe, la méthode de culture d’exposition directe et la méthode de culture d’exposition pour évaluer la cytocompatibilité in vitro de matériaux d’implants biodégradables, y compris les polymères biodégradables, les céramiques, les métaux et leurs composites, avec différents types de cellules. La recherche a montré que les méthodes de culture influencent les réponses cellulaires aux matériaux biodégradables parce que leur dégradation dynamique induit des différences spatio-temporelles à l’interface et dans l’environnement local. Plus précisément, la méthode de culture directe révèle les réponses des cellules ensemencées directement sur les implants; la méthode de culture par exposition directe élucide les réponses des cellules hôtes établies entrant en contact avec les implants; et la méthode de culture d’exposition évalue les cellules hôtes établies qui ne sont pas en contact direct avec les implants, mais qui sont influencées par les changements dans l’environnement local dus à la dégradation des implants.
Cet article fournit des exemples de ces trois méthodes de culture pour étudier la cytocompatibilité in vitro des matériaux implantaires biodégradables et leurs interactions avec les cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse (BMSC). Il décrit également comment récolter, passer, cultiver, semer, fixer, tacher, caractériser les cellules et analyser les milieux et les matériaux de postculture. Les méthodes in vitro décrites dans cet article imitent différents scénarios de l’environnement in vivo , élargissant l’applicabilité et la pertinence des tests de cytocompatibilité in vitro de différents biomatériaux pour diverses applications biomédicales.
Introduction
Pendant des décennies, les matériaux biodégradables ont été largement étudiés et utilisés dans des applications biomédicales telles que les applications orthopédiques1,2, dentaires3,4 et craniomaxillo-faciales5. Contrairement aux implants et aux matériaux permanents, les métaux biodégradables, les céramiques, les polymères et leurs composites se dégradent progressivement dans le corps au fil du temps via différentes réactions chimiques dans l’environnement physiologique. Par exemple, les métaux biodégradables tels que les alliages de magnésium (Mg)1,6,7 et les alliages de zinc (Zn)8,9 sont des matériaux prometteurs pour les dispositifs de fixation osseuse. Leur biodégradabilité pourrait éliminer la nécessité de chirurgies secondaires pour retirer les implants après la cicatrisation osseuse. Les céramiques biodégradables telles que les ciments de phosphate de calcium (CPC) ont montré un potentiel intéressant pour le traitement des fractures ostéoporotiques de compression vertébrale dans la cyphoplastie percutanée10. Les CPC fournissent un soutien mécanique au corps vertébral fracturé et se dégradent progressivement après la guérison de la fracture.
Les polymères biodégradables, tels que certains polysaccharides et polyesters, ont également été largement explorés pour des applications biomédicales. Par exemple, l’hydrogel de chitosane en tant que polysaccharide biodégradable a montré ses capacités à prévenir les infections et à régénérer les tissus cutanés11. L’acide poly-L-lactique (PLLA), l’acide poly(glycolique) (PGA) et le poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA) sont des polyesters largement étudiés pour la fabrication d’échafaudages poreux 2D ou 3D pour des applications d’ingénierie tissulaire12,13,14. De plus, les matériaux composites intègrent deux phases ou plus de métaux, de céramiques et de polymères pour fournir des fonctions avancées pour un large éventail d’applications biomédicales15,16,17. Par exemple, les composites PLGA et phosphate de calcium peuvent être utilisés pour fabriquer des échafaudages biodégradables pour des applications telles que la réparation des défauts osseux du crâne18. Ces échafaudages et implants biodégradables pourraient soutenir et favoriser la croissance des cellules et des tissus, puis se dégrader progressivement dans le corps au fil du temps.
Comme le montre le tableau supplémentaire 1, différents matériaux biodégradables peuvent avoir des mécanismes, des produits et des taux de dégradation variés. Par exemple, les alliages de magnésium, tels que Mg-2 % en poids de Zn-0,5 % en poids de Ca (ZC21)1, Mg-4 % en poids de Zn-1 % en poids de Sr (ZSr41)19 et Mg-9 % en poids d’Al-1 % en poids de zinc (AZ91)20, se dégradent en réagissant avec l’eau, et leurs produits de dégradation comprennent principalement des ions Mg2+, des ions OH-, du gaz H2 et des dépôts minéraux. Le taux de dégradation des métaux biodégradables varie en fonction de leurs différentes compositions, géométries et environnements de dégradation. Par exemple, Cipriano et al.19 ont rapporté que les fils ZSr41 (Ø1,1 × 15 mm) perdaient 85 % de masse tandis que les fils Mg purs de même géométrie perdaient 40 % de masse après avoir été implantés dans les tibias du rat pendant 47 jours. Les matériaux céramiques biodégradables tels que l’hydroxyapatite (HA) et le phosphate β-tricalcique (β-TCP) peuvent se dégrader par dissolution liquide extracellulaire entraînée par solution ou se décomposer en petites particules, puis se dégrader via des processus de dissolution liquide extracellulaire et de résorption à médiation cellulaire. Les produits de dégradation de ces céramiques à base de phosphate de calcium peuvent inclure des ions Ca2+, des ions (PO4)3-, des ions OH- et des dépôts minéraux21. Le taux de dégradation des céramiques de phosphate de calcium est significativement affecté par leurs structures cristallines. Par exemple, Van Blitterswijk et al.22 ont rapporté que l’AH avec des micropores à 40 % vol. n’a pas perdu de masse tandis que β-TCP avec 40 % vol.% de micropores a perdu 30 ± 4 % de masse après avoir été implanté dans les tibias de lapins pendant 3 mois. Les polymères tels que PLGA14,23 peuvent se dégrader en raison de l’hydrolyse des liaisons esters en présence d’eau, et les produits de dégradation comprennent principalement les acides lactique et glycolique. Il peut s’écouler un mois avant que PLGA 50/50 et PLGA 95/5 n’atteigne une dégradation complète24.
Les tests de réponse cellulaire et de cytocompatibilité sont essentiels pour évaluer et dépister ces matériaux implantaires biodégradables pour des applications biomédicales. Cependant, les normes actuelles de l’Organisation internationale de normalisation (ISO), telles que l’ISO 10993-5:2009 « Évaluation biologique des dispositifs médicaux - Partie 5 Tests de cytotoxicité in vitro », ont été initialement conçues pour évaluer la cytotoxicité de biomatériaux non dégradables tels que les alliages Ti et les alliages Cr-Co in vitro25. Plus précisément, l’ISO 10993-5:2009 ne couvre que les essais de cytotoxicité in vitro de l’extrait, les essais de contact direct et les essais de contact indirect. Dans le test d’extrait, l’extrait est préparé en immergeant des échantillons dans des fluides d’extraction tels que des milieux de culture avec du sérum et des solutions salines physiologiques dans l’une des conditions de temps et de température standard. L’extrait collecté ou la dilution est ensuite ajouté dans la culture cellulaire pour étudier la cytotoxicité. Pour l’essai de contact direct, le contact direct entre l’échantillon et les cellules est obtenu en plaçant l’échantillon d’essai sur la couche cellulaire établie (adhérée). Dans le test de contact indirect, le milieu de culture contenant du sérum et de la gélose fondue est pipeté pour recouvrir les cellules établies. L’échantillon est ensuite placé sur la couche de gélose solidifiée avec ou sans filtre.
Les normes ISO ont montré certaines limites lorsqu’elles sont appliquées pour évaluer les matériaux biodégradables in vitro. Contrairement aux matériaux non dégradables, les comportements de dégradation des matériaux biodégradables sont dynamiques et peuvent changer à un moment différent ou dans des conditions environnementales variées (par exemple, température, humidité, composition du milieu et type de cellule). L’essai d’extrait évalue uniquement la cytotoxicité des produits de dégradation du matériau et ne reflète pas le processus dynamique de dégradation de l’échantillon. Les tests de contact direct et indirect de la norme ISO ne caractérisent que les interactions entre les cellules établies et les échantillons. De plus, dans l’essai de contact indirect, les matériaux et les cellules se trouvent dans différents microenvironnements qui ne reflètent pas l’environnement in vivo et ne capturent pas la dégradation dynamique des matériaux biodégradables.
L’objectif de cet article est de présenter et de discuter des méthodes d’essai de cytocompatibilité pour divers matériaux d’implants biodégradables afin de répondre aux limites susmentionnées des méthodes décrites dans les normes ISO actuelles. Les méthodes présentées dans cet article prennent en compte le comportement de dégradation dynamique des matériaux implantaires et les différentes circonstances des interactions cellule-matériau in vivo. Plus précisément, cet article fournit trois méthodes de test de cytocompatibilité, à savoir la culture directe, la culture d’exposition directe et la culture d’exposition pour divers matériaux biodégradables, y compris les polymères biodégradables, les céramiques, les métaux et leurs composites pour les applications d’implants médicaux.
Dans la méthode de culture directe, les cellules en suspension dans le milieu de culture sont directement ensemencées sur les échantillons, évaluant ainsi les interactions entre les cellules nouvellement ensemencées et les implants. Dans la culture d’exposition directe, les échantillons sont placés directement sur la couche cellulaire établie pour imiter les interactions des implants avec les cellules hôtes établies dans le corps. Dans la culture d’exposition, les échantillons sont placés dans leurs inserts de puits respectifs, puis introduits dans les puits de culture avec des cellules établies, ce qui caractérise les réponses des cellules établies aux changements dans l’environnement local induits par la dégradation de l’implant lorsqu’elles n’ont pas de contact direct avec les implants. Les méthodes de culture directe et de culture par exposition directe évaluent les cellules directement ou indirectement en contact avec les matériaux de l’implant dans le même puits de culture. La culture d’exposition caractérise indirectement les cellules en contact avec les matériaux de l’implant à une distance prescrite dans le même puits de culture.
Cet article présente une description détaillée des tests de cytocompatibilité pour différents matériaux biodégradables et de leurs interactions avec les cellules modèles, c’est-à-dire les cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse (BMSC). Les protocoles comprennent la récolte, la culture, l’ensemencement, la fixation, la coloration et l’imagerie des cellules, ainsi que des analyses des matériaux et des milieux de postculture, qui s’appliquent à une variété de matériaux d’implants biodégradables et à un large éventail de types de cellules. Ces méthodes sont utiles pour le criblage de matériaux biodégradables pour différentes applications biomédicales en termes de réponses cellulaires et de cytocompatibilité in vitro.
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Protocol
Ce protocole a été approuvé par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Californie à Riverside (UCR) pour la récolte de cellules et de tissus. Un rat femelle Sprague-Dawley (SD) de 12 semaines est montré à titre d’exemple dans la vidéo. Les rats femelles et mâles plus jeunes sont préférés.
1. Préparation de la culture cellulaire
REMARQUE : Les trois méthodes de culture décrites dans cet article sont généralement applicables aux différents types de cellules adhérentes. Ici, les BMSC récoltés sur des sevrés de rats seront introduits comme exemple pour la préparation de la culture cellulaire. Selon leur pertinence pour des applications médicales spécifiques, différents types de cellules peuvent être utilisés, y compris des cellules primaires prélevées sur des animaux ou des donneurs humains et des lignées cellulaires à partir d’une banque de cellules / tissus.
- Récolte de BMSC à partir de sevrages de rats
REMARQUE : Le diagramme schématique de la figure 1 montre les étapes à suivre pour récolter les BMSC des sevrés de rats.- Euthanasier le rat Sprague Dawley (SD) par inhalation de CO2 .
- Retirez la peau, les muscles et les tissus conjonctifs pour disséquer le fémur du rat euthanasié. Placer les os fémoraux dans un tube conique de 15 mL (polypropylène) contenant un milieu de culture cellulaire. Placez les tubes coniques sur de la glace jusqu’au moment de l’extraction cellulaire.
REMARQUE: Tibia peut également être utilisé pour récolter des BMSC. Le milieu de culture cellulaire est le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S). - Transférer les os dans une boîte de Petri dans l’armoire de sécurité biologique. Coupez les extrémités de l’os à l’aide d’une lame chirurgicale et rincez la moelle osseuse dans un tube conique de 50 mL (polypropylène) en lavant la cavité de la moelle osseuse avec un milieu de culture cellulaire à l’aide d’une seringue avec une aiguille de 251/2 G.
REMARQUE: Insérez une seringue avec une aiguille de 18 G dans le support avec de la moelle osseuse. Lentement et doucement, prenez et distribuez le milieu pour briser le gros morceau de moelle jusqu’à ce qu’aucun agglomérat cellulaire / tissulaire visible ne soit présent. - Filtrer la suspension de la cellule à l’aide d’un filtre de 70 μm, suivi d’une centrifugation à 126 × g (1 000 tr/min) pendant 5 min pour obtenir les pastilles de la cellule.
- Aspirer le milieu surnageant et reconstituer avec 10 mL de milieux frais. Pipettez doucement de haut en bas pour remettre les cellules en suspension à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL.
- Pipettez la suspension directement sur le fond intérieur d’une fiole T-75 et ajoutez du support pour porter le volume à 25 mL. Cultiver les cellules dans un incubateur dans un environnement de culture cellulaire stérile standard (c.-à-d. 37 °C, atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2 et 95 % d’air).
- Après 3-7 jours, rincez les cellules non adhérentes en aspirant l’ancien milieu et en reconstituant avec du milieu frais. Continuez à cultiver et à nourrir les cellules avec un milieu frais jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour le passage cellulaire, la congélation ou l’utilisation dans une expérience.
- Entretien des cellules
- Changez régulièrement le milieu de culture cellulaire pour éliminer les déchets cellulaires et reconstituer les nutriments environ tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 90% à 100%. À 90% de confluence, le passage, le gel ou l’utilisation des cellules dans une expérience.
- Cellules de passage
REMARQUE: Le passage, également appelé sous-culture, est un terme qui s’applique chaque fois que des cellules sont transférées d’une culture à une autre. Les cellules fraîchement récoltées sont au stade de passage 0 (P0). Les quantités de solution d’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (trypsine-EDTA) et de milieux décrits dans cet article sont pour une fiole de T-75.- Vérifiez les cellules au microscope optique pour confirmer qu’elles sont confluentes à 90 %.
- Aspirer le milieu de la fiole cellulaire.
- Distribuer 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans la fiole à l’aide d’une pipette sérologique. Bercez doucement la fiole pour rincer les cellules avec du PBS; aspirer tous les PBS.
REMARQUE: Cette étape sert de rinçage supplémentaire pour s’assurer qu’aucune cellule morte ou aucun déchet cellulaire ne sera transféré pendant le passage. - Distribuer 3 mL de trypsine-EDTA dans la fiole cellulaire directement sur la surface des cellules. Secouez doucement la fiole pour vous assurer que toute la surface avec les cellules est recouverte par la trypsine-EDTA.
- Placez la fiole cellulaire avec de la trypsine-EDTA dans l’incubateur pendant 5 minutes pour permettre aux cellules de se détacher.
- Après 5 min dans l’incubateur, vérifiez les cellules au microscope optique pour confirmer que les cellules sont détachées. Si certaines cellules ne se sont pas détachées, appuyez doucement sur le côté de la fiole et vérifiez à nouveau la fiole.
- Ajouter 9 mL de milieu frais dans la fiole cellulaire pour diluer la trypsine-EDTA. Cela fournit des protéines plus accessibles auxquelles la trypsine-EDTA peut se lier au lieu de lyser les cellules.
- Pipeter les cellules dans un milieu et de la trypsine-EDTA et les distribuer dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger les cellules à 126 × g (1 000 tr/min) pendant 5 min.
- Sans perturber la pastille cellulaire, aspirer le milieu avec de la trypsine-EDTA.
- Ajouter 5 à 10 mL de milieu frais dans le tube de centrifugeuse et remettre doucement en suspension les cellules dans le milieu à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL.
- Pipeter les cellules en suspension dans le milieu hors du tube de centrifugeuse et diviser le volume en 2-3 flacons de culture frais. Ajouter suffisamment de milieu pour porter le volume moyen total à 25 mL pour chaque flacon.
REMARQUE: Le ratio de division pendant la sous-culture peut varier en fonction des types de cellules et des caractéristiques de croissance spécifiques. - Vérifiez les cellules sous un microscope optique et replacez-les dans l’incubateur.
- Congélation de cellules
- Vérifiez les cellules au microscope optique pour confirmer qu’elles sont confluentes à 90 %.
- Répétez les étapes 1.2.2.2 à 1.2.2.9.
- Ajouter 900 μL de milieu frais au tube de centrifugeuse avec une micropipette de 100-1000 μL. Remettre lentement et doucement les cellules en milieu à l’aide de la même micropipette.
- Transférer la suspension cellulaire de 900 μL dans un cryovial. Ajouter 100 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO).
- Dès que possible, placez le cryovial dans un récipient en mousse cylindrique conçu pour réguler la diminution de la température (voir le Tableau des matériaux). Placez le récipient en mousse dans le congélateur à -80 °C.
- Décongélation des cellules
- Décongeler les cellules congelées au bain-marie. Prenez un tube conique stérile de 15 mL rempli de 5 mL de milieu frais, placez les cellules dans le tube conique et centrifugez à 126 × g (1 000 tr/min) pendant 5 min.
- Aspirer le milieu contenant du DMSO.
- Ajouter 5 à 10 mL de milieu frais au tube conique de 15 mL de cellules. Pipettez lentement et doucement de haut en bas pour remettre les cellules en suspension.
- Pipeter les cellules en suspension dans un milieu à partir du tube conique de 15 mL et distribuer dans une nouvelle fiole T-75. Lors de la distribution des cellules, utilisez un mouvement de balayage pour répartir les cellules aussi uniformément que possible au fond de la fiole cellulaire.
- Ajouter suffisamment de milieu frais pour porter le volume moyen total à 25 mL pour chaque fiole T-75.
- Vérifiez les cellules sous un microscope optique et replacez la fiole dans l’incubateur.
2. Préparation et stérilisation des échantillons
- Préparation des échantillons
- Utilisez des plaques traitées par culture tissulaire telles que des plaques de 6, 12, 24, 48 ou 96 puits pour les expériences de culture cellulaire décrites dans cet article. Sélectionnez le type de plaques de culture tissulaire et le volume de milieu dans chaque puits en fonction de différents plans expérimentaux tels que la dimension de l’échantillon.
- Stériliser ou désinfecter tous les échantillons biodégradables avant la culture cellulaire.
REMARQUE: La désinfection est acceptable pour in vitro les études lorsque les échantillons sont sujets à des changements chimiques et/ou de surface dans certaines conditions de stérilisation impliquant une chaleur élevée, un oxydant et/ou des radicaux. Les méthodes de stérilisation ou de désinfection pour différents types d’échantillons varient en fonction des différentes propriétés des matériaux, tels que les polymères, les métaux et les céramiques. Le processus de stérilisation ou de désinfection peut impliquer de la chaleur, du gaz, des radiations, des produits chimiques, une haute pression ou une combinaison de ceux-ci.- Métaux biodégradables
- En général, utilisez le rayonnement ultraviolet (UV) pour désinfecter les métaux biodégradables pour les études in vitro .
REMARQUE: Par exemple, Zhang et al. ont rapporté que des échantillons d’alliage de magnésium pur (Mg) et de ZC21 Mg ont été désinfectés sous rayonnement UV pendant 4 h avant d’être utilisés dans les études cellulaires1. Pour les études in vivo, les échantillons doivent généralement être stérilisés. Pour de nombreux métaux biodégradables tels que le magnésium ou les alliages de magnésium, l’autoclavage à la vapeur doit être évité car ces échantillons pourraient être oxydés ou corrodés dans l’eau6. Un plat en quartz est recommandé pour la désinfection UV car il offre une meilleure transparence UV que la plupart des verres et des plastiques. - Stériliser les échantillons d’alliage Mg à feu sec dans un four ou un autoclave à la plage de température de 100-200 °C.
REMARQUE: Comme certains alliages métalliques peuvent encore s’oxyder à la surface à des températures élevées dans l’air, un rayonnement de haute intensité peut être utilisé comme alternative dans certains cas. Cependant, les rayonnements de haute intensité tels que les rayonnements alpha ou gamma doivent être évités lors de la stérilisation de fines feuilles métalliques. Il peut provoquer un déplacement d’atomes dans les matériaux, modifiant la microstructure des matériaux. - Utiliser la stérilisation au gaz à l’oxyde d’éthylène (EtO) comme méthode alternative pour les métaux biodégradables sensibles à la chaleur et aux radiations26.
- En général, utilisez le rayonnement ultraviolet (UV) pour désinfecter les métaux biodégradables pour les études in vitro .
- Céramique biodégradable
- Généralement, désinfectez les céramiques biodégradables à l’aide d’un rayonnement UV ou d’une solution d’éthanol à 70% avant les études in vitro .
NOTE : Par exemple, Liu et coll. ont rapporté que les échantillons de phosphate de calcium ont été désinfectés par immersion dans de l’éthanol à 70 % pendant 1 h et exposés à la lumière UV pendant 12 h de chaque côté avant d’être utilisés dans des tests de cytocompatibilité in vitro27. - Utilisez des autoclaves pour stériliser les céramiques biodégradables si les températures élevées et la vapeur d’eau n’endommagent pas leurs compostions et microstructures.
REMARQUE: Certaines céramiques peuvent être affectées par l’autoclavage. Par exemple, un changement de phase et une rugosité de surface ont été constatés lorsque des céramiques de zircone stabilisées à l’yttria ont été autoclavées à 121 °C pendant 15 minutes. De plus, les CPC ne peuvent pas être stérilisés par autoclavage à la vapeur car les échantillons réagiront avec l’eau. - Utilisez d’autres méthodes de stérilisation telles que le rayonnement cobalt-60 pour les céramiques de zircone stabilisées à l’yttria et les échantillons de CPC susmentionnés28.
- Généralement, désinfectez les céramiques biodégradables à l’aide d’un rayonnement UV ou d’une solution d’éthanol à 70% avant les études in vitro .
- Polymères biodégradables
- En général, désinfectez les polymères biodégradables à l’aide de rayons UV ou d’éthanol à 70% avant de les utiliser dans des études cellulaires in vitro.
REMARQUE: Certains polymères peuvent subir des changements chimiques sous le rayonnement UV. Pour la stérilisation, un traitement aux rayons gamma tel que le rayonnement Cobalt-60 peut être utilisé. Par exemple, les poudres d’amidon ont été stérilisées sous rayonnement cobalt-60 avant d’être utilisées dans des études cellulaires in vitro29. - Matériaux polymères autoclaves pouvant résister à des températures et à une humidité élevées.
REMARQUE: Par exemple, les polymères tels que le polypropylène peuvent être autoclavés car ils peuvent tolérer des températures d’autoclavage (c’est-à-dire 121-134 ° C). Certains polymères tels que la polycaprolactone (PCL) ne peuvent pas être autoclavés en raison de leurs points de fusion relativement bas (c’est-à-dire environ 60 °C)30. - Utilisez le gaz EtO pour stériliser les matériaux polymères sensibles à la stérilisation par la chaleur ou par rayonnement.
- En général, désinfectez les polymères biodégradables à l’aide de rayons UV ou d’éthanol à 70% avant de les utiliser dans des études cellulaires in vitro.
- Métaux biodégradables
3. Méthodes de culture cellulaire
- Méthodes de culture directe
REMARQUE : Le diagramme schématique de la figure 2A montre les étapes de la méthode de culture directe. Dans cet article, les BMSC ont été cultivés sur une plaque dérivée de Mg placée à l’intérieur des puits d’une plaque traitée par culture tissulaire de 12 puits à titre d’exemple pour illustrer la méthode de culture.- Suivez les étapes décrites aux étapes 1.2.2.1-1.2.2.10 pour obtenir la suspension cellulaire.
- Utilisez une fiole confluente à 90 % pour déterminer la concentration cellulaire dans la suspension cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre. Diluer la suspension cellulaire à l’aide d’un milieu frais à une concentration cellulaire prescrite nécessaire à l’étude cellulaire in vitro.
REMARQUE: La densité d’ensemencement des cellules est déterminée par la conception expérimentale. Par exemple, des densités cellulaires de 2 000 à 40 000 cellules/cm2 ont été utilisées dans différentes études cellulaires avec des matériaux biodégradables. - Placez les échantillons (plaque Mg) au centre des 12 plaques de culture tissulaire bien traitées. Rincer séquentiellement les plaques de culture avec 2 mL de PBS et 2 mL de DMEM pour calibrer la pression osmotique dans des conditions stériles. Ajouter 3 mL de suspension cellulaire diluée dans chaque puits sur les échantillons d’intérêt.
- Cultiver les cellules dans un incubateur dans des conditions de culture cellulaire standard pendant 24 h.
REMARQUE: Le temps de culture peut être plus long ou plus court que 24 h selon la conception expérimentale.
- Cultures à exposition directe
REMARQUE : Le diagramme schématique de la figure 2B montre les étapes de la culture d’exposition directe.- Comme décrit aux étapes 3.1.1 et 3.1.2, préparer la suspension cellulaire avec les concentrations requises de cellules en fonction de la conception expérimentale pour différents types de cellules et applications prévues.
- Rincer les plaques de culture avec 2 mL de PBS et 2 mL de DMEM séquentiellement pour calibrer la pression osmotique dans des conditions stériles. Ajouter 3 mL de la suspension cellulaire diluée dans chaque puits. Cultivez les cellules dans l’incubateur humidifié dans des conditions de culture cellulaire standard pendant 24 h ou jusqu’à ce que les cellules atteignent 50 à 80% de confluence.
REMARQUE: Le niveau de confluence cellulaire peut varier selon les types de cellules et la conception expérimentale. - Après 24 h, rincez les cellules dans la plaque du puits avec du PBS à l’aide d’une pipette pour éliminer les cellules mortes flottantes.
- Placez les échantillons désinfectés ou stérilisés directement sur les cellules adhérentes. Ajouter 3 mL de milieu frais dans chaque puits.
- Cultiver les cellules dans des conditions de culture cellulaire standard pendant encore 24 heures.
REMARQUE: Le temps de culture peut être plus long ou plus court que 24 h selon la conception expérimentale.
- Cultures d’exposition
REMARQUE : Le diagramme schématique de la figure 2C montre les étapes de la méthode de culture d’exposition.- Les premières étapes de la préparation cellulaire sont les mêmes que celles de la culture d’exposition. Comme décrit aux étapes 3.1.1 et 3.1.2, préparer la suspension cellulaire avec les cellules souhaitées. Semblable aux étapes 3.2.1 et 3.2.2, ensemencez les cellules dans la plaque de puits à la densité souhaitée et cultivez-les dans un incubateur dans des conditions de culture cellulaire standard pendant 24 h.
- Après 24 h, rincer les cellules adhérentes avec du PBS pour éliminer les cellules mortes flottantes, puis ajouter 3 mL de milieu frais dans chaque puits.
- Ensuite, placez les échantillons dans les inserts de puits avec une taille de pore membranaire de 0,4 μm et placez les inserts de puits avec les échantillons dans chaque puits avec les cellules.
- Cultiver les cellules dans des conditions de culture cellulaire standard pendant encore 24 heures.
REMARQUE: Le temps de culture peut être plus long ou plus court que 24 h selon la conception expérimentale.
4. Caractérisation post-culture des cellules
REMARQUE: Pour la culture directe et la culture d’exposition directe, fixez, coloriez, imagez et analysez les cellules adhérentes sur les plaques de puits et les échantillons. Pour la culture d’exposition, analysez les cellules collées aux plaques de puits.
- Fixation des cellules
- Recueillir le milieu de postculture de chaque puits dans un tube conique correspondant de 15 mL pour une analyse plus approfondie. Prélever tous les échantillons après la culture pour une analyse plus approfondie.
- Rincez les cellules adhérentes sur les échantillons et les plaques de puits 3 fois en utilisant PBS.
- Ajouter 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA, formol tamponné neutre à 10 %) dans chaque plaque de puits. Remettez le couvercle sur la plaque du puits et laissez le PFA réagir pendant 20 min.
- Après 20 min, aspirer le PFA et le distribuer dans un flacon poubelle. Rincez la plaque du puits 3 fois à l’aide de PBS pour éliminer le PFA et transférez les déchets dans le flacon de déchets.
- Coloration cellulaire
- Préparez les stocks de travail des agents colorants en suivant les instructions du fabricant.
REMARQUE: Par exemple, Alexa Fluor 488 Phalloidin est utilisé pour colorer la F-actine, et 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) est utilisé pour colorer les noyaux cellulaires. Le temps de coloration peut être réduit si les échantillons se dégradent rapidement dans les solutions de coloration. - Ajouter 200-400 μL d’agent colorant alexa Fluor 488 Phalloidin dilué à chaque puits pour couvrir les cellules sur la plaque du puits et l’échantillon. Enveloppez la plaque du puits dans du papier d’aluminium pour éviter toute exposition à la lumière et laissez l’Alexa Fluor 488 Phalloidin réagir pendant 20 minutes à température ambiante.
- Collectez l’agent colorant Alexa Fluor 488 Phalloidin et distribuez-le dans le flacon de déchets correspondant. Rincez la plaque du puits 3 fois à l’aide de PBS pour éliminer l’excès de phalloïdine Alexa Fluor 488 et distribuez le PBS usagé dans le flacon de déchets correspondant.
- Ajouter 200 à 400 μL de DAPI dilué à chaque puits pour couvrir les cellules du puits et de l’échantillon. Enveloppez la plaque du puits dans du papier d’aluminium et laissez le DAPI réagir pendant 5 min à température ambiante.
- Collectez le DAPI et distribuez-le dans le flacon de déchets correspondant. Rincez la plaque du puits 3 fois à l’aide de PBS pour éliminer le DAPI et distribuez le PBS usagé dans le flacon de déchets correspondant.
- Préparez les stocks de travail des agents colorants en suivant les instructions du fabricant.
- Imagerie cellulaire
- Après la coloration, imagez les cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence. Dans la mesure du possible, prenez des images de cellules à contraste de phase en plus des images de fluorescence. Imagez les cellules sur les échantillons biodégradables dès que possible ou immédiatement après la coloration pour éviter ou réduire les changements possibles causés par la dégradation continue des échantillons. Stocker les cellules dans les plaques de puits dans une solution tampon à 2-8 °C après la fixation, et imager les cellules dès que possible après la coloration pour éviter la perte de signaux de fluorescence.
- Pour la culture directe et la culture par exposition directe, imager et évaluer deux types de cellules : (1) les cellules sur les échantillons (en contact direct avec les échantillons) et (2) les cellules adhérentes sur la plaque de puits entourant les échantillons (contact indirect avec les échantillons), comme le montre la figure 3A.
- Pour la culture d’exposition, comme le montre la figure 3B, utilisez un guide d’image lorsque vous prenez les images de fluorescence des cellules pour déterminer si la réponse cellulaire serait différente en réponse au gradient de dégradation dynamique des échantillons. Imagez et analysez séparément les cellules situées dans la zone située à l’intérieur de l’anneau intérieur (à 3,5 mm du centre) et de l’anneau extérieur (à 7 mm du centre).
Remarque : Le guide d’image est utilisé pour définir la distance entre les cellules et les échantillons. - Pour chaque échantillon et puits dans les plaques de culture, prélever au hasard au moins cinq images de chaque zone d’intérêt où les cellules sont en contact direct ou indirect avec les échantillons à une distance prédéfinie.
- Analyse d’images
- Pour toutes les images cellulaires obtenues à partir de l’étape 4.3, quantifiez la morphologie cellulaire en mesurant la zone d’étalement cellulaire et le rapport d’aspect à l’aide d’un logiciel tel que ImageJ pour l’analyse d’images.
- Comptez le nombre de cellules dans chaque zone de l’image. Calculez la densité d’adhérence des cellules dans des conditions de contact direct et indirect comme le nombre de cellules par unité de surface.
5. Analyses postculturelles des milieux et des échantillons
- Mesurer le pH du milieu de postculture.
REMARQUE: Certains échantillons modifient la valeur du pH du milieu pendant leur dégradation. Par exemple, les métaux biodégradables tels que les alliages de magnésium augmentent généralement la valeur du pH du milieu en raison de leur dégradation31. En revanche, les polymères biodégradables tels que le PLGA diminuent souvent la valeur du pH du milieu lorsqu’ils se dégradent32. La mesure de la valeur du pH du milieu de postculture peut indiquer la dégradation de ces échantillons in vitro.- Avant la fixation cellulaire, prélever le milieu de postculture comme à l’étape 4.1.1.
- Mesurez les valeurs de pH du milieu de postculture dans chaque puits immédiatement après la collecte, à l’aide d’un pH-mètre précalibré.
REMARQUE: Le pH du milieu peut dériver au fil du temps en raison des conditions environnementales telles que le niveau de CO2 et la température, qui doivent être prises en considération.
- Analyser les compositions moyennes pour le comportement de dégradation des échantillons biodégradables. Pour certains échantillons qui provoquent un changement de couleur du milieu, mesurez la valeur de densité optique (O.D.) du milieu de postculture à l’aide d’un spectrophotomètre ou d’un lecteur de microplaques pour déterminer le comportement de dégradation. Alternativement, utilisez la spectroscopie ultraviolet-visible (UV-VIS) et la réflectance totale atténuée par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR-ATR) pour analyser les produits de dégradation dans le milieu de postculture.
REMARQUE: La mesure des produits de dégradation dans le milieu post-culture est utile pour comprendre le comportement de dégradation des échantillons. L’une des approches les plus courantes consiste à mesurer les ions d’intérêt dans le milieu de postculture à l’aide d’un spectromètre d’émission plasma-optique à couplage inductif (ICP-OES). L’ICP-OES peut être utilisé pour mesurer les compositions des milieux de postculture des métaux et des céramiques, mais peut ne pas convenir aux polymères. Les polymères sont généralement constitués de carbone, d’hydrogène et d’oxygène, et la quantification précise de ces éléments est difficile pour ICP-OES.- Conformément à l’étape 5.1.2 pour la mesure du pH, recueillir et diluer le milieu à l’aide d’un facteur de dilution souhaitable pour des mesures optimales des concentrations d’ions.
- Mesurer les concentrations des ions d’intérêt dans le milieu de postculture à l’aide d’un ICP-OES.
- Analyse postculturelle d’échantillons
REMARQUE: Après l’étude cellulaire in vitro , les échantillons biodégradables peuvent changer de dimension, de masse, de morphologie de surface, de microstructure et de composition. L’analyse postculturenelle des échantillons aide à comprendre le mécanisme de dégradation des échantillons.- Après la culture cellulaire, prenez les photographies des échantillons pour montrer les changements possibles dans la dimension, la couleur, la morphologie et d’autres caractéristiques visibles de l’échantillon.
- Sécher ou déshydrater les échantillons de postculture et mesurer la masse, la dimension et le volume de l’échantillon pour quantifier tout changement de masse, de dimension et de volume.
- Utilisez un microscope électronique à balayage (MEB) pour caractériser la microstructure et la morphologie des échantillons. Utilisez la spectroscopie à rayons X à dispersion d’énergie (EDX) et la diffraction des rayons X (XRD) pour caractériser la composition et la phase des produits de dégradation sur les échantillons. Utilisez FTIR-ATR pour détecter la liaison chimique sur les surfaces de l’échantillon.
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Representative Results
La figure 4 montre les images de fluorescence représentatives des BMSC dans des conditions de contact direct et indirect en utilisant différentes méthodes de culture. La figure 4A,B montre les BMSC dans des conditions de contact direct et indirect après la même culture directe de 24 heures avec des alliages de magnésium ZC2111. Les alliages ZC21 se composent de 97,5 % en poids de magnésium, de 2 % en poids de zinc et de 0,5 % en poids de calcium. Les cellules qui n’ont pas de contact direct avec les échantillons d’alliage ZC21 se propagent mieux que celles qui ont un contact direct avec les échantillons. Comme le montre la figure 4C,D, les cellules soumises à des conditions de contact direct et indirect présentent toutes une morphologie normale après une exposition directe de 24 heures avec des hydrogels d’acide hyaluronique (HyA) réticulés par des ions Fe3+. Toutefois, le nombre de cellules sous la condition de contact indirect est inférieur à celui sous la condition de contact direct33. Une autre étude a rapporté les effets de la dégradation des alliages ZSr41 (ф = 1,1 mm) sur les BMSC après une culture d’exposition de 24 heures19. Les alliages ZSr41 sont constitués de 95 % en poids de magnésium, de 4 % en poids de zinc et de 1 % en poids de strontium. La figure 4E montre les images de fluorescence représentatives des BMSC adhérant au puits de culture à un emplacement situé à 3,5 mm du centre du puits, après une culture d’exposition de 24 heures avec les broches biodégradables19.
La figure 5 montre les exemples de données pour la densité d’adhésion cellulaire quantifiée. Comme le montre la figure 5A, dans la culture d’exposition directe (24h_DE) sur 24 heures, les BMSC en contact direct avec le ZC21 ont une densité d’adhésion cellulaire significativement plus élevée que tout autre groupe. Dans la culture directe de 24 heures (24h_D), les BMSC en contact direct avec le ZC21 présentent une densité d’adhérence cellulaire significativement plus élevée que le groupe Mg, significativement inférieure à celle du groupe de référence Glass, mais aucune différence statistique par rapport au groupe témoin de l’alliage Ti (T64). Comme le montre la figure 5B, dans la condition de contact indirect de la culture d’exposition directe, la densité d’adhérence BMSC est significativement plus élevée pour le groupe ZC21 que pour le groupe Mg. Cependant, il ne montre aucune différence significative par rapport aux groupes témoins T64 et cellulaires uniquement. Dans la condition de contact indirect de la culture directe, la densité d’adhésion BMSC est significativement plus élevée pour le groupe ZC21 que pour le groupe Mg, mais ne montre aucune différence significative par rapport aux groupes témoins T64 et cellules seules1.
La figure 6A montre la valeur du pH du milieu post-culture après la culture d’exposition directe et la culture directe. Pour la culture d’exposition directe, les valeurs de pH du milieu varient de 8,3 à 8,4 pour tous les échantillons. Dans la culture directe, les valeurs de pH de moyen varient de 7,9 à 8 dans tous les groupes. La figure 9B montre la concentration d’ions Mg2+ dans le milieu de postculture. Dans la culture d’exposition directe et la culture directe, les concentrations d’ions Mg2+ dans les groupes ZC21 et Mg sont significativement plus élevées que dans tout autre groupe témoin1. La figure 7 montre les modèles XRD pour ZSr41 et Mg pur après une culture d’exposition de 3 jours. Dans la figure 7A, les phases cristallines de Mg, Ca(OH)2, ZnO, MgO∙H2O, Ca(HPO4)(H2O)2 et Ca5(PO4)3(OH) (c.-à-d. hydroxyapatite ou HA), Mg17Sr2 se trouvent à la surface de ZSr41. Dans la figure 7B, les phases cristallines de Mg, Ca(OH)2, Mg3(PO4)2, Mg7(PO4)2(OH)8, Ca2P2O7∙5H2O sont à la surface de Mg19 pur. La figure 8A montre la superposition d’images SEM et de cartes EDX de la composition élémentaire de surface pour mgO revêtu de MgO et le contrôle des substrats MgO et du verre après 24 h de culture directe avec des BMSC. La figure 8B montre la composition élémentaire quantitative de surface des surfaces de l’échantillon, indiquant différents dépôts formés pendant la culture cellulaire34.
Figure 1 : Diagramme schématique montrant les étapes de récolte des BMSC des sevrés de rats. Ce chiffre est modifié à partir de 35. Abréviation : BMSC = cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Diagramme schématique montrant les trois méthodes de culture cellulaire. (A) Culture directe, (B) Culture d’exposition directe et (C) Culture d’exposition. Ce chiffre est modifié à partir de 36. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Diagrammes schématiques montrant la culture directe et la culture d’exposition directe. (A) Cellules en contact direct et en contact indirect en culture directe et en culture d’exposition directe. (B) Utilisation d’un guide d’imagerie pour prendre des photos des cellules collées à la plaque du puits à différentes distances du centre des échantillons en culture d’exposition. La figure 3B est modifiée à partir de 37. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Images de fluorescence représentatives des BMSC. (A, B) Conditions de contact direct et indirect après une culture directe de 24 h avec des alliages ZC21. (C, D) Culture d’exposition directe avec des hydrogels HyA. (E) Sur la plaque de culture après une culture d’exposition de 24 heures avec des alliages ZSr41. Barres d’échelle = 100 μm. A et B sont reproduites à partir de 1; C et D sont reproduits à partir de 33; et E est reproduit à partir de 19. Abréviations : BMSC = cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse; HyA = acide hyaluronique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Résultats quantitatifs pour la densité d’adhésion cellulaire des BMSC. (A) Conditions de contact direct et (B) de contact indirect après la culture d’exposition directe de 24 heures (24 h_DE) et la culture directe (24 h_D). Ce chiffre est reproduit à partir de 1. Abréviations : BMSC = cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse; DE = culture d’exposition directe; D = culture directe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Résultats représentatifs pour les analyses post-culture du milieu après la culture d’exposition directe et la culture directe de 24 heures. (A) valeurs de pH et (B) concentrations d’ions Mg2+. Ce chiffre est reproduit à partir de 1. Abréviations : DE = culture d’exposition directe; D = culture directe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Résultats de postculture représentatifs pour les analyses de phase d’échantillons métalliques biodégradables après 3 jours de culture avec des BMSC. (A) Spectre de diffraction des rayons X pour ZSr41. (B) Spectre XRD pour Mg pur. Ce chiffre est reproduit à partir de 19. Abréviations : BMSC = cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse; XRD = diffraction des rayons X. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Résultats de postculture représentatifs pour les analyses de surface d’échantillons après 24 h de culture directe avec des BMSC, y compris la microstructure de surface, la morphologie et la composition. (A) Superposition d’images SEM et de cartes EDX de la composition élémentaire de surface pour mgO revêtu de MgO, contrôle Mg non revêtu et référence en verre. (B) Composition élémentaire de surface (at. %) quantifiée à partir d’analyses EDX. Barres d’échelle = 200 μm. Reproduit à partir de 34. Abréviations : BMSC = cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse; MEB = microscopie électronique à balayage; EDX = spectroscopie à rayons X à dispersion d’énergie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau supplémentaire 1 : Mécanismes, produits et taux de dégradation pour différents types de matériaux, et résultats recueillis pour l’analyse de l’échantillon et du milieu de postculture. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
Différentes méthodes de culture cellulaire peuvent être utilisées pour évaluer la cytocompatibilité in vitro de biomatériaux d’intérêt pour divers aspects d’applications in vivo. Cet article présente trois méthodes de culture in vitro , à savoir la culture directe, la culture d’exposition directe et la culture d’exposition, pour imiter différents scénarios in vivo où des matériaux d’implant biodégradables sont utilisés à l’intérieur du corps humain. La méthode de culture directe est principalement utilisée pour évaluer le comportement des cellules nouvellement ensemencées qui adhèrent directement aux matériaux de l’implant et les entourent. La méthode de culture par exposition directe imite le scénario in vivo où les matériaux de l’implant entrent en contact direct avec les cellules et les tissus établis. La méthode de culture d’exposition peut être utilisée pour montrer comment les produits de dégradation des matériaux de l’implant et les changements dans le microenvironnement local peuvent affecter les cellules et les tissus établis qui ne sont pas directement en contact avec les matériaux de l’implant.
Dans la culture directe, les cellules nouvellement ensemencées dans des conditions de contact direct et indirect sont évaluées. Dans la culture d’exposition directe, les cellules établies peuvent être évaluées dans des conditions de contact direct et indirect. Dans la culture d’exposition, seules les cellules établies dans des conditions de contact indirect peuvent être évaluées. Les cellules nouvellement ensemencées dans des conditions de contact direct dans la culture directe sont affectées par les propriétés du matériau et les changements induits par le matériau dans le milieu, tels que les changements dans la concentration d’ions et la valeur du pH.
Les propriétés du matériau mentionnées ci-dessus peuvent inclure la morphologie de surface, l’hydrophilie, l’énergie libre de surface, la rigidité et la composition. Les cellules nouvellement ensemencées dans des conditions de contact indirect dans la méthode de culture directe et toutes les cellules établies dans les méthodes de culture d’exposition directe et de culture d’exposition sont principalement affectées par les changements induits par le matériau dans le milieu. Les trois méthodes différentes décrites dans cet article sont plus proches du scénario pratique de l’environnement in vivo que les méthodes conventionnelles telles que la méthode de l’extrait moyen. La méthode de l’extrait moyen évalue uniquement la cytotoxicité des produits de dégradation du matériau et ne reflète pas le processus dynamique de dégradation de l’échantillon. Dans les méthodes de culture décrites dans cet article, comme les cellules sont cultivées avec les matériaux de l’implant, le changement dynamique des matériaux biodégradables et de l’environnement du milieu peut affecter les cellules in situ.
Bien qu’aucune étude in vitro ne puisse remplacer complètement les études in vivo , les études in vitro sont complémentaires et peuvent fournir des données précieuses de manière peu coûteuse et efficace. Les études in vivo incluent généralement toutes les variables multiples dans un modèle, tandis que la culture cellulaire in vitro peut étudier les effets d’un seul facteur sur les interactions cellule-matériau. Les méthodes présentées dans cet article peuvent imiter différents scénarios des études in vivo pertinentes. Nous pouvons créer des liens entre différentes variables pour fournir des suppléments pour les études in vivo . Un modèle in vivo n’inclut généralement que le même tissu dans un type d’animal. Cependant, les études in vitro peuvent inclure différents types de cellules dans une culture, ce qui peut étudier les effets combinés de différentes variables sur les interactions cellule-matériau. De plus, il est relativement difficile d’étudier les effets des changements environnementaux dynamiques sur les interactions cellule-matériau dans des modèles in vivo . Les méthodes décrites dans cet article peuvent étudier les effets des changements dynamiques tels que les concentrations d’ions dans le milieu sur le comportement cellulaire38.
Les méthodes présentées dans cet article sont applicables pour comprendre la cytocompatibilité in vitro de tous les types de matériaux, y compris les polymères, les métaux, les céramiques, les composites et les nanoparticules, et pour déterminer leurs interactions avec différentes cellules, bactéries ou champignons en fonction des applications prévues. Par exemple, Xu et al. ont évalué la cytocompatibilité in vitro des hydrogels à base de HyA avec les BMSC via la méthode de culture par exposition directe33. Les densités d’adhésion cellulaire et les morphologies cellulaires ont été analysées dans des conditions de contact direct et indirect. La cytotoxicité des composites d’hydrogel à base de HyA pourrait être liée aux concentrations d’ions Fe3+ et H+ libérées par les hydrogels HyA réticulés au cours de l’expérience de culture cellulaire. Tian et coll. ont cultivé des cellules urothéliales humaines (HUC) avec quatre alliages Mg différents pendant 24 h et 48 h en utilisant la méthode de culture d’exposition et leurs produits de dégradation insolubles de MgO et Mg(OH)2 pendant 24 h en utilisant la culture d’exposition directe pour étudier la cytocompatibilité et les comportements de dégradation des alliages mg contenant du zinc (Zn) et du strontium (Sr) pour une application potentielle de stent urétéral39 . Dans cette étude, ZSr41_B contenant 4 % en poids de Zn et 0,5 % en poids de Sr s’est avérée avoir une meilleure cytocompatibilité avec les HUC parmi tous les autres alliages Mg-4Zn-xSr dans les cultures d’exposition de 24 h et 48 h. Les résultats ont également montré qu’aucune cellule adhérente visible n’a été trouvée sur la plaque du puits lorsque les concentrations d’oxyde de magnésium (MgO) et d’hydroxyde de magnésium (Mg(OH)2) dépassaient 1,0 mg/mL après 24 h de culture d’exposition directe. Par conséquent, Tian et al. ont conclu que la réduction des taux de dégradation des alliages Mg est nécessaire pour contrôler les effets secondaires possibles vers une traduction clinique future. Wetteland et al. ont créé un nanocomposite à base de polymère en dispersant des nanoparticules d’hydroxyapatite (nHA) et de nMgO dans un polymère PLGA biodégradable40. Ce nanocomposite a été étudié en cultivant des BMSC avec différents échantillons en utilisant la méthode de culture directe. Les résultats ont démontré qu’une meilleure dispersion des nanoparticules dans le polymère pouvait améliorer l’adhérence du BMSC sur le nHA/PLGA mais diminuer la viabilité cellulaire sur le nMgO/PLGA. Sur la base des résultats d’études cellulaires in vitro, Wetteland et al. ont rapporté des informations précieuses pour la conception de nanocomposites céramiques / polymères optimaux pour différentes applications biomédicales.
Les morphologies et le nombre de cellules peuvent être observés et quantifiés dans des images de fluorescence à l’aide d’un logiciel d’analyse quantitative d’images tel que ImageJ. Nous pouvons étudier les effets de différents matériaux sur l’adhésion et la morphologie des cellules en quantifiant les densités d’adhésion cellulaire, les rapports d’aspect cellulaire et les zones d’étalement cellulaire pour différents groupes d’échantillons. La morphologie des cellules du groupe témoin vierge, où seules les cellules sont cultivées en milieu, pourrait servir d’étalon de référence sans aucune influence des matériaux de l’échantillon. Nous pouvons déterminer si les matériaux de l’échantillon affecteraient l’adhésion et la morphologie cellulaires in vitro en comparant les densités d’adhésion cellulaire et les morphologies cellulaires des groupes d’échantillons avec celles du témoin à blanc. La zone d’étalement cellulaire révèle la préférence d’adhésion cellulaire à la surface de l’échantillon, montrant comment les cellules interagissent avec les matériaux de l’échantillon. Dans cet article, nous avons réduit le temps de réaction pour la coloration DAPI à un temps inférieur au temps optimal recommandé par le fournisseur, car les échantillons biodégradables, tels que le magnésium pur, se dégradent rapidement dans les solutions aqueuses. La morphologie des cellules adhérant aux matériaux biodégradables peut changer si le processus de coloration prend trop de temps et que le temps d’exposition à l’eau est trop long pour les échantillons. De plus, pour les cellules adhérant aux matériaux biodégradables, des images cellulaires doivent être prises rapidement pour réduire tout changement possible dans l’adhésion et la morphologie des cellules en raison de la dégradation de l’échantillon.
Outre la collecte des résultats des cellules, les analyses de milieux de postculture et d’échantillons sont importantes car elles fourniront des données précieuses pour analyser le mécanisme de dégradation, les produits et les taux des matériaux implantaires. Par exemple, les polymères biodégradables tels que le PLGA peuvent générer des sous-produits de dégradation acides tels que les acides hydroxyle-carboxyliques monomères ou oligomères au cours de la culture cellulaire32, ce qui peut influencer la croissance et la prolifération cellulaires. En revanche, les métaux biodégradables, tels que le magnésium et ses alliages, produisent des ions hydroxyde et de l’hydrogène gazeux au cours de leur dégradation31, ce qui peut augmenter considérablement le pH local, et une alcalinité sévère peut avoir des effets néfastes sur les fonctions cellulaires locales. Diverses céramiques biodégradables peuvent également augmenter le pH du milieu41. En général, les cellules ont besoin d’une plage de pH spécifique dans le milieu de culture pour fonctionner correctement, et on sait que l’augmentation ou la diminution des valeurs de pH dans les fluides corporels est nocive pour la vie42. La mesure du pH du milieu de postculture est utile pour comprendre tout dommage potentiel que les matériaux d’échantillons biodégradables peuvent causer en culture cellulaire. Par conséquent, il est nécessaire de mesurer la valeur du pH du milieu de postculture pour comprendre les mécanismes potentiels de la façon dont ces matériaux biodégradables affectent les cellules.
Il est important de mesurer les concentrations d’ions cruciales dans le milieu de post-culture pour les matériaux biodégradables. Par exemple, Cortez Alcaraz et al. ont mesuré les concentrations d’ions Mg2+ et Ca2+ du milieu de postculture lorsqu’ils ont étudié des échantillons de magnésium enduits de nanoparticules d’oxyde de magnésium en utilisant la culture directe avec des BMSC34. Les concentrations d’ions magnésium indiquent les propriétés de dégradation de différents échantillons in vitro pendant la culture cellulaire, et les concentrations d’ions calcium peuvent fournir des informations sur les dépôts de calcium pendant la prolifération cellulaire. Xu et al. ont mesuré les concentrations d’ions Fe3+ du milieu de postculture lorsqu’ils ont étudié les hydrogels HyA en utilisant la culture d’exposition directe avec des BMSC. Ils ont utilisé des ions Fe3+ pour ajuster les densités de réticulation de HyA33. Les ions Fe3+ peuvent diminuer la valeur du pH du milieu de culture, et des concentrations élevées d’ions Fe3+ peuvent être toxiques pour les cellules. Par conséquent, il est important de mesurer les concentrations des ions d’intérêt pour améliorer la cytocompatibilité des matériaux biodégradables et de leurs produits de dégradation associés.
Nous pouvons collecter différentes données pour analyser les interactions cellule-matériau pour différents matériaux. Par exemple, comme le montre le tableau supplémentaire 1, les alliages Mg se dégradent en réagissant avec l’eau, et les produits de dégradation peuvent inclure les ions Mg2+ et OH- , le gaz H2 et certains autres produits de dégradation insolubles tels que Mg(OH)2. XRD, SEM et EDX, qui pourraient être utilisés pour déterminer le dépôt minéral formé sur le matériau. Nous pouvons étudier les effets de la concentration d’ions Mg2+ et des valeurs de pH dans le milieu sur les comportements cellulaires. De plus, nous pouvons utiliser ces résultats pour étudier l’évolution du gaz lors de la dégradation des métaux. Des études in vitro ont rapporté que le niveau de tolérance critique du gaz H2 était de <0,01 mL / cm2 / jour, ce qui a été largement utilisé pour filtrer les alliages de magnésium pour des applications d’implants temporaires. Essentiellement, la quantité d’évolution du gaz dépend du taux de dégradation des alliages de magnésium. Dans un autre exemple, la PLGA se dégrade en raison de l’hydrolyse de ses liaisons esters en présence d’eau. Les produits de dégradation de l’acide lactique et de l’acide glycolique, ainsi que les valeurs de pH dans le milieu, ont pu être étudiés pour analyser les interactions cellule-matériau. Les méthodes décrites dans cet article comprennent la mesure des ions libérés et des valeurs de pH dans les milieux de culture cellulaire et le changement de masse des matériaux, qui peuvent être utilisés pour estimer le taux de dégradation des matériaux.
Différents matériaux se comportent généralement différemment in vitro et in vivo, et les méthodes d’études de cytocompatibilité doivent être choisies en fonction de l’environnement d’application et du type de matériau. Pour les applications orthopédiques, il est souhaitable d’évaluer les interactions entre les cellules osseuses et les implants concernés lorsqu’ils sont en contact direct les uns avec les autres. La méthode de culture directe pourrait être utilisée pour étudier les interactions entre les cellules nouvellement ensemencées et l’implant. Dans les applications cardiovasculaires, comme les cellules établies entreront directement ou indirectement en contact avec les matériaux d’endoprothèse implantés, des méthodes de culture et de culture d’exposition directe peuvent être utilisées pour évaluer la cytocompatibilité des métaux biodégradables pour les applications cardiovasculaires. Nous pensons que les méthodes in vitro décrites dans cet article sont réalisables pour fournir des preuves initiales de la cytocompatibilité des matériaux implantaires biodégradables. Les méthodes de culture doivent être modifiées pour différents matériaux avec des mécanismes, des produits et des taux de dégradation variés. Par exemple, le temps de culture de différents matériaux peut être modifié en fonction des taux de dégradation variés de différents types de matériaux. Différents résultats peuvent être recueillis en fonction de différents mécanismes de dégradation et produits des matériaux.
En résumé, il est important d’analyser les cellules, le milieu et les échantillons de matériaux qualitativement et quantitativement, avant et après la culture cellulaire in vitro , pour comprendre les effets des matériaux implantaires biodégradables et de leurs produits de dégradation sur la cytocompatibilité. Les trois méthodes de culture présentées dans cet article peuvent être utilisées pour étudier un large éventail de matériaux biodégradables, y compris les polymères biodégradables, les céramiques et les métaux pour les applications d’implants médicaux et d’ingénierie tissulaire. Ces études cellulaires in vitro sont précieuses pour le criblage de matériaux biodégradables, l’optimisation de la conception de dispositifs implantables et d’échafaudages au stade précoce du développement du produit et la réduction de la toxicité potentielle pour les cellules.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Les auteurs apprécient le soutien financier de la National Science Foundation des États-Unis (NSF CBET award 1512764 et NSF PIRE 1545852), des National Institutes of Health (NIH NIDCR 1R03DE028631), de la Regents Faculty Development Fellowship de l’Université de Californie (UC) et du Committee on Research Seed Grant (Huinan Liu) et de la UC-Riverside Dissertation Research Grant (Jiajia Lin). Les auteurs apprécient le Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis (CFAMM) à l’UC-Riverside pour l’utilisation du SEM/EDS et le Dr Perry Cheung pour l’utilisation des instruments XRD. Les auteurs apprécient également Thanh Vy Nguyen et Queenie Xu pour l’édition partielle. Les auteurs tiennent également à remercier Cindy Lee d’avoir enregistré la narration de la vidéo. Toutes les opinions, constatations et conclusions, ou recommandations exprimées dans cet article sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les points de vue de la National Science Foundation ou des National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipette | VWR | 490019-704 | |
| 12-well tissue-culture-treated plates | Thermo Fisher Scientific | 353043 | |
| 15 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-666 | |
| 18 G needle | BD | 305196 | |
| 25½ G needle | BD | 305122 | |
| 4′,6-diamidino-2- phenylindole dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
| 50 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-658 | |
| 70 μm nylon strainer | Fisher Scientific | 50-105-0135 | |
| Alexa Flour 488-phalloidin | Life technologies | A12379 | |
| Biological safety cabinet | LABCONCO | Class II, Type A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Rotor F-35-6-30, Centrifuge5430 | |
| Clear Fused Quartz Round Dish | AdValue Technology | FQ-4085 | |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-19AIC | |
| CoolCell Freezer Container | Corning | 432000 | foam container designed to regulate temperature decrease |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 5000-1020 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| EDX analysis software | Oxford Instruments | AztecSynergy | |
| Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) | FEI | 50mm2 X-Max50 SDD | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Inc. | SH30910 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Formaldehyde | VWR | 100496-496 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | ||
| Inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES) |
PerkinElmer | Optima 8000 | |
| Optical microscope | VWR | VistaVision | |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific, Inc., | 15070063 | |
| pH meter | VWR | model SB70P | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 97062-730 | |
| Scanning electronic microscope (SEM) | FEI | Nova NanoSEM 450 | |
| surgical blade | VWR | 76353-728 | |
| Tissue Culture Flasks | VWR | T-75, MSPP-90076 | |
| Transwell inserts | Corning | 3460 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid solution (Trypsin-EDTA) | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| X-ray diffraction instrument (XRD) | PANalytical | Empyrean Series 2 |
References
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