Summary
Denne protokol beskriver en metode til at udføre brud på voksne mus og overvåge helingsprocessen.
Abstract
Frakturreparation er en væsentlig funktion af skelettet, der ikke pålideligt kan modelleres in vitro. En museskademodel er en effektiv tilgang til at teste, om et gen, genprodukt eller lægemiddel påvirker knoglereparation, fordi murine knogler rekapitulerer de stadier, der observeres under helbredelse af menneskelige brud. Når en mus eller et menneske brækker en knogle, initieres en inflammatorisk reaktion, og periosteum, en stamcelleniche, der omgiver selve knoglen, aktiveres og udvides. Celler, der bor i periosteum, differentierer derefter for at danne en vaskulariseret blød callus. Overgangen fra den bløde callus til en hård callus sker, når de rekrutterede skeletstamceller differentierer sig til mineraliserende celler, og brobygningen mellem de brudte ender resulterer i knogleforeningen. Den mineraliserede callus gennemgår derefter ombygning for at genoprette den oprindelige form og struktur af den helede knogle. Frakturheling er blevet undersøgt hos mus ved hjælp af forskellige skadesmodeller. Alligevel er den bedste måde at rekapitulere hele denne biologiske proces på at bryde igennem tværsnittet af en lang knogle, der omfatter begge kortikater. Denne protokol beskriver, hvordan en stabiliseret, tværgående lårbensbrud sikkert kan udføres for at vurdere heling hos voksne mus. En kirurgisk protokol, der omfatter detaljerede høst- og billeddannelsesteknikker til at karakterisere de forskellige stadier af brudheling, er også tilvejebragt.
Introduction
Frakturer, brud i kontinuiteten af knogleoverfladen, forekommer i alle segmenter af befolkningen. De bliver alvorlige hos mennesker, der har skrøbelige knogler på grund af aldring eller sygdom, og sundhedsomkostningerne ved skrøbelighedsfrakturer forventes at overstige 25 milliarder dollars om 5 år 1,2,3,4,5. Forståelse af de biologiske mekanismer, der er involveret i reparation af brud, ville være et udgangspunkt for at udvikle nye terapier, der sigter mod at forbedre helingsprocessen. Tidligere forskning har vist, at der ved brud forekommer fire væsentlige trin, der gør det muligt for knoglen at helbrede: (1) dannelse af hæmatomet; (2) dannelse af en fibrocartilaginous callus; (3) mineralisering af den bløde callus til dannelse af knogle; og (4) ombygning af den helede knogle 6,7. Mange biologiske processer aktiveres for at helbrede bruddet med succes. For det første initieres et akut proinflammatorisk respons umiddelbart efter et brudpå 6,7. Derefter aktiveres periosteum og udvides, og periosteale celler differentierer sig til chondrocytter for at danne en brusk callus, der vokser for at udfylde det hul, der efterlades af de forstyrrede knoglesegmenter 6,7,8,9. Neurale og vaskulære celler invaderer den nydannede callus for at tilvejebringe yderligere celler og signalmolekyler, der er nødvendige for at lette reparation 6,7,8,9,10. Ud over at bidrage til callusdannelse differentierer periosteale celler sig også til osteoblaster, der lægger vævet knogle i brobygningscallus. Endelig ombygger osteoklaster den nydannede knogle for at vende tilbage til sin oprindelige form og lamellære struktur 7,8,9,10,11. Mange grupper udviklede musemodeller af brudreparation. En af de tidligere og oftest anvendte brudmodeller hos mus er Einhorn-tilgangen, hvor en vægt falder på benet fra en bestemt højde12. Manglen på kontrol over vinklen og den kraft, der påføres for at fremkalde bruddet, skaber en masse variation i placeringen og størrelsen af knoglediskontinuiteten. Efterfølgende resulterer det i variationer i det specifikke frakturhelingsrespons, der observeres. Andre populære tilgange er kirurgisk indgreb for at producere en tibial monokortikal defekt eller stressfrakturer, procedurer, der inducerer forholdsvis mildere helbredende reaktioner10,13. Variabilitet i disse modeller skyldes primært den person, der udfører proceduren14.
Her giver en detaljeret museknoglebenskademodel mulighed for kontrol over bruddet for at give en reproducerbar skade og muliggøre kvantitativ og kvalitativ vurdering af reparation af lårbensbrud. Specifikt introduceres et fuldstændigt gennembrud i lårbenene hos voksne mus og stabiliserer brudenderne for at tage højde for den rolle, fysisk belastning spiller i knogleheling. Metoderne til høst af væv og billeddannelse af de forskellige trin i helingsprocessen ved hjælp af histologi og mikrocomputertomografi (microCT) er også detaljeret angivet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beskrevne dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee i Harvard Medical Area. 12 uger gamle C57BL/6J-mus (hanner og hunner) blev anvendt i denne protokol. C57BL/6J han- og hunmus opnår maksimal knoglemasse omkring 12 ugers alderen med lårben, der er brede nok til at passe til en stabiliserende stift, hvilket gør dem til en passende stamme at bruge til denne protokol15.
1. Forberedelse til operationen
- Autoklave det kirurgiske udstyr, herunder kirurgisk saks, lige tang, buede tang, kirurgiske klemmer og diamantskærehjul (se Materialetabel) for at minimere risikoen for infektion.
- Placer et rent musebur på en varmepude for at lette postkirurgisk genopretning. Indstil varmepuden til at nå en temperatur mellem 37-45 °C.
- Placer musen under anæstesi ved hjælp af et isoflurankammer. Indstil induktionsiltstrømmen til 2 L/min, isofluraninduktionen til 2-4%, vedligeholdelsesnæsekeglenilt til 2 L/min, og vedligeholdelsesisofluranen er 1,4 %.
- Bekræft, at musens vejrtrækning er stabil, og at de ikke reagerer på en tåklemme. Påfør et tyndt lag oftalmisk salve på hvert øje for at forhindre hornhinde ridser. Overfør musen til en steril pude og oprethold anæstesi ved hjælp af en næsekegle for at levere isofluran kontinuerligt i samme hastighed som i trin 1.3.
BEMÆRK: Brug af 12 uger gamle mus eller ældre anbefales, da lårben fra yngre mus kan være for tynde til at rumme en stabiliserende stift. - Musen injiceres subkutant med 0,05 mg/kg legemsvægt af buprenorphin med langsom frigivelse (se materialetabel).
- Brug en elektrisk trimmer til at barbere en 2 x 2 cm firkant på begge lår svarende til lårbenets placering.
- Desinficere det barberede område ved hjælp af sterilt gasbind eller vatpinde for at sprede et lag jod efterfulgt af en skylning med 70% ethanol (figur 1A).
2. Kirurgi
- Brug en steril skalpel til at lave et 5 mm snit i det barberede, desinficerede område og skræl huden væk for at udsætte den underliggende fascia.
- Brug lige tang og fin saks til delikat at gribe og skære fascia direkte, der dækker lårbenet for at udsætte musklen. Et 5 mm snit af fascia er tilstrækkeligt til at få adgang til den underliggende muskel.
- Brug et par lige tang til forsigtigt at adskille musklen fra lårbenet med minimal vævsskade.
- Når lårbenet er synligt, skal du skubbe de buede tang under lårbenet mellem den adskilte muskel og knogle. Lad tangen langsomt åbne for at opretholde muskeladskillelse og sikre lårbenet for at lette et rent snit.
BEMÆRK: Lårbenet skal forblive udsat og adskilt fra muskler og hud, når tangen ikke holdes, som vist i figur 1B. - Lav et tværgående snit midt på lårbensakslen ved hjælp af en håndholdt sav på indstillingen med lav effekt (se Materialetabel for den anvendte klinge og det anvendte roterende værktøjssæt).
BEMÆRK: Når lårbenet er helt skåret, oprettes to brudender: den proksimale sektion (fastgjort til hoftebenet) og den distale sektion (fastgjort til knæet, også kendt som kvælningsleddet). Undgå at skære lårbenet i en enkelt bevægelse. Lav i stedet 3-5 afleveringer, indtil lårbenet er helt skåret igennem. Dette er afgørende for at undgå overophedning af det omgivende væv og generering af betydeligt knogleaffald, hvilket påvirker helingen negativt. - Indsæt en styrenål (23 G x 1 TW IM, 0,6 mm x 25 mm) (se Materialetabel) i marvhulen i den distale sektion. Brug fingrene til forsigtigt at dreje nålen, når du skubber for at tråde gennem knæleddet (figur 1C).
- Fjern styrenålen fra den distale ende, og gentag på den proksimale ende ved hjælp af den samme blide vridningsbevægelse for at skubbe styrenålen gennem hofteleddet. Lad styrenålen stå i den proksimale ende, med spidsen kommet ud af huden (figur 1D).
BEMÆRK: For at stabilisere brudenderne blev en styrenål først brugt til at skabe en vej gennem brudenderne, og derefter blev en stabiliserende stift gevindskåret gennem denne vej for at sikre brudenderne14.
- Fjern styrenålen fra den distale ende, og gentag på den proksimale ende ved hjælp af den samme blide vridningsbevægelse for at skubbe styrenålen gennem hofteleddet. Lad styrenålen stå i den proksimale ende, med spidsen kommet ud af huden (figur 1D).
- Indsæt stabiliseringsstiften (nål, 27 G x 1 1/4, 0,4 mm x 30 mm) (se Materialetabel) i spidsen af styrenålen (figur 1E). Skub forsigtigt, så den stabiliserende stift kommer ind, når styrenålen forlader marvhulen i den proksimale ende.
- Kassér styrenålen. Brug pincet til at holde og justere den distale ende med den proksimale ende, og fortsæt med at tråde den stabiliserende stift gennem det distale marvhulrum, indtil den kommer ud af knæleddet ved hjælp af den vej, der er lavet i 2.6 (figur 1F).
BEMÆRK: Den stabiliserende stift skal nu stikke ud fra hoften og knæleddet.
- Kassér styrenålen. Brug pincet til at holde og justere den distale ende med den proksimale ende, og fortsæt med at tråde den stabiliserende stift gennem det distale marvhulrum, indtil den kommer ud af knæleddet ved hjælp af den vej, der er lavet i 2.6 (figur 1F).
- Brug den kirurgiske klemme til at trække spidsen af stiften for at bringe de proksimale og distale sektioner tæt sammen, så de næppe rører. Justering af brudenderne med tang, hvis det er nødvendigt, og fold enderne af den stabiliserende stift mod brudstedet ved hjælp af den kirurgiske klemme (se Materialetabel).
- Fjern plasten fra bunden af nålen ved hjælp af trådskærere. Brug klemmen til at dreje begge ender af stiften, indtil de er stumpe for at undgå indre vævsskader.
BEMÆRK: Brudenderne er nu låst på plads, så musen kan lægge vægt på det skadede ben. Stiften er sikret, hvis brudenderne ikke er i stand til at adskille. En trådskærer kan også bruges til at stumpe enderne. Den stabiliserende stift skal forblive på plads i hele undersøgelsens varighed, indtil musen er aflivet. Forsøg på at fjerne stiften vil sandsynligvis destabilisere brudresponsen og forårsage skade på dyret. Stiften kan fjernes ved dissektion.
- Fjern plasten fra bunden af nålen ved hjælp af trådskærere. Brug klemmen til at dreje begge ender af stiften, indtil de er stumpe for at undgå indre vævsskader.
- Brug lige tang til at omplacere musklen på lårbenet. Brug buede tang til at klemme enderne af huden sammen og lukke åbningen ved hjælp af sårklemmer.
BEMÆRK: Luk ikke huden for tæt med klemmerne, da musen ellers undgår at lægge vægt på dette ben. Begrænsning af fysisk belastning under genopretning kan forsinke helingsprocessen. - Gentag trin 2.2 til 2.4 på det andet ben, og luk såret uden at udføre lårbensbruddet.
BEMÆRK: Denne sham-opererede lårben tjener som den kontralaterale kontrol. - Træk isofluraneksponeringen tilbage, placer musen i det opvarmede bur, og sørg for, at de genvinder bevidstheden inden for 10-15 minutter.
- Overvåg musens aktivitet og snitsted dagligt i 5 dage efter operationen for tegn på nød eller infektion.
BEMÆRK: Hvis dyret viser tegn på smerte, ikke spiser og / eller tøver med at gå på bagbenene, skal du konsultere veterinærpersonale og administrere yderligere smertestillende midler. - Fjern sårklemmerne 10 dage efter operationen.
BEMÆRK: Hvis såret ikke ser ud til at være lukket efter 10 dage, skal du kontakte dyrlægen og IACUC, inden du fjerner klemmerne.
3. Vævshøst
- Aflive musene via CO2 -indånding efterfulgt af cervikal dislokation.
BEMÆRK: Denne procedure er i overensstemmelse med panelet for eutanasi fra American Veterinary Medical Association. - Brug en saks og tang til at fjerne huden fra begge museben, forskyde lårbenet fra hoftebenet og skære tilstødende muskler for at frigøre benet.
BEMÆRK: Undgå at fjerne for mange muskler omkring lårbenet, da callus kan løsnes eller beskadiges. - Undgå den stabiliserende stift, skær gennem knæleddet for at adskille lårbenet fra skinnebenet.
- Dissekere omkring de distale og proksimale dele af lårbenet for at udsætte enderne af den stabiliserende stift.
- Skær de foldede stumpe ender af stiften med en hård trådskærer, så kun den lige del af stiften er tilbage. Brug tang til langsomt og forsigtigt at skubbe den stabiliserende stift ud af lårbenet.
BEMÆRK: Hvis stiften ikke let glider ud, må du ikke anvende kraft, da dette kan løsne callus og beskadige prøven. Prøv i stedet at dreje stiften og fjerne den delikat. Fjernelse af stiften kan også være lettere efter fiksering.
4. Histologi - Alcian Blue / Eosin / Orange G farvning
BEMÆRK: Alcian Blue / Orange G / Eosin farvning bruges rutinemæssigt til at visualisere brusk (blå) og knoglen (lyserød). Bruskarealet kan kvantificeres som en andel af det samlede callusareal (figur 2A,B).
- Fastgør lårben i 10% neutral bufferet formalin natten over ved 4 °C.
- De faste prøver vaskes i fosfatbufret saltvand (PBS).
- Anbring prøver i 0,5M EDTA, pH 8,0 på en langsomt roterende ryster i 2 uger. Skift EDTA-løsning hver anden dag for at sikre effektiv afkalkning.
BEMÆRK: Der kræves ingen specifik omdrejningstal for rysteren; Sikre, at væsken strømmer i beholderen for at dække alle prøverne. Fuldstændig afkalkning kan testes ved røntgen af lårbenene. - For at behandle prøverne til paraffinindlejring inkuberes dem i følgende opløsninger (1 time hver): 70% EtOH, 95% EtOH, 100% EtOH, 100% EtOH, Xylen, Xylen, Paraffin, Paraffin.
- Integrer prøverne i paraffin til sektionering.
- Skær 5-7 μm tykke langsgående sektioner af de brækkede lårben ved hjælp af et mikrotome.
- Deparaffiniser sektionerne ved at inkubere dem i 2 bade Xylen (5 minutter hver).
- Rehydrer sektionerne ved at inkubere i følgende ethanolgradient (2 minutter hver): 100% EtOH, 100% EtOH, 80% EtOH, 70% EtOH.
- Anbring rutsjebaner i ledningsvand i 1 minut.
- Lav opløsningerne af Alcian blå, Syrealkohol, Ammoniumvand og Eosin/Orange G til histologi som nævnt i Supplerende fil 1.
BEMÆRK: De foreslåede volumener af hver opløsning skal være tilstrækkelige til fuldstændigt at nedsænke diasene til farvningen. - Læg dias i syrealkohol i 30 s og inkuber i Alcian blå i 40 min.
- Vask forsigtigt under den løbende vandhane, indtil vandet er klart i ca. 2 min.
- Dyp diasene hurtigt i syrealkohol i 1 s.
- Skyl som beskrevet i trin 4.9.
- Inkuber i ammoniumvand i 15 s.
- Skyl som beskrevet i trin 4.9.
- Placer i 95% EtOHfor 1 min og inkuber i Eosin / Orange G i 90 s.
- Dehydrer diasene hurtigt med en enkelt dukkert i 70% EtOH, 80% EtOH og 100% EtOH.
- Placer dias i Xylene i 1 minut for at rydde diasene.
- Påfør monteringsmedier og et dækslip til billeddannelse.
BEMÆRK: Til molekylær analyse kan RNA og protein isoleres fra callus. Disseker forsigtigt musklen under et dissekerende omfang og adskil callus fra den underliggende knogle ved hjælp af en skalpel.
5. Mikrokt
BEMÆRK: I de senere stadier af heling kan microCT udføres for at afbilde og kvantificere mineraliseringen i den hårde callus og brudgabet. I C57BL/6J-mus mineraliseres callus normalt og påvises ved hjælp af microCT efter 10 dage efter fraktur (dpf) (figur 2C).
- Fastgør lårben i 10% neutral bufferet formalin natten over ved 4 °C.
BEMÆRK: MicroCT kan udføres på de samme lårben, der anvendes til histologi, så længe det gøres før EDTA-afkalkning (trin 4.3). Når du bruger de samme lårben til begge teknikker, skal du udføre microCT, hente prøverne og gå til trin 4.3. - De faste prøver vaskes i fosfatbufret saltvand (PBS) og opbevares i 70 % EtOH.
- Udfør mikroCT med en isotrop voxelstørrelse på 7 μm ved et energiniveau på 55 kVP og en intensitet på 145 μA (se materialetabellen).
- Konturer mikroCT-skiverne til at omfatte callus og udelukke den kortikale knogle.
BEMÆRK: Da callus bliver mere mineraliseret med tiden, kan tærsklen justeres for at visualisere og måle callusvolumen på forskellige stadier. - Opnå knoglevolumen indeholdt i calluskonturerne som en måling af callusvolumenet.
BEMÆRK: Brudgabet kan måles direkte på microCT-skiverne som den afstand, der er optaget af pausen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I C57BL / 6J-mus fuldender en vellykket operation de tidligere nævnte helingstrin med ringe eller ingen lokal inflammatorisk respons eller periosteal involvering i det sham-opererede kontralaterale lårben. Et hæmatom dannes et par timer efter operationen, og periosteum aktiveres for at rekruttere skeletstam til chondrogenese. Forskellige cellepopulationer, såsom Prx1+ mesenkymale forfædre, kan spores under reparationsprocessen ved hjælp af kommercielt tilgængelige fluorescerende reportermusmodeller (figur 3). Ved 5 dage efter brud (dpf) kan Alcian Blue-farvning bruges til at visualisere den bløde callus og efterfølgende kvantificere bruskområdet (figur 2A,B). Mineralisering kan påvises ved microCT ved 28 dpf (figur 2C). Volumenet af den mineraliserede callus, afstanden til brudgabet og knoglestyrken målt ved mekanisk test anvendes almindeligvis som kvantificerbare resultater af brudreparation. Genetisk modifikation eller lægemiddelintervention kan ændre genopretningsforløbet, så det anbefales at udføre en tidsforløbsundersøgelse for at karakterisere brud på forskellige stadier af reparation. Hele callus kan dissekeres til molekylær analyse, og den kontralaterale knogleaksel kan bruges som en kontrol. Hvis brudenderne ikke er justeret eller tilstrækkeligt fastgjort med stiften, vil de resulterende billeder vise manglende dannelse af callus på hele eller den ene side af brudstedet (figur 4).
Figur 1: Fraktur og indsættelse af den stabiliserende stift. (A) En firkant er barberet på højre ben af en C57BL/6J mus. (B) Efter et snit er lavet i huden og fascia, fastgøres buede tang under lårbenet for at adskille muskler, hud og knogle. (C) Efter at snittet er foretaget, oprettes to brudender: den proksimale del af lårbenet, der er fastgjort til hoftebenet, og den distale sektion, der er fastgjort til knæet. Styrenålen (grøn) indsættes i den distale sektion og skubbes gennem knæleddet. (D) Styrenålen fjernes fra den distale sektion, indsættes i den proksimale sektion og skubbes gennem hofteleddet. (E) Den stabiliserende stift (grå nål) indsættes i styrenålen, der stikker ud fra hofteleddet. (F) Den stabiliserende stift skubbes gennem den proksimale sektion, ind i den distale sektion og gennem knæleddet ved hjælp af stien lavet af styrenålen i C. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Histologi og mikroCT af lårbensbrud. (A) Formalinfikserede paraffinsektioner af lårbensfrakturer blev opsamlet ved 5, 10 og 28 dpf og farvet med Alcian Blue/Eosin/Orange G. Scale bar = 500 μm. (B) Bruskområdet blev kvantificeret ved hjælp af ImageJ-software ved 5, 10 og 28 dpf. (C) Ved 28 dpf blev mineralisering observeret, og callusvolumen og brudgab kunne måles ved hjælp af microCT. Skalabjælke = 1.000 μm. Data vist som Mean ± SEM. Det mineraliserede callusvolumen blev målt ved konturering omkring den kortikale knogle på brudstedet. Det mørkegrå område afgrænser den mineraliserede callus på billedet, mens den kortikale knogle (lysegrå) ikke indgår i målingen. Data vist som Mean ± SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Fluorescerende reportermodel, der bruges til at visualisere udvidelse af Prx1+ periosteale celler efter brud. Prx1CreER; Rosa26tdTomato-mus blev injiceret dagligt i fem dage med 80 mg/kg legemsvægt af tamoxifen for at fremkalde tdTomato-ekspression. Tre dage efter den endelige injektion blev lårbensbrud indledt, og mus blev ofret ved 7 eller 14 dpf for at spore, hvor Prx1-ekspressorceller og deres afkom (Prx1+) er placeret i fraktur callus og udvidet periosteum. Skalabjælke = 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Eksempel på uregelmæssig heling på grund af kirurgiske problemer. Frakturenderne blev ikke justeret korrekt, og den stabiliserende stift gennemboret gennem lårbenets proksimale del i dette eksempel. Disse fejl resulterede i callusdannelse, hvor lårbenet blev gennemboret (gul kasse) snarere end på det afskårne sted. Skalabjælke = 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Sammensætning af de opløsninger, der kræves til histologi. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Skadesmodellen, der er beskrevet i denne protokol, omfatter alle fire væsentlige trin, der observeres under helingen af spontane brud, herunder (1) proinflammatorisk respons med dannelsen af hæmatomet, (2) rekruttering af skeletstamfædre fra periosteum til dannelse af den bløde callus, (3) mineralisering af callus ved osteoblaster og (4) ombygning af knoglen ved osteoklaster.
Den kirurgiske procedure, der er beskrevet i dette manuskript, er optimeret til voksne mus, der er mindst 12 uger gamle. En 27 G x 1 1/4 (0,4 mm x 30 mm) nål bruges som stabiliserende stift, fordi det er den ideelle størrelse til bredden af marvhulen i denne alder. Om nødvendigt kan protokollen ændres for yngre dyr, hvis der anvendes en tyndere stabiliserende stift. Den stabiliserende stift er en væsentlig del af operationens succes, da ustabilitet er kendt for at påvirke frakturhelingen betydeligt16. Andre stabiliseringsmetoder er blevet gennemgået, og alle kommer med deres fordele og begrænsninger 17,18,19. Den ideelle stabilisering bør vælges ud fra forskningsspørgsmålet og forsøgsmålet. En begrænsning af den beskrevne stabilisering her er, at stiften går gennem vækstpladerne og leddene. Hvis bidraget fra led- eller vækstpladebrusk er bekymrende, foreslår vi at overveje en anden stabiliserende metode.
Variabilitet i kirurgisk teknik og mellem dyr er et problem, når du udfører denne operation. Derfor anbefales det at bruge rigelige tal, især til kvantitative udlæsninger, og at sammenligne lignende typer brud på tværs af grupper. Det er vigtigt at fastgøre lårbenssektionerne tæt på hinanden for at undgå huller over 2 mm. Variabilitet i mellemrum mellem sektioner kan betydeligt påvirke størrelsen af callus og tidspunktet for reparation. Sektionerne skal også være korrekt justeret. Løse og forkert justerede brud vil forårsage mere signifikant variabilitet på tværs af prøver og kan forringe helingen.
Vægtbærende er også afgørende for tidspunktet for knogleheling og kan introducere variabilitet mellem mus. De fleste mus lægger minimal vægt på det skadede ben et par timer efter operationen, men bør gå normalt den næste dag. Det er afgørende at kontrollere, at musen bevæger sig normalt, og at belastningen fordeles jævnt på begge ben, især når man bruger det kontralaterale lårben som en sham-opereret kontrol. Derudover kan operationen udløse en systemisk betændelse, der påvirker det kontralaterale ben. Det anbefales derfor at sammenligne sham-opererede lårben med ikke-opererede mus, når denne teknik etableres. At have ikke-opererede kontroller kan også være at foretrække for kvantificerbare resultater såsom virkninger på RNA eller proteinekspression.
Konsistensen af brudgeometrien kan være udfordrende med andre metoder20, men ved hjælp af en sav kan kirurgen få mere kontrol og afhjælpe variationen i efterfølgende brud. Savmetoden er også blevet brugt til at skabe metafysebrud af de proksimale musefærd med succes21.
Forskelle mellem han- og hunmus i deres reaktion på frakturheling observeres sjældent. Køn kan dog blive en faktor med alder og lægemiddelintervention, så det anbefales kraftigt at sammenligne dyr af samme køn eller udføre statistikker for at forhøre kønsforskelle, før de kombinerer prøver. Desuden blev denne protokol designet til C57BL6 / J-mus. Efterforskere, der bruger andre musestammer, bør sammenligne heling hos han- og hunmus for at identificere eventuelle kønsforskelle.
Vi mener, at denne lårbensbrudskirurgi er en effektiv model til at rekapitulere de betydelige helingstrin hos mus og kan bruges til at teste virkningerne af genetiske modifikationer eller terapeutiske indgreb på frakturgendannelse hos mennesker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Vicki Rosen for økonomisk støtte og vejledning med projektet. Vi vil også gerne takke veterinær- og IACUC-personalet på Harvard School of Medicine for konsultation vedrørende steril teknik, dyrevelfærd og de materialer, der bruges til at udvikle denne protokol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle | BD precision | 305193 | Use as guide needle |
| 27 G x 1 ¼ (0.4 mm x 30 mm) | BD precision | 305136 | Use as stabilizing pin |
| 9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit | Braintree Scientific, INC | ACS-KIT | |
| Alcian Blue 8 GX | Electron Microscopy Sciences | 10350 | |
| Ammonium hydroxide | Millipore Sigma | AX1303 | |
| Circular blade X926.7 THIN-FLEX | Abrasive technologies | CELBTFSG633 | |
| DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit | Dremel | 7700 1/15 | |
| Eosin Y | ThermoScientific | 7111 | |
| Fine curved dissecting forceps | VWR | 82027-406 | |
| Hematoxulin Gill 2 | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Hydrochloric acid | Millipore Sigma | HX0603-4 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Microsurgical kit | VWR | 95042-540 | |
| Orange G | Sigma-Aldrich | 1625 | |
| Phloxine B | Sigma-Aldrich | P4030 | |
| Povidone-Iodine Swabs | PDI | S23125 | |
| SCANCO Medical µCT35 | Scanco | ||
| Slow-release buprenorphine | Zoopharm |
References
- Black, D. M., Rosen, C. J.
- Curtis, E. M., Moon, R. J., Harvey, N. C., Cooper, C. The impact of fragility fracture and approaches to osteoporosis risk assessment worldwide. Bone. 104, 29-38 (2017).
- Laurent, M. R., Dedeyne, L., Dupont, J., Mellaerts, B., Dejaeger, M., Gielen, E. Age-related bone loss and sarcopenia in men. Maturitas. 122, 51-56 (2019).
- NOF - Just for men. National Osteoporosis Foundation. , Available from: https://cdn.nof.org/wp-content/uploads/2015/12/Osteoporosis-Fast-Facts.pdf (2019).
- Williams, S. A., et al. Economic burden of osteoporotic fractures in US managed care enrollees. The American Journal of Managed Care. 26, 142-149 (2020).
- Sheen, J. R., Garla, V. V.
- Holmes, D.
- Duchamp de Lageneste, O., et al. Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin. Nature Communications. 9, 773 (2018).
- Bahney, C. S., et al.
- Li, Z., et al. Fracture repair requires TrkA signaling by skeletal sensory nerves. Journal of Clinical Investigation. 129, 5137-5150 (2019).
- Colnot, C., Thompson, Z., Miclau, T., Werb, Z., Helms, J. A. Altered fracture repair in the absence of MMP9. Development. 130, 4123-4133 (2003).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2, 97-101 (1984).
- Hu, K., Olsen, B. R. Osteoblast-derived VEGF regulates osteoblast differentiation and bone formation during bone repair. Journal of Clinical Investigation. 126, 509-526 (2016).
- Collier, C. D., et al. Characterization of a reproducible model of fracture healing in mice using an open femoral osteotomy. Bone Reports. 12, 100250 (2020).
- Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22, 1197-1207 (2007).
- Garcia, P., et al. A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing. Journal of Biomechanics. 41, 1689-1696 (2008).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 31-38 (2009).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. European Cells & Materials. 26 (1-12), 12-14 (2013).
- Histing, T., et al. Ex vivo analysis of rotational stiffness of different osteosynthesis techniques in mouse femur fracture. Journal of Orthopaedic Research. 27, 1152-1156 (2009).
- Williams, J. N., Li, Y., Valiya Kambrath, A., Sankar, U. The Generation of closed femoral fractures in mice: A model to study bone healing. Journal of Visualized Experiments. (138), e58122 (2018).
- Haffner-Luntzer, M., et al. A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur. Journal of Orthopaedic Research. 38, 2131-2138 (2020).
