Определена оптимальная концентрация сахарозы для экстракции гликогена печени с помощью центрифугирования градиента плотности сахарозы. Добавление 10-минутной стадии кипячения для ингибирования ферментов, расщепляющих гликоген, оказалось полезным.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Экстракция молекул гликогена печени для определения структуры гликогена
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Гликоген печени представляет собой гиперразветвленный полимер глюкозы, который участвует в поддержании уровня сахара в крови у животных. На свойства гликогена влияет его структура. Следовательно, подходящий метод экстракции, который выделяет репрезентативные образцы гликогена, имеет решающее значение для изучения этой макромолекулы. По сравнению с другими методами экстракции, метод, использующий стадию центрифугирования с градиентом плотности сахарозы, может свести к минимуму молекулярное повреждение. Основываясь на этом методе, в недавней публикации описывается, как изменялась плотность раствора сахарозы, используемого во время центрифугирования (30%, 50%, 72,5%), чтобы найти наиболее подходящую концентрацию для извлечения частиц гликогена самых разных размеров, ограничивая потери более мелких частиц. Была введена 10-минутная стадия кипячения, чтобы проверить его способность денатурировать ферменты, разрушающие гликоген, тем самым сохраняя гликоген. Было показано, что самая низкая концентрация сахарозы (30%) и добавление стадии кипячения позволяют извлечь наиболее репрезентативные образцы гликогена.
Введение
Гликоген представляет собой сложный, гиперразветвленный полимер глюкозы, содержащийся в животных, грибах и бактериях1. У млекопитающих гликоген печени функционирует как буфер глюкозы в крови, сохраняя гомеостаз, в то время как мышечный гликоген действует как кратковременный резервуар глюкозы, обеспечиваяэнергию напрямую. Структуру гликогена часто описывают тремя уровнями (см. рис. 1): 1. Линейные цепи образуются мономерами глюкозы через гликозидные связи (1→4)-α, причем точки разветвления соединяются гликозидными связями (1→6)-α; 2. сильно разветвленные частицы β (~20 нм в диаметре), которые....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Печень мышей, использованная для оптимизацииэтой процедуры, была взята у 12 самцов мышей BKS-DB/Nju (7,2 недели, см. таблицу материалов). Использование животных было одобрено Комитетом по уходу за животными и этике Народной больницы Уханьского университета, IACUC Issue No. WDRM 20181113.
1 Ткани животного происхождения
- Взвесьте печень мыши (1-1,8 г цельной печени от каждой мыши).
- Быстро заморозьте печень мыши в жидком азоте и храните ее при температуре -80 °C.
2. Приготовление буфера и реагентов
- Приготовьте буфер для выделения гликогена,....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В то время как описанная выше процедура является наиболее оптимальным методом (30% сахарозы с добавлением 10-минутной стадии кипячения), здесь приведены данные для гликогена, экстрагированного с помощью трех концентраций сахарозы (30%, 50%, 72,5%), со стадией кипячения и без нее, как описано ранее21. В соответствии с протоколом чистота, выход сырой нефти и выход гликогена сухого гликогена, экстрагированного в различных условиях, приведены в таблице 1, воспроизведенной из
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Предыдущие исследования показали, что структура гликогена важна для его свойств; Например, размер молекулы влияет на скорость деградации гликогена10, а распределение длины цепи влияет на его растворимость26. Чтобы правильно понять эти взаимосвязи, важно экстрагировать гликоген с помощью процедуры, которая изолирует, насколько это возможно, репрезентативный и неповрежденный образец. В традиционных методах экстракции использовались либо горячие щелочные условия, либо холодная.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Благодарности
Авторы выражают благодарность г-ну Гаошэн Ву и г-же Юньвэнь Чжу за техническую помощь в работе с FACE, а также г-ну Чжэнься Ху и г-ну Дэнбиню за техническую помощь в работе с Комиссией по ценным бумагам и биржам. MAS поддерживается стипендией Advance Queensland Industry Research Fellowship, Mater Foundation, Equity Trustees и Фондами Л. Г. МакКаллама Эста и Джорджа Уибера. Эта работа была поддержана Приоритетной академической программой высших учебных заведений провинции Цзянсу, грантом Фонда естественных наук Китая C1304013151101138 и Программой талантов инноваций и предпринимательства провинции Цзянсу 2017 года. Рисунки 1-5<....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 8-аминопирен-1,3,6-трисульфонат (APTS) | SIGMA Aldrich | 9341 | 0,1 М раствор |
| Уксусная кислота | SIGMA Aldrich | 695092 | 0,1 М, pH 3,5 раствор |
| Agilent 1260 Infinity SEC система | Agilent, Санта-Клара, Калифорния, США | Эксклюзионная хроматография (SEC) | |
| BKS-DB/Nju фоновые мыши | Нанкинский биомедицинский исследовательский институт Нанкинского университета | ||
| Набор для анализа D-глюкозы (формат GOPOD) | Megazyme | K-GLUC | |
| этиленединитрилотетрауксусная кислота (ЭДТА) | SIGMA Aldrich | 431788 | |
| Гомогенизатор | IKA | T 25 | |
| Соляная кислота | SIGMA Aldrich | 2104 | 0,1 М раствор |
| Соляная кислота | SIGMA Aldrich | 2104 | 0,1 М раствор |
| Система P/ACE MDQ plus | Ab Sciex, США | Фторофор-ассистированный электрофорез углеводов (FACE) | |
| Детектор показателя преломления | Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, США) | Эксклюзионная хроматография (SEC) | |
| Ацетат натрия | SIGMA Aldrich | 241245 | 1 м, раствор pH 4,5 |
| Азид натрия | SIGMA Aldrich | S2002 | |
| Хлорид натрия | SIGMA Aldrich | S9888 | |
| Цианоборогидрид натрия | SIGMA Aldrich | 156159 | 1 М раствор |
| Фторид натрия | SIGMA Aldrich | 201154 | |
| Гидроксид натрия | SIGMA Aldrich | 43617 | 0,1 М раствор |
| Нитрат натрия | SIGMA Aldrich | NISTRM8569 | |
| Пирофосфат | натрия SIGMA Aldrich | 221368 | |
| Sucrose | SIGMA Aldrich | V90016 | |
| SUPREMA предварительная колонка, 1 000 и 10 000 колонок | Polymer Standards Services, Майнц, Германия | Эксклюзионная хроматография (SEC) | |
| Trizma | SIGMA Aldrich | T 1503 | |
| Ультрацентрифужные пробирки | Beckman | 4 мл, тонкостенная ультрапрозрачная пробирка с открытым верхом, 11 x 60 мм |
Ссылки
- Hills, D. M., Heller, H. C., Hacker, S. D., Hall, D. W., Sadava, D., Laskowski, M. Life: the science of biology. 12th edn. Freeeman, W. H. , (2020).
- Calder, P. C., Geddes, R. Glycogen of high molecular weight from mammalian muscle. Carbohydrate Research. 135 (2), 249-256 (1985).
- Rybicka, K. K.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
