Summary
Denne studien presenterer en protokoll for live-3D-celle immunocytokjemi anvendt på en pediatrisk diffus midtlinje gliomcellelinje, nyttig for å studere i sanntid uttrykket av proteiner på plasmamembranen under dynamiske prosesser som 3D-celleinvasjon og migrasjon.
Abstract
Cellemigrasjon og invasjon er spesifikke kjennetegn på diffus midtlinjegliom (DMG) H3K27M-muterte svulster. Vi har allerede modellert disse funksjonene ved hjelp av tredimensjonale (3D) cellebaserte invasjons- og migrasjonsanalyser. I denne studien har vi optimalisert disse 3D-analysene for live-celle immunocytokjemi. Et antistoffmerkingsreagens ble brukt til å oppdage i sanntid ekspresjonen av adhesjonsmolekylet CD44, på plasmamembranen til migrerende og invaderende celler i en DMG H3K27M primær pasientavledet cellelinje. CD44 er assosiert med kreft stamcellefenotype og tumorcellemigrasjon og invasjon og er involvert i direkte interaksjoner med sentralnervesystemet (CNS) ekstracellulær matriks. Neurospheres (NS) fra DMG H3K27M-cellelinjen ble innebygd i basalmembranmatrisen (BMM) eller plassert på et tynt belegglag av BMM, i nærvær av et anti-CD44-antistoff i forbindelse med antistoffmerkingsreagenset (ALR). Den levende 3D-celle immunocytokjemiske bildeanalysen ble utført på et live-celleanalyseinstrument for kvantitativt å måle det totale CD44-uttrykket, spesielt på de migrerende og invaderende cellene. Metoden tillater også visualisering i sanntid av intermitterende ekspresjon av CD44 på plasmamembranen til migrerende og invaderende celler. Videre ga analysen også ny innsikt i den potensielle rollen til CD44 i mesenkymal til amoeboidovergang i DMG H3K27M-celler.
Introduction
Tumorcellers evne til å unnslippe og spre seg gjennom det omkringliggende vevet er et kjennetegn på kreft1. Spesielt er tumorcellemotilitet et karakteristisk trekk ved ondartede svulster, enten det er en metastatisk tumortype som bryst2 eller kolorektal kreft3 eller en lokalt invasiv type som diffus gliom 4,5.
Avbildning har en sentral rolle i undersøkelsen av mange aspekter av tumorcellefenotyper; Imidlertid er levende celleavbildning definitivt å foretrekke når man studerer dynamiske cellulære prosesser som migrasjon og invasjon, når endringer i morfologi og celle-celleinteraksjon 6,7 forekommer og lettere kan undersøkes over tid. For levende celleavbildning kan forskjellige optiske mikroskopisystemer brukes, fra fasekontrast til konfokale fluorescerende mikroskoper, og bildeinnsamling utført over kort eller lang tid på et invertert mikroskop utstyrt med et kammer for temperatur og CO2-kontroll, eller i bildeanalysesystemer med høyt innhold som har innebygde kamre, eller alternativt i bildesystemer som kan sitte i inkubatoren uten å måtte forstyrre cellene under hele varigheten av eksperimentet. Valget av systemet som brukes dikteres ofte av en rekke faktorer som nødvendig oppløsning, lengden på den totale innsamlingstiden og tidsintervallene, fartøytypen som brukes og gjennomstrømningen av analysen (enkeltkammer eller flerbrønnsplate), følsomheten til cellene som brukes (dyrebare og / eller sjeldne celler) og fototoksisitet av cellene hvis fluoroforer er tilstede.
Med hensyn til fluorescerende avbildning i levende modus, kan dette oppnås ved å transducere celler for ekspresjon av fluorescerende proteiner enten for stabilt uttrykk eller som et induserbart system8, ved forbigående celletransfeksjon, eller ved å bruke cellefargestoffer som nå er tilgjengelige for live-cellemerking7, for live-cellesporing samt for merking av subcellulære organeller9.
En nyttig tilnærming har nylig blitt utviklet for levende celle immunocytokjemi, hvor et antistoff som gjenkjenner en overflatemarkør av valg kan bindes til et merkingsreagens, og ved tillegg til kulturmediet kan celler som uttrykker den spesifikke markøren lett avbildes i sanntid ved levende celleavbildning. Visualisering og kvantifisering av markøruttrykk ved hjelp av et slikt system kan lett oppnås når celler dyrkes i todimensjonale (2D) kulturforhold10.
I denne studien optimaliserte vi protokoller for live-3D-celle immunocytokjemisk invasjon og migrasjon av pediatrisk diffus midtlinjegliom (DMG) pasientavledede celler11,12. DMG er svært aggressive hjernesvulster som rammer barn, for de aller fleste assosiert med drivermutasjonen K27M i histon H3-varianter. DMG oppstår i hjernestammen og midtlinjeområdene i sentralnervesystemet (CNS) og er preget av en svært infiltrerende natur. Denne invasive kapasiteten har vist seg å være i det minste delvis mediert av intratumorheterogeniteten og kreftstammelignende egenskaper av DMG-celler7.
For å eksemplifisere våre analyser ble det brukt et antistoffmerkingsreagens (ALR) i kombinasjon med et antistoff mot CD44. CD44 er et transmembrant glykoprotein og adhesjonsmolekyl uttrykt på stamcelle og andre celletyper, assosiert med kreftstamcellefenotype og tumorcellemigrasjon og invasjon13. Protokollene inkluderer prøvepreparering, bildeoppkjøp i lysfelt og fluorescerende modus, og analysen på et levende celleanalyseinstrument som tillot å kvantitativt måle i sanntid det totale CD44-uttrykket på DMG-cellemembranen under 3D-invasjon og migrasjon. Analysene tillot også muligheten til å visualisere det intermitterende fluorescerende signalet av CD44 på individuelle celler mens de migrerte og invaderte. Interessant nok ble det også observert en effekt av anti-CD44-antistoffet, som potensielt virket som et blokkerende antistoff, også syntes å redusere cellemigrasjon og invasjon, samt å indusere en endring av invasjonsmønsteret fra en kollektiv mesenkymallignende til en mer encellet amoeboid-lignende fenotype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen følger retningslinjene til institusjonenes humane forskningsetiske komiteer.
MERK: Denne studien ble utført med Incucyte S3 og/eller SX5 Live-Cell Analysis Instrument (referert til som live cell analysis instrument).
1. Generering av reproduserbare størrelse tumor sfæroider
MERK: Protokollen (seksjon 1) beskrevet av Vinci et al. 2015 7,12, ble brukt som rapportert nedenfor, med noen modifikasjoner:
- Samle DMG H3K27M-mutante nevrosfærer (NS) og sentrifuge ved 170 x g i 10 minutter (min) ved romtemperatur (RT).
- Inkuber NS med 500 μL av accutaseoppløsningen i 3 minutter ved 37 °C for å bryte dem opp.
- Nøytraliser accutase-løsningen med tumorstamcelle (TSM) medium7 og sentrifuge cellesuspensjonen ved 355 x g i 5 minutter ved RT.
- Resuspender cellepelleten i 1 ml TSM-medium og tell deretter cellene ved hjelp av et celletellekammer.
- Fortynn cellesuspensjonen for å oppnå 2,5-5 x 103celler / ml og frø 100 μL / brønn i ultra-low attachment (ULA) 96-brønns rundbunnsplater (se materialfortegnelse). Bruk en riktig celletetthet for å oppnå individuell NS på ~ 300 μm diameter, 4 dager etter cellesåing (250-500 celler / brønn for svært aggressive gliomceller).
- Bekreft NS-dannelsen visuelt ved å bruke et invertert mikroskop 4 dager etter cellesåing.
2. Klargjøring av ALR/antistoffkompleks og oppsett for invasjonsanalysen
MERK: For antistoffmerkingsprosedyren brukes antistoffmerkingsfargestoffprotokollen10 for levende celleimmunocytokjemi med noen modifikasjoner, som rapportert nedenfor. For invasjonsanalysen følges protokollen tidligere beskrevet av Vinci et al. 201512 .
- Vurder antall brønner (f.eks. 60 brønner) for å analysere og beregne volumet som trengs for hvert reagens. Inkluder også brønnene for negativ kontroll (prøver med ALR, men uten antistoff).
- Tilsett 100 μL sterilt vann til ALR for å rehydrere reagenset (endelig konsentrasjon = 0,5 mg / ml). Pipette for å blande løsningen.
MERK: Reagenset er lysfølsomt; Hold deg derfor i mørket. Aliquot det resterende reagenset og oppbevar ved -80 °C (unngå frysing og tining). - Bland antistoffet med ALR i TSM-mediet (eller passende cellevekstmedium for den valgte cellelinjen) i en rundbunns flerbrønnsplate eller i et gult rør og beskytt mot lys.
- Forbered nok mengde av mediet til å dispensere 25 μL / brønn ved 3x endelig analysekonsentrasjon. Inkuber ved RT i 15 min.
MERK: Et 1:3 molforhold mellom antistoff og ALR anbefales, med en endelig (1x) konsentrasjon av testantistoffet <1,5 μg/ml. For eksperimentene i denne protokollen brukes et anti-humant CD44-museantistoff (startkonsentrasjon 86 μg / ml) ved en endelig konsentrasjon på 0,1 μg / ml (3x konsentrasjon = 0,3 μg / ml). Tilsett reagensene i følgende rekkefølge: i) antistoff; ii) ALR; iii) TSM medium. Bland ved pipettering. - Fortynn bakgrunnssuppressorreagenset (BSR) i TSM-medium (eller passende cellevekstmedier for valgt cellelinje) ved 1,5 mM (3x) for å oppnå en endelig konsentrasjon på 0,5 mM ved slutten av analysen.
- Utfør invasjonsanalysen direkte i ULA 96-brønns rundbunnsplate der celler opprinnelig ble sådd. Kontroller NS visuelt ved hjelp av et invertert mikroskop før du starter.
- Fjern forsiktig og langsomt 75 μL/brønn av mediet, og unngå å berøre bunnen av brønnen der NS sitter. Kontroller tilstedeværelsen av NS visuelt.
- Tilsett forsiktig 25 μL av BSR til hver brønn.
- Tilsett forsiktig 25 μL av ALR/antistoffkomplekset til hver brønn. Vent 2 eller 3 minutter for å la ALR/antistoffkomplekset blandes med mediet.
- Sjekk visuelt ved hjelp av et invertert mikroskop for å sikre at hver NS er sentralt plassert i bunnen av brønnen. Unngå dannelse av bobler. Hvis det er en boble, fjern den ved å bruke en nål.
- Legg tallerkenen på is og vent 5 min for å la bunnen av tallerkenen bli kald.
- Med en forkjølt p200-spiss dispenseres 75 μL/brønn av basalmembranmatriks (BMM), plasser pipettespissen på brønnens indre vegg og unngå å berøre bunnen av brønnen. Unngå dannelse av bobler og fjern med en steril nål de eksisterende.
MERK: Sørg for å ha tint BMM-en ved 4 °C fra kvelden før. - La platen ligge på is i 5 min for å la BMM-en blandes med mediet. Sjekk visuelt ved hjelp av et invertert mikroskop tilstedeværelsen av NS og at de er sentralt plassert i brønnen. Hvis ikke, sentrifuger platen ved 4 °C ved 180 x g i 5 minutter.
- Overfør platen i live-cell analyseinstrumentet (Table of Materials) plassert i inkubatoren ved 37 ° C, 5% CO2, 95% fuktighet.
3. Klargjøring av ALR/antistoffkomplekset og oppsett for migrasjonsanalysen
MERK: For antistoffmerkingsprosedyren brukes Labeling Dyes-protokollen10 for Live-Cell Immunocytochemistry.
- Vurder antall brønner for å analysere og beregne volumet som trengs for hvert reagens. Inkluder også brønnene som trengs for de negative kontrollene. Kontroller NS visuelt ved hjelp av et invertert mikroskop før du starter.
- Bruk plater med flat bunn 96 brønner. Utfør beleggingsprosedyren som beskrevet av Vinci et al., 201314. For denne studien brukes BMM som et tynt belegg.
- Når belegget er klart, fjern overflødig BMM-belegg med en p200-spiss som plasserer spissen i kanten av brønnen og unngår å berøre bunnen. Hvis du arbeider med flere brønner, bruk en flerkanalspipett.
- Klipp en p200-spiss, ta 50 μL av cellemediet + NS fra hver valgte brønn, og overfør den til en belagt flatbunnsbrønn. Kontroller tilstedeværelsen og posisjonen til NS i hver brønn visuelt.
MERK: Hver NS må være sentralt plassert i brønnen. Unngå å lene deg på tuppen på kanten av brønnen under overføringen, men slipp mediet sentralt i brønnen uten å berøre bunnen. For høyt migrerende celler, vurder et høyere antall replikater enn standard tre replikater. Dette skyldes at når NS sitter for nær kanten av brønnen, kan migrerende celler dekke et mindre område av brønnen. - Rehydrer ALR som beskrevet ovenfor (trinn 2.2-2.3).
MERK: Reagens er lysfølsom. Se ovenfor for gode håndteringsrutiner. - Bland antistoffet med ALR i passende komplette cellevekstmedier i en rundbunns flerbrønnsplate eller i et gult rør og beskytt mot lys. Forbered nok mengde til å dispensere 50 μL / brønn ved 3x endelig analysekonsentrasjon. Inkuber ved RT i 15 min.
MERK: Tilsett reagensene i rekkefølgen som angitt ovenfor (trinn 2.4). - Følg samme fremgangsmåte som rapportert i trinn 2.5.
- Tilsett forsiktig 50 μL av BSR til hver brønn.
- Tilsett forsiktig 50 μL av ALR/antistoffet til hver brønn. Vent 2 eller 3 minutter for å la reagensene blande seg og kontrollere visuelt ved hjelp av et invertert mikroskop for å sikre at det meste av replikerende NS er sentralt plassert i brønnen.
- Unngå dannelse av bobler og fjern eventuelle eksisterende ved å bruke en nål. Overfør platen forsiktig i instrumentet for levende celleanalyse plassert i inkubatoren ved 37 °C, 5 % CO2, 95 % fuktighet.
4. Instrumentinnstilling for live-celleanalyse for bildeopptak
- Skann platene med live-celleanalyseinstrumentet (for spesifikasjoner, se Materialfortegnelse) med skanneintervaller som starter fra henholdsvis punkt null (t0) for invasjons- og migrasjonsanalysene etter trinn 2.14. og 3.10. opptil 96 timer.
MERK: Sørg for å kunne avhende live-celleanalyseinstrumentet umiddelbart etter starten av invasjons- og migrasjonsanalysen. Avhengig av tumortype kan celler begynne å invadere eller migrere fra NS allerede innen 1 time fra analyseoppsettet. - På live-celleanalyseinstrumentprogramvaren velger du alternativet Planlegg å anskaffe. Klikk på + -fanen og velg alternativet Skann etter planen.
- I programvarevinduet Opprett eller gjenopprett fartøy, klikk på alternativet Ny.
- Velg den spesifikke applikasjonen i live-celleanalyseinstrumentet for invasjons- og migrasjonsinnsamlingen. Velg Spheroid skannetype, 4x objektiv, Fase + Brightfield og grønne bildekanaler for invasjonsanalysen. Velg Fortynningskloningsskanningstype , 4x mål og Fase og grønn for migreringsanalysen.
- Velg platetype og definer brønnene som skal skannes, ved å utheve dem på platekartet.
- Sett opp skannefrekvensen (for eksperimentene i denne protokollen var skannefrekvensen 15 min for invasjon og 30 min for migrasjon).
- Klikk på Legg til i tidsplan og start skanningen.
5. Instrumentinnstilling for live-celleanalyse for bildeanalyse
- Velg fanen Opprett ny analysedefinisjon.
- Velg henholdsvis Spheroid Invasion eller Basic Analyzer-program for invasjon og migrasjon i kategorien.
- Velg de aktuelle kanalene for invasjon og flytting (for Invasion: Phase+Brightfield-Green; for Migration: Phase-Green) i bildekanalen.
- Velg noen få representative bilder fra 3-4 brønner for forhåndsvisning og finjustering av analyseinnstillingen.
- For invasjonsanalysen, i kategorien Analysedefinisjon , justerer du programinnstillingene i Brightfield - og Green-kanalene med følgende innstilling for å generere en presis segmentering mellom hele sfæroid- og invaderende celler (se figur 5; blå maske):
Brightfield-segmentering: Hele sfæroidfølsomhet = 50; Invaderende cellefølsomhet = 100; Rydd opp = standard.
Hele sfæroidfiltre: angi alle parametere som standard.
Invaderende cellefiltre: angi alle parametere som standard.
Grønn segmentering: radius = 900. - For migreringsanalysen justerer du programinnstillingene i fase - og grønnkanalene for å generere en nøyaktig segmentering mellom konfluensen og grønne celler (se figur 5, gule og rosa masker) med følgende innstilling:
Fase: angi alle parametere som standard.
grønn segmentering: radius = 300; Terskel = 1000
Opprydding: Hullfylling = 400; Filtre = standard.
Hele Vel: angi alle parametere som standard. - Sjekk at analyseinnstillingene er riktige for NS ved å klikke tilfeldig på flere brønner. Segmenteringen må skissere sfæroiden. Hvis ikke, juster innstillingen deretter.
- Velg brønnene og tidspunktene som skal analyseres.
- Lagre analysedefinisjonen og klikk på Fullfør.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Live-3D-Cell Immunocytochemistry-protokoll for invasjon og migrasjon er oppsummert i en enkel og reproduserbar arbeidsflyt i figur 1. Ved såing av DMG-cellene i ULA 96-brønns rundbunnsplater, oppnås reproduserbar størrelse NS og brukes i trinnene som vises. Når NS har nådd den ideelle størrelsen på ~300 μm (ca. 4 dager etter såing), startes invasjon12 og migrasjon14-analyser . Tilsetningen av ALR / antistoffkomplekset sammen med bakgrunnsdemperen i mediet til den enkelte NS, gjør det mulig å følge det spesifikke markøruttrykket på cellemembranen, i levende avbildning og over tid. Overflatemarkøruttrykket under celleinvasjonen og migrasjonen overvåkes enkelt med intervaller fra t = 0 opp til 96 timer ved hjelp av live-celleanalyseinstrumentet. Dette bildebehandlingssystemet tillater en helautomatisk bildeanalyse.
En primær pasientavledet cellelinje, QCTB-R059, ble brukt til å eksemplifisere invasjons- og migrasjonsproprieties av pediatrisk DMG-tumorspredning. QCTB-R059 ble opprinnelig indikert som en pediatrisk talamisk glioblastom (GBM) cellelinje15. Senere har det blitt indikert som H3-K27M talamic glioma cell line 16 eller diffus midline glioma (DMG) H3-K27M cellelinje11, etter 2016 Verdens helseorganisasjon klassifisering av hjernesvulster med introduksjonen av DMG H3F3A K27M-mutant som en ny enhet17.
CD44, et adhesjonsmolekyl kjent for å være involvert i cellemigrasjon og invasjon, ble undersøkt. CD44 uttrykkes av QCTB-R059-celler som demonstrert ved konfokale bilder av immunfluorescerende (IF) farging på 3D-cellemigrasjon på (figur 2) og invasjon i (figur 3) BMM.
Med tanke på at 3D-invasjon og migrasjon begge er ikke-statiske prosesser, tenkte vi å undersøke uttrykket av CD44 over tid når celler er i bevegelse. For å gjøre dette benyttet vi live-celle immunocytokjemi-analysen og tilpasset protokollen for 3D-analyser. Ved å bruke ALR i kompleks med et anti-CD44-antistoff, kan vi i sanntid følge uttrykket av CD44 når proteinet uttrykkes på cellemembranen mens cellene unngår nevrosfærene og sprer seg til og inn i BMM.
Live-3D-celle immunocytokjemi tillater visualisering av CD44-uttrykk (Supplementary Video 1 og Supplementary Video 2). De representative rammene for timelapse, både for migrasjon og invasjon (figur 4A,B), viser mer detaljert det intermitterende uttrykket av CD44 på cellemembranen. Spesielt er det mulig å se det grønne fluorescerende signalet til å være på (grønn sirkel) og deretter av (svart sirkel) på samme celle observert over tid, noe som tyder på at uttrykket av CD44 er av og på mens celler migrerer og invaderer.
Migrasjons- og invasjonsprosessene følges over 96 timer, og som vist i figur 5 viser QCTB-R059-celler et høyt nivå av CD44, noe som viser at totalt sett er uttrykket observert med levende celleimmunocytokjemi i tråd med uttrykket av CD44 oppnådd av IF vist på konfokale bilder i figur 2 og figur 3. Interessant skjønt, vi la også merke til at når anti-CD44-antistoffet brukes på levende celler, påvirker det cellemorfologi, induserer en overgang fra mesenkymallignende til amoeboid-lignende invasjon. Det induserer en reduksjon av disse cellenes invasive og migrerende kapasitet (tilleggsfigur 1). Vi kan imidlertid ikke utelukke at reduksjonen i cellemigrasjon og invasjon observert også delvis skyldes en hemming av celleproliferasjon.
Den automatiserte bildeanalysen utført på live-celleanalyseinstrumentet viser kvantifiseringen av CD44-uttrykk og økningen over tid, målt ved det samlede grønne fluorescerende signalet assosiert med ALR (figur 5B, C) for både migrasjon og invasjon. Kvantifiseringene oppnås som eksemplifisert i figur 5B og figur 5C, med den automatiserte bildeanalysen satt til å segmentere hele området dekket av CD44-grønnmigrerte celler (figur 4B) og hele spredningsområdet dekket av CD44-grønninvaderte celler, men unntatt nevrosfærekjernen (figur 5C).
Figur 1: Skjematisk arbeidsflyt av Live-3D-celle immunocytokjemiske analyser. Arbeidsflyten viser trinnene som er involvert i 3D-invasjon og migrasjon live imaging metoder, inkludert representative bilder av pediatriske primære DMG-pasientavledede celler (QCTB-R059) etter invasjon i (topppanel; t = 96 timer) og migrasjon til (nederste panel; t = 96 h) BMM. Barer = 800 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: CD44-uttrykk ved 3D-tumorcellemigrasjon. Representative immunfluorescerende konfokale bilder av CD44-uttrykk i primære DMG-pasientavledede celler (QCTB-R059) ved migrering til BMM. Tidspunkt = 96 timer (rød:CD44; blå: kjerner). Skalastenger: 500 μm (øvre panel) og 200 μm (nedre panel). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: CD44-uttrykk ved 3D-tumorcelleinvasjon. Representative immunfluorescerende konfokale bilder av CD44-uttrykk i primære DMG-pasientavledede celler (QCTB-R059) ved invasjon i BMM. Tidspunkt = 96 t (rød:CD44; blå: kjerner). Skalastenger: 250 μm (øvre panel) og 100 μm (nedre panel). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: CD44-uttrykk over tid. Utvalgte rammer for QCTB-R059-migrasjon (A) og invasjon (B) time-lapse. Bilder ble oppnådd på live-cell imaging instrumentet. Grønn sirkel indikerer uttrykket av CD44, svart sirkel indikerer ingen CD44-uttrykk på cellemembranen til den samme cellen observert over tid. Skalastenger: 200 μm (A) og 100 μm (B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Live-3D-celle immunocytokjemiske analyser for CD44: migrasjon og invasjon. (A) Representative brightfield, fluorescerende (ALR med anti-CD44 antistoff), og slå sammen bilder av QCTB-R059 celle immunocytokjemisk migrasjon, og invasjon (96 timer) er vist. Skala barer: 400 μm. (B) Kvantifisering av CD44 samlet uttrykk relativt til migrasjon (B) og invasjon (C), bestemt av ALR-anti-CD44 bildeanalyse på live-celle imaging instrument. Kurvene viser den grønne middelintensiteten til CD44-uttrykk over tid. Verdier menes ± SD. De to små figurene i plottene viser segmenteringen som ble brukt til analysen av flyttingen (B) der hele området ble vurdert og invasjonen (C) som NS-kjernedelen ble ekskludert for. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Effekt av anti-CD44 antistoff på cellemorfologi og grad av cellemotilitet. Representative bilder av QCTB-R059 invasjons- og migrasjonsanalyse viser effekten av anti-CD44-antistoff brukt til live-3D-celle immunocytokjemi. Cellene viser redusert invasjons- og migrasjonskapasitet samt overgangen fra et mer mesenkymallignende til amøboidlignende invasjonsmønster mellom den negative kontrollen (uten anti-CD44-antistoff) og CD44 (pluss anti-CD44-antistoff). Nedre panel viser høyere effektforstørrelse som viser et klarere syn på cellens morfologiske utseende i fravær og tilstedeværelse av anti-CD44-antistoffet (hvite piler). Skalastenger: 800 μm øvre panel og 100 μm nedre panel. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsvideo 1: Time-lapse video av QCTB-R059 3D-cellemigrasjon på BMM i nærvær av anti-CD44 antistoff. Fluorescerende grønt signal, som representerer ekspresjonen av CD44 på cellemembranen, visualiseres over tid ved konjugering av anti-CD44-antistoffet med ALR. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Tilleggsvideo 2: Time-lapse video av QCTB-R059 3D-celleinvasjon i BMM i nærvær av anti-CD44 antistoff. Fluorescerende grønt signal, som representerer ekspresjonen av CD44 på cellemembranen, visualiseres over tid ved konjugering av anti-CD44-antistoffet med ALR. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den levende 3D-celle immunocytokjemi vi har vedtatt her for pediatrisk DMG invasjon og migrasjon kan lett tilpasses også for andre svært invasive tumorcelletyper, inkludert bryst- og tykktarmskreftcellelinjer.
Forskjellig fra tidligere utførte live-2D-celle immunocytokjemiske analyser10, når du arbeider i 3D, anbefales det å være oppmerksom på noen kritiske trinn. Spesielt for invasjonsanalysen vi beskriver, anbefales det å tilsette ALR/antistoffblandingen direkte til mediet med NS i hver brønn, før tilsetning av BMM, og ikke i BMM eller på toppen av BMM når den er gelert. Dette er for å tillate en god blanding av reagensene med mediet og sikre mer direkte tilgang av reagensene til celleoverflaten. For å sikre en bedre kvalitet på bildebehandlingen, selv om protokollen inkluderer bruk av BSR, anbefaler vi dessuten å bruke fenolfritt medium og BMM.
Et annet poeng å vurdere for live-celle immunocytokjemi er at ethvert antistoff som binder et ekstracellulært membranprotein på levende celler, kan påvirke proteinfunksjonen ved å endre dens konformasjon eller ved å okkupere bindingsstedet til en ligand eller et protein på en tilstøtende celle, og derfor fungere som et "blokkeringsmiddel"18,19. Selv om denne tilnærmingen kan være nyttig som en terapeutisk strategi19, kan det ikke være det primære målet for noe eksperimentelt oppsett. Derfor, før du utfører et stort sett med eksperimenter, bør forskjellige antistoffer som binder forskjellige epitoper av det samme proteinet testes for også å verifisere potensiell "blokkerende" effekt. I denne studien brukte vi et spesifikt antistoff for å følge i sanntid uttrykket av CD44 på cellemembranen til en svært aggressiv pediatrisk DMG-cellelinje i 3D-invasjon og migrasjon. Protokollen som ble brukt tillot oss å kvantitativt måle uttrykket av CD44 over tid på celler som invaderer og migrerer. Interessant, i nærvær av anti-CD44-antistoffet, bemerket vi også en reduksjon i cellemotilitet i forhold til cellene med ALR, men i fravær av antistoffet. Vi kan ikke utelukke, men også en hemmende effekt på celleproliferasjon. Tilegnelsen av et annet invasjonsmønster med overgang fra mesenkymallignende til amøbelignende cellemorfologi20 ble også observert i nærvær av anti-CD44-antistoffer. Disse uventede resultatene tyder på at blokkering av CD44 kan bidra til mesenkymal til amoeboid overgang i pediatrisk DMG.
Med hensyn til begrensningene i denne protokollen, tatt i betraktning oppløsningen til CCD-kameraet til Incucyte Live-Cell Analysis Instrument og dets begrensede z-stack-evne, kan oppsettet vi presenterer for live-3D-celle immunocytokjemi-analysene brukes som en foreløpig tilnærming, i stor skala multibrønnformat, før du går videre til en mer grundig analyse ved hjelp av enten kraftigere fluorescerende bildebehandlingssystemer (f.eks. konfokale mikroskoper og bildebehandlingssystem med høyt innhold med en konfokal modalitet som Operette CLS eller Opera Phoneix) eller en mer raffinert tilnærming for å studere i sanntid uttrykket av et overflateprotein via en reporteranalyse21.
En bredere anvendelse av live-3d-celleimmunocytokjemi presentert her som en monokultur, kan være en 3D-samkulturanalyse etablert for å avbilde og analysere i sanntids direkte celle-celle-interaksjoner. I dette tilfellet kan to forskjellige ALR brukes med forskjellige fluoroforer for å binde proteiner spesifikt uttrykt på cellemembranen på forskjellige celletyper (f.eks. tumorceller og immunceller). I dette tilfellet kan direkte cellekontakt analyseres med levende avbildning ved samlokalisering av de to forskjellige ALR / antistoffkompleksene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen relevante tilknytninger eller økonomisk engasjement med noen organisasjon eller enhet med økonomisk interesse i eller økonomisk konflikt med emnet eller materialet som er omtalt i manuskriptet.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Silvia Soddu og Dr. Giulia Federici (Unit of Cellular Networks and Molecular Therapeutic Targets, IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute, Roma, Italia) for tilgang til IncuCyte S3 Live Cell Imaging System i det foreløpige oppsettet av bildebehandlingsprotokollen. Videre takker vi Bernadett Kolozsvari for de tekniske rådene. Studien ble støttet av Children with Cancer UK grant (16-234) og Det italienske helsedepartementet Ricerca Corrente. M Vinci er en barn med kreft UK Fellow. R Ferretti er mottaker av Fondazione Veronesi Fellowship (2018 og 2019). Forfatterne anerkjenner Fondazione Heal for deres støtte og Children's Hospital Foundation for finansiering av Queensland Children's Tumor Bank.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well TC-Treated Microplates | Corning | 3595 | size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution for neurosphere dissociation |
| Burker chamber | Mv medical | FFL16034 | cell counting chamber |
| CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
| Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye | Incucyte | 4743 | Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry |
| Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | - | The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays. |
| Inverted Microscope | - | any inverted microscope | |
| Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
| Tumor stem cell (TSM) medium | - | - | growth cell medium (see reference in the text for details) |
| Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, round bottom clear |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
- Magrì, A., Bardelli, A. Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).
- Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
- Caretti, V., et al. Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma. Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).
- Pericoli, G., et al. Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763 (2020).
- Vinci, M., et al. Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells. Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).
- Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies. Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).
- Huang, C. C., et al. Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells. PLoS One. 10 (6), 0128045 (2015).
- Prudner, B. C., et al. Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors. Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).
- Ferretti, R., et al. Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction. Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
- Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 64 (2018).
- Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).
- Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).
- Mount, C. W., et al. Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M. Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Czabanka, M., et al. Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209 (2020).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Panková, K., Rösel, D., Novotný, M., Brábek, J. The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
