Summary
اعتلال الشبكية السكري هو أحد الأسباب الرئيسية للعمى. تعد الأنسجة وفحص انهيار الحاجز الدموي والشبكية وتصوير الأوعية الفلورية تقنيات قيمة لفهم الفيزيولوجيا المرضية للشبكية ، والتي يمكن أن تعزز الفحص الفعال للأدوية ضد اعتلال الشبكية السكري.
Abstract
يغير مرض العين في الجزء الخلفي مثل اعتلال الشبكية السكري فسيولوجيا الشبكية. يتميز اعتلال الشبكية السكري بانفصال الشبكية ، وانهيار حاجز الشبكية الدموي (BRB) ، وتكوين الأوعية الدموية في الشبكية. نموذج الفئران في الجسم الحي هو أداة تجريبية قيمة لدراسة التغيرات في بنية ووظيفة شبكية العين. نقترح ثلاث تقنيات تجريبية مختلفة في نموذج الفئران لتحديد التغيرات المورفولوجية لخلايا الشبكية ، والأوعية الدموية الشبكية ، و BRB المعرضة للخطر. يستخدم علم أنسجة الشبكية لدراسة مورفولوجيا خلايا الشبكية المختلفة. أيضا ، يتم إجراء القياس الكمي عن طريق عدد خلايا الشبكية وقياس سمك طبقات الشبكية المختلفة. يستخدم اختبار انهيار BRB لتحديد تسرب البروتينات خارج العين من البلازما إلى الأنسجة الزجاجية بسبب انهيار BRB. يستخدم تصوير الأوعية الدموية الفلوري لدراسة تولد الأوعية الدموية وتسرب الأوعية الدموية عن طريق تصور الأوعية الدموية في الشبكية باستخدام صبغة FITC-dextran.
Introduction
اعتلال الشبكية السكري (DR) هو واحد من أكثر المضاعفات الثانوية تعقيدا لمرض السكري. كما أنه السبب الرئيسي للعمى الذي يمكن الوقاية منه بين السكان في سن العمل في جميع أنحاء العالم. في تحليل تلوي حديث ل 32.4 مليون شخص كفيف ، كان 830،000 شخص (2.6٪) مكفوفين بسبب DR1. احتلت نسبة فقدان البصر المنسوبة إلى مرض السكري المرتبة السابعة في عام 2015 بنسبة 1.06٪ (0.15-2.38) على مستوى العالم2,3.
يتم تشخيص اعتلال الشبكية السكري عن طريق تشوهات الأوعية الدموية في أنسجة العين الخلفية. سريريا ، ينقسم إلى مرحلتين - DR غير التكاثري (NPDR) و DR التكاثري (PDR) ، بناء على الأوعية الدموية في شبكية العين. يعتبر ارتفاع السكر في الدم المنظم القوي ل DR لأنه ينطوي على العديد من المسارات المشاركة في التنكس العصبي4,5 والالتهاب 6,7 والأوعية الدموية الدقيقة8 في شبكية العين. تشمل المضاعفات الأيضية المتعددة الناجمة عن ارتفاع السكر في الدم تراكم المنتجات النهائية المتقدمة للغليكاتيون (AGEs) ، ومسار البوليول ، ومسار الهيكسوسامين ، ومسار بروتين كيناز-سي. هذه المسارات مسؤولة عن تكاثر الخلايا (الخلايا البطانية) ، والهجرة (pericytes) ، وموت الخلايا المبرمج (خلايا الشبكية العصبية ، والخلايا المحيطة ، والخلايا البطانية) بناء على مراحل مختلفة من اعتلال الشبكية السكري. يمكن أن تؤدي هذه التغيرات الأيضية إلى تغيرات فسيولوجية مثل انفصال الشبكية ، وفقدان خلايا الشبكية ، وانهيار حاجز الدم والشبكية (BRB) ، وتمدد الأوعية الدموية ، وتكوين الأوعية الدموية9.
مرض السكري من النوع 1 الناجم عن الستربتوزوتوسين (STZ) هو ممارسة راسخة ومقبولة جيدا في الفئران لتقييم التسبب في مرض السكري ومضاعفاته. ترجع الآثار السكرية ل STZ إلى التدمير الانتقائي لخلايا جزيرة البنكرياس β 10. ونتيجة لذلك ، ستخضع الحيوانات لنقص الأنسولين ، وارتفاع السكر في الدم ، و polydipsia ، و polyuria ، وكلها خصائص لمرض السكري من النوع 1 البشري11. بالنسبة لتحريض مرض السكري الحاد ، يتم إعطاء STZ عند 40-65 مجم / كجم من وزن الجسم عن طريق الوريد أو داخل الصفاق خلال مرحلة البلوغ. بعد حوالي 72 ساعة ، تقدم هذه الحيوانات مستويات الجلوكوز في الدم أكبر من 250 ملغ / ديسيلتر 10,12.
لفهم التغيرات الفسيولوجية في شبكية العين بسبب التنكس العصبي والالتهابات وتكوين الأوعية الدموية ، يجب تحسين التقنيات المختلفة في النماذج الحيوانية التجريبية. يمكن دراسة التغيرات الهيكلية والوظيفية في خلايا الشبكية وأوعية الشبكية من خلال تقنيات مختلفة مثل علم الأنسجة وفحص انهيار BRB وتصوير الأوعية الفلورية.
يتضمن علم الأنسجة دراسة تشريح الخلايا والأنسجة والأعضاء على المستوى المجهري. وهو ينشئ علاقة بين بنية ووظيفة الخلايا / الأنسجة. يتم تنفيذ عدة خطوات لتصور وتحديد التغيرات المجهرية في بنية الأنسجة ، وبالتالي مقارنة النظراء الأصحاء والمريضين 13. وبالتالي ، من الضروري توحيد كل خطوة من خطوات علم الأنسجة بدقة. الخطوات المختلفة التي ينطوي عليها علم أنسجة الشبكية هي تثبيت العينة ، وتقليم العينة ، والجفاف ، وإزالة ، والتشريب بالبارافين ، وتضمين البارافين ، والتقسيم ، والتلطيخ (تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين) 13،14.
في شبكية العين السليمة ، يتم التحكم في نقل الجزيئات عبر شبكية العين بواسطة BRB ، الذي يتكون من الخلايا البطانية والخلايا المحيطة على الجانب الداخلي ، والخلايا الظهارية الصباغية الشبكية على الجانب الخارجي. ومع ذلك ، تبدأ الخلايا البطانية BRB الداخلية والخلايا المحيطة في التدهور أثناء الحالة المريضة ، كما أن BRB معرض للخطر أيضا15. بسبب هذا الانهيار BRB ، تتسرب العديد من جزيئات الوزن الجزيئي المنخفض إلى الأنسجة الزجاجية والشبكية 16. مع تقدم المرض ، تتسرب العديد من جزيئات البروتين الأخرى (الوزن الجزيئي المنخفض والمرتفع) أيضا إلى الأنسجة الزجاجية والشبكية بسبب اضطراب التوازن 17. يؤدي إلى مضاعفات أخرى مختلفة وفي نهاية المطاف وذمة بقعية وعمى. وبالتالي ، فإن تحديد مستويات البروتين في الجسم الزجاجي ومقارنة الحالات الصحية والسكري يضر بمقاييس BRB.
تصوير الأوعية الفلورية هو تقنية تستخدم لدراسة الدورة الدموية للشبكية والمشيمية باستخدام صبغة الفلورسنت. يتم استخدامه لتصور الأوعية الدموية في شبكية العين والمشيمية عن طريق حقن صبغة الفلوريسين عبر الوريد أو حقن القلب18. بمجرد حقن الصبغة ، تصل أولا إلى شرايين الشبكية ، تليها أوردة الشبكية. عادة ما يتم الانتهاء من هذا الدوران للصبغة في غضون 5 إلى 10 دقائق من حقن الصبغة19. إنها تقنية مهمة لتشخيص مختلف أمراض العين في الجزء الخلفي، بما في ذلك اعتلال الشبكية السكري والأوعية الدموية الجديدة المشيمية20. يساعد على اكتشاف التغيرات الرئيسية والثانوية في الأوعية الدموية في الحالات الطبيعية والمريضة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتبع هذا البروتوكول جميع إرشادات رعاية الحيوان التي تقدمها لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية ، BITS-Pilani ، حرم حيدر أباد.
1. أنسجة الشبكية
- استئصال العين وتثبيتها
- القتل الرحيم لفأر ويستار الذكر المصاب بالسكري من 2 إلى 3 أشهر جنبا إلى جنب مع التحكم المطابق للعمر (14 إلى 15 أسبوعا) باستخدام جرعة عالية من البنتوباربيتال (150 ملغ / كجم) عن طريق الطريق داخل الصفاق. لا توجد نبضات قلب يمكن اكتشافها تؤكد الوفاة في غضون 2-5 دقائق.
- استئصال العين عن طريق إجراء شقوق باستخدام شفرة مشرط على المناطق الأنفية والصدغية من العين. ثم قطع على طول حوافها باستخدام ملقط ومقص صغير لإزالة العين من المقبس المداري.
ملاحظة: قبل التضحية بالفئران ، حافظ على الحلول المثبتة جاهزة.
تحذير: الفورمالديهايد يهيج الجلد والعين والأنف والجهاز التنفسي. يمكن أن يسبب أيضا السرطان لأنه محسس قوي للجلد. ارتد القفازات وتعامل معها تحت غطاء المحرك21. - اغسل العين جيدا ب 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) في طبق بتري لإزالة الدم. إزالة الدهون الزائدة المحيطة بالعين لسهولة اختراق المحلول المثبت.
- ضع العين على الفور في 5 مل من محلول التثبيت بمساعدة الملقط ، وتأكد من أنها ليست عالقة على جدران القوارير الزجاجية. حرك بلطف لبضع ثوان واستبدل الغطاء بوضع العلامات المناسبة. احتضان العين في محلول مثبت لمدة 24 إلى 48 ساعة في الظروف المظلمة في درجة حرارة الغرفة.
- تقليم الأنسجة
- بعد التثبيت ، قم بإزالة العين من المحلول المثبت ، واغسلها ب 10 مل من PBS ، وضعها في طبق بتري يحتوي على 10 مل من PBS المبرد عند 4 درجات مئوية.
- باستخدام ملقط صغير ، امسك العين بالعصب البصري واصنع في pars plana بمساعدة مقص صغير. قطع من خلال كامل هامش القرنية لفصل الكوب الأمامي من العين. باستخدام الملقط ، اختر العدسة بلطف ، وتخلص منها ، واقطع العصب البصري.
- باستخدام مقص صغير منحني ، قم بعمل قسم طولي من كأس العين الخلفي ، يمر عبر القرص البصري ويقسمه إلى نصفين. ضعه في قاعدة الكاسيت وأغلق الغطاء بشكل صحيح دون أي إزعاج للأنسجة. قم بتسمية الكاسيت باسم عينة الأنسجة وتاريخها.
- الجفاف وإزالة وتشريب البارافين للأنسجة
- تجفيف الأنسجة المشذبة عن طريق النقل التدريجي في 80 مل من 50 ٪ ، 70 ٪ ، 90 ٪ ، و 100 ٪ من الإيثانول. أثناء نقل الكاسيت من تركيز إلى آخر ، تأكد من ربتها على ورق نظيف لتقليل التلوث.
ملاحظة: اسمح للمنديل بالوقوف في كل عملية نقل لمدة 30 دقيقة (مرتين). إجمالي الوقت المستغرق لهذه الخطوة هو حوالي 4 ساعات. - عند الجفاف ، انقل الكاسيت إلى 80 مل من الزيلين لمدة 30 دقيقة (مرتين) لاستبدال الإيثانول بالزيلين.
ملاحظة: بعد الحضانة مع الزيلين ، يصبح النسيج شفافا.
تحذير: الزيلين هو مركب عطري مع حلقة البنزين. يهيج العين والأغشية المخاطية وقد يسبب أيضا الاكتئاب. - أخيرا ، قم بتشريب الأنسجة بالبارافين المسخن مسبقا عند 60 درجة مئوية ليحل محل الزيلين في الأنسجة. ضعي الكاسيت عدة مرات على المناديل الورقية لتقليل محتوى الزيلين وضعيه في 200 مل من البارافين (السائل عند 60 درجة مئوية) لمدة 2 ساعة (1 ساعة × 2).
تحذير: تجنب استنشاق البارافين المذاب ، لأنه ينتج قطرات دهنية صغيرة قد تسبب عدم الراحة في الجهاز التنفسي.
- تجفيف الأنسجة المشذبة عن طريق النقل التدريجي في 80 مل من 50 ٪ ، 70 ٪ ، 90 ٪ ، و 100 ٪ من الإيثانول. أثناء نقل الكاسيت من تركيز إلى آخر ، تأكد من ربتها على ورق نظيف لتقليل التلوث.
- تضمين البارافين
- قم بتشغيل آلة تضمين البارافين قبل 1 ساعة على الأقل من الاستخدام لإذابة البارافين ولكي تصل المحطات إلى درجات الحرارة المطلوبة. املأ قالبا فولاذيا بشمع البارافين المذاب عن طريق وضعه على سطح ساخن ، ثم قم بإزالة كاسيت واحد في كل مرة من حاوية البارافين.
- انقل القالب الفولاذي من سطح ساخن إلى سطح بارد (4 درجات مئوية). عند هذه النقطة ، سيبدأ الشمع الموجود في القالب في التصلب. قبل أن يتصلب تماما ، ضع الأنسجة في الشمع بمساعدة الملقط وقم بتوجيه الأنسجة بحيث يواجه جزء القرص البصري من الكوب الخلفي قاعدة القالب.
ملاحظة: تأكد من أن الأنسجة لا تتحرك والحفاظ على اتجاهها المطلوب. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فضع القالب مرة أخرى على سطح العمل الدافئ حتى تسييل البارافين بالكامل ، ثم ابدأ مرة أخرى بالخطوة 1.4.2. - عندما يبدأ الشمع في القالب في التصلب ، ضع قاعدة الكاسيت على الفور فوق القالب. املأ القالب بعناية بالبارافين فوق الحافة العلوية للكاسيت وانقله ببطء إلى سطح بارد (بالقرب من -20 درجة مئوية) للتصلب السريع. حتى يتم تصلبه ، كرر العملية مع أشرطة الكاسيت الأخرى من الخطوة 1.4.2.
- بمجرد تصلب جميع القوالب ، افصل القالب الفولاذي عن الكاسيت. إذا كان الأمر صعبا ، فانتظر لفترة أطول قليلا وحاول مرة أخرى (لا تقم بإزالته بقوة). يصبح الفصل أسهل عند التصلب الكامل. الآن يصبح الكاسيت قاعدة كتلة البارافين التي سيتم الاحتفاظ بها أثناء التقسيم بواسطة microtome.
ملاحظة: يمكن تخزين هذه الكتلة في درجة حرارة الغرفة لمزيد من الاستخدام. في هذه المرحلة ، يمكن إيقاف العملية واستمرارها لاحقا (إذا لزم الأمر).
- التقسيم
- قم بتثبيت شفرة ميكروتوم يمكن التخلص منها في حامل الشفرة. قم بإزالة شمع البارافين الزائد حول أشرطة الكاسيت بحيث تظل الأجزاء العلوية والسفلية من الكتل موازية للسكين. قم بتركيب الكتلة على حامل الكاسيت.
- افتح العجلة اليدوية لدفعها حتى يتلامس سطح الكتلة مع حافة السكين. قم بتقليم شمع البارافين الزائد على الكتلة حتى يتم تصور الأنسجة على سطح الكتلة. اضبط سمك القسم على 5 ميكرومتر وقم بقص شريط من خمسة إلى ستة أقسام.
- باستخدام الملقط ، انقل الشريط برفق إلى سطح الحمام المائي الدافئ مسبقا (حوالي 50 درجة مئوية) لكشف الشريط. اجمع المقاطع على شريحة زجاجية مغلفة بألبومين ماير عن طريق الضغط باستمرار على الشريحة أسفل القسم. ارفع الأقسام برفق واترك الشرائح تجف أفقيا طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح في درجة حرارة الغرفة في صناديق جافة لعدة أشهر. في هذه الخطوة ، يمكن إيقاف العملية ومتابعتها لاحقا.
- تلطيخ
- سخني الشرائح ليتم تلطيخها في فرن الهواء الساخن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة قبل استخدامها حتى يذوب البارافين ، واتبع الخطوات كما هو مذكور في الجدول 1.
تحذير: تكون بقع الهيماتوكسيلين والإيوسين سامة عند استنشاقها أو تناولها. وقد أفيد بأنها مسرطنة.
- سخني الشرائح ليتم تلطيخها في فرن الهواء الساخن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة قبل استخدامها حتى يذوب البارافين ، واتبع الخطوات كما هو مذكور في الجدول 1.
| الكاشف | وقت الوقوف | التكرار (عدد المرات) |
| زيلين | 5 دقائق | 2 |
| 100٪ إيثانول | 5 دقائق | 2 |
| 90٪ إيثانول | 5 دقائق | 2 |
| 70٪ إيثانول | 5 دقائق | 2 |
| 50٪ إيثانول | 5 دقائق | 2 |
| الماء | 5 دقائق | 2 |
| هيماتوكسيلين | 4 دقائق | 1 |
| غسل المياه | ||
| 1٪ الكحول الحمضي في 70٪ الإيثانول | 30 ثانية | 1 |
| غسل المياه | ||
| ماء سكوت | 1 دقيقة | 1 |
| غسل المياه | ||
| 50٪ إيثانول | 1 دقيقة | 1 |
| 95٪ إيثانول | 1 دقيقة | 1 |
| 0.25٪ أوزين | 5 ثانية | 1 |
| غسل المياه | ||
| الماء | 2 دقيقة | 1 |
| 95٪ إيثانول | 1 دقيقة | 1 |
| 100٪ إيثانول | 1 دقيقة | 1 |
| زيلين | 5 دقائق | 2 |
| حامل وغطاء | ||
الجدول 1. إجراء تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين
2. فحص انهيار الحاجز الدموي الدماغي
- تجمع الدم والجسم الزجاجي
- تخدير فأر ويستار الذكر المصاب بالسكري من 2 إلى 3 أشهر جنبا إلى جنب مع التحكم المطابق للعمر (14 إلى 15 أسبوعا) باستخدام الكيتامين (80 ملغ / كغ) و xylazine (8 ملغ / كغ). تأكد من حالة التخدير عن طريق سحب الدواسة المنعكس (قرصة إصبع القدم). جمع على الفور 1 مل من الدم عن طريق ثقب القلب في أنبوب مغلفة حمض الإيثيلين ديامين رباعي أسيتيك (EDTA) لفصل البلازما عن الدم الكامل.
- القتل الرحيم للفئران باستخدام جرعة عالية من البنتوباربيتال (150 ملغم / كغ) ، عن طريق الحقن من خلال الطريق داخل الصفاق. لا توجد نبضات قلب يمكن اكتشافها تؤكد الوفاة في غضون 2-5 دقائق. قم باستئصال العين ووضعها على الفور على الثلج الجاف.
- ضع العين في طبق بتري نظيف فوق الثلج الجاف (مستحسن) وابدأ في تشريح العين كما هو مذكور في الخطوة 1.2.2.
- قم بإزالة العدسة، واسحب الجسم الزجاجي بعناية من الكوب الخلفي باستخدام ملقط صغير وضعه في أنبوب تجانس يحتوي على ثلاث إلى أربع حبات زجاجية (2-4 مم).
ملاحظة: يوصى بالتشريح على الثلج الجاف لأن إزالة العدسة والجسم الزجاجي أسهل في ظل ظروف التجميد.
- إعداد العينات
- تجانس الفكاهة الزجاجية في مجانس الخرز بسرعة متوسطة لمدة 10 ثوان.
- نقل عينات الدم (1 مل) والجسم الزجاجي (10-20 ميكرولتر) إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة وأجهزة الطرد المركزي على حد سواء العينات عند 5200 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: في حالة التجانس الناجح ، يكون للزجاج اتساق موحد بعد الطرد المركزي. ومع ذلك ، في حالة الاتساق غير المنتظم للزجاج ، كرر من الخطوة 2.2.1 مع زيادة وقت التجانس. - جمع supernatant من كلتا العينتين ، وتخفيف الفكاهة الزجاجية وعينات البلازما بنسبة 1: 10 و 1: 20 ، على التوالي ، مع PBS.
- القياس الكمي للبروتين ونسبة بروتين البلازما الزجاجية
- لقياس تركيز البروتين في عينات الفكاهة والبلازما الزجاجية ، أضف 5 ميكرولتر من العينات المخففة إلى 250 ميكرولتر من كاشف برادفورد ، واخلطها جيدا ، واقرأ الامتصاص عند 590 نانومتر في غضون 40 دقيقة.
ملاحظة: إذا كانت قيمة امتصاص العينات أعلى من 1.0، فقم بتخفيف العينات بشكل أكبر وكرر الإجراء من الخطوة 2.2.3. - تطبيع مستوى البروتين الزجاجي إلى مستوى بروتين البلازما من نفس الفئران وقياس الفرق بين الفئران الصحية مقابل الفئران السكرية.
- لقياس تركيز البروتين في عينات الفكاهة والبلازما الزجاجية ، أضف 5 ميكرولتر من العينات المخففة إلى 250 ميكرولتر من كاشف برادفورد ، واخلطها جيدا ، واقرأ الامتصاص عند 590 نانومتر في غضون 40 دقيقة.
3. تصوير الأوعية الدموية الفلورية
- FITC-dextran70000 حقن صبغة
- تخدير الفئران الذكور ويستار السكري من 2 إلى 3 أشهر جنبا إلى جنب مع السيطرة المتطابقة مع العمر (14 إلى 15 أسبوعا) باستخدام 3 ٪ من الايزوفلوران وتأكيد رد فعل انسحاب دواسة (قرصة إصبع القدم). اغمس الذيل في كوب يحتوي على ماء دافئ (37-40 درجة مئوية). نظف الذيل بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل حقن الصبغة. حدد موقع الوريد الجانبي للذيل وحدد موضع الحقن في الجزء السفلي من الذيل.
ملاحظة: في حالة فشل إدخال الإبرة، حاول الإدراج في موقع آخر أعلى الموضع الحالي (طرف إلى قاعدة الذيل). ومع ذلك ، ينصح بالحقن مرة واحدة لأن الوخز المتكرر قد يؤدي إلى تطور الإجهاد في الفئران ، مما قد يسبب تضيق الأوعية. - حقن 1 مل من محلول صبغة FITC-dextran70000 50 ملغم/مل من خلال الوريد الذيل واسمح للصبغة بالدوران لمدة 5 دقائق. القتل الرحيم للفئران بجرعة عالية من البنتوباربيتال (150 ملغ / كغ) ، عن طريق الحقن من خلال الطريق داخل الصفاق. لا توجد نبضات قلب يمكن اكتشافها تؤكد الوفاة في غضون 2-5 دقائق. استئصال العين كما هو مذكور في الخطوة 1.1.1.
ملاحظة: إذا لزم الأمر ، يمكن تثبيت العين في محلول الفورمالديهايد بنسبة 4٪ ، لمدة لا تزيد عن 30 دقيقة.
- تخدير الفئران الذكور ويستار السكري من 2 إلى 3 أشهر جنبا إلى جنب مع السيطرة المتطابقة مع العمر (14 إلى 15 أسبوعا) باستخدام 3 ٪ من الايزوفلوران وتأكيد رد فعل انسحاب دواسة (قرصة إصبع القدم). اغمس الذيل في كوب يحتوي على ماء دافئ (37-40 درجة مئوية). نظف الذيل بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل حقن الصبغة. حدد موقع الوريد الجانبي للذيل وحدد موضع الحقن في الجزء السفلي من الذيل.
- إعداد جبل مسطح
- لإعداد حوامل مسطحة ، حافظ على أدوات التشريح جاهزة مع الشرائح والأغطية. ضع العين في طبق بتري مملوء ب PBS المبرد وابدأ في تشريح العين كما هو مذكور في الخطوة 1.2.2.
- الآن ضع طرف ملقط مدبب بين الصلبة والشبكية. حركها برفق على طول حافة الكوب ، مع التأكد من عدم ربط شبكية العين بالصلبة في أي وقت. إذا كان هناك أي عائق ، فقم بقطع هذا الجزء ببطء على طول الحافة باستخدام مقص صغير منحني.
- بمجرد التأكد من أن شبكية العين غير متصلة بالصلبة من أي جانب ، يتم قطعها بالقرب من القرص البصري ، مما يجعل ثقبا صغيرا بحيث تنفصل الشبكية تماما عن الصلبة. ادفع شبكية العين ببطء إلى محلول PBS وضعها على شريحة مسطحة نظيفة بمساعدة ملعقة أو ملقط.
- باستخدام مقص دقيق أو شفرات مشرط ، قم بإجراء جروح طفيفة في أنسجة الشبكية ، وتقسيمها إلى أربعة أرباع. تأكد من أن الجروح على بعد 2 مم على الأقل من الثقب الذي تركه القرص البصري في المركز ، كما هو موضح في الشكل 1.
- قم بإزالة PBS الزائد من جوانب الأنسجة باستخدام أطراف 0.2 مل دون إزعاج الحامل المسطح.
- ضع قطرة من وسط التركيب المضاد للتلاشي (50 ميكرولتر إلى 100 ميكرولتر) على حامل مسطح ، وقم بتغطيته بغطاء ، وتصور على الفور تحت المجهر البؤري.
ملاحظة: حافظ على الحد الأدنى من الضوء أثناء الإجراء بأكمله.
- تصور جبل مسطح
- تصور الحامل المسطح تحت هدف 10x للمجهر البؤري. قم بإجراء مسح ضوئي للتجانب لالتقاط الحامل المسطح بالكامل كصورة واحدة. يعتمد عدد البلاط على حجم الحامل المسطح للشبكية. أيضا ، قم بإجراء تكديس Z لتصور الأوردة والشرايين في بؤر مختلفة (الحجم المفضل ل Z-stack هو 5 ميكرومتر ، اعتمادا على أي منها ، يختلف عدد خطوات Z-stack).
- استخدم كاشف PMT و HyD بنسبة ربح 700-900 و 100-150 ، على التوالي. اختر نطاق الانبعاثات بين 510-530 نانومتر لصبغة FITC-dextran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أنسجة الشبكية
في شبكية العين السكرية ، تخضع خلايا الشبكية للتنكس. بالإضافة إلى ذلك ، يزداد سمك طبقات الشبكية بسبب الوذمة 22. يمكن استخدام الصور التي تم الحصول عليها بعد تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين لعدد الخلايا وقياس سمك الطبقات المختلفة ، كما هو موضح في الشكل 2 باستخدام ImageJ.
فحص انهيار الحاجز الدموي الشبكي
نظرا لأن BRB يتعرض للخطر في الفئران المصابة بالسكري ، يصبح التسرب بارزا ، مما يؤدي إلى تراكم الجزيئات الحيوية من البلازما إلى شبكية العين والجسم الزجاجي. في الفئران المصابة بالسكري ، يكون تسرب البروتين من البلازما إلى الجسم الزجاجي أعلى بنحو ثلاثة أضعاف مقارنة بالفئران السليمة (الشكل 3). يمكن تقدير البروتين باستخدام أي طريقة عدة مثل طريقة لوري أو طريقة حمض بيسينكونينيك (BCA) أو طريقة برادفورد (المذكورة في هذه الورقة ، القسم 2.3). يوصى بتشريح العين حديثا ، لأن التأخير في المعالجة يمكن أن يؤدي إلى التصاق زجاجي قوي مع شبكية العين ، مما يجعل من الصعب فصلها. قد يؤدي الفصل غير السليم للزجاج الزجاجي عن شبكية العين إلى نتائج إيجابية كاذبة.
تصوير الأوعية الفلورية
تستخدم هذه التقنية لتصور تسرب الشبكية والأوعية الدموية، بما في ذلك الأوعية الدموية الدقيقة والكلية. يعتمد اختيار حجم FITC-dextran على تطبيقه لمختلف الدراسات. يستخدم الوزن الجزيئي المنخفض FITC-dextran ، الذي يتراوح من 4-6 kDa ، لتصور التسرب في الأوعية الدموية. في المقابل ، يتم استخدام جزيئات FITC-dextran عالية الوزن الجزيئي ، والتي تتراوح من 70 kDa إلى 2 مليون Da ، لتصور تولد الأوعية. يؤدي الحقن الناجح للصبغة إلى تصور الأوعية الدموية بأكملها للحامل المسطح للشبكية ، كما هو موضح في الشكل 4. يمكن استخدام الصور التي تم الحصول عليها بعد الفحص المجهري البؤري لتحديد مساحة الأوعية الدموية المشغولة في شبكية العين بأكملها باستخدام برنامج ImageJ لمقارنة المجموعات السليمة والمريضة.
الشكل 1. إعداد شبكية العين على جبل مسطح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. صور الأنسجة للشبكية الصحية مقابل السكرية. (A) و (B) يمثلان صور الشبكية الملطخة ب H & E للتحكم (A) والفئران السكرية (B) تحت 40x. يزداد السماكة الكلية للشبكية وكل طبقة في حالات مرض السكري (C). الاختصارات: PRL = طبقة المستقبلات الضوئية ، ONL = الطبقة النووية الخارجية ، OPL = طبقة الشكل الخارجي ، INL = الطبقة النووية الداخلية ، IPL = طبقة الشكل الضفيري الداخلية ، و GCL = طبقة الخلايا العقدية. يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± SD. * يمثل اختلافا معنويا عن المجموعة الضابطة (P < 0.0001) ، في حين يمثل # فرقا معنويا عن المجموعة الضابطة عند P < 0.05 ، الذي تم الحصول عليه بواسطة اختبار ANOVA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. انهيار حاجز الدم والشبكية في الفئران السليمة مقابل الفئران السكرية. يمثل الرسم البياني نسبة بروتين البلازما الزجاجية للفئران الصحية مقابل الفئران السكرية. يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± SEM. * يمثل اختلافا كبيرا عن المجموعة الضابطة (P < 0.01) التي تم الحصول عليها بواسطة اختبار t غير المقترن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. تصوير الأوعية الدموية الفلورية للأوعية الدموية في الشبكية. (أ) و (ب) يمثلان جبلا مسطحا من شبكية العين مرئيا بواسطة مسح البلاط وخياطة الصور تحت 10x. (A) يمثل شبكية العين الضابطة ، (B) يمثل شبكية العين السكرية. يشير السهم الأبيض إلى التسرب. تم الحصول على جميع الصور بواسطة Z-stack (سمك 5 ميكرومتر). أشرطة المقياس في (A) و (B) هي 0.5 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
علم الأنسجة
يتم إجراء علم الأنسجة الشبكية لتصور التغيرات المورفولوجية لخلايا الشبكية وطبقاتها. يجب تحسين العديد من الخطوات ، بما في ذلك اختيار الحل المثبت ، ومدة التثبيت ، والجفاف ، وتشريب البارافين. يجب ألا يتجاوز حجم الأنسجة 3 مم ، حيث يصبح الاختراق المثبت بطيئا. يؤدي البارفورمالديهايد الشائع الاستخدام بنسبة 4٪ إلى انفصال الشبكية حتى في العين السليمة بسبب الأسمولية العالية نسبيا للمحلول مقارنة بالفكاهة المائية والفكاهة الزجاجية ، مما يؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة23. الأسمولية العالية للمحلول تؤدي إلى تقلص الحجم وتؤدي إلى انكماش الأنسجة. الحل المثبت المستخدم في هذا البروتوكول هو 1٪ الفورمالديهايد مع 1.25٪ glutaraldehyde ، الذي يحتوي على أسمولية أقل نسبيا ، ويقلل من تشويه الأنسجة ، ويقلل من انفصال الشبكية عن الطبقة الظهارية الصباغية الشبكية ، ويحافظ أيضا على الهيكل في حالته الأصلية. خيار آخر من الحل المثبت هو حمض الخليك والإيثانول مع الفورمالديهايد. يمكن أن تساعد الحالة الحمضية للمحلول المثبت في التثبيت السريع للأنسجة ، بينما يحسن الإيثانول من تغلغل المحلول المثبت. ومع ذلك ، فإن تحسين نسبة الإيثانول وحمض الخليك أمر ضروري لأن التركيز الزائد قد يؤدي إلى انكماش أو تورم الأنسجة ، على التوالي24. تشمل معلمات التقييم لتثبيت الأنسجة بنجاح انفصال شبكية العين وطبقات الشبكية السليمة وانكماش الأنسجة. عامل حاسم آخر أثناء إجراء التثبيت هو حجم المحلول المثبت ، والذي يجب أن يكون على الأقل 20 إلى 25 ضعف حجم العين للتثبيت المناسب25. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم تدوير مقلة العين أو الأنسجة كلما تم نقلها من محلول إلى آخر ، بحيث لا تلتصق بقاع أو جدران الحاوية.
يمكن أن تؤدي معالجة الأنسجة غير المكتملة ، بما في ذلك الجفاف والتشريب بالبارافين ، إلى تقلص الأنسجة وجفافها ، والتي يمكن تصورها عند حدوث الاكتئاب على سطح الكتلة. بالإضافة إلى ذلك ، سيؤدي سوء معالجة الأنسجة أيضا إلى تلوين الأقسام باللون الأبيض عند تعرضها للماء25. إذا لم تتم معالجة الأنسجة بشكل صحيح ، فيمكن استعادتها من خلال الزيلين لإزالة البارافين ، تليها الإماهة في خفض تصنيف الإيثانول ، (أي 100٪ إيثانول ، 90٪ إيثانول ، و 70٪ إيثانول). مرة أخرى ، كرر الخطوات من 1.3 إلى 1.4 لإعداد كتل البارافين بنجاح.
أثناء تحضير كتل البارافين ، من الضروري التأكد من أن الأنسجة محاطة من جميع الجوانب بالبارافين ولا توجد فقاعات هواء. أي خطأ في إعداد الكتلة سيؤدي إلى تقسيم غير ناجح للأنسجة. في بعض الأحيان يتم طي الكأس الخلفي أثناء المعالجة ؛ في هذه المرحلة ، يمكن سحبه بلطف باستخدام ملقط (في البارافين الساخن) ولكن ليس إلى الحد الذي يتلف فيه الأنسجة. لنفترض أن اتجاه الأنسجة في قالب الصلب ليس كما هو مرغوب فيه بينما يبدأ البارافين في التصلب ؛ في هذه الحالة ، يمكن إعادته إلى البارافين المذاب والأنسجة لإعادة توجيه الأنسجة لإعداد كتل البارافين. أيضا ، أثناء نقل الأنسجة إلى قالب التضمين ، تأكد من أن البارافين حول الأنسجة لا يتصلب. يخلق انفصال شعري بين الأنسجة وتضمين الوسط (البارافين) في block25. إذا حدث ذلك ، فقم بإذابة البارافين حول الأنسجة عن طريق وضعه في البارافين الساخن ووضعه في القالب الفولاذي مرة أخرى.
أثناء التقسيم ، يجب أن تكون الشفرة حادة بما يكفي لإعطاء شرائط منفتحة من الأنسجة. لا تستخدم جزءا معينا من الشفرة أكثر من 30 مرة. إذا لم يتم تقسيم الكتلة بشكل صحيح ، افترض أن الشفرة حادة ، وبالتالي ، استبدلها أو أعد شحذها. إذا لم تكن الأقسام مناسبة ، فقد يكون ذلك أيضا بسبب تشريب البارافين غير السليم أو استخدام البارافين القديم لتشريب وإعداد الكتل. يمكن إذابة البارافين الموجود في الكتلة ، ويمكن استخدام البارافين الطازج لإعداد الكتلة. لتجنب الأقسام غير المستوية ، قم بتدوير عجلة الميكروتوم ببطء مع المنعطفات المتساوية بدلا من الحركات السريعة والمتشنجة.
أثناء إجراء تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين ، فإن تحسين وقت بقع الهيماتوكسيلين والإيوسين أمر بالغ الأهمية لأنه قد يؤدي إلى أنسجة أقل أو مفرطة التلطيخ. سيؤدي الذوبان غير السليم للبارافين أو إماهة الأنسجة إلى تلطيخ غير متساو. يمكن تصوره كأقسام بيضاء على الشريحة. تجفيف الأنسجة وإذابة البارافين مرة أخرى في فرن الهواء الساخن ، تليها الخطوات المذكورة في الجدول 1. علاوة على ذلك ، فإن أحد الأخطاء الشائعة التي يتم إجراؤها أثناء تلطيخ H & E هو استخدام الكحول كمجففة بعد بقعة Eosin. قد يؤدي الاستخدام المفرط للكحول إلى نقص تلطيخ السيتوبلازم وأجسام التضمين مما قد يؤدي إلى أقسام ملطخة بشكل سيئ 25. يجب أن يتم استخدام وسط التركيب مباشرة بعد إزالة الزيلين الزائد ، وتجنب تجفيف الزيلين لأنه قد يؤدي إلى تشويه الأنسجة. أيضا ، يجب تجنب المركب المائي (مثل الجلسرين في PBS) لأن الأنسجة في حالة جفاف. لا يخترق المركب المائي الأنسجة وينتج عنه صور ضبابية.
عند تحسين جميع الخطوات المذكورة أعلاه ، سيتمكن الباحثون من إجراء علم الأنسجة بنجاح. يستغرق الأمر حوالي ثلاثة محاولات لاختيار الحل المثبت المطلوب وتحسين معلمات العملية الأخرى.
انهيار حاجز الدم والشبكية
الخطوة الأكثر حساسية في هذه التقنية هي عزل الجسم الزجاجي عن العين. من الأفضل تنفيذه على عين جديدة. يوصى باستخدام الثلج الجاف لسهولة عزل الجسم الزجاجي ، خاصة إذا كان الجسم الزجاجي لا يزال متصلا بشبكية العين. في كثير من الأحيان ، يمكن تحديد العدسة أو الشبكية مع الجسم الزجاجي عن طريق تعكر الجسم الزجاجي بسبب شبكية العين. يمكن عادة تجنب هذه المشاكل باستخدام ظروف التجميد. ومع ذلك ، إذا كانت العلامات الزجاجية بجانب العدسة ، فيمكن فصلها عن طريق القطع عند تقاطع العدسة والجسم الزجاجي باستخدام مقص صغير. إذا انسحبت شبكية العين مع الجسم الزجاجي، يمكن إزالة الشبكية قطعة تلو الأخرى باستخدام ملقط صغير. ويقترح أيضا استخدام مرشح الطرد المركزي لسهولة عزل الجسم الزجاجي عن العدسة والشبكية26. نظرا لأن الجسم الزجاجي عبارة عن بنية تشبه الهلام ، فإنه يحتاج إلى تجانس لمزيج متجانس من البروتينات. عادة ، كما هو مذكور في الخطوة 2.2.1 ، تكون دورة تجانس واحدة كافية للتجانس السليم ، والذي يمكن تحديده عن طريق تسييل الفكاهة الزجاجية عند الطرد المركزي. إذا لوحظت الطبيعة الهلامية للزجاج بعد الطرد المركزي ، كرر التجانس (الخطوة 2.2.1). يمكن إجراء تحديد كمية البروتين باستخدام أي طريقة عدة ، ولكن يجب أن تكون حساسة للكشف عن مستويات البروتين المنخفضة في الجسم الزجاجي حتى 2 ميكروغرام / ميكرولتر.
تصوير الأوعية الفلورية
تهدف هذه التقنية إلى تصور شبكة الأوعية الدموية في شبكية العين ، وبالتالي ، يجب أن تصل الصبغة بالتساوي إلى الأوعية الدقيقة في الشبكية. يمكن تحسين خطوات مختلفة لضمان ذلك ، مثل موقع الحقن ووقت الدورة الدموية. يمكن حقن الصبغة عن طريق حقن الوريد الذيل أو حقن القلب. مخاطر حقن القلب حقن الصبغة في موقع آخر غير القلب إذا لم تكن مدربة تدريبا جيدا. لذلك ، يفضل حقن الوريد الذيل. ومع ذلك ، فإن تحديد الوريد الجانبي سهل عند غمسه في الماء الدافئ (37-40 درجة مئوية) وتنظيفه باستخدام 70٪ من الإيثانول. يساعد الإيثانول على توسيع الأوعية الدموية ، مما قد يساعد في الوصول إلى موقع الوريد. من الضروري أيضا حقن الصبغة في الوريد فقط. يمكن الشعور بالفشل في حقن الصبغة في الوريد الذيل عن طريق المقاومة أثناء حقن الصبغة أو انتفاخ المنطقة المجاورة بسبب الحقن تحت الجلد. يمكن إزالة الإبرة وإعادة إدخالها في موقع آخر من الذيل. يمكن أيضا تصور حقن الوريد الذيل الناجح عن طريق التبول القسري للفئران ؛ لون الصبغة مرئي في بول الفئران في غضون 30 إلى 40 ثانية.
أيضا ، وقت التداول ضروري. عادة ما تكون 5 إلى 10 دقائق كافية لتعميم الصبغة في أوعية الشبكية بنجاح. يمكن تحضير حامل مسطح في عين جديدة أو عين ثابتة. يمكن أن يكون إعداد حامل مسطح في عين جديدة أمرا صعبا ، ولكن بمجرد إتقانه ، تكون التقنية هي الأكثر تفضيلا أثناء التثبيت ، تبدأ الصبغة في التسرب في محلول التثبيت 27. لذلك ، لا ينبغي إطالة التثبيت لأكثر من 30 دقيقة للعين بأكملها. في حالة وجود صعوبة في فصل شبكية العين الطازجة ، يمكن حتى تثبيته في محلول مثبت (4٪ فورمالديهايد) بعد فصل الكوب الخلفي عن الكوب الأمامي لمدة 15 إلى 20 دقيقة. غالبا ما ينظر إلى أن الصبغة تتسرب من الأوعية الدموية إلى الأنسجة المحيطة ، حتى في شبكية العين الصحية. قد يكون هذا بسبب التثبيت الزائد ؛ وبالتالي ، ينبغي تحسين الوقت اللازم للتثبيت. إنه يعزز فقط العزل السهل للشبكية ويحافظ على الهيكل للاستخدام في المستقبل. علاوة على ذلك ، قد تؤدي زيادة وقت دوران الصبغة في الحيوان أيضا إلى تسرب الصبغة من الأوعية الشبكية إلى الأنسجة المحيطة بها ، والتي تحتاج إلى تحسين.
حجم FITC-dextran ضروري لأن صبغة الوزن الجزيئي الأعلى لن تدخل الأوعية الدموية الدقيقة. في المقابل، سوف تتسرب صبغة الوزن الجزيئي المنخفض من أوعية جديدة من شبكية العين الصحية28. لذلك ، يفضل FITC-dextran بوزن جزيئي يبلغ 70 كيلو لإجراء تصوير الأوعية الدموية الفلوري ، لتصور التسرب والأوعية الدموية في شبكية العين. ومع ذلك ، فإن أحد القيود الكبيرة على هذه التقنية هو مدة تطوير الأوعية الدموية الجديدة في الفئران المصابة بالسكري والإجراء الغازي للدراسة ، والذي يمكن استبداله في المستقبل بتقنيات غير غازية مثل تخطيط الشبكية الكهربائي وقاع العين وغيرها من الأدوات البصرية غير الغازية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح مالية منافسة.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن ينوه بالمجلس الهندي للبحوث الطبية (ICMR; ITR-2020-2882) لتمويل الدعم المقدم إلى الدكتور نيرمال ج. نود أيضا أن نشكر منحة الجامعة للجنة على توفير زمالة بحثية مبتدئة لمانيشا مالاني ومرفق المختبرات التحليلية المركزي ، BITS-Pilani ، حرم حيدر أباد لتوفير مرافق البنية التحتية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | Anesthesia agent | |
| Ketamine hydrochloride | Troikaa Pharmaceuticals | Anesthesia agent | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | Anesthesia agent | |
| Pentobarbital sodium | Zora Pharma | Euthanesia agent | |
| Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Prepared in-house |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydration |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | Clearing of ethanol or paraffin |
| Paraffin wax | HiMedia | GRM10702 | used for embedding tissue |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides |
| Hydrochloric acid | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | For preparation of 1 % acid alcohol |
| Acetic acid | HiMedia | AS119 | For preparation of eosin |
| Scotts water | Leica | 3802900 | Bluing reagent |
| Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution | Sigma | 1.09254.0500 | Staining of nuclei |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house |
| DPX Mountant media | Sigma | 6522 | Visualization and protection of retinal sections |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Cassettes | HiMedia | PW1292 | To hold tissue during histology processing |
| Water bath | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperature maintenance |
| Paraffin embedding station | Myr | EC 350 | Preparation of paraffin blocks |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Sectioning |
| Blades | Leica | Leica 818 | Sectioning |
| Slides | HiMedia | BG005 | Holding paraffin-tissue sections |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | Not applicable | Not applicable | Dissection |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Protein quantification |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| EDTA coated tubes | J.K Diagnostics | Not applicable | Separate plasma from whole blood |
| Homogenization tubes | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Homogenization of vitreous |
| Homogenization caps | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Homogenization of vitreous |
| Glass beads | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Homogenization of vitreous |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenization of vitreous |
| 96-well plate - Transparent | Grenier | GN655101 | Protein quantification |
| Plate reader | Molecular devices | SpectrMax M4 | Absorbance measurement |
| Centrifuge | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia | FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | Prepared in-house |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading mounting medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| Slides | HiMedia | BG005 | Flatmount preparation |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Confocal microscope | Leica | DMi8 | Visualization of flatmount |
References
- Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
- Pandova, M. G. Visual Impairment and Blindness. , IntechOpen. (2019).
- Mokdad, A. H., et al. Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017. Ethnicity & Disease. 29, Suppl 1 159-172 (2019).
- Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).
- El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).
- Schröder, S., Palinski, W., Schmid-Schönbein, G. Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy. The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).
- Miyamoto, K., et al. Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).
- Bhanushali, D., et al. Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).
- Wang, W., Lo, A. C. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).
- Akbarzadeh, A., et al.
- Weiss, R. B. Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity. Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).
- Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. The metabolic fate and elimination of streptozotocin. Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).
- Luna, L. G. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , McGraw-Hill, Blakiston Division. New York. (1968).
- Okunlola, A., et al. Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether. Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).
- Wallow, I., Engerman, R. Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).
- do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proença, R., Cunha-Vaz, J. Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes. Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).
- Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus. Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).
- D'amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Gupta, D. Fluorescein angiography refresher course: Here's how to interpret the findings of this useful diagnostic tool. Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).
- Edelman, J. L., Castro, M. R. Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat. Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).
- Formaldehyde, 2-Butoxyethanol and 1-tert-Butoxypropan-2-ol. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. , Available from: http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vol88/index.php (2009).
- Szabó, K., et al. Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats. Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).
- Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Luna, L. G. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , Blakiston Division, McGraw-Hill. McGraw-Hill, New York. (1968).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).
- D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye (Lond). 5, Pt 4 440-446 (1991).
