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Medicine

कॉर्नियल घाव हीलिंग का अध्ययन करने के लिए एक उपकला घर्षण मॉडल

Published: December 29, 2021 doi: 10.3791/63112
Automatic Translation
1, 1, 2, 2,3, 1,2
1College of Optometry, University of Houston, 2Children’s Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center

Summary

यहां, ट्रेफिन और एक कुंद गोल्फ क्लब स्पड का उपयोग करके माउस में एक केंद्रीय कॉर्नियल उपकला घर्षण घाव बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। यह कॉर्नियल घाव भरने वाला मॉडल अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और अब इसका उपयोग बीमारियों के संदर्भ में समझौता किए गए कॉर्नियल घाव भरने का मूल्यांकन करने के लिए किया जा रहा है।

Abstract

कॉर्निया दृष्टि के लिए महत्वपूर्ण है, आंख की अपवर्तक शक्ति के लगभग दो-तिहाई के लिए लेखांकन। दृष्टि में कॉर्निया की भूमिका के लिए महत्वपूर्ण इसकी पारदर्शिता है। हालांकि, इसकी बाहरी स्थिति के कारण, कॉर्निया विभिन्न प्रकार की चोटों के लिए अतिसंवेदनशील होता है जिससे कॉर्नियल पारदर्शिता और अंतिम अंधापन का नुकसान हो सकता है। इन चोटों के जवाब में कुशल कॉर्नियल घाव भरने कॉर्नियल होमियोस्टेसिस को बनाए रखने और कॉर्नियल पारदर्शिता और अपवर्तक क्षमताओं के संरक्षण के लिए निर्णायक है। समझौता कॉर्नियल घाव भरने की घटनाओं में, कॉर्निया संक्रमण, अल्सर और स्कारिंग के लिए कमजोर हो जाता है। कॉर्नियल पारदर्शिता और दृष्टि के संरक्षण के लिए कॉर्नियल घाव भरने के मौलिक महत्व को देखते हुए, सामान्य कॉर्नियल घाव भरने की प्रक्रिया की बेहतर समझ संक्रमण और बीमारी से जुड़े बिगड़ा कॉर्नियल घाव भरने को समझने के लिए एक शर्त है। इस लक्ष्य की ओर, कॉर्नियल घायल होने के मूत्र मॉडल सामान्य शारीरिक स्थितियों के तहत काम करने वाले कॉर्नियल घाव भरने के तंत्र की हमारी समझ को आगे बढ़ाने में उपयोगी साबित हुए हैं। यहां, ट्रेफिन और एक ब्लंट गोल्फ क्लब स्पड का उपयोग करके माउस में एक केंद्रीय कॉर्नियल उपकला घर्षण बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। इस मॉडल में, कॉर्निया पर केंद्रित एक 2 मिमी व्यास गोलाकार ट्रेफिन का उपयोग घाव क्षेत्र को सीमांकित करने के लिए किया जाता है। गोल्फ क्लब स्पड का उपयोग उपकला को डिब्राइड करने और कॉर्नियल उपकला तहखाने झिल्ली को नुकसान पहुंचाए बिना एक परिपत्र घाव बनाने के लिए देखभाल के साथ किया जाता है। परिणामी भड़काऊ प्रतिक्रिया सेलुलर और आणविक घटनाओं के एक अच्छी तरह से विशेषता वाले कैस्केड के रूप में आगे बढ़ती है जो कुशल घाव भरने के लिए महत्वपूर्ण हैं। यह सरल कॉर्नियल घाव भरने वाला मॉडल अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और अच्छी तरह से प्रकाशित है और अब इसका उपयोग बीमारी के संदर्भ में समझौता किए गए कॉर्नियल घाव भरने का मूल्यांकन करने के लिए किया जा रहा है।

Introduction

कॉर्निया आंख का पारदर्शी पूर्वकाल एक तिहाई है। कॉर्निया आंख की आंतरिक संरचनाओं की रक्षा करने और एक संरचनात्मक बाधा बनाने सहित कई कार्यों में कार्य करता है जो आंख को संक्रमण1 से बचाता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि कॉर्निया दृष्टि के लिए महत्वपूर्ण है, जो आंख 2,3 की अपवर्तक शक्ति का लगभग दो-तिहाई प्रदान करता है। दृष्टि में कॉर्निया की भूमिका के लिए महत्वपूर्ण इसकी पारदर्शिता है। हालांकि, इसकी बाहरी स्थिति के कारण, कॉर्निया को दिन-प्रतिदिन के आधार पर विभिन्न प्रकार की चोटों के संपर्क में लाया जाता है जिससे इसके बाधा कार्य में व्यवधान, पारदर्शिता का नुकसान और अंतिम अंधापन हो सकता है। कॉर्नियल पारदर्शिता का नुकसान दुनिया भर में दृश्य हानि का एक प्रमुख कारण है 4,5. कॉर्नियल घर्षण आपातकालीन कक्ष (ईआर) की यात्राओं का एक सामान्य कारण है, जो ईआर 6 में प्रस्तुत आंखों से संबंधित मामलों के आधे हिस्से के लिए लेखांकन करताहै। संयुक्त राज्य अमेरिका में सालाना 1 मिलियन से अधिक व्यक्तियों को आंखों से संबंधित चोटों से पीड़ित होने का अनुमानहै 7. इन चोटों के जवाब में कुशल कॉर्नियल घाव भरने कॉर्नियल होमियोस्टेसिस को बनाए रखने और इसकी पारदर्शिता और अपवर्तक क्षमताओं के संरक्षण के लिए निर्णायक है। समझौता किए गए कॉर्नियल घाव भरने की घटनाओं में, कॉर्निया संक्रमण, अल्सर और 8,9 को निशान देने के लिए कमजोर हो जाता है। इसके अलावा, अपवर्तक सर्जरी की बढ़ती लोकप्रियता कॉर्निया10 पर एक अद्वितीय दर्दनाक चुनौती रखती है। कॉर्नियल पारदर्शिता और दृष्टि के संरक्षण के लिए कॉर्नियल घाव भरने के मौलिक महत्व को देखते हुए, सामान्य कॉर्नियल घाव भरने की प्रक्रिया की बेहतर समझ संक्रमण और बीमारी से जुड़े बिगड़ा कॉर्नियल घाव भरने को समझने के लिए एक शर्त है।

उस अंत तक, कॉर्नियल घाव भरने के कई पशु मॉडल 11,12,13,14,15 विकसित किए गए हैं। कॉर्नियल घाव भरने के मूत्र मॉडल सामान्य शारीरिक स्थितियों के तहत काम करने वाले कॉर्नियल घाव भरने के तंत्र की हमारी समझ को आगे बढ़ाने में उपयोगी साबित हुए हैं। कॉर्नियल घाव भरने के अध्ययन में विभिन्न प्रकार के कॉर्नियल घावों को नियोजित किया गया है, प्रत्येक घाव भरने की प्रक्रिया के विभिन्न पहलुओं की जांच के लिए उपयुक्त है। कॉर्नियल घाव भरने के अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले सबसे आम प्रकार के घाव मॉडल यांत्रिक और रासायनिक घाव मॉडल हैं। रासायनिक कॉर्नियल घाव, ज्यादातर कॉर्निया पर क्षारीय जलने के निर्माण को शामिल करते हैं, कॉर्नियल अल्सर, ओपेसिफिकेशन और नियोवैस्कुलराइजेशन13 का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होते हैं। यांत्रिक कॉर्नियल घावों में डिब्राइडमेंट (घर्षण) घाव और केराटेक्टॉमी घाव 14,15,16 शामिल हैं। एक बरकरार या भंग कॉर्नियल उपकला तहखाने झिल्ली क्रमशः डिब्राइडमेंट और केराटेक्टॉमी घावों को परिभाषित करती है। डिब्राइडमेंट घावों में, उपकला तहखाने झिल्ली बरकरार रहती है, जबकि केराटेक्टॉमी घावों में, तहखाने झिल्ली को ज्यादातर पूर्वकाल स्ट्रोमा में प्रवेश के साथ भंग कर दिया जाता है। कॉर्नियल घावों के बाद पुन: उपकलाकरण, उपकला कोशिका प्रसार, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और तंत्रिका पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए डिब्राइडमेंट घाव सबसे उपयोगी होते हैं। दूसरी ओर, केराटेक्टॉमी घाव, कॉर्नियल स्कारिंग14,15 का अध्ययन करने के लिए सबसे उपयोगी हैं।

यहां, ट्रेफिन और एक कुंद गोल्फ क्लब स्पड का उपयोग करके माउस में एक केंद्रीय कॉर्नियल उपकला घर्षण घाव बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। यह सरल कॉर्नियल घाव भरने वाला मॉडल अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और अच्छी तरह से प्रकाशित है और अब इसका उपयोग रोग17 के संदर्भ में समझौता किए गए कॉर्नियल घाव भरने का मूल्यांकन करने के लिए किया जा रहा है।

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Protocol

सभी पशु प्रोटोकॉल को ह्यूस्टन विश्वविद्यालय और बेलोर कॉलेज ऑफ मेडिसिन में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया था। दृष्टि और नेत्र अनुसंधान में जानवरों के उपयोग पर एसोसिएशन फॉर रिसर्च इन विजन एंड ओप्थाल्मोलॉजी (एआरवीओ) के बयान में उल्लिखित दिशानिर्देशों का चूहों को संभालने और उपयोग करने में पालन किया गया था।

1. तैयारी

  1. फ्लोरोसिसिन समाधान की तैयारी
    1. बाँझ खारा या बाँझ 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 1 एमएल में सोडियम फ्लोरोसिसिन नमक के 10 मिलीग्राम भंग करके 1% फ्लोरोसिसिन समाधान तैयार करें।
      नोट: माइक्रोबियल संदूषण से बचने के लिए उपयोग के दिन या एक दिन पहले सोडियम फ्लोरोसिसिन समाधान तैयार करें। जब उपयोग से एक दिन पहले तैयार किया जाता है, तो प्रकाश से दूर 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्लोरोसिसिन समाधान स्टोर करें। फोटोब्लीचिंग को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्यूबों को लपेटें।
    2. समाधान को एक ही प्रयोग में उपयोग के लिए उपयुक्त एलिकोट्स में विभाजित करें। फ्लोरोसिसिन समाधान के 1-1.5 μL का उपयोग प्रति माउस प्रति समय बिंदु किया जाता है। एकल प्रयोग के लिए उपयुक्त विभाज्य की मात्रा की गणना करने के लिए निम्न सूत्र का उपयोग करें:
      Equation 1
      नोट: उदाहरण के लिए, यदि छह चूहों का अध्ययन पांच समय बिंदुओं पर निगरानी किए गए घाव के आकार के साथ एक ही प्रयोग में किया जाता है, तो उस एकल प्रयोग के लिए उपयुक्त विभाज्य की मात्रा होगी:
      Equation 2
  2. चूहों के संज्ञाहरण के लिए केटामाइन / ज़ाइलाज़िन कॉकटेल की तैयारी।
    1. कॉकटेल के 10 एमएल तैयार करने के लिए, 2.0 एमएल केटामाइन (100 मिलीग्राम / एमएल) को 1.0 एमएल ज़ाइलाज़िन (20 मिलीग्राम / एमएल) के साथ मिलाएं, और बाँझ पीबीएस के 7.0 एमएल जोड़ें। सर्जरी के एक दिन पहले या दिन केटामाइन / ज़ाइलाज़िन कॉकटेल तैयार करें।
      नोट: सभी समाधानों का उपयोग कमरे के तापमान पर किया जाना चाहिए जब तक कि अन्यथा नहीं कहा गया हो।

2. संज्ञाहरण

  1. प्रशासित करने के लिए संवेदनाहारी की उचित मात्रा निर्धारित करने के लिए माउस (8-12 सप्ताह पुराने सी 57 बीएल / 6 वाइल्डटाइप चूहों) का वजन करें। एनेस्थेटिक18 के इंजेक्शन के लिए चूहों को रोकने और संभालने के लिए दो हाथ वाले माउस संयम तकनीक का उपयोग करें। केटामाइन के 80 मिलीग्राम / किग्रा और ज़ाइलाज़िन के 8 मिलीग्राम / किग्रा की अंतिम एकाग्रता पर केटामाइन / ज़ाइलाज़िन कॉकटेल इंट्रापेरिटोनियल (यानी) प्रशासित करें।
  2. माउस पर कॉर्नियल घायल करने से पहले पूर्ण संज्ञाहरण प्राप्त होने तक प्रतीक्षा करें। पैर की अंगुली चुटकी के बाद पेडल पलटा का आकलन करके संज्ञाहरण की गहराई का मूल्यांकन करें। जब पर्याप्त संज्ञाहरण प्राप्त किया जाता है, तो माउस को पैर की अंगुली चुटकी पर स्थानांतरित नहीं करना चाहिए।
    नोट: क्योंकि चूहों जल्दी संज्ञाहरण के दौरान शरीर की गर्मी खो देते हैं, हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए चूहों के लिए गर्मी का स्रोत प्रदान करना महत्वपूर्ण है। संज्ञाहरण और वसूली चरणों के दौरान एक गर्मी स्रोत (हीटिंग पैड) पर चूहों प्लेस।

3. कॉर्नियल घाव का निर्माण

  1. केवल दाईं या बाईं आंख को घाव दें। आंख (यानी, बाएं या दाएं) के साथ स्थिरता बनाए रखें जो माउस से माउस में जाने पर घायल हो जाती है।
    नोट: क्योंकि घर्षण कॉर्नियल नसों को नुकसान पहुंचाते हैं और तीक्ष्णता को कम करते हैं, दोनों आंखों को घायल करने से महत्वपूर्ण असुविधा और हानि हो सकती है। चूंकि एनाल्जेसिक में भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को दबाने की क्षमता होती है, इसलिए कॉर्नियल सूजन को समझने के उद्देश्य से कुछ प्रयोगों में उनका उपयोग एक कन्फ्यूडर हो सकता है। कॉर्नियल घाव प्रयोगों में एनाल्जेसिक से बचने को हमारी संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था।
  2. उपकला कॉर्नियल घाव बनाने के लिए
    1. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, कॉर्निया के केंद्र को सीमांकित करने के लिए 2 मिमी व्यास ट्रेफिन ( चित्रा 1 देखें) का उपयोग करें, पलकों को पकड़ने के लिए अंगूठे और तर्जनी का उपयोग करके आंख को खुला रखें। कॉर्नियल एपिथेलियम पर एक छाप बनाने के लिए ट्रेफिन को धीरे-धीरे घुमाएं।
      नोट: ट्रेफिन का उपयोग करते समय अत्यधिक दबाव लागू नहीं करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए क्योंकि इसके परिणामस्वरूप कॉर्नियल छिद्र हो सकता है। इसके अलावा, ट्रेफिन को केंद्रीय रूप से स्थिति में रखने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। कॉर्निया के केंद्र का पता लगाने के लिए विद्यार्थियों का उपयोग लैंडमार्क के रूप में किया जा सकता है।
    2. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, ट्रेफिन के साथ सीमांकित क्षेत्र के भीतर कॉर्निया की सतह से लगभग 45 डिग्री पर ब्लंट गोल्फ क्लब स्पड ( चित्रा 1 देखें) पकड़ो। एपिथेलियम को डिब्राइड करने के लिए स्पड के साथ सीमांकित क्षेत्र के भीतर उपकला को सावधानीपूर्वक और लगातार परिमार्जन करें।
      नोट: डिब्राइडमेंट में अत्यधिक बल लागू न करें क्योंकि इससे कॉर्नियल वेध भी हो सकता है। चूहों की आंखें घायल प्रक्रिया के दौरान सूख सकती हैं, जिससे डिब्राइडमेंट मुश्किल हो जाता है। ऐसे मामले में, इष्टतम जलयोजन बनाए रखने के लिए ओकुलर सतह पर बाँझ पीबीएस लागू करें।

Figure 1
चित्रा 1: 2 मिमी ट्रेफिन और ब्लंट गोल्फ क्लब स्पड। ट्रेफिन का उपयोग कॉर्निया केंद्र में एक परिपत्र क्षेत्र का सीमांकन करने के लिए किया जाता है, और गोल्फ क्लब स्पड का उपयोग सीमांकित क्षेत्र के भीतर उपकला को हटाने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

4. घाव बंद करने और पुन: उपकलाकरण की निगरानी

  1. एक नीले प्रकाश स्रोत के साथ एक डिजिटल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके घायल सतह और छवि कॉर्निया पर 1% फ्लोरोसिसिन समाधान के 1-1.5 μL को पिपेट करें।
  2. घाव के आकार के अतिवृद्धि के लिए अग्रणी आसपास के उपकला में फैलने से बचने के लिए फ्लोरोसिसिन समाधान के अलावा के पहले मिनट के भीतर छवियों को प्राप्त करें। घायल कॉर्निया को घायल होने के बाद विशिष्ट समय (यानी, 0 एच, 12 एच, 18 एच, 24 एच, और 30 एच) पर चित्रित किया जाता है।
    नोट: सभी समय बिंदुओं पर, इमेजिंग संज्ञाहरण के तहत किया जाता है; केटामाइन /जाइलाज़िन का उपयोग घायल होने के समय किया जाता है जबकि आइसोफ्लुरेन का उपयोग बाद के समय बिंदुओं पर किया जाता है। चूहों को घाव बंद करने की निगरानी की अवधि के लिए अलग-अलग पिंजरों में व्यक्तिगत रूप से रखा जाता है। जब एक साथ रखा जाता है, तो चूहे लिटरमेट की आंखों को चाटना करते हैं, एक ऐसा व्यवहार जिसे विभिन्नऊतकों 19,20 में घाव भरने को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है।
  3. कैप्चर की गई छवियों का विश्लेषण करें, एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके घाव क्षेत्र का पता लगाएं। प्रत्येक समय बिंदु के लिए घाव क्षेत्र को 0 घंटे में मूल घाव क्षेत्र के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जाता है।

5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग और विश्लेषण

  1. घायल होने के बाद वांछित समय बिंदुओं पर एक आईएसीयूसी-अनुमोदित विधि (इस मामले में, कार्बन डाइऑक्साइड ओवरडोज के बाद ग्रीवा अव्यवस्था) द्वारा चूहों को यूथेनाइज करें।
  2. आईरिस घुमावदार कैंची का उपयोग करके नेत्रगोलक को विस्थापित करने के लिए पार्श्व कैंथस पर धीरे-धीरे दबाकर आंखों की कटाई करें। ऑप्टिक तंत्रिका को मजबूती से समझने के लिए नेत्रगोलक के पीछे कैंची का मार्गदर्शन करें, और फिर तंत्रिका को काट दें, जो नेत्रगोलक को हटाने की अनुमति देता है।
  3. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 2% पैराफॉर्मल्डेहाइड युक्त 1 एक्स पीबीएस के 1 एमएल में प्रत्येक नेत्रगोलक को ठीक करें, और फिर प्रत्येक 5 मिनट के लिए 1 एक्स पीबीएस के 1 एमएल में तीन बार धोएं।
  4. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, स्क्लेरा में चीरा लगाने के लिए एक सर्जिकल ब्लेड का उपयोग करें, लगभग 500 μm लिम्बस के लिए डिस्टल, और फिर ग्लोब के माध्यम से काट लें। संदंश का उपयोग करके, धीरे-धीरे कॉर्निया से आईरिस पदार्थ को हटा दें, और फिर सावधानीपूर्वक स्क्लरल ऊतक को दूर ट्रिम करें, जिससे लिम्बस को बरकरार रखना सुनिश्चित हो जाए।
  5. चार आंशिक रेडियल कटौती करें, प्रत्येक लंबाई में लगभग 1 मिमी, जो परिधीय कॉर्निया से विस्तारित होता है और कॉर्निया को समतल करने की अनुमति देने के लिए केंद्र से कम हो जाता है।
  6. कमरे के तापमान पर अतिरिक्त 45 मिनट के लिए 1 एक्स पीबीएस में 2% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) और 0.01% ट्राइटनएक्स -100 के 1 एमएल में कॉर्निया को परमीबिलाइज़ और ब्लॉक करें।
  7. 2% बीएसए युक्त 1 एक्स पीबीएस में तैयार सीधे लेबल वाले अद्वितीय फ्लोरोक्रोम संयुग्मित एंटीबॉडी के कॉकटेल में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कॉर्निया सेते हैं।
    नोट: एंटीबॉडी को विशिष्ट कोशिकाओं और ब्याज के ऊतकों को लेबल करने के लिए लक्षित किया जाता है। उदाहरण के लिए, एंडोथेलियम, न्यूट्रोफिल और प्लेटलेट्स को क्रमशः एंटी-सीडी 3121,22, एंटी-लाइ-6 जी23,24, और एंटी-सीडी 41 25,26 एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जाता है। 4', 6-डायमिडिनो -2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई) को नाभिक की कल्पना करने के लिए एंटीबॉडी कॉकटेल में जोड़ा जाता है।
  8. इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक 15 मिनट के लिए 1x पीबीएस में कॉर्निया को तीन बार धोएं।
  9. एंटी-फेड फ्लोरेसेंस माउंटिंग माध्यम की एक बूंद में माइक्रोस्कोप स्लाइड पर माउंट कॉर्निया, एक कवरस्लिप के साथ कवर करें, और प्रतिदीप्ति प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके वांछित आवर्धन (4 एक्स से 100 एक्स उद्देश्य) के साथ छवि। चित्रा 2 ए में सचित्र के रूप में विभिन्न क्षेत्रों में कॉर्निया की पूर्ण मोटाई छवियों ले लो।
    नोट: चित्रा 2 ए में सचित्र सूक्ष्म विश्लेषण के पैटर्न का उपयोग सूजन और सेल विभाजन में विशिष्ट क्षेत्रीय परिवर्तनों का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है। डीएपीआई और एलवाई -6 जी धुंधला दोनों का उपयोग अतिरिक्त संवहनी न्यूट्रोफिल की पहचान करने के लिए किया जाता है। डीएपीआई धुंधला होने के साथ, गोलाकार न्यूट्रोफिल में एक अलग घोड़े की नाल या डोनट के आकार का नाभिक (चित्रा 2 बी) होता है।

Figure 2
चित्रा 2: कॉर्नियल इमेजिंग रणनीति और केंद्रीय घर्षण के बाद न्यूट्रोफिल घुसपैठ (ए) कॉर्निया के व्यास में नौ सूक्ष्म क्षेत्रों को दिखाते हुए कॉर्निया पूरे बाउंट का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। ग्रे क्षेत्र मूल घाव क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। प्रत्येक क्षेत्र की चौड़ाई 500 μm है (बी) डीएपीआई धुंधला के साथ न्यूट्रोफिल नाभिक के अलग घोड़े की नाल या डोनट आकार पर ध्यान दें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Representative Results

चित्रा 3 ब्लंट गोल्फ क्लब स्पड के साथ बनाए गए कॉर्नियल घाव के ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ को दर्शाता है, यह दर्शाता है कि चोट के बाद उपकला तहखाने झिल्ली वास्तव में बरकरार है।

Figure 3
चित्रा 3: उपकला तहखाने झिल्ली कॉर्नियल घर्षण के बाद बरकरार रहती है। कुंद गोल्फ क्लब स्पड के साथ बनाए गए कॉर्नियल घाव का ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ। तीर घाव के आसपास शेष उपकला के नीचे तहखाने झिल्ली को इंगित करते हैं, जबकि तीर विघटित क्षेत्र में तहखाने झिल्ली को इंगित करते हैं। यह कॉर्निया के एब्रेडेड भागों के लिए अनब्रेडेड से तहखाने झिल्ली की निरंतरता को दर्शाता है, यह दर्शाता है कि तहखाने झिल्ली को डिब्राइडमेंट के बाद बरकरार रखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

कॉर्नियल घायल होने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग 2 मिमी उपकला घर्षण घाव 27,28,29,30,31,32,33 के लिए घाव भरने की गतिशीलता को बड़े पैमाने पर चिह्नित करने के लिए किया गया है। विवो में घाव बंद करने और पुन: उपकलाकरण की दर की निगरानी करने की क्षमता इस मॉडल का एक केंद्रीय हिस्सा है। जैसा कि चित्रा 4 ए में दिखाया गया है, फ्लोरोसिसिन समाधान और नीले प्रकाश स्रोत के साथ एक डिजिटल माइक्रोस्कोप का उपयोग घाव के आकार के दृश्य को सक्षम बनाता है। इस मॉडल में, घाव बंद करने की निगरानी घायल होने के समय (0 घंटे), 12 घंटे, 18 घंटे, 24 घंटे, और घायल होने के बाद 30 घंटे के समय की जाती है। चित्रा 4 बी 30 घंटे से अधिक घाव बंद करने के कैनेटीक्स से पता चलता है। 6 जंगली प्रकार के चूहों में, घाव बंद करने और पुन: उपकलाकरण आमतौर पर घायल होने के बाद 24 घंटे पूरा होता है जैसा कि चित्रा 4 बी में सचित्र है और एक अच्छी तरह से विनियमित भड़काऊ प्रतिक्रिया कुशल घाव भरने के लिए मौलिक है 34,35,36।

Figure 4
चित्रा 4: उपकला घाव बंद करने का मूल्यांकन फ्लोरोसिसिन धुंधला का उपयोग करके किया गया था (ए) 0 एच, 12 एच, 18 एच, 24 एच और 30 एच पर कॉर्नियल घाव के फ्लोरोसिसिन धुंधला होने की प्रतिनिधि छवियां। इस मॉडल में, घाव बंद करना आमतौर पर घायल होने के 24 घंटे बाद पूरा होता है। 24 घंटे और 30 घंटे में केंद्रीय कॉर्निया में हरे रंग के धुंधला होने की कमी पर ध्यान दें (बी) घाव बंद कैनेटीक्स घायल होने के बाद 24 घंटे तक पूर्ण घाव बंद होने का संकेत देता है। प्रत्येक समय बिंदु पर मूल्य मूल घाव क्षेत्र (यानी, 0 घंटे पर घाव क्षेत्र) (एन ≥ 6) के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जाता है। माध्य ± मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत डेटा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इस मॉडल में घायल होने के लिए भड़काऊ प्रतिक्रिया अच्छी तरह से विशेषता है। उपकला घर्षण घाव कॉर्नियल लिम्बल वास्कुलचर में तेजी से भड़काऊ प्रतिक्रिया को प्राप्त करता है जो मुख्य रूप से वासोडिलेशन की विशेषता है, प्लेटलेट एक्सट्रावेशन लिम्बस 37,38,39 तक सीमित है और कॉर्निया40 के केंद्र की ओर माइग्रेशन के साथ न्यूट्रोफिल एक्सट्रावेशन। चित्रा 5 एक्स्ट्रावास्कुलर न्यूट्रोफिल (चित्रा 5 ए) और एक्स्ट्रावास्कुलर प्लेटलेट्स और न्यूट्रोफिल (चित्रा 5 बी) के साथ एक घायल कॉर्निया के साथ एक अनियंत्रित कॉर्निया के लिम्बल वास्कुलचर को दर्शाता है।

Figure 5
चित्रा 5: लिम्बस पर भड़काऊ सेल इमेजिंग। कॉर्नियल लिम्बस का फोटोमाइक्रोग्राफ एंटी-सीडी 31 एंटीबॉडी (लाल रंग में दिखाया गया है), एंटी-ली -6 जी एंटीबॉडी (हरे रंग में दिखाया गया है) के साथ न्यूट्रोफिल और एंटी-सीडी 41 एंटीबॉडी (नीले रंग में दिखाया गया) के साथ प्लेटलेट्स के साथ लिम्बल रक्त वाहिकाओं के लिए धुंधला दिखा रहा है। (ए) कोई घर्षण नहीं और (बी) घर्षण के बाद 30 घंटे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इस मॉडल में, कॉर्निया में न्यूट्रोफिल घुसपैठ का मूल्यांकन पांच अलग-अलग क्षेत्रों में किया जाता है जैसा कि चित्रा 2 ए में सचित्र है। इन अलग-अलग क्षेत्रों को निर्धारित करने के लिए, पूर्ण कॉर्निया होलमाउंट की एक छवि पर कब्जा कर लिया जाता है, जो एंटी-सीडी 31 धुंधला के साथ लिम्बल वास्कुलचर की कल्पना करता है। प्रत्येक पंखुड़ी पर लिम्बल क्षेत्र के सबसे भीतरी किनारे को एक गाइड के रूप में लिम्बल वास्कुलचर का उपयोग करके चिह्नित किया जाता है। क्षैतिज (एक्स) या ऊर्ध्वाधर (वाई) दिशा में एक पंखुड़ी से दूसरे तक लिम्बल क्षेत्र के सबसे भीतरी किनारे से दूरी को प्रत्येक कॉर्निया होलमाउंट के लिए मापा जाता है। 8-12 सप्ताह के सी 57 बीएल / 6 जंगली प्रकार के चूहों के लिए, यह दूरी ~ 3.7 मिमी है। यह दूरी परिधीय-से-परिधीय क्षेत्रों को कवर करती है। कॉर्निया पूरे के केंद्र की गणना तब पूरे बाउंट के क्षैतिज या ऊर्ध्वाधर व्यास के आधे हिस्से के अनुरूप बिंदु के रूप में की जाती है। पैरासेंट्रल क्षेत्र गणना किए गए केंद्र से 500 μm बाएं, दाएं, ऊपर या नीचे है। अन्य फ़ील्ड पूर्ववर्ती फ़ील्ड से सभी 500 μm हैं। डीएपीआई और एलवाई -6 जी धुंधला दोनों का उपयोग अतिरिक्त संवहनी न्यूट्रोफिल की पहचान करने के लिए किया जाता है। चार चतुर्भुज से प्रत्येक कॉर्नियल क्षेत्र में न्यूट्रोफिल गिनती औसत होती है और प्रति क्षेत्र न्यूट्रोफिल के रूप में व्यक्त की जाती है।

इस मॉडल में प्लेटलेट मूल्यांकन केवल लिम्बस पर किया जाता है; कॉर्नियल घाव भरने के दौरान, प्लेटलेट्स अतिरिक्त हो जाते हैं और लिम्बस27,37 में स्थानीयकृत होते हैं। लिम्बस में प्लेटलेट्स की कुल संख्या की गणना की जाती है, और गिनती को लिम्बल क्षेत्र के प्लेटलेट्स / मिमी2 के रूप में व्यक्त किया जाता है। चार पंखुड़ियों से गिनती को कुल या औसत किया जा सकता है।

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Discussion

इस विधियों के पेपर का उद्देश्य एक ट्रेफिन और एक कुंद गोल्फ क्लब स्पड का उपयोग करके माउस में एक केंद्रीय कॉर्नियल उपकला घर्षण घाव बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करना था। इस मूत्र मॉडल का उपयोग कॉर्नियल सूजन और घाव भरने में इसके योगदान का अध्ययन करने के लिए किया गया है। इस प्रकार के मॉडल का उपयोग सामान्य शारीरिक स्थितियों के तहत कॉर्नियल घाव भरने के तंत्र का अध्ययन करने के लिए औरविकृतियों 17,28,29,41,42 में किया जा सकता है। मॉडल का उपयोग पैथोलॉजिकल स्थितियों के तहत कॉर्नियल घाव भरने की जांच करने के लिए किया गया है जैसा कि आहार-प्रेरित मोटापे17 के माउस मॉडल में बिगड़ा हुआ कॉर्नियल घाव भरने पर एक अध्ययन से प्रमाणित है। इस मॉडल का एक अलग लाभ यह है कि यह तहखाने झिल्ली को भंग किए बिना एक सटीक केंद्रीय स्थान के साथ एक सटीक (2 मिमी) प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य उपकला घाव आकार बनाता है। कॉर्नियल घायल होने का यह मॉडल सीधा और प्रदर्शन करने के लिए त्वरित है। ब्लंट गोल्फ क्लबके अलावा स्पड 29,39,43,44,45, घूर्णन गड़गड़ाहट (अल्गरब्रश) 38,46,47, और डायमंड ब्लेड 32,37,40,48,49,50,51 दोनों का उपयोग इस मॉडल में घर्षण घाव बनाने के लिए किया जा सकता है। एक अनुभवी उपयोगकर्ता के हाथों में, किसी भी उपकरण द्वारा बनाए गए घर्षण घाव में कोई पर्याप्त अंतर नहीं है। प्रशिक्षण उद्देश्यों के लिए और एक नौसिखिए के हाथों में, घूर्णन गड़गड़ाहट और हीरे के ब्लेड की तुलना में ब्लंट गोल्फ क्लब स्पड के साथ प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करना अक्सर आसान होता है। घूर्णन गड़गड़ाहट (अल्गरब्रश) को एक नाजुक स्पर्श की आवश्यकता होती है अन्यथा घूर्णन गड़गड़ाहट उपकला तहखाने झिल्ली को नुकसान पहुंचा सकती है। यह अन्य जांचकर्ताओं52,53 द्वारा भी बताया गया है। दूसरी ओर, कुंद गोल्फ क्लब स्पड लगातार उपकला तहखाने झिल्ली को बरकरार रखता है।

इस कॉर्नियल घायल प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक पुन: पेश करने और बाद में पुन: उपकलाकरण और सूजन गतिशीलता का निरीक्षण करने के लिए, माउस के समान तनाव और आयु सीमा का उपयोग किया जाना चाहिए, और घाव के आकार और गहराई को ऊपर वर्णित के रूप में बनाया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में वर्णित कॉर्नियल घाव भरने की गतिशीलता और समयसीमा सी 57 बीएल / 6 माउस तनाव के लिए हैं और यदि माउस के एक अलग तनाव का उपयोग किया जाता है तो इसे साझा नहीं किया जा सकता है। पाल-घोष एट अल .54 ने कॉर्नियल उपकला डिब्राइडमेंट घावों को ठीक करने के लिए सी 57 बीएल / 6 और बीएएलबी / सी की क्षमता में भिन्नता की सूचना दी। एक ही कॉर्नियल घाव के आकार के लिए, कॉर्नियल घाव बंद करना और फिर से उपकलाकरण बीएएलबी / सी चूहों में धीमा होता है। घाव बंद करने के पूरा होने के लिए समयरेखा और यहां वर्णित विशेषता भड़काऊ प्रतिक्रिया 2 मिमी व्यास आकार के परिपत्र घाव के लिए है। 2 मिमी से अधिक घाव व्यास के लिए एक लंबा घाव बंद होने का समय अपेक्षित है जबकि 2 मिमी से कम घाव व्यास के लिए कम समय की उम्मीद है। इसके अलावा, बड़े कॉर्नियल घाव, विशेष रूप से लिम्बस के करीब, अधिक अतिरंजित भड़काऊ प्रतिक्रिया प्राप्त करने की उम्मीद है, क्योंकि कॉर्निया16 में अधिक ल्यूकोसाइट्स की भर्ती की जाती है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि घाव कॉर्नियल एपिथेलियम तक ही सीमित होना चाहिए। उपकला तहखाने झिल्ली को तोड़ने या कॉर्नियल स्ट्रोमा को भेदने वाले घावों को ठीक करने में अधिक समय लगता है। ये घाव एक परिवर्तित भड़काऊ प्रतिक्रिया, नवसंवहनीकरण, मायोफाइब्रोब्लास्ट गठन और55,56 के निशान के साथ भी जुड़े हुए हैं।

एब्रेडेड कॉर्निया के माइक्रोबियल संक्रमण को रोकने के लिए हर कदम में देखभाल की जानी चाहिए। माइक्रोबियल संक्रमण भड़काऊ प्रतिक्रिया को बदल देता है और अल्सर, स्कारिंग और दृष्टि हानि57 को जन्म दे सकता है। घाव के माइक्रोबियल संक्रमण को रोकने के लिए, बाँझ उपकरण और समाधान हमेशा उपयोग किया जाना चाहिए। यदि एक समय में कई चूहों को घायल किया जा रहा है, तो प्रत्येक माउस के लिए एक बाँझ ट्रेफिन का उपयोग किया जाना चाहिए। चूहों के बीच में, गोल्फ क्लब स्पड को बाँझ पीबीएस में धोया जाना चाहिए, इसके बाद 70% इथेनॉल में कीटाणुशोधन किया जाना चाहिए और बाँझ पीबीएस में फिर से धोया जाना चाहिए। यदि कई दिनों में अतिरिक्त चूहों पर घायल किया जाता है, तो इसे दिन के एक ही समय में किया जाना चाहिए। यह घाव भरने और सूजन पर सर्कैडियन प्रभाव को नियंत्रित करने के लिए है। सी 57 बीएल / 6 चूहों में, दिन का समय जब घाव बनाया जाता है तो कॉर्नियल घाव भरने की दर और गुणवत्ता को प्रभावित करता है। तेजी से घाव बंद करने और अधिक से अधिक सेल विभाजन मनाया जाता है जब चूहों को दोपहर या शाम42 में घायल होने की तुलना में सुबह में घायल कर दिया जाता है। घाव भरने पर सर्कैडियन प्रभाव त्वचा58,59 सहित अन्य ऊतकों में बताया गया है। इस मॉडल में घायल होना हमेशा सुबह में किया जाता है।

इस मॉडल में घायल होने के परिणामस्वरूप भड़काऊ प्रतिक्रिया सेलुलर और आणविक घटनाओं के एक अच्छी तरह से विशेषता वाले कैस्केड के रूप में आगे बढ़ती है जो कुशल घाव भरने के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस मॉडल में घर्षण-प्रेरित सूजन में सबसे अच्छी विशेषता वाले सेलुलर खिलाड़ी न्यूट्रोफिल और प्लेटलेट्स हैं। न्यूट्रोफिल कॉर्नियल घर्षण की साइट के पहले उत्तरदाता हैं; न्यूट्रोफिल के महत्वपूर्ण स्तर घायल होने के 6 घंटे के भीतर कॉर्नियल स्ट्रोमा में पाए जाते हैं। न्यूट्रोफिल सेल मलबे को साफ करने के लिए जिम्मेदार हैं, सूजन और घाव की मरम्मत60 के लिए आंतरिक एक प्रक्रिया। उनकी फागोसाइटिक गतिविधियों के अलावा, न्यूट्रोफिल में संवहनी एंडोथेलियल विकास कारक (वीईजीएफ) 61 जैसे विकास कारक होते हैं। वीईजीएफ62,63 को घायल करने के बाद कॉर्नियल नसों के पुनर्जनन के लिए एक महत्वपूर्ण न्यूरो-पुनर्योजी कारक है और कॉर्नियल उपकला कोशिका विभाजन45,63 के लिए भी महत्वपूर्ण है। लिम्बस पर न्यूट्रोफिल घुसपैठ 18 घंटे में पहली चोटी के साथ दो तरंगों में होती है और दूसरी चोटी40 को घायल करने के बाद 30 घंटे में होती है। न्यूट्रोपेनिक चूहों 37,40 का उपयोग करना, कॉर्नियल घाव भरने के लिए न्यूट्रोफिल एक्सट्रावेशन और कॉर्निया के केंद्र में बाद में प्रवास को महत्वपूर्ण दिखाया गया है। यद्यपि पारंपरिक रूप से हेमोस्टेसिस और रक्त के थक्के के रखरखाव में निर्णायक होने के लिए जाना जाता है, प्लेटलेट्स में कॉर्नियल घाव भरने में भी एक मान्यता प्राप्त महत्वपूर्ण भूमिकाहोती है। प्लेटलेट्स में कई मध्यस्थ होते हैं जो सूजन और ऊतक संकल्प64,65 में योगदान करते हैं। थ्रोम्बोसाइटोपेनिया वाले चूहों में, इस मॉडल का उपयोग यह दिखाने के लिए किया गया है कि प्लेटलेट्स कुशल कॉर्नियल घाव भरने के लिए महत्वपूर्ण हैं37.

यद्यपि न्यूट्रोफिल और प्लेटलेट्स इस मॉडल में सबसे अच्छी विशेषता वाली कोशिकाएं हैं, गामा डेल्टा टी-कोशिकाओं, प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं और डेंड्रिटिक कोशिकाओं जैसी प्रतिरक्षा कोशिकाओं को भी इस मॉडल27,48 का उपयोग करके घायल होने के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में शामिल दिखाया गया है। स्ट्रोमा28,29 में प्राकृतिक हत्यारा सेल एक्सट्रावेशन और हीलिंग एपिथेलियम27 में गामा डेल्टा टी कोशिकाओं के प्रवास की सूचना दी गई है। इस मॉडल का उपयोग कॉर्नियल घाव भरने के दौरान प्रतिरक्षा सेल एक्सट्रावेशन के लिए महत्वपूर्ण आसंजन अणुओं की पहचान करने के लिए भी किया गया है। लिम्फोसाइट फ़ंक्शन एंटीजन -1 (एलएफए -1) 32, सीडी 1851, और अंतरकोशिकीय आसंजन अणु -1 (आईसीएएम -1) 47,49 सभी को इस मॉडल का उपयोग करके न्यूट्रोफिल एक्सट्रावेशन और कुशल कॉर्नियल घाव भरने के लिए महत्वपूर्ण दिखाया गया है। घायल होने के जवाब में उपकला कोशिका विभाजन, जो घाव बंद होने के बाद उपकला पुन: स्तरीकरण के लिए महत्वपूर्ण है, माइटोटिक आंकड़ों का उपयोग करके मूल्यांकन किया जाता है। कोशिका विभाजन के विभिन्न चरणों के दौरान गुणसूत्र संक्षेपण नाभिक को एक विशिष्ट उपस्थिति देता है जिसे माइटोटिक आकृति के रूप में जाना जाता है। नाभिक का डीएपीआई धुंधला होना इन माइटोटिक आंकड़ों के दृश्य को सक्षम बनाता है।

माउस कॉर्नियल घर्षण घाव मॉडल उल्लेखनीय रूप से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य साबित हुआ है और सेलुलर और आणविक तंत्र में काफी अंतर्दृष्टि प्रदान करता है जो कुशल घाव भरने में योगदान देता है। हालांकि, यह ध्यान देने योग्य है कि इसकी नैदानिक प्रयोज्यता के संबंध में मॉडल की सीमाएं हैं। मॉडल और इसके परिणाम केवल सरल, गैर-मर्मज्ञ उपकला घर्षण पर लागू होते हैं। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, शारीरिक या रासायनिक अपमान के कारण मर्मज्ञ घावों के परिणामस्वरूप कॉर्नियल चोटें अलग-अलग घाव भरने वाले कैनेटीक्स और परिणामों को प्राप्त करेंगी, खासकर यदि घाव संक्रमित हो जाता है जैसा कि मानव कॉर्निया को चोटों के मामले में अक्सर होता है। ऐसा कहा जा रहा है कि, माउस कॉर्नियल घर्षण घाव मॉडल सूजन के मौलिक सिद्धांतों का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट आधार प्रदान करता है जो कॉर्नियल घाव भरने को संशोधित करता है।

यहां वर्णित कॉर्नियल घायल प्रोटोकॉल सीधा और आसानी से पुन: पेश किया गया है। यह कॉर्नियल घाव भरने की प्रक्रिया और इसकी संबंधित भड़काऊ प्रतिक्रिया के बारे में मौलिक प्रश्नों की जांच करने के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है। घाव भरने की जटिलताओं से जुड़े कॉर्नियल विकृतियों को समझने में सहायता करने की इसकी क्षमता सिर्फ शुरुआत है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

फंडिंग: द्वारा समर्थित: एनआईएच ईवाई 018239 (एआरबी, सीडब्ल्यूएस, और आरईआर), पी 30 ईवाई 007551 (एआरबी), और सिग्मा शी ग्रांट इन एड ऑफ रिसर्च (पीकेए)। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की ज़िम्मेदारी है और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, या सिग्मा शी के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करती है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-CD31 antibody BD Bioscience, Pharmingen 550274
Anti-CD41 antibody BD Bioscience, Pharmingen 553847
Anti-Ly6G antibody BD Bioscience, Pharmingen 551459
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher scientific B14
C57BL/6 mice Jackson Laboratories 664
DAPI Sigma Aldrich D8417
DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope GE Life Sciences
Dissecting microscope Leica microsystems
Electronic Toploading Balances (Weighing scale) Fisher Scientific
Ethanol ThermoFisher scientific T038181000CS
Golf-club spud Stephens instruments S2-1135
Iris curve scissors Fisher Scientific 31212
Isoflurane Patterson veterinary 07-893-1389
Ketamine Patterson veterinary 07-890-8598
Phospate buffered saline (PBS) ThermoFisher scientific AM9624
Sodium fluorescein salt Sigma Aldrich 46970
Surgical blade (scapel blade) Fine Science tools 10022-00
Trephine Integra Miltex 33-31
TritonX -100 Fisher Scientific 50-295-34
Forcep Fine Science tools 11923-13
Xylazine Patterson veterinary 07-808-1947

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