Summary
Presentamos un protocolo para generar un modelo de cáncer de páncreas ortotópico mínimamente invasivo mediante inyección guiada por ultrasonido de células de cáncer de páncreas humano y el posterior monitoreo del crecimiento tumoral in vivo por imagen ecográfica.
Abstract
El cáncer de páncreas (CaP) representa uno de los tipos de cáncer más mortales en todo el mundo. Las razones de la malignidad PCa se basan principalmente en su comportamiento maligno intrínseco y alta resistencia a los tratamientos terapéuticos. De hecho, a pesar de muchos esfuerzos, tanto la quimioterapia estándar como las terapias diana innovadoras han fracasado sustancialmente cuando se pasaron de la evaluación preclínica al entorno clínico. En este escenario, se necesita urgentemente el desarrollo de modelos preclínicos de ratón que imiten mejor las características in vivo de la CaP para probar los fármacos recientemente desarrollados. El presente protocolo describe un método para generar un modelo de ratón de CaP, representado por un xenoinjerto ortotópico obtenido por inyección guiada por ultrasonido de células tumorales pancreáticas humanas. Utilizando un protocolo tan confiable y mínimamente invasivo, también proporcionamos evidencia de injerto in vivo y desarrollo de masas tumorales, que pueden ser monitoreadas por imágenes de ultrasonido (US). Un aspecto destacable del modelo de CaP descrito aquí es el lento desarrollo de las masas tumorales a lo largo del tiempo, lo que permite identificar con precisión el punto de partida de los tratamientos farmacológicos y un mejor seguimiento de los efectos de las intervenciones terapéuticas. Además, la técnica descrita aquí es un ejemplo de implementación de los principios de las 3R, ya que minimiza el dolor y el sufrimiento y mejora directamente el bienestar de los animales en la investigación.
Introduction
La CaP, y su forma más común, el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), es una de las causas más comunes de muerte relacionada con el cáncer con una tasa de supervivencia a 1 año inferior al 20 % y una tasa de supervivencia a 5 años del 8 %, independientemente del estadio 1,2. La enfermedad es casi siempre mortal, y se prevé que su incidencia crezca continuamente en los próximos años, a diferencia de otros tipos de cáncer, cuya incidencia está disminuyendo3. Factores como la detección tardía del cáncer, la tendencia a la progresión rápida y la falta de terapias específicas conducen a un mal pronóstico de la CaP4. Se han obtenido grandes avances en la investigación del cáncer, gracias al desarrollo de modelos preclínicos de ratón más precisos. Los modelos han proporcionado información adecuada para la comprensión del mecanismo molecular subyacente al cáncer y para el desarrollo de nuevos tratamientos5. Estos avances se aplican mal a la CaP, que, a pesar de los grandes esfuerzos recientes, sigue siendo resistente a las terapias quimioterapéuticas actuales1. Por estas razones, el desarrollo de nuevos enfoques para mejorar las perspectivas de los pacientes es obligatorio.
A lo largo de los años, se han desarrollado muchos modelos de ratón PCa, incluidos los xenoinjertos, que son los modelos más utilizados en la actualidad5. Los modelos de xenoinjerto se clasifican como heterotópicos subcutáneos y ortotópicos, dependiendo de la ubicación de las células tumorales implantadas. Los xenoinjertos heterotópicos subcutáneos son más fáciles y baratos de lograr, pero pasan por alto ciertos rasgos característicos de la CaP (es decir, el peculiar microambiente tumoral, caracterizado por la acumulación de tejido fibrótico, hipoxia, acidez y angiogénesis)6,7. Esto explica por qué los xenoinjertos subcutáneos a menudo no proporcionan datos sólidos para los tratamientos terapéuticos, lo que lleva a fracasos cuando se traduce al entorno clínico8. Por otro lado, los xenoinjertos ortotópicos se parecen más al microambiente tumoral, lo que lleva a una mejor imitación del desarrollo natural de la enfermedad. Además, los xenoinjertos ortotópicos son más adecuados para estudiar el proceso metastásico y las características invasivas de la CaP, que casi no ocurren en modelos subcutáneos9. En general, hoy en día se prefieren los modelos de ratón xenoinjerto ortotópico para realizar pruebas preclínicas de drogas 9,10. Los xenoinjertos ortotópicos generalmente dependen de procedimientos quirúrgicos para implantar células o piezas muy pequeñas de tejido tumoral en el páncreas. De hecho, varios artículos basados en modelos quirúrgicos de CaP han sido publicados en las últimas décadas11. Sin embargo, la calidad y el resultado del procedimiento quirúrgico para el establecimiento de un modelo de tumor ortotópico dependen en gran medida de la habilidad técnica del operador. Otro punto clave para un xenoinjerto ortotópico de PCa exitoso para un enfoque clínico traslacional es la posibilidad de establecer una enfermedad localizada con una cinética de crecimiento predecible.
Para abordar estos problemas, aquí describimos un procedimiento innovador para producir un xenoinjerto ortotópico de PCa, explotando la inyección guiada por ultrasonido (US) de células PCa humanas en la cola del páncreas en ratones inmunodeficientes. Este procedimiento genera un modelo de ratón PCa fiable. El crecimiento del tumor es seguido in vivo por imágenes de EE.UU.
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Protocol
El presente protocolo recibió la aprobación del Ministerio de Salud italiano con el número de autorización 843/2020-PR. Con el fin de garantizar condiciones asépticas, los animales se mantuvieron dentro de la sala de barrera del vivero de animales de investigación (Ce.S.A.L.) de la Universidad de Florencia. Todos los procedimientos se realizaron en el mismo espacio donde se alojaron los ratones en las instalaciones LIGeMA de la Universidad de Florencia (Italia).
1. Preparación celular
- Cultive células PCa de la línea celular PCa en una placa de Petri de 100 mm que contenga el medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con 2% de L-glutamina y 10% de suero fetal bovino (FBS).
- Incubar las células en normoxia a 37 °C con 5% deCO2.
- Separar las células con tripsina. Contar y resuspender 1 x 106 células en 20 μL de PBS, 1 h antes de la inoculación.
2. Preparación del ratón para inyección guiada por ultrasonido (US-GI)
NOTA: Los siguientes pasos se realizaron en condiciones estériles. Todo el procedimiento de inyección guiada por US, desde el comienzo de la anestesia hasta que el ratón se retira de la plataforma animal, toma alrededor de 10-12 min más 5 min para la recuperación completa del ratón.
- Justo antes de la intervención, administrar carprofeno (AINE) por vía subcutánea (s.c.) a una dosis final de 5 mg/kg o tramadol a una dosis final de 5 mg/kg utilizando una jeringa de tuberculina con una aguja de 27 G.
NOTA: Para el presente protocolo, se utilizaron 20 ratones hembra Athymic Nude-Foxn1nu . Los ratones tenían 8 semanas de edad y pesaban 20-22 g. - Encienda el generador de imágenes y seleccione Ratón (pequeño) abdominal en el menú de aplicaciones del panel del transductor. Asegúrese de que aparezca la ventana de imágenes B-Mode (Brightness Mode) y que el sistema esté listo para adquirir datos B-Mode.
NOTA: El modo B es el modo de imagen predeterminado del sistema. El sistema muestra los ecos en una vista bidimensional (2D) asignando un nivel de brillo basado en la amplitud de la señal de eco. El modo B es el modo más efectivo para localizar estructuras anatómicas.- Vaya al Explorador de estudios.
- Seleccione Nuevo estudio y escriba el nombre y la información del estudio, es decir, la fecha del estudio, etc.
- Complete toda la información necesaria en el nombre de la serie, es decir, la cepa del animal, la identificación, la fecha de nacimiento, etc.
- Toca Listo; el programa está listo para imágenes en modo B.
- Anestesiar al ratón en la cámara de inducción de la anestesia utilizando isoflurano al 4% con un flujo de gas de 2 L/min deO2.
NOTA: Aproximadamente 4 minutos son suficientes para la anestesia adecuada (respirar alrededor de 50-60 respiraciones por minuto). - Una vez que el ratón esté anestesiado, cambie la conexión de la máquina anestésica para dirigir el isoflurano hacia la mesa de manipulación del ratón.
- Colocar el ratón anestesiado en su flanco derecho sobre la mesa de manipulación (calentado a 37 °C) con el hocico en un cono nasal para asegurarse de que el ratón está anestesiado con isoflurano al 2% con un flujo de gas de 0,8 L/min deO2 (Figura 1A).
- Aplique una gota de lágrimas artificiales en los ojos del ratón para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia.
- Pegue firmemente la mano derecha, el pie derecho y la cola en las almohadillas de electrodos de la plataforma del animal con una gasa adhesiva.
NOTA: La frecuencia respiratoria del ratón y el electrocardiograma (ECG) se registran a través de las almohadillas de los electrodos.
3. Inyección de células PANC1 en el páncreas por el método US-GI
- Desinfecte la piel del ratón con etanol al 70% y mantenga la piel del flanco izquierdo estirada con una gasa adhesiva.
NOTA: Mantener la piel estirada es importante para reducir la resistencia a la inserción de la aguja y para prevenir deformaciones de la aguja. - Aplique gel de ultrasonido en el abdomen y el flanco izquierdo del ratón con una jeringa de 20 ml (sin la aguja).
- Usando la perilla de control de altura del transductor estadounidense, baje el transductor para tocar el flanco izquierdo del ratón y colóquelo transversalmente al cuerpo del animal.
- Mueva el transductor para visualizar el páncreas en la pantalla del transductor utilizando imágenes en modo B (Figura 1B).
- Prepare una jeringa Hamilton de 50 μL, que contenga 1 x 106 células PANC1 suspendidas en 20 μL de PBS, con una aguja de 30 mm 28 G y coloque la jeringa en el soporte apropiado (Figura 1C).
NOTA: Antes de usar, desinfecte la aguja de la jeringa con etanol al 70% durante un período de 5-10 minutos. - Utilizando el micromanipulador titular, bajar la jeringa a la piel del ratón, con el bisel de la aguja hacia arriba y en el mismo plano que el transductor de ultrasonido, formando un ángulo de 45° con el transductor (Figura 1D).
NOTA: A partir de este paso, proceda monitoreando la imagen de EE. UU. en la pantalla. - Usando el micromanipulador, perfore la piel e inserte la aguja de la jeringa en el páncreas y observe la imagen de EE.UU. en la pantalla, para seguir su trayectoria (Figura 1E).
NOTA: Antes de la inyección, tome la cola del páncreas como referencia que se encuentra detrás del bazo y cerca del riñón izquierdo. - Una vez insertada la aguja en el páncreas, inyecte un bolo de 20 μL que contenga las células directamente en el páncreas aplicando una presión constante sobre el émbolo de la jeringa (Figura 1F).
NOTA: El procedimiento de inyección correcto se verifica por la presencia de una pequeña burbuja en el páncreas y el flujo de líquido hipoecogénico, que es apenas visible desde la punta de la aguja. - Deje la aguja en su lugar durante 5-10 s después de inyectar todo el bolo y luego retírela lentamente.
- Retire el transductor US, limpie el gel del flanco y coloque el ratón solo en una jaula nueva. Observe al animal hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
4.3D Imágenes de EE.UU. para la monitorización de tumores pancreáticos en ratones
NOTA: La evaluación del desarrollo del tumor se realizó a partir de 8 días después de la inyección celular, utilizando el mismo instrumento utilizado para la inyección guiada por los Estados Unidos (enumerada en la Tabla de materiales). Por lo tanto, algunos procedimientos, como el encendido del sistema (paso 2.2.), la anestesia (pasos 2.3. - 2.6.) y la colocación del ratón en la plataforma animal (paso 2.7.), coinciden completamente con lo descrito anteriormente en el protocolo.
- Antes de iniciar la creación de imágenes de EE. UU., configure la estación de trabajo como se muestra en la figura 2A.
- Fije el transductor en el sistema de motor 3D (Figura 2A).
- Encienda el generador de imágenes y seleccione Nuevo estudio en el Explorador de estudios.
- Coloque el ratón en la cámara de inducción de anestesia (isoflurano al 4%).
- Colocar el ratón anestesiado en su flanco derecho sobre la mesa de manipulación calentada a 37 °C con el hocico en el tubo anestésico y reducir el isoflurano al 2% (Figura 2B).
NOTA: Es importante que el ratón se coloque en la misma posición que la inyección guiada por los Estados Unidos, para mantener las mismas referencias anatómicas. - Aplique una gota de ungüento veterinario en los ojos del ratón.
- Aplique una capa de gel de ultrasonido en el abdomen y el flanco izquierdo del ratón.
- Coloque el transductor de 55 MHz en la orientación transversal para tocar la piel del flanco izquierdo de tal manera que el páncreas esté aproximadamente centrado (Figura 2C).
- Utilice el motor 3D para adquirir imágenes de todo el páncreas en la orientación transversal, idealmente reuniendo 90-100 fotogramas por adquisición (el número de fotogramas puede variar según la elección personal).
- Seleccione la posición del motor 3D en el panel táctil del generador de imágenes.
- Indique la distancia de exploración moviendo el cursor para adquirir imágenes de todo el páncreas de ambas extremidades.
- Seleccione Escanear fotogramas y comience la adquisición 3D.
- Una vez que se hayan realizado las imágenes 3D, retire el transductor, limpie el gel de la piel y coloque el mouse solo en una jaula nueva para su recuperación. Observe al animal hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
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Representative Results
Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, los ratones fueron anestesiados primero en una cámara de isoflurano y colocados en la plataforma animal (Figura 1A). El páncreas se visualizó con imágenes de ultrasonido (Figura 1B). Se cargó una jeringa Hamilton de 50 μL con 1 x 106 células PANC1 suspendidas en 20 μL de PBS y colocadas en el soporte de la aguja (Figura 1C). El ángulo óptimo entre la jeringa y el transductor US fue de 45° (Figura 1D). Usando el micromanipulador, la aguja de la jeringa se insertó en el páncreas y su trayectoria se observó en la pantalla del generador de imágenes de EE. UU. (Figura 1E). Luego se inyectó un bolo de 20 μL de células tumorales en el páncreas (Figura 1F) y después de 10 s se retrajo la aguja. Se persiguieron acciones relevantes para prevenir el retroceso de las células y su posterior fuga en la cavidad peritoneal, como aplicar una presión constante durante la inoculación, hacer una pausa después de la inyección celular y usar una aguja delgada con un ángulo de bisel de 30 °. Después de la inyección guiada por los Estados Unidos, el peso de los ratones fue monitoreado todos los días para evaluar cualquier signo de estrés debido al procedimiento. No se observó ningún cambio significativo en el peso de los ratones inyectados.
Luego se aplicaron imágenes 3D US para monitorear el injerto de células tumorales y el desarrollo del tumor. La primera adquisición de imágenes se realizó el día 8 después de la inyección celular, seguida de adquisiciones semanales (para un total de 6 adquisiciones). Durante la obtención de imágenes, los animales se colocaron en el flanco derecho sobre la plataforma calentada (37 °C) y se anestesiaron mediante inhalación de gas isoflurano (dosis de inducción al 4% y dosis de mantenimiento al 2%) (Figura 2). La adquisición 3D se realizó en modo B utilizando el motor 3D que permite al transductor escanear el abdomen en varias secciones, perpendiculares a su eje. Se obtuvieron una serie de imágenes 2D, que luego fueron ensambladas por el software de análisis, reconstruyendo la imagen anatómica 3D del órgano (re-renderizado 3D). Para realizar imágenes 3D, fue necesario sincronizar las fases de respiración del ratón con la adquisición del escaneo 3D. La reproducibilidad del protocolo fue confirmada por la presencia de la masa tumoral, una estructura hipoecogénica (representada con colores oscuros) en la cola del páncreas, a partir del día 8, en 16 de 20 (80%) animales (Figura 3A). En cuatro ratones (20% de los animales), se observó el desarrollo de masa tumoral 2 semanas después de la inyección. Esta latencia se remonta a un procedimiento subóptimo de inserción de agujas en el páncreas, que causó fugas de células en el peritoneo.
La figura 3B muestra el volumen tumoral medio (n = 16) evaluado por imágenes de EE.UU. del modelo de ratón de inyección guiada por EE.UU. El día después de la última adquisición estadounidense, los ratones fueron sacrificados primero por inhalación deCO2 y luego por dislocación cervical. Se examinó la cavidad abdominal y se explantaron las masas tumorales para su análisis histológico (Figura 3C-E).
Figura 1: Método guiado por los Estados Unidos para el establecimiento de un modelo ortotópico de ratón PCa . (A) El ratón se coloca en el flanco derecho sobre un soporte especial calentado a 37 °C. (B) El transductor US se encuentra transversalmente al cuerpo animal a nivel del bazo y el páncreas se visualiza en modo B. La vista del flanco del abdomen del ratón muestra el páncreas (1) entre el bazo (2) y el riñón izquierdo (3). Barra de escala: 2 mm. (C) La jeringa Hamilton se coloca en el soporte adecuado. (D) En esta situación, el transductor (2) y la jeringa (1) se colocan formando un ángulo de 45°. (E) La aguja de la jeringa (1) se inserta en la cola del páncreas, justo debajo del bazo. Barra de escala: 2 mm. (F) Se inyecta un bolo que contiene 1 x 106 células PANC1 en 20 μL de PBS en la cola del páncreas, utilizando una jeringa Hamilton con una aguja de 28 G. Barra de escala: 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Estación de trabajo de imágenes utilizada para monitorear tumores pancreáticos en ratones . (A) Lugar de trabajo para imágenes de EE. UU. (1) transductor de 55 MHz; (2) Mesa de manejo del ratón; (3) Motor 3D; (4) Perilla de control de altura del transductor de EE. UU. (B) El ratón se coloca en su flanco derecho sobre la mesa de manipulación con su hocico en el tubo anestésico (1), la piel se estira y el gel estadounidense se aplica en el flanco derecho. (C) El transductor se baja para tocar la piel del ratón y se coloca transversalmente al cuerpo del animal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Desarrollo de xenoinjerto ortotópico de PCa en el páncreas del ratón . (A) Adquisición de imágenes 2D US de la masa tumoral desarrollada después de la inyección de células guiadas por eco. El desarrollo del tumor se monitorea con imágenes de US después de 8 días de inyección celular, seguido de una adquisición una vez a la semana hasta el día 44, para un total de 6 adquisiciones. El tumor está representado por una estructura hipoecogénica en el parénquima pancreático. La estructura hipoecogénica está representada ecográficamente por un área con ecos de intensidad reducida, en comparación con el parénquima circundante o una estructura vecina. Barra de escala: 2 mm. (B) Evolución temporal del volumen tumoral de PDAC ortotópico derivado de células PANC1. (C) Adquisición de imágenes de US de una masa tumoral en el día 43 después de la inyección celular. Barra de escala: 2 mm.3D la representación de la masa tumoral se muestra en el recuadro. (D) Después de la toma de imágenes, los animales son sacrificados y se realiza un examen de necropsia. (1) Masa tumoral; (2) Una pequeña porción de un páncreas sano; (3) Bazo; (4) Estómago; (5) Hígado. Barra de escala: 5 mm. (E) Tinción con hematoxilina y eosina de la masa tumoral con un aumento de 4x. Barra de escala: 200 μm. En la parte superior derecha del panel, inserción de la masa tumoral en la que las células acinares pancreáticas aún son visibles; Aumento de 40x. Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aunque el uso de imágenes de US está muy extendido en la clínica, el desarrollo tumoral en muchos modelos preclínicos de ratón generalmente se describe utilizando imágenes bioluminiscentes11. Esta última es una forma indirecta de evaluar el injerto y la expansión tumoral y tampoco proporciona una cinética confiable de crecimiento tumoral. En el presente estudio, hemos aplicado imágenes de US para realizar la inyección de células, así como para monitorear el desarrollo de tumores. El protocolo que hemos descrito y los resultados que hemos proporcionado representan un avance relevante en la investigación de PCa.
El método guiado por los Estados Unidos descrito aquí para la inyección de células tumorales pancreáticas es mínimamente invasivo y permite superar muchos inconvenientes causados por el procedimiento quirúrgico, que generalmente se aplica para establecer un modelo ortotópico de ratón PCa. Aunque faltan en la literatura indicaciones sobre la tasa de mortalidad o los efectos secundarios debidos al procedimiento quirúrgico, nuestra experiencia sugiere que el método quirúrgico produce mayor mortalidad postoperatoria en un bajo porcentaje de casos (alrededor del 10%), con sufrimiento frecuente de los animales, que requiere una cierta cantidad de tiempo de recuperación12. Además, los puntos aplicados después de la cirugía impiden la correcta aplicación de los procedimientos de imagen. Esto da como resultado la adquisición de imágenes estadounidenses con muy mala calidad, lo que lleva a una extrapolación de datos inexacta causada por artefactos, como regiones de reverberación y sombras. Teniendo en cuenta todos estos hechos, se prefiere un método que no necesita un procedimiento quirúrgico para el establecimiento de un modelo de ratón ortotópico y se recomienda encarecidamente para fines de investigación preclínica. Además, al ser mínimamente invasivo, el tiempo de recuperación de la inoculación celular es más rápido y el sufrimiento del animal es mínimo en el método guiado por los Estados Unidos. Una gran ventaja es que el método guiado por los Estados Unidos es compatible con el uso de anestesia con isoflurano que permite una inducción y recuperación más rápidas, un efecto relativamente menor sobre la función cardiovascular y la autorregulación del flujo sanguíneo cerebral, en comparación con otros métodos de anestesia (es decir, solución de ketamina / xilazina). En general, el metabolismo insignificante del isoflurano lo hace particularmente útil en el manejo anestésico13. De hecho, aproximadamente 5 minutos después del final del procedimiento, los animales recuperan la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Además, los ratones son premedicados con un analgésico (carprofeno) para minimizar el dolor, y no son necesarios tratamientos postoperatorios debido a la rápida y completa recuperación.
Sin embargo, hay algunos pasos cruciales de solución de problemas en el procedimiento que deben considerarse. El número de células que deben inocularse no debe exceder de 1 x 106 células y el volumen de inóculo celular no debe ser superior a 20 μL para evitar el riesgo de fuga de células fuera del páncreas. La inyección celular debe realizarse inmediatamente después de su desprendimiento, para evitar una disminución de la vitalidad celular. Después de la inyección celular, es necesario esperar al menos 10 s antes de retirar la aguja para evitar la fuga de células fuera del páncreas.
Uno de los aspectos más críticos del presente protocolo se refiere al posicionamiento del ratón en la plataforma animal. El ratón debe estar acostado sobre su lado derecho sobre la mesa de manipulación de animales y la piel debe estar estirada. Si la piel no se estira adecuadamente durante la inyección, la aguja tendrá dificultades para perforar y entrar en el páncreas, con el riesgo de que las células se derramen fuera del páncreas. La inyección guiada por ultrasonido para producir un modelo de ratón PCa fue descrita por primera vez por Huynh et al. en 201114. Aquí, nos centramos en la metodología adecuada para producir dicho modelo, describiendo en detalle todos los pasos para hacerlo reproducible. Además, en comparación con Huynh et al.14, hemos introducido algunas innovaciones relacionadas principalmente con los avances en la tecnología estadounidense que se produjeron en los últimos 5 años. En el presente protocolo, se recomienda encarecidamente el uso de una jeringa Hamilton con una aguja rígida y un ángulo cónico de 30° para obtener una mayor precisión durante la inyección celular y minimizar la fuga celular. Finalmente, durante la inyección guiada por los Estados Unidos, los ratones se aseguraron en su lado derecho sobre la plataforma animal, mientras que en Huynh et al.14 los ratones se colocaron en decúbito dorsal. La posición lateral del ratón permite visualizar la cola del páncreas, justo debajo del bazo, que actúa como referencia visual (Figura 1B) durante la inyección celular, asegurando la reproducibilidad de la técnica.
Al igual que con otras técnicas, también hay algunas limitaciones con el procedimiento guiado por los Estados Unidos. La mayor limitación es que la inyección se puede realizar solo en la cola del páncreas porque el cuerpo y la cabeza están cubiertos por otros órganos y son difíciles de alcanzar con la aguja. Además, otra limitación asociada con el uso de imágenes de US para monitorear el crecimiento tumoral es la incapacidad de visualizar toda la masa tumoral cuando se vuelve demasiado grande, después de 6 semanas de inoculación (Figura 3C-E). Aunque, volúmenes tan grandes no imitan el curso clínico de la enfermedad.
Otra ventaja del modelo de CaP obtenido con el protocolo aquí descrito es el lento injerto celular y crecimiento de las masas tumorales (Figura 3B). Esto es ideal para la identificación precisa del punto de partida para la intervención farmacológica y un mejor seguimiento de los efectos de las intervenciones terapéuticas a lo largo del tiempo.
Finalmente, la técnica descrita es un ejemplo de implementación de los principios de las 3R que implican el refinamiento de la técnica y el desarrollo de un procedimiento que minimice el dolor, el sufrimiento, la angustia o el daño duradero, mejorando directamente el bienestar de los animales en investigación.
Las aplicaciones futuras del modelo PCa obtenido por la inyección guiada por los Estados Unidos incluyen estudios dirigidos al desarrollo de tratamientos terapéuticos apropiados o combinaciones de tratamientos. De hecho, el uso de tales técnicas innovadoras in vivo podría combinarse con el uso de moléculas pequeñas, por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y conjugados anticuerpo-fármaco (ADC), con un enfoque teragnóstico. Este último podría ser utilizado solo, con fines terapéuticos, como nuestro grupo ha demostrado en nuestro trabajo reciente15 o después de una conjugación fluorófora adecuada, con el objetivo de monitorear el crecimiento tumoral.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, beca no. 15627, IG 21510 e IG 19766) a AA, PRIN Ministerio Italiano de Universidad e Investigación (MIUR). Aprovechando el conocimiento básico de la red de canales iónicos en cáncer para estrategias terapéuticas innovadoras (LIONESS) 20174TB8KW a AA, pHioniC: subvención de la Unión Europea Horizon 2020 No 813834 a AA. CD fue apoyado por una beca AIRC para Italia ID 24020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt, Germany | P5856 | |
| 3D-Mode package | Visualsonics Fujifilm, Italy | Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging | |
| Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel | PARKER LABORATORIES, INC. | 150 | Gel for ultrasound |
| Athymic Mice (Nude-Foxn1nu) | ENVIGO, Italy | 69 | 20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight |
| CO2 Incubator Function Line | Heraeus Instruments, Germany | BB16-ICN2 | |
| Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature | Visualsonics Fujifilm, Italy | 11426 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Euroclone Spa, Italy | ECM0101L | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) | Euroclone Spa, Italy | ECB4004L | |
| Eppendorf (1.5mL) | Sarstedt, Germany | 72.690.001 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone Spa, Italy | ECS0170L | |
| Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge | Permax S.r.l., Italy | 7803-02 | |
| Hamilton Syringe 705RM 50 µL | Permax S.r.l., Italy | 7637-01 | |
| Isoflo (250 mL) | Ecuphar | 7081219 | |
| L-glutamine 100X | Euroclone Spa, Italy | ECB3000D | |
| Mouse Handling table II | Visualsonics Fujifilm, Italy | 50249 | |
| MX550D: 55 MHz MX Series Transducer | Visualsonics Fujifilm, Italy | 51069 | Ultrasound Transducers |
| Oxygen/isofluorane mixer | Angelo Franceschini S.r.l. | LFY-I-5A | |
| PANC1 cell line | American Type Culture Collection (ATCC), USA | CRL-1469 | |
| Rimadyl (carprofen) | Pfizer | 11319 | 20 mL, injection solution |
| Trypsin-EDTA 1X in PBS | Euroclone Spa, Italy | ECB3052D | |
| Vet ointment for eyes, Systane nighttime | Alcon | 509/28555-1 | |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version) | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-12055 | complete with gas chamber |
| Vevo Imaging Station 2 | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-11983 | Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount |
| Vevo Lab | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20034 | Data Analysis Software |
| Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20054 | Includes analytic software package for B-mode |
| Vevo Photoacoustic Enclosure | Visualsonics Fujifilm, Italy | 53157 |
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