Summary
Vi presenterer en protokoll for å generere en minimal invasiv ortotopisk kreft i bukspyttkjertelen ved ultralydstyrt injeksjon av humane kreftceller i bukspyttkjertelen og den påfølgende overvåking av tumorvekst in vivo ved ultralydavbildning.
Abstract
Kreft i bukspyttkjertelen (PCa) representerer en av de dødeligste krefttypene over hele verden. Årsakene til PCa-malignitet er hovedsakelig avhengige av sin egen ondartede oppførsel og høy motstand mot terapeutiske behandlinger. Faktisk, til tross for mange anstrengelser, har både standard kjemoterapi og innovative målterapier vesentlig mislyktes når de flyttes fra preklinisk evaluering til klinisk setting. I dette scenariet er det viktig å utvikle prekliniske musemodeller som bedre etterligner in vivo-egenskapene til PCa for å teste nyutviklede stoffer. Den nåværende protokollen beskriver en metode for å generere en musemodell av PCa, representert ved en ortotopisk xenograft oppnådd ved ultralydstyrt injeksjon av humane bukspyttkjerteltumorceller. Ved hjelp av en slik pålitelig og minimal invasiv protokoll, gir vi også bevis på in vivo engraftment og utvikling av tumormasser, som kan overvåkes ved hjelp av ultralyd (US) bildebehandling. Et bemerkelsesverdig aspekt ved PCa-modellen beskrevet her er den langsomme utviklingen av tumormassene over tid, noe som muliggjør presis identifisering av utgangspunktet for farmakologiske behandlinger og bedre overvåking av effekten av terapeutiske inngrep. Videre er teknikken beskrevet her et eksempel på implementering av 3R-prinsippene siden den minimerer smerte og lidelse og direkte forbedrer dyrevelferden i forskning.
Introduction
PCa, og dens vanligste form, bukspyttkjertelen Ductal Adeno Carcinoma (PDAC), er en av de vanligste årsakene til kreftrelatert død med en 1-års overlevelsesrate lavere enn 20% og en 5-års overlevelse på 8%, uavhengig av stadium 1,2. Sykdommen er nesten alltid dødelig, og forekomsten forventes å vokse kontinuerlig de neste årene, i motsetning til andre krefttyper, hvis forekomst faller3. Faktorer som sen kreftdeteksjon, tendensen til rask progresjon og mangel på spesifikke terapier fører til en dårlig prognose for PCa4. Store fremskritt innen kreftforskning er oppnådd, takket være utviklingen av mer nøyaktige prekliniske musemodeller. Modellene har gitt relevant innsikt i forståelsen av den molekylære mekanismen som ligger til grunn for kreft og utviklingen av nye behandlinger5. Disse fremskrittene gjelder dårlig for PCa, som til tross for stor nylig innsats forblir resistent mot dagens kjemoterapeutiske terapier1. Av disse grunner er utviklingen av nye tilnærminger for å forbedre pasientens utsikter obligatorisk.
Gjennom årene har mange PCa-musemodeller blitt utviklet, inkludert xenografts, som er de mest brukte modellene i dag5. Xenograftmodeller klassifiseres som subkutane heterotopiske og ortotopiske, avhengig av plasseringen av de implanterte tumorcellene. Subkutane heterotopiske xenotransplantater er enklere og billigere å oppnå, men savner visse karakteristiske trekk ved PCa (dvs. det særegne tumormikromiljøet, preget av akkumulering av fibrotisk vev, hypoksi, surhet og angiogenese)6,7. Dette forklarer hvorfor subkutane xenotransplantater ofte ikke gir robuste data for terapeutiske behandlinger som fører til feil når de oversettes til klinisk setting8. På den annen side ligner ortotopiske xenotransplantater tumormikromiljøet nærmere, noe som fører til bedre etterligning av den naturlige utviklingen av sykdommen. I tillegg er ortotopiske xenotransplantater mer egnet for å studere den metastatiske prosessen og de invasive egenskapene til PCa, som nesten ikke forekommer i subkutane modeller9. Samlet sett er ortotopiske xenograftmusemodeller i dag foretrukket for å utføre preklinisk legemiddeltesting 9,10. Ortotopiske xenotransplantater er vanligvis avhengige av kirurgiske prosedyrer for å implantere enten celler eller svært små tumorvevsstykker i bukspyttkjertelen. Faktisk har flere papirer basert på kirurgiske modeller av PCa blitt publisert de siste tiårene11. Kvaliteten og utfallet av den kirurgiske prosedyren for etablering av en ortotopisk tumormodell er imidlertid sterkt avhengig av operatørens tekniske ferdigheter. Et annet sentralt punkt for en vellykket ortotopisk PCa xenograft for en translasjonell klinisk tilnærming er muligheten til å etablere lokalisert sykdom med forutsigbar vekstkinetikk.
For å løse disse problemene, beskriver vi her en innovativ prosedyre for å produsere en ortotopisk PCa xenograft, som utnytter ultralyd (US) -guidet injeksjon av humane PCa-celler i halen av bukspyttkjertelen i immunsviktende mus. Denne prosedyren genererer en pålitelig PCa-musemodell. Tumorveksten følges in vivo av amerikansk avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den nåværende protokollen mottok godkjenning fra det italienske helsedepartementet med autorisasjonsnummer 843/2020-PR. For å sikre aseptiske forhold ble dyrene opprettholdt inne i barriererommet til forskningsdyret vivarium (Ce.S.A.L.) ved Universitetet i Firenze. Alle prosedyrer ble utført i samme rom hvor musene ble plassert på LIGeMA-anlegget ved Universitetet i Firenze (Italia).
1. Cell forberedelse
- Dyrk PCa-celler fra PCa-cellelinjen i en 100 mm petriskål som inneholder Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 2% L-glutamin og 10% Fetal Bovine Serum (FBS).
- Inkuber cellene i normoksi ved 37 °C med 5 % CO2.
- Løsne cellene med trypsin. Telle, og resuspendere 1 x 106 celler i 20 μL av PBS, 1 time før inokulasjon.
2. Museforberedelse for ultralydstyrt injeksjon (US-GI)
MERK: Følgende trinn ble utført under sterile forhold. Hele prosedyren for USA-guidet injeksjon, fra begynnelsen av anestesien til musen er fjernet fra dyreplattformen, tar rundt 10-12 minutter pluss 5 minutter for fullstendig musegjenoppretting.
- Rett før intervensjonen, administrer karprofen (NSAID) subkutant (s.c.) i en siste dose på 5 mg/kg eller tramadol i en siste dose på 5 mg/kg ved bruk av en tuberkulinsprøyte med en 27 G nål.
MERK: For denne protokollen ble det brukt 20 atymiske naken-Foxn1nu hunnmus. Musene var 8 uker gamle og veide 20-22 g. - Slå på bildeapparatet og velg Mus (liten) abdominal på applikasjonsmenyen fra svingerpanelet. Kontroller at bildevinduet B-modus (Lysstyrkemodus) vises, og at systemet er klart til å hente B-Mode-data.
MERK: B-modus er systemets standard bildemodus. Systemet viser ekko i en todimensjonal (2D) visning ved å tilordne et lysstyrkenivå basert på ekkosignalamplituden. B-modus er den mest effektive modusen for å finne anatomiske strukturer.- Gå til studiebrowseren.
- Velg Ny studie og skriv inn studienavn og informasjon, dvs. dato for studien osv.
- Fyll ut all nødvendig informasjon i serienavnet, dvs. dyrestamme, ID, fødselsdato osv.
- Trykk på Ferdig; programmet er klart for B-modus bildebehandling.
- Bedøve musen i anestesiinduksjonskammeret ved bruk av 4% isofluran med en gasstrøm på 2 l / min av O2.
MERK: Omtrent 4 minutter er tilstrekkelig for riktig anestesi (puste rundt 50-60 pust per minutt). - Når musen er bedøvet, endrer du tilkoblingen til bedøvelsesmaskinen for å lede isofluranen mot musehåndteringsbordet.
- Plasser den bedøvede musen på høyre flanke på håndteringsbordet (oppvarmet ved 37 °C) med snuten i en nesekjegle for å sikre at musen bedøves ved bruk av 2 % isofluran med en gasstrøm på 0,8 l/min O2 (figur 1A).
- Påfør en dråpe kunstige tårer på musens øyne for å forhindre tørrhet mens du er under anestesi.
- Tape høyre hånd, høyre fot og hale fast på elektrodeputene på dyreplattformen med selvklebende gasbind.
MERK: Musens respirasjonsfrekvens og elektrokardiogram (EKG) registreres gjennom elektrodeputene.
3. Injeksjon av PANC1-celler i bukspyttkjertelen ved hjelp av US-GI-metoden
- Desinfiser museskinnet med 70% etanol og hold huden på venstre flanke strukket ved hjelp av klebende gasbind.
MERK: Å holde huden strukket er viktig for å redusere motstanden mot innsetting av nålen og for å forhindre nåledeformasjoner. - Påfør ultralydgel på magen og venstre flanke av musen ved hjelp av en 20 ml sprøyte (uten nålen).
- Bruk høydekontrollknappen til den amerikanske svingeren, senk svingeren for å berøre musens venstre flanke og plasser den på tvers til dyrets kropp.
- Flytt svingeren for å visualisere bukspyttkjertelen på transduserdisplayet ved hjelp av B-modus-avbildning (figur 1B).
- Klargjør en 50 μL Hamilton-sprøyte som inneholder 1 x 106 PANC1-celler suspendert i 20 mikroliter PBS, med en 30 mm 28 G kanyle og plasser sprøyten på den aktuelle holderen (figur 1C).
MERK: Før bruk, desinfiser sprøytenålen med 70% etanol i en periode på 5-10 minutter. - Bruk holderens mikromanipulator, senk sprøyten til musehuden, med nålen skrå opp og i samme plan som ultralydtransduseren, og danner en vinkel på 45 ° med transduseren (figur 1D).
MERK: Fra dette trinnet og fremover, fortsett ved å overvåke det amerikanske bildet på displayet. - Ved hjelp av mikromanipulatoren perforerer du huden og stikker sprøytenålen inn i bukspyttkjertelen og observerer det amerikanske bildet på displayet, for å følge banen (figur 1E).
MERK: Før injeksjon, ta halen av bukspyttkjertelen som en referanse som ligger bak milten og nær venstre nyre. - Når nålen er satt inn i bukspyttkjertelen, injiser en 20 μL bolus som inneholder cellene direkte inn i bukspyttkjertelen ved å påføre sprøytestemplet konstant trykk (figur 1F).
MERK: Den riktige injeksjonsprosedyren kontrolleres ved tilstedeværelse av en liten boble i bukspyttkjertelen og strømmen av hypoekogen væske, som knapt er synlig fra nålespissen. - La nålen stå på plass i 5-10 s etter at hele bolusen er injisert, og trekk den deretter sakte tilbake.
- Fjern den amerikanske transduseren, rengjør gelen fra flanken, og plasser musen alene i et nytt bur. Vær oppmerksom på dyret til det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency.
4.3D amerikansk bildebehandling for overvåking av bukspyttkjerteltumorer hos mus
MERK: Evalueringen av tumorutvikling ble utført fra 8 dager etter celleinjeksjonen, ved bruk av det samme instrumentet som ble brukt til den amerikanske veiledede injeksjonen (oppført i Materialtabell). Derfor samsvarer noen prosedyrer, for eksempel systemtenning (trinn 2.2.), anestesi (trinn 2.3. - 2.6.) og museplassering på dyreplattformen (trinn 2.7.), fullt ut med det som ble beskrevet ovenfor i protokollen.
- Før du starter den amerikanske bildebehandlingen, må du sette opp arbeidsstasjonen som vist i figur 2A.
- Fest svingeren på 3D-motorsystemet (figur 2A).
- Slå på bildeapparatet, og velg Ny studie i studienettleseren.
- Plasser musen i anestesiinduksjonskammeret (4 % isofluran).
- Plasser den bedøvede musen på høyre flanke på håndteringsbordet oppvarmet ved 37 °C med snuten i bedøvelsesslangen og reduser isofluran til 2 % (figur 2B).
MERK: Det er viktig at musen er plassert i samme posisjon som den amerikanske veiledede injeksjonen, for å opprettholde de samme anatomiske referansene. - Påfør en dråpe veterinærsalve på musens øyne.
- Påfør et lag med ultralydgel på musens mage og venstre flanke.
- Plasser 55 MHz-svingeren i tverrretningen for å berøre venstre flankehud slik at bukspyttkjertelen er omtrent sentrert (figur 2C).
- Bruk 3D-motoren til å skaffe bilder av hele bukspyttkjertelen i tverrretningen, ideelt sett samle 90-100 bilder per oppkjøp (antall rammer kan variere avhengig av personlig valg).
- Velg 3D-motorposisjon på bildeplaten.
- Angi skanneavstanden ved å flytte markøren for å få bilder av hele bukspyttkjertelen fra begge ekstremiteter.
- Velg Skann rammer, og start 3D-anskaffelsen.
- Når 3D-avbildning er ferdig, fjern transduseren, rengjør gelen fra huden og plasser musen alene i et nytt bur for utvinning. Vær oppmerksom på dyret til det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter protokollen beskrevet ovenfor ble mus først bedøvet i et isoflurankammer og plassert på dyreplattformen (figur 1A). Pancreas ble visualisert med ultralydavbildning (figur 1B). En 50 μL Hamilton-sprøyte ble lastet med 1 x 106 PANC1-celler suspendert i 20 μL PBS og plassert på nåleholderen (figur 1C). Den optimale vinkelen mellom sprøyten og den amerikanske svingeren var 45° (figur 1D). Ved hjelp av mikromanipulatoren ble sprøytenålen satt inn i bukspyttkjertelen og dens bane ble observert på det amerikanske bildedisplayet (figur 1E). En 20 μL bolus av tumorceller ble deretter injisert i bukspyttkjertelen (figur 1F) og etter 10 s ble nålen trukket tilbake. Relevante tiltak for å forhindre rekyl av celler og deres påfølgende lekkasje i bukhulen ble forfulgt, for eksempel å påføre et konstant trykk under inokulasjonen, pause etter celleinjeksjon og bruk av en tynn nål med en 30 ° skråvinkel. Etter den amerikanske veiledede injeksjonen ble musens vekt overvåket hver dag for å vurdere tegn på stress på grunn av prosedyren. Ingen signifikant endring i vekten av injiserte mus ble observert.
3D US imaging ble deretter brukt til å overvåke tumorcelleopptak og tumorutvikling. Den første bildeinnsamlingen ble utført på dag 8 etter celleinjeksjon, etterfulgt av ukentlige anskaffelser (for totalt 6 anskaffelser). Under bildediagnostikk ble dyrene plassert på høyre flanke på den oppvarmede (37 °C) plattformen og bedøvet ved innånding av isoflurangass (induksjonsdose ved 4 % og vedlikeholdsdose ved 2 %) (figur 2). 3D-oppkjøpet ble utført i B-modus ved hjelp av 3D-motoren som gjør at transduseren kan skanne magen i forskjellige seksjoner, vinkelrett på aksen. En serie 2D-bilder ble oppnådd, som deretter ble satt sammen av analyseprogramvaren, og rekonstruerte det 3D anatomiske bildet av orgelet (3D-gjengivelse). For å utføre 3D-bildebehandling var det nødvendig å synkronisere musens pustefaser med oppkjøpet av 3D-skanningen. Reproduserbarheten av protokollen ble bekreftet ved tilstedeværelse av tumormassen, en hypo-ekkogen struktur (representert med mørke farger) i halen av bukspyttkjertelen, fra dag 8, hos 16 av 20 (80%) dyr (figur 3A). Hos fire mus (20% av dyrene) ble utviklingen av tumormasse observert 2 uker etter injeksjonen. Denne latensen kunne spores tilbake til en suboptimal prosedyre for nålestikk i bukspyttkjertelen, noe som forårsaket lekkasje av celler i bukhinnen.
Figur 3B viser gjennomsnittlig tumorvolum (n = 16) evaluert ved amerikansk avbildning av den amerikanske veiledede injeksjonsmusmodellen. Dagen etter den siste amerikanske anskaffelsen ble mus avlivet først ved CO 2-innånding og deretter ved cervikal dislokasjon. Bukhulen ble undersøkt og tumormassene eksplantert for histologisk analyse (figur 3C-E).
Figur 1: USA-veiledet metode for etablering av en ortotopisk PCa-musemodell . (A) Musen er plassert på høyre flanke på en spesiell støtte oppvarmet ved 37 °C. (B) Den amerikanske svingeren er plassert på tvers til dyrekroppen på miltnivå og bukspyttkjertelen visualiseres i B-modus. Flankevisningen av museabdomen viser pancreas (1) mellom milten (2) og venstre nyre (3). Vektstang: 2 mm. (C) Hamilton-sprøyten er plassert på riktig holder. (D) I denne situasjonen er svingeren (2) og sprøyten (1) plassert og danner en vinkel på 45 °. (E) Nålen på sprøyten (1) settes inn i halen av bukspyttkjertelen, like under milten. Vektstang: 2 mm. (F) En bolus som inneholder 1 x 106 PANC1-celler i 20 μL PBS injiseres i halen av bukspyttkjertelen ved hjelp av en Hamilton-sprøyte med en 28 G nål. Vektstang: 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Imaging arbeidsstasjon brukt til overvåking av bukspyttkjerteltumorer hos mus . (A) Arbeidsplass for amerikansk bildebehandling. (1) 55 MHz svinger; (2) Mus håndtering tabell; (3) 3D-motor; (4) Høydekontrollknappen til US transduser. (B) Musen plasseres på høyre flanke på håndteringsbordet med snuten i bedøvelsesslangen (1), huden strekkes og den amerikanske gelen påføres på høyre flanke. (C) Transduseren senkes for å berøre musehuden og plasseres på tvers mot dyrekroppen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Utvikling av ortotopisk PCa xenograft i musepankreas . (A) 2D amerikansk bildeoppkjøp av tumormassen utviklet etter ekkostyrt celleinjeksjon. Utviklingen av svulsten overvåkes med amerikansk avbildning etter 8 dager med celleinjeksjon, etterfulgt av en gang i uken oppkjøp til dag 44, for totalt 6 oppkjøp. Svulsten er representert av en hypo-ekkogen struktur i bukspyttkjertelen parenchyma. Den hypo-ekkogene strukturen er ekkografisk representert av et område med ekko av redusert intensitet, sammenlignet med den omkringliggende parenchymen eller en nærliggende struktur. Skalastang: 2 mm. (B) Tidsforløp for tumorvolumet av ortotopisk PDAC avledet fra PANC1-celler. (C) US imaging oppkjøp av en tumormasse på dag 43 etter celleinjeksjon. Skala bar: 2 mm.3D re-rendering av tumormassen er vist i innfellingen. (D) Etter avbildning blir dyrene avlivet, og nekropsyundersøkelse utføres. (1) Tumormasse; (2) En liten del av en sunn bukspyttkjertel; (3) Milt; (4) Mage; (5) Lever. Skala bar: 5 mm. (E) Hematoxylin og eosin farging av tumormassen ved 4x forstørrelse. Skala bar: 200 μm. På høyre øvre side av panelet, innfelt av tumormassen der bukspyttkjertelen acinarceller fortsatt er synlige; 40x forstørrelse. Skala bar: 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om bruken av amerikansk bildebehandling er utbredt i klinikken, er tumorutvikling i mange prekliniske musemodeller vanligvis beskrevet ved hjelp av bioluminescerende bildebehandling11. Sistnevnte er en indirekte måte å evaluere tumorinnkapsling og utvidelse på, og det gir heller ikke en pålitelig tumorvekstkinetikk. I denne studien har vi brukt amerikansk bildebehandling for å utføre celleinjeksjon, samt for å overvåke tumorutvikling. Protokollen vi har beskrevet og resultatene vi har gitt representerer et relevant gjennombrudd i PCa-forskningen.
Den amerikanske veiledede metoden beskrevet her for injeksjon av bukspyttkjerteltumorceller er minimal invasiv og gjør det mulig å overvinne mange ulemper forårsaket av den kirurgiske prosedyren, som vanligvis brukes til å etablere en ortotopisk PCa-musemodell. Selv om indikasjoner på dødelighet eller bivirkninger på grunn av det kirurgiske inngrepet mangler i litteraturen, tilsier vår erfaring at operasjonsmetoden gir høyere postoperativ dødelighet i en lav prosentandel av tilfellene (rundt 10%), med hyppig lidelse hos dyr, noe som krever en viss restitusjonstid12. I tillegg forhindrer stingene som påføres etter operasjonen riktig bruk av bildebehandlingsprosedyrer. Dette resulterer i innsamling av amerikanske bilder med svært dårlig kvalitet, noe som fører til unøyaktig dataekstrapolering forårsaket av artefakter, for eksempel etterklang og skyggeområder. Med tanke på alle disse fakta, foretrekkes en metode som ikke trenger en kirurgisk prosedyre for etablering av en ortotopisk musemodell og anbefales sterkt for prekliniske forskningsformål. Videre, å være minimal invasiv, er gjenopprettingstiden fra celleinokulasjon raskere og dyrets lidelse er minimal i den amerikanske guidede metoden. En stor fordel er at den USA-veiledede metoden er kompatibel med bruk av isofluranbedøvelse som gir raskere induksjon og gjenoppretting, relativt mindre sparsom effekt på kardiovaskulær funksjon og cerebral blodstrømsautoregulering, sammenlignet med andre anestesimetoder (dvs. ketamin / xylazinoppløsning). Samlet sett gjør den ubetydelige metabolismen av isofluran det spesielt nyttig ved behandling av bedøvelse13. Faktisk, omtrent 5 minutter etter slutten av prosedyren, gjenvinner dyrene tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency. I tillegg er mus premedisinert med smertestillende (karprofen) for å minimere smerte, og ingen postoperative behandlinger er nødvendige på grunn av rask og fullstendig gjenoppretting.
Likevel er det noen viktige feilsøkingstrinn i prosedyren som må vurderes. Antall celler som skal inokuleres må ikke overstige 1 x 106 celler, og volumet av celleinokulum må ikke være større enn 20 μL for å unngå risiko for cellelekkasje ut av bukspyttkjertelen. Celleinjeksjon bør utføres umiddelbart etter løsningen, for å unngå en reduksjon i cellens vitalitet. Etter celleinjeksjon er det nødvendig å vente i minst 10 s før du fjerner nålen for å unngå lekkasje av celler ut av bukspyttkjertelen.
En av de mest kritiske aspektene ved denne protokollen gjelder plasseringen av musen på dyreplattformen. Musen må ligge på høyre side på dyrehåndteringsbordet og huden må strekkes. Hvis huden ikke er riktig strukket under injeksjonen, vil nålen slite med å pierce og komme inn i bukspyttkjertelen, med risiko for at celler søler ut av bukspyttkjertelen. Den ultralydstyrte injeksjonen for å produsere en PCa-musemodell ble først beskrevet av Huynh og medarbeidere i 201114. Her fokuserte vi på metodikken som er egnet til å produsere en slik modell, og beskriver i detalj alle trinnene for å gjøre den reproduserbar. Videre, sammenlignet med Huynh et al.14, har vi introdusert noen innovasjoner hovedsakelig relatert til fremskrittene innen amerikansk teknologi som skjedde de siste 5 årene. I denne protokollen anbefales bruk av en Hamilton-sprøyte med en stiv nål og en skråvinkel på 30 ° sterkt for å oppnå bedre nøyaktighet under celleinjeksjon og for å minimere cellelekkasje. Til slutt, under den USA-styrte injeksjonen, ble mus festet på høyre side på dyreplattformen, mens i Huynh et al.14 ble mus plassert i dorsal recumbency. Musens sideposisjon gjør det mulig å visualisere halen av bukspyttkjertelen, like under milten, som fungerer som en visuell referanse (figur 1B) under celleinjeksjonen, og sikrer reproduserbarheten av teknikken.
Som med andre teknikker, er det også noen begrensninger med den amerikanske veiledede prosedyren. Den største begrensningen er at injeksjonen kun kan utføres i halen av bukspyttkjertelen fordi kroppen og hodet er dekket av andre organer og er vanskelige å nå med nålen. Videre er en annen begrensning forbundet med bruk av amerikansk bildebehandling for å overvåke tumorvekst manglende evne til å visualisere hele tumormassen når den blir for stor, etter 6 ukers inokulasjon (figur 3C-E). Selv om slike store volumer ikke etterligner sykdommens kliniske forløb.
En annen fordel med PCa-modellen oppnådd med protokollen beskrevet her er langsom celletransplantasjon og vekst av tumormassene (figur 3B). Dette er ideelt for presis identifisering av utgangspunktet for farmakologisk intervensjon og bedre overvåking av effekten av terapeutiske tiltak over tid.
Endelig er den beskrevne teknikken et eksempel på implementering av 3R-prinsippene som involverer forfining av teknikk og utvikling av prosedyre som minimerer smerte, lidelse, nød eller varig skade, noe som direkte forbedrer dyrenes velferd i forskning.
Fremtidige anvendelser av PCa-modellen oppnådd av den amerikanske veiledede injeksjonen inkluderer studier rettet mot utvikling av passende terapeutiske behandlinger eller behandlingskombinasjoner. Faktisk kan bruken av slike innovative in vivo-teknikker kombineres med bruk av små molekyler, for eksempel antistoffer, antistofffragmenter og antistoff-legemiddelkonjugater (ADC), med en termisk tilnærming. Sistnevnte kan brukes alene, til terapeutiske formål, som vår gruppe har vist i vårt siste arbeid15 eller etter en skikkelig fluoroforkonjugering, med sikte på å overvåke tumorvekst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, grant no. 15627, IG 21510, og IG 19766) til AA, PRIN Italian Ministry of University and Research (MIUR). Utnytte grunnleggende kunnskap om ionkanalnettverk i kreft for innovative terapeutiske strategier (LIONESS) 20174TB8KW til AA, pHioniC: EUs Horizon 2020-tilskudd No 813834 til AA. CD ble støttet av et AIRC-stipend for Italia ID 24020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt, Germany | P5856 | |
| 3D-Mode package | Visualsonics Fujifilm, Italy | Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging | |
| Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel | PARKER LABORATORIES, INC. | 150 | Gel for ultrasound |
| Athymic Mice (Nude-Foxn1nu) | ENVIGO, Italy | 69 | 20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight |
| CO2 Incubator Function Line | Heraeus Instruments, Germany | BB16-ICN2 | |
| Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature | Visualsonics Fujifilm, Italy | 11426 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Euroclone Spa, Italy | ECM0101L | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) | Euroclone Spa, Italy | ECB4004L | |
| Eppendorf (1.5mL) | Sarstedt, Germany | 72.690.001 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone Spa, Italy | ECS0170L | |
| Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge | Permax S.r.l., Italy | 7803-02 | |
| Hamilton Syringe 705RM 50 µL | Permax S.r.l., Italy | 7637-01 | |
| Isoflo (250 mL) | Ecuphar | 7081219 | |
| L-glutamine 100X | Euroclone Spa, Italy | ECB3000D | |
| Mouse Handling table II | Visualsonics Fujifilm, Italy | 50249 | |
| MX550D: 55 MHz MX Series Transducer | Visualsonics Fujifilm, Italy | 51069 | Ultrasound Transducers |
| Oxygen/isofluorane mixer | Angelo Franceschini S.r.l. | LFY-I-5A | |
| PANC1 cell line | American Type Culture Collection (ATCC), USA | CRL-1469 | |
| Rimadyl (carprofen) | Pfizer | 11319 | 20 mL, injection solution |
| Trypsin-EDTA 1X in PBS | Euroclone Spa, Italy | ECB3052D | |
| Vet ointment for eyes, Systane nighttime | Alcon | 509/28555-1 | |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version) | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-12055 | complete with gas chamber |
| Vevo Imaging Station 2 | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-11983 | Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount |
| Vevo Lab | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20034 | Data Analysis Software |
| Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20054 | Includes analytic software package for B-mode |
| Vevo Photoacoustic Enclosure | Visualsonics Fujifilm, Italy | 53157 |
References
- Zeng, S., et al.
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: The unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the united states. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Rawla, P., Sunkara, T., Gaduputi, V. Epidemiology of pancreatic cancer: Global trends, etiology and risk factors. World Journal of Oncology. 10 (1), 10 (2019).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L.
- Hofschroer, V., et al. Ion channels orchestrate pancreatic ductal adenocarcinoma progression and therapy. Frontiers in Pharmacology. 11, 586599 (2021).
- Adamska, A., Domenichini, A., Falasca, M. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Current and evolving therapies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1338 (2017).
- Qiu, W., Su, G. H. Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models. Methods in Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice. Cancer Metastasis Reviews. 17 (3), 279-284 (1998).
- Qiu, W., Su, G. H. Challenges and advances in mouse modeling for human pancreatic tumorigenesis and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 32 (1-2), 83-107 (2013).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. DMM Disease Models and Mechanisms. 11 (7), (2018).
- Lottini, T., et al. Micro-ultrasound, non-linear contrast mode with microbubbles and Optical Flow software tool: together for a new translational method in the study of the tumoral rheology microenvironment. WMIC 2017: Imaging the Future from Molecules to Medicine. , (2017).
- Ludders, J. W. Advantages and guidelines for using isoflurane. The Veterinary Clinics of North America Small Animal Practice. 22 (2), 328-331 (1992).
- Huynh, S., et al. Development of an orthotopic human pancreatic cancer xenograft model using ultrasound guided injection of cells. PLoS One. 6 (5), 20330 (2011).
- Duranti, C., et al. Harnessing the hERG1/β1 Integrin Complex via a Novel Bispecific Single-chain Antibody: An Effective Strategy against Solid Cancers. Molecular Cancer Therapeutics. 20 (8), 1338-1349 (2021).
