Summary
이 프로토콜은 생체 내에서 SARS-CoV-2 감염을 연구하는 데 필요한 2차 접근법의 필요성을 극복하기 위해 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서 루시페라아제 및 형광 발현 재조합 (r)SARS-CoV-2 및 생체내 이미징 시스템 (IVIS)을 사용하는 바이러스 감염의 역학을 기술한다.
Abstract
코로나 바이러스 질병 2019 (COVID-19) 전염병은 심각한 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2 (SARS-CoV-2)에 의해 발생했습니다. 현재까지 SARS-CoV-2는 전 세계적으로 242 백만 명이 넘는 감염과 4.9 백만 명 이상의 사망자를 담당했습니다. 다른 바이러스와 마찬가지로 SARS-CoV-2를 연구하려면 감염된 세포 및 / 또는 동물 모델에서 바이러스의 존재를 탐지하기 위해 실험 방법을 사용해야합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 생체발광 (나노루시페라제, Nluc) 또는 형광 (금성) 단백질을 발현하는 복제 적격 재조합 (r) SARS-CoV-2를 생성하였다. 이러한 리포터-발현 rSARS-CoV-2는 Nluc 및 금성 리포터 유전자의 발현에 기초하여 시험관내 및 생체내에서 바이러스 감염을 추적할 수 있게 한다. 여기에서 연구는 앞서 기술한 K18 인간 안지오텐신-전환 효소 2(hACE2) 생체내 영상 시스템(IVIS)을 이용한 감염의 형질전환 마우스 모델에서 SARS-CoV-2 감염을 검출하고 추적하기 위해 rSARS-CoV-2/Nluc 및 rSARS-CoV-2/Venus의 사용을 기술 한다 . 이 rSARS-CoV-2/Nluc 및 rSARS-CoV-2/Venus는 생체 내에서 rSARS-CoV-2/WT와 같은 병원성 및 바이러스 복제를 보여줍니다. 중요하게도, Nluc 및 Venus 발현은 우리가 감염된 마우스에서 생체 내 및 생체외에서 바이러스 감염을 직접 추적할 수 있게 해준다. 이러한 rSARS-CoV-2/Nluc 및 rSARS-CoV-2/Venus는 생체 내에서 SARS-CoV-2의 생물학을 연구하고, 바이러스 감염 및 관련 COVID-19 질병을 이해하고, SARS-CoV-2 감염과 싸우기 위한 효과적인 예방 및/또는 치료 치료법을 식별하는 데 탁월한 옵션을 제공합니다.
Introduction
중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2 (SARS-CoV-2)는 코로나 비리 대 (Coronaviridae) 계열1의 베타 코로나 바이러스 계통에 속하는 외피, 양성 감각, 단일 가닥 RNA 바이러스입니다. 이 바이러스 군은 알파-, 베타-, 감마-, 델타-코로나바이러스1로 나뉜다. 알파 및 베타 코로나 바이러스는 주로 포유류를 감염시키는 반면, 감마 및 델타 코로나 바이러스는 거의 독점적으로 조류를 감염시킵니다 2. 현재까지 일곱 개의 코로나바이러스(CoV)가 종 장벽을 넘어 인간 코로나바이러스(HCoV)로 등장했다: 두 개의 알파-CoV(HCoV-229E 및 HCoV-NL63)와 5개의 베타-CoV(HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, 중동호흡기 증후군 코로나바이러스[MERS-CoV], SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV 및 SARS-CoV-2는 병원성이 높아 심한 하부 호흡기 감염을 일으킵니다 7. SARS-CoV-2가 출현하기 전에 CoVs에 의해 야기 된 두 가지 전염병 발생이있었습니다 : 2002-2003 년 중국 광동 프로비던스의 SARS-CoV, 약 9.7 %의 치사율 (CFR); 2012 년부터 현재까지 중동의 MERS-CoV와 CFR은 약 34 % 7,8입니다. SARS-CoV-2는 3.4 % -49 % 사이의 전체 CFR을 가지며 기본 조건은 더 높은 CFR 8,9에 기여합니다. SARS-CoV-2는 2019년 12월 중국 우한에서 발견된 이래 전 세계적으로 242백만 명이 넘는 인간 감염과 4백9십만 명 이상의 인간 사망 7,10,11,12명을 담당하고 있습니다. 특히, 2020년 말부터 새로운 SARS-CoV-2 변종(VoC)과 관심 변종(VoI)은 전염 및 항원성 9,13, COVID-19 전염병의 전반적인 방향을 포함한 바이러스 특성에 영향을 미쳤습니다. SARS-CoV-2 감염의 치료를 위해 현재 미국 (미국)은 단 하나뿐입니다. 식품 의약품 안전청 (FDA) 치료 항 바이러스 (렘데시비르) 및 하나의 긴급 사용 허가 (EUA) 약물 (바리시티닙, 렘데시비르와 함께 투여되는)14. 또한 6개의 승인된 EUA 모노클로날 항체가 있다: REGEN-COV (카시리비맙 및 임데비맙, 함께 투여됨), 소트로비맙, 토실리주맙, 바멜라니비맙 및 에테세비맙이 함께 투여된15,16,17,18,19. 현재 FDA가 승인한 예방백신인 화이자-바이오엔테크는 단 하나뿐이며, 다른 두 가지 예방백신(모더나와 얀센)은 20,21,22,23,24유로 승인을 받았다. 그러나 통제되지 않은 감염률과 VoC 및 VoI의 출현으로 SARS-CoV-2는 여전히 인체 건강에 위협이되고 있습니다. 따라서 SARS-CoV-2 감염과 여전히 진행중인 COVID-19 전염병을 통제하기위한 효율적인 예방 및 치료제를 식별하기 위해 새로운 접근법이 시급히 필요합니다.
SARS-CoV-2를 연구하려면 감염된 세포 및 / 또는 검증 된 동물 감염 모델에서 바이러스의 존재를 확인하기위한 힘든 기술과 2 차 접근법이 필요합니다. 역 유전학의 사용은 바이러스 감염의 생물학에서 중요한 질문에 대답하는 재조합 바이러스의 생성을 허용했다. 예를 들어, 역유전학 기술은 바이러스 감염, 병인 및 질병의 메커니즘을 밝히고 이해하는 수단을 제공했습니다. 마찬가지로, 역유전학 접근법은 바이러스 단백질이 부족한 재조합 바이러스를 조작하여 바이러스 병인에 대한 기여도를 이해하는 길을 열었습니다. 또한, 역유전학 기술은 바이러스 감염의 치료를 위한 예방적 및/또는 치료적 접근법을 확인하는 것을 포함하여, 시험관내 및 생체내 응용을 위해 리포터 유전자를 발현하는 재조합 바이러스를 생성하는데 사용되어 왔다. 형광 및 생체발광 단백질은 그들의 민감도, 안정성 및 신기술25,26의 개선에 기초한 용이한 검출로 인해 가장 일반적으로 사용되는 리포터 유전자이다. 시험관 내에서 형광 단백질은 감염된 세포에서 바이러스의 국소화를위한 더 나은 옵션으로 작용하는 것으로 밝혀졌으며 루시페라제는 정량화 연구 27,28,29에 더 편리합니다. 생체 내에서, 루시페라제는 전체 동물 영상화를 위한 형광 단백질보다 선호되는 반면, 형광 단백질은 감염된 세포의 확인 또는 생체외 영상화(30,31,32)에 바람직하다. 리포터 발현 재조합 바이러스의 사용은 플라비바이러스, 엔테로바이러스, 알파바이러스, 렌티바이러스, 아레나바이러스 및 인플루엔자 바이러스28,33,34,35,36을 포함한 많은 패밀리에서 바이러스를 연구하기 위한 강력한 도구로 사용되었다.
SARS-CoV-2를 연구하고 생체 내에서 실시간 SARS-CoV-2 감염을 특성화하기위한 2 차 접근법의 필요성을 극복하기 위해 우리는 이전에 설명 된 박테리아 인공 염색체 (BAC) 기반 역 유전학을 사용하여 생체 발광 (nanoluciferase, Nluc) 또는 형광 (금성) 단백질을 발현하는 복제 적격 재조합 (r) SARS-CoV-2를 생성했습니다. 박테리아37,38에서 그의 전파 동안 바이러스 서열의 독성을 최소화하기 위해. 특히, rSARS-CoV-2/Nluc 및 rSARS-CoV-2/Venus는 생체 내에서 rSARS-CoV-2/WT와 유사한 병원성을 나타냈다. rSARS-CoV-2/Venus로부터의 높은 수준의 금성 발현은 생체내 영상화 시스템(IVIS)39를 사용하여 감염된 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스의 폐에서 바이러스 감염을 검출하는 것을 허용하였다. 금성 발현의 수준은 폐에서 검출된 바이러스 역가와 잘 상관관계가 있으며, 이는 SARS-CoV-2 감염의 유효한 대리자로 금성 발현을 사용하는 타당성을 입증하였다. rSARS-CoV-2/Nluc를 사용하여 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서 동일한 IVIS 접근법을 사용하여 실시간으로 바이러스 감염의 역학을 추적하고 종적으로 생체 내에서 SARS-CoV-2 감염을 종방향으로 평가할 수 있었습니다.
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Protocol
K18 hACE2 트랜스제닉 마우스와 관련된 프로토콜은 Texas Biomedical Research Institute (TBRI) Institutional Biosafety Committee (IBC) 및 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았다. 모든 실험은 국가 연구위원회 (National Research Council)40의 실험실 동물 관리 및 사용 안내서의 권장 사항을 따릅니다. 마우스와 함께 작업 할 때 적절한 개인 보호 장비 (PPE)가 필요합니다.
1. K18 hACE2 트랜스제닉 마우스의 사용
- 특정 병원체가 없는 조건 하에서 생물안전 수준(BSL)-2 동물 보호 시설에서 4-6주령 암컷 B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J 마우스(K18 hACE2 형질전환 마우스)를 구입하고 유지합니다.
- BSL2 시설에 도착한 후 동물들이 7 일 동안 적응하고 감염 및 기타 실험 절차를 위해 BSL-3 동물 시설로 옮길 수 있도록하십시오.
- IACUC 프로토콜에 따라 케이지 당 4 마리의 마우스를 놓습니다. 동물이 사망했는지 확인하기 위해 쥐가 rSARS-CoV-2 및 생체 내 이미징에 감염된 후 치명적인 플러스 (> 100 mg / kg)의 치사량으로 동물을 안락사시킵니다.
2. 생물안전
참고: 이 원고에서 rSARS-CoV-2는 앞서 설명한37과 같이 SARS-CoV-2 USA-WA1/2020 균주에 대한 BAC 기반 역유전 시스템을 사용하여 생성됩니다. rSARS-CoV-2/Nluc 또는 rSARS-CoV-2/Venus 감염과 관련된 모든 생체내 절차는 BSL-3 조건 하에서 생물학적 안전 캐비닛에서 수행되어야 합니다.
- 이 기사에 설명 된 모든 실험 절차를 수행하기 전후에 2 % Wexicide 및 70 % 에탄올 소독제로 생물 안전 캐비닛을 순차적으로 청소하십시오.
- 모든 해부 재료 (가위, 해부 포셉 등)와 균질 화기를 각 사용 전후에 멸균하십시오.
- 격리실을 청소하고 제조업체의 지시에 따라 각 사용 전후에 MB10 정제를 사용하여 소독하십시오.
- IBC 및 IACUC 지침에 따른 절차 중에 생산된 모든 생물학적 물질은 폐기하십시오.
3. rSARS-CoV-2의 생체내 특성화
- 마우스 감염
- 암컷 4-6주령의 K18 hACE2 형질전환 마우스를 표지된 케이지에 넣고, 이어 펀치 코드를 사용하여 각 케이지에서 마우스를 확인하고, 케이지당 4마리의 마우스를 배치한다. 체중 및 생존을 위해 마우스 그룹을 사용하고 바이러스 적정 및 이미징을 위해 다른 동물 그룹을 사용하십시오.
- 감염되기 전에 가슴 젖꼭지에서 사타구니 젖꼭지 부위까지 복부 쪽의 마우스 가슴을 면도하여 생체 발광 신호를 촉진하십시오.
- 멸균 1x 인산염 완충 식염수 (PBS)를 사용하여 총 부피50 μL의 멸균 조건 하에서 10 5 개의 플라크 형성 단위 (PFU) / 마우스로 rSARS-CoV-2 접종물을 준비하십시오.
참고: 바이러스 희석에 사용되는 rSARS-CoV-2의 양을 수식으로 계산하십시오: 바이러스 필요 = (마우스 당 105 PFU / 50 μL) x 최종 부피) / 스톡 바이러스 역가. - 바이러스 접종물을 얼음 위에 차갑게 유지하십시오.
- 모의 감염 (1x PBS) 및 rSARS-CoV-2/WT 감염 마우스를 내부 대조군으로 사용한다. 모의에 감염된 마우스를 rSARS-CoV-2-감염된 마우스보다 별도의 케이지에 놓습니다.
- 마취실에서 5% 이소플루란 기체 진정제를 사용하여 마우스를 마취시키고 3% 이소플루란으로 유지한다.
- 자세 반응과 우측 반사가 확인되면 마우스를 등쪽 요란 위치에 놓습니다.
- 검지 손가락과 엄지 손가락 사이에 마우스의 목을 경련시키고 새끼 손가락으로 손바닥에 꼬리를 대고 동물을 등쪽 위치에 고정시킵니다.
- 50 μL의 바이러스 접종물을 함유하는 피펫 팁을 콧구멍에 놓고 용액을 천천히 꺼낸다. 바이러스 접종물이 흡입되고 접종물 방울이 사라지는 것을 관찰하여 환류가 없는지 확인하십시오.
- 생체발광 모니터링 K18 hACE2 rSARS-CoV-2/Nluc에 감염된 형질전환 마우스(도 1 및 도 2)
참고: 이 실험은 개략적인 표현을 따르며 그림 1에 표시된 바이러스를 사용합니다. 이소플루란 마취 부착은 생체내 영상화 시스템(IVIS)을 위해 요구된다. 필요한 장비 및 시스템에 대한 자세한 내용은 자료 표를 참조하십시오.- 이미징 소프트웨어를 시작하고 매개 변수를 설정하고, 이미지 모드를 생체 발광으로 클릭하고, 필터를 열고, 노출 시간을 자동으로 설정합니다.
- IVIS 기계를 초기화 할 때, 생물안전 캐비닛 안에 있는 동안 마우스를 격리실에 놓으십시오. 마우스를 이소플루란으로 5% 농도로 유도한다. 자세 반응과 우측 반사의 손실이 확인되면 3 % 이소플루란으로 유지하십시오.
- 일단 마우스가 마취되면, 이들을 격리 챔버로부터 제거하고, 25 G 바늘로 1x PBS (최종 부피 100 μL/마우스)에 1:10으로 희석된 루시퍼라제 기질을 역궤도 방식으로 투여한다.
- 루시퍼라아제 기질 투여 후, 마우스를 다시 격리 챔버에 넣고 가슴을 위로 향하게하고 비강을 매니폴드 콘 내부에 두어 이미징 절차 동안 동물을 마취 시키십시오.
- 격리 챔버를 IVIS 시스템으로 전송하고 IVIS 이미저 도어를 닫은 후 즉시 소프트웨어 프로그램에서 획득 을 선택하여 초기화합니다(그림 2A).
- 획득한 생체 발광 이미지를 분석하려면 소프트웨어의 ROI (관심 영역) 도구를 사용하여 정확한 신호를 지정하고 플럭스를 측정합니다(그림 2B).
- 측정을 클릭하고 시스템이 광자의 생체 발광 평가를 시작하여 다양한 매개 변수에서 제공하는 출력 측정치에 필적하는 절대 광자 방출을 제공 할 수 있도록합니다.
- 감염 후 1-, 2-, 4- 및 6-일째에 마우스를 이미지화한다.
- 이미징 후 마우스를 다시 케이지에 넣습니다.
- rSARS-CoV-2/Venus에 감염된 K18 hACE2 형질전환 마우스에서의 형광 분석(도 3 및 도 4)
참고: 이 실험은 그림 3에 표시된 도식 표현과 rSARS-CoV-2를 따릅니다. 필요한 장비 및 시스템에 대한 자세한 내용은 자료 표를 참조하십시오.- 이미징 소프트웨어를 시작하고 매개 변수를 설정하고, 여기(500nm) 및 방출 필터(530nm)를 설정하고, 이미지 모드를 형광 으로 클릭하고 노출 시간을 자동으로 설정합니다.
- 치명적인 플러스 (>100 mg / kg)의 치사량을 사용하여 마우스를 복강 내 안락사시킵니다. 안락사 후 절개 부위를 70 % 에탄올로 소독하십시오.
- 핀셋을 사용하여 피부를 당기고 흉골에서 복부까지 절개하고 가위로 측면에서 절개를 자릅니다. 간정맥을 절단하여 폐의 혈액량을 최소화하고 이미징 중에 높은 배경 신호를 피하십시오.
- 가위를 사용하여 흉골을 자르고 흉곽을 엽니 다. 다음으로, 기관지 끝을 가위로 자르고 핀셋으로 폐를 제거하십시오.
- 적출된 폐를 2 mL의 1x PBS를 함유하는 6-웰 플레이트에 넣고 헹구어 과량의 혈액을 제거하였다. 70% 에탄올을 사용하여 샘플 사이의 수술 도구를 소독하고 세척하여 시료 간의 오염 가능성을 최소화합니다.
- IVIS 기계를 초기화 한 후 폐를 검은 색 트레이에 넣고 조직을 서로 분리하십시오.
- 트레이를 생물안전 캐비닛 내부의 격리실 내부에 놓은 다음 격리실을 IVIS로 옮깁니다. 도어를 닫고 획득( Acqui )을 클릭하여 이미징 시스템을 시작합니다(그림 4A).
- 형광을 분석하려면 ROI 도구를 활용하고 각 폐 주위에 ROI 를 그립니다. 각 ROI를 수동으로 측정한 다음 제공된 평균 방사 효율 값을 사용하고 모의에 감염된 마우스의 ROI에서 뺍니다(그림 4B).
- 일단 이미징이 완료되면, 조직을 당일 분석을 위해 얼음 위에 놓거나 드라이 아이스 동결을 위한 냉동 튜브에 넣고 추후 처리를 위해 -80°C에서 저장한다.
- rSARS-CoV-2/Nluc(도 2A-C) 및 rSARS-CoV-2/Venus에 감염된 K18 hACE2 형질전환 마우스의 폐 밝은 장 영상 및 병리학적 스코어링(도 4A-C)
- rSARS-CoV-2/Nluc, rSARS-CoV-2/WT에 감염된 마우스의 생체 발광을 이미징하고 모의에 감염된 후 마우스를 케이지로 되돌립니다. 안락사 및 마우스 폐의 생체외 밝은 장 이미징을 진행한다(도 2A).
- 감염된 마우스의 폐의 생체외 형광을 이미징한 후, 폐의 밝은 필드 이미지를 촬영한다(도 4A).
- ImageJ를 사용하여 폐 표면의 총 병변을 분석한다(도 2C 및 4C).
- ImageJ에서 분석할 폐 이미지를 엽니다.
- 픽셀 대 cm의 비율을 계산하고 직선 도구를 사용하여 이미지의 실제 길이를 측정하십시오.
- 선택한 후 분석 > 측정 을 클릭하여 길이에 대한 픽셀 길이를 계산합니다.
- 분석 > 배율 설정을 클릭하고 이전 단계에서 계산 된 숫자를 입력하십시오.
- 자유형 선택 도구를 사용하여 전체 폐 표면을 선택합니다. 분석 > 측정을 클릭하여 총 폐 영역을 측정하십시오.
- 편집 > 선택 > 역 만들기 를 클릭하여 폐 영역의 나머지 부분을 선택한 다음 삭제 또는 백 스페이스를 눌러 배경을 제거하십시오.
- 선택한 영역을 제거한 다음 이미지를 클릭하> 색상 임계값 조정>십시오.
- 병리학 적 병변 영역을 선택하려면 혼잡 및 출혈 수준에 따라 밝기 를 최소 (1 ~ 50) 및 최대 (50 ~ 200 사이)로 조정하십시오.
- 병리학 적 병변이 선택되면 임계 색상 패널의 하단에서 선택을 클릭 한 다음 분석 > 측정을 클릭하여 병리학 적 영역을 측정하십시오.
- 공식으로 총 병변의 비율을 계산하십시오 : 병리학 적 영역의 % = (병리학 적 면적 / 총 폐 표면의 측정) x 100.
- 바이러스 적정 (그림 2D 및 그림 4D)
- 이미징시 쥐 안락사를 완료하고 폐, 뇌 및 비강 점막을 수집하십시오.
- 폐, 뇌 및 비강 점막을 분리된 멸균 조직 균질기에 넣고 차가운 1x PBS 1 mL를 첨가한다.
- 샘플을 21,500 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화한다. 상층액을 수집하여 새로운 멸균 튜브로 옮기고 펠렛을 버리십시오.
- 바이러스 적정이 같은 날 수행되는 경우, 상청액을 4°C에서 보관한다. 대안적으로, 균질화된 샘플의 상청액을 나중에 평가될 때까지 -80°C에서 동결시킨다.
- 조직 균질액으로부터 얻은 상청액을 활용하여 10배 연속 희석액을 만들고 Vero E6 세포의 합류 단층을 상청액의 각 희석액 1mL로 감염시킵니다(6-웰 플레이트 포맷, 1.2 × 106 세포/웰, 삼중).
- 바이러스를 가습된 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 1시간 동안 흡착시킨다.
- 바이러스 흡착 후, 세포를 1 mL의 1x PBS로 세척하고, 72시간 동안 37°C에서 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 1% 아가를 함유하는 감염 후 배지2 mL에서 인큐베이션한다.
- 인큐베이션 후, 플레이트를 4°C에서 24시간 동안 10% 중성 완충 포르말린으로 불활성화시키고, 전체 플레이트가 침수되도록 한다.
- 플레이트를 BSL3에서 꺼내어 세포를 1 mL의 1x PBS로 3회 세척하고 1 mL의 0.5% 트리톤 X-100으로 실온에서 10분 동안 투과시킨다(RT).
- 세포를 37°C에서 1시간 동안 1x PBS 중의 2.5% 소 혈청 알부민(BSA) 1 mL로 차단하고, 이어서 37°C에서 1시간 동안 2.5% BSA로 희석된 SARS-CoV 뉴클레오캡시드(N) 단백질 교차반응성 모노클로날 항체(1C7C7)의 1 mL에서 1 mL로 인큐베이션하였다.
- 1x PBS 1 mL로 세포를 세 번 세척하고 제조업체의 지시에 따라 ABC 키트 및 DAB 퍼옥시다제 기질 키트를 사용하여 플라크를 개발하십시오.
- 바이러스 역가를 PFU/mL로 계산합니다.
참고: PFU/mL = 희석 계수 x 플라크 수 x (1mL/접종 부피) 공식으로 계산하십시오.
- rSARS-CoV-2/Nluc에 감염된 K18 hACE2 형질전환 마우스의 조직에서의 Nluc 활성(도 2E)
- 모의, rSARS-CoV-2/WT 및 rSARS-CoV-2/Nluc에 감염된 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스로부터의 장기 균질물에서 Nluc의 존재를 제조자의 지시에 따라 루시퍼라제 검정을 사용하여 정량화한다.
- 이환률 및 사망률 평가(도 2F, G 및 도 4E, F)
- 4-6주령의 암컷 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스를 rSARS-CoV-2/WT, rSARS-CoV-2/금성, rSARS-CoV-2/Nluc, 또는 섹션 3.1에 기재된 바와 같이 모의 감염의 105 PFU로 비강내 감염시킨다.
- 12 일 동안 마우스를 모니터링하고 동시에 무게를 측정하여 음식 섭취로 인한 체중 변화를 최소화하십시오. 초기 체중의 25 %를 잃은 마우스를 인도적 인 종점에 도달했기 때문에 안락사시키고 바이러스 감염에 굴복하는 것으로 이들 마우스를 주목하십시오.
- 12일 후, 바이러스 감염에서 생존한 마우스를 안락사시키고 체중 변화 및 생존률의 %를 계산한다.
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Representative Results
K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서의 rSARS-CoV-2/Nluc 감염 (도 1 및 2)
도 1A는 생체내 감염을 평가하기 위해 사용된 rSARS-CoV-2/WT(상단) 및 rSARS-CoV-2/Nluc(하단)의 개략적인 표현을 보여준다. 도 1B는 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서 rSARS-CoV-2/Nluc 감염 역학을 평가하기 위해 적용된 개략적인 흐름도를 보여준다. 4 내지 6주령의 암컷 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스 (N=4)를 모의-감염시키거나, 105 PFU의 rSARS-COV-2/WT 또는 rSARS-CoV-2/Nluc를 비강내 감염시켰다. 감염 후 1-, 2-, 4- 및 6-일째에, 마우스를 격리 챔버를 사용하여 침전시킨 다음, Nluc 기질을 소궤도로 주사하였다. 분리 챔버를 즉시 IVIS 내에 배치하고, Nluc 신호를 이미징 소프트웨어를 사용하여 생체내에서 평가하였다. Nluc 발현은 rSARS-CoV-2/Nluc에 감염된 마우스에서는 쉽게 검출되었으나 rSARS-CoV-2/WT에 감염되거나 모의에 감염된 마우스에서는 검출되지 않았다(도 2A). 정량적 분석은 감염 후 다른 날에서 Nluc 강도를 나타냈다(도 2B). rSARS-CoV-2/Nluc에 감염된 마우스의 폐 표면 상의 총체적 병변은 rSARS-CoV-2/WT 감염군의 병변과 비교하였다(도 2C). 마지막으로, 마우스 장기 (폐, 비강 터비네이트 및 뇌)를 균질화하고 바이러스 역가는 플라크 분석 (PFU / mL)에 의해 결정되었으며 Nluc 활성은 제조업체의 지시에 따라 루시퍼라제 분석을 사용하여 결정되었습니다. 플라크는 교차 반응성 SARS-CoV N 모노클로날 항체 1C7C7을 사용한 면역염색에 의해 평가되었다. rSARS-CoV-2/Nluc 감염 마우스에서 검출된 바이러스 역가는 감염 후 상이한 날에 모든 장기에서 rSARS-CoV-2/WT로 감염된 것과 비교되었다(도 2D). Nluc 활성은 rSARS-CoV-2/Nluc-감염된 마우스로부터의 장기에서만 검출되었다(도 2E). 모의-감염 및 바이러스-감염된 마우스의 분리된 그룹을 체중의 변화(도 2F) 및 생존(도 2G)에 대해 12일 동안 모니터링하였다. rSARS-CoV-2/Nluc 및 rSARS-CoV-2/WT에 감염된 마우스는 체중의 최대 25%를 잃었고 모두 감염 후 7-8일 사이에 바이러스 감염에 굴복했습니다(그림 2F-G).
K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서의 rSARS-CoV-2/금성 감염 (도 3 및 4)
도 3A는 생체외 감염을 평가하기 위해 사용된 rSARS-CoV-2/WT(상단) 및 rSARS-CoV-2/Nluc(하단)의 개략적인 표현을 보여준다. 도 3B는 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서 rSARS-CoV-2/Venus 역학을 평가하기 위해 적용된 개략적인 흐름도를 도시한다. 4 내지 6주령의 암컷 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스(N=4/군)를 모의-감염시키거나, rSARS-COV-2/WT 또는 rSARS-CoV-2/금성의 105 PFU에 비강내 감염시켰다. 감염 후 1-, 2-, 4- 및 6-일에, 마우스를 안락사시키고, 그들의 폐를 적출하고 IVIS를 사용하여 생체외 영상화하였다. 금성 발현은 rSARS-CoV-2/Venus에 감염된 마우스로부터 모든 폐에서 쉽게 검출되었으나 rSARS-CoV-2/WT에 감염되거나 모의에 감염된 마우스에서는 검출되지 않았다(도 4A). 정량적 분석에 따르면 금성 강도는 감염 후 2 일에 최고조에 달하고 감염된 마우스의 폐에서 감염 과정에서 감소하는 것으로 나타났습니다 (그림 4B). 폐 표면의 이미지는 rSARS-CoV-2/Venus에 감염된 마우스의 총 병변을 밝혀 rSARS-CoV-2/WT 감염 마우스의 병변과 비슷하였다(도 4C). 마지막으로, 마우스 기관 (폐, 비강 터비네이트 및 뇌)을 균질화하고, 바이러스 역가를 플라크 검정에 의해 결정하고, SARS-CoV N 단백질 교차 반응성 모노클로날 항체 1C7C7을 사용한 면역염색에 의해 평가하였다. rSARS-CoV-2/Venus에 의한 감염은 모든 장기에서 rSARS-CoV-2/WT에 감염된 마우스에서 관찰된 것과 유사한 바이러스 역가를 가져왔다(도 4D). 모의-감염 및 바이러스-감염된 마우스의 분리된 그룹을 체중의 변화(도 4E) 및 생존(도 4F)에 대해 12일 동안 모니터링하였다. rSARS-CoV-2/Venus 및 rSARS-CoV-2/WT에 감염된 마우스는 체중의 최대 25%를 잃었고 모두 생존 없이 감염 후 9일째까지 바이러스 감염에 굴복했습니다(그림 4E-4F).
도 1: K18 hACE2 트랜스제닉 마우스를 이용한 생체내 rSARS-CoV-2/Nluc 감염의 평가. (A) rSARS-CoV-2/WT(상단) 및 rSARS-CoV-2/Nluc(하단)의 도식 표현. (B) 생체 내에서 rSARS-CoV-2/Nluc의 평가를 위한 개략적 흐름도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 감염된 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서의 rSARS-CoV-2Nluc 발현. (A-B) 4 내지 6주령의 암컷 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스를 모의 감염(N=4) 또는 rSARS-CoV-2/WT(N=4) 또는 rSARS-CoV-2/Nluc(N=4)로 감염시켜 동물당 10개의5 PFU를 사용하였다. 마우스를 감염 후 1-, 2-, 4- 및 6-일에 마취시키고, Nluc 기질과 함께 역궤도 주사를 받은 후였다. (A) Nluc 발현은 생체내 영상화 시스템 하에서 결정되었고, 모의-감염 및 감염된 마우스로부터의 폐를 적출하고 감염 후 1-, 2-, 4- 및 6-일에서 촬영하였다. (B) Nluc 강도는 이미지 분석 소프트웨어에 의해 정량적으로 분석되었고, (C) 폐 표면의 총 병변은 ImageJ (C)**P < 0.01에 의해 정량적으로 분석되었다. (d) rSARS-CoV-2/WT 및 rSARS-CoV-2/Nluc에 감염된 마우스로부터의 비강 터비네이트(왼쪽), 폐(중간) 및 뇌(오른쪽)에서의 바이러스 역가는 플라크 분석에 의해 결정되었다. (e) 비강 터비네이트(왼쪽), 폐(중간) 및 뇌(오른쪽)에서의 Nluc 활성은 루시퍼라아제 다중 플레이트 판독기 하에 측정되었다. ns, 중요하지 않습니다. 모의- 및 바이러스-감염된 마우스를 (F) 체중 및 (G) 생존의 변화에 대해 12일 동안 모니터링하였다. 모든 데이터는 각 그룹에 대한 평균 ± SD로 제시되고 SPSS13.0 (IBM)에 의해 분석된다. 0.05 미만의 P 값(P<0.05)은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 이 수치는 Ye C. et al.41에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: K18 hACE2 트랜스제닉 마우스를 이용한 생체내 rSARS-CoV-2/금성 감염의 평가. (A) rSARS-CoV-2/WT(상단) 및 rSARS-CoV-2/금성(하단)의 개략적 표현. (B) 생체 내에서 rSARS-CoV-2/금성의 평가를 위한 개략적 흐름도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 감염된 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서의 rSARS-CoV-2/Venus 발현. (A-B) 4 ~ 6 주령의 암컷 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스는 rSARS-CoV-2/WT (N = 4) 또는 rSARS-CoV-2/Venus (N = 4)로 모의 감염 (N = 4) 또는 감염 (105 PFU/마우스)하였다. 폐는 감염 후 1-, 2-, 4-, 및 6-일에 절제되었고, 폐의 이미지는 감염 후 1-, 2-, 4- 및 6-일에 촬영되었다. (A) 금성 발현은 IVIS 하에서 평가되었고, (B) 형광 강도는 이미지 분석 소프트웨어에 의해 정량적으로 분석되었고, (C) 폐 표면의 총 병변은 ImageJ에 의해 정량적으로 분석되었다. **P < 0.01. (d) rSARS-CoV-2/WT 및 rSARS-CoV-2/Venus에 감염된 마우스로부터의 비강 터비네이트(왼쪽), 폐(중간) 및 뇌(오른쪽)에서의 바이러스 역가는 플라크 분석에 의해 결정되었다. ns, 중요하지 않습니다. 모의- 및 SARS-CoV-2-감염된 마우스를 (E) 체중 감소 및 (F) 생존에 대해 12일 동안 모니터링하였다. 모든 데이터는 각 그룹에 대한 평균 ± SD로 제시되고 SPSS13.0 (IBM)에 의해 분석된다. 0.05 미만의 P 값(P<0.05)은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 이 수치는 Ye C. et al.41에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 생체 내에서 바이러스 감염을 모니터링하기 위해 이러한 rSARS-CoV-2 발현 리포터 유전자를 사용하는 타당성을 입증한다. 두 리포터 발현 재조합 바이러스는 생체 내에서 SARS-CoV-2 감염을 연구하기위한 훌륭한 도구를 제공합니다. 기술된 생체 외 (rSARS-CoV-2/금성) 및 생체내 (rSARS-CoV-2/Nluc) 이미징 시스템은 SARS-CoV-2 감염, 바이러스 병인의 역학을 이해하고 바이러스 감염 후 다른 시기에 감염된 세포/기관을 식별하는 데 탁월한 옵션을 제공합니다. 생체 외 (rSARS-CoV-2 / 금성) 및 생체 내 (rSARS-CoV-2 / Nluc) 연구를 수행하기 위해서는 정확하고 재현 가능한 감염뿐만 아니라 rSARS-CoV-2 / Nluc의 적절한 예방 접종을 갖는 것이 탁월합니다.
rSARS-CoV-2/Nluc를 사용하여 생체 내 감염을 연구할 때, 마우스는 IVIS 하에서 Nluc 시각화를 용이하게 하기 위해 면도되어야 합니다. 또한 Nluc의 시각화를 위해 Nluc 기질을 접종할 필요성이 있다. 이것은 높은 Nluc 신호를 보장하기 위해 Nluc 기질의 농도 및 부피를 결정하기 위해 몇 가지 실험 테스트가 필요할 수 있습니다. rSARS-CoV-2 / Venus를 사용하여 생체외 감염을 연구할 때, 그리고 IVIS를 사용하여 전체 마우스로부터 직접 금성을 검출하는 한계 때문에, 폐의 생체외 영상만이 금성 발현의 검출을 허용한다. 이를 위해서는 상이한 시간 지점에서 안락사될 마우스 그룹이 있어야 한다. 이것은 rSARS-CoV-2 / Venus에 필요한 감염 후 각 시간에 안락사를 요구하지 않고 동일한 그룹의 마우스가 감염 후 다른 날에 이미징 될 수 있기 때문에 rSARS-CoV-2 / Nluc에 감염된 마우스의 상황과 상반됩니다. rSARS-CoV-2/Nluc에 비해 rSARS-CoV-2/Venus의 장점은 이전에 인플루엔자 (REF)에서 설명한 것처럼 특정 세포 마커를 사용하여 감염되지 않은 세포에서 감염된 세포를 단순히 분류하여 SARS-CoV-2에 감염된 세포의 유형을 식별하기 위해 유세포 분석기와 함께 사용할 수 있다는 것입니다. 우리의 rSARS-CoV-2/Venus 및 rSARS-CoV-2/Nluc의 한 가지 중요한 측면은 둘 다 감쇠의 징후를 나타내지 않고 시험관내 및 생체 내에서 WT-유사 성장 특성을 나타내어 감염된 마우스(rSARS-CoV-2/Venus)의 폐에서 바이러스 감염 생체 외 및 비침습적 종방향 생체 영상화를 사용하여 전체 마우스(rSARS-CoV-2/Nluc) 에서 바이러스 복제의 역동성을 모니터링할 수 있다는 것입니다.
중요하게도, 이러한 리포터-발현 rSARS-CoV-2/금성 및 rSARS-CoV-2/Nluc는 SARS-CoV-2 감염(41)의 치료를 위한 납 예방 및/또는 치료제의 식별을 위한 우수한 옵션을 나타낸다. 사용된 상이한 형광 단백질(예를 들어, 금성 및 mCherry)을 발현하는 리포터-발현 rSARS-CoV-2의 사용은 이중형광 분석에서 이들을 결합시켜 치료제가 동시에 시험관내 및 생체내에서 두 바이러스의 감염을 효율적으로 억제할 수 있는지를 확인하고, 바이러스 감염 및 병인(39)을 추적할 수 있게 한다.
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Disclosures
저자들은 연구 결과가 설명 된 작업과 관련하여 상업적, 재정적 및 비 재정적 또는 개인적인 이해 상충이없는 상태에서 수행되었다고 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 COVID-19 전염병 기간 동안 시설을 완전히 운영하고 안전하게 유지하려는 노력에 대해 우리 연구소 (Texas Biomedical Research Institute)의 회원들에게 감사드립니다. 우리는 또한 우리의 프로토콜을 시간 효율적인 방식으로 검토해 주신 IBC(Institutional Biosafety Committee)와 주문(IACUC)에 감사드립니다. 우리는 SARS-CoV 교차 반응성 1C7C7 뉴클레오캡시드 (N) 단백질 모노클로날 항체를 제공해준 마운트 시나이 의과 대학의 토마스 모란 박사에게 감사드립니다. 마르티네즈-소브리도 실험실에서의 SARS-CoV-2 연구는 현재 NIAID/NIH 보조금 RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 및 R43AI165089-01에 의해 지원되고 있습니다. 국방부 (DoD)는 W81XWH2110095 및 W81XWH2110103을 부여합니다. 정밀 치료를위한 샌 안토니오 파트너십; 텍사스 생물 의학 연구소 포럼; 샌 안토니오에있는 텍사스 대학 건강 과학 센터; 샌안토니오 의료 재단; 인플루엔자 병인 및 전염 연구 센터 (CRIPT), NIAID가 자금을 지원하는 인플루엔자 연구 및 대응 우수 센터 (CEIRR, 계약 # 75N93021C00014)에 의해.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at room temperature (RT) |
| 1% DEAE-Dextran | MP Biomedicals | 195133 | |
| 10% Formalin solution, neutral buffered | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Agar | Oxoid | LP0028 | |
| 24-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 662160 | |
| 5% Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| 6-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6) | ATCC | CRL-1586 | |
| Ami HT | Spectral Instruments Imaging | ||
| Aura Imaging Software 3.2.0 | Spectral Instruments Imaging | Image analysis software | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), 35% | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4 °C |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4 °C |
| Anesthesia gas machine | Veterinary Anesthesia Systems, Inc. | VAS 2001R | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20 °C |
| Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic mice | The Jackson Laboratory | 34860 | |
| Graphpad Prism Version 9.1.0 | GraphPad | ||
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Store at RT |
| MARS Data Analysis Software | BMG LABTECH | ||
| MB10 tablets | QUIP Laboratories | MBTAB1.5 | Store at RT |
| Nano-Glo Luciferase Assay Reagent | Promega | N1110 | This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Store at -20 °C |
| PHERAstar FSX | BMG LABTECH | PHERAstar FSX | |
| Precelleys Evolution homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| Soft tissue homogenizing CK14 – 7 mL | Bertin Instruments | P000940-LYSK0-A | |
| T75 EasYFlask | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase | Vector Laboratories | PK-4002 | ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit |
References
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